专利名称：迷迭香酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种迷迭香酸的制备方法。
背景技术：
迷迭香酸(rosmarinic acid，简称RosA)，化学名为R(+)2-((3-(3，4-二羟基苯基-(-氧化-2-丙烯基)氧基)3，4-二羟基苯丙酸)，是一种多功能酚酸类化合物，最早由Ellis从迷迭香这种药材中发现的故此命名为迷迭香酸。迷迭香酸广泛存在于迷迭香、苏叶、丹参、肾茶等唇形科药材中。迷迭香酸作为抗氧剂，具有极强的清除体内自由基活性，其抗氧化活性强于咖啡酸、绿原酸、叶酸等，它还能抑制内皮细胞调节的低密度脂蛋白的氧化。迷迭香酸还具有抗病毒活性。Arda等发现变豆菜的醇水提取物具有抗HIV(人类免疫缺陷病毒)的活性。其中起主要作用的物质是迷迭香酸。Mazumder等的研究进一步表明迷迭香酸能抑制HIV-1(人类免疫缺陷病毒-1)整合酶的活性。其IC50(半抑制浓度)值小于10mmol/L。Hangav等的研究表明迷迭香酸是控制疱疹病毒的一种有效成分。迷迭香酸的抗病毒活性除已知病毒生活周期中某些酶的活性外，它还能迅速与病毒外壳蛋白结合，从而使病毒失活。此外，迷迭香酸还具有其他方面的功能。如迷迭香酸作为化妆品的添加剂能抑制急慢性感染，抗紫外线，以致弹性蛋白的降解、增加细胞膜的稳定性。邹正午等发现丹参中的迷迭香酸还具有抗血栓及抗血小板凝集、促进纤维蛋白溶解的作用。日本京都大学研究生院药学部的Makino T及其同事研究了迷迭香酸在体内对系膜增生型肾小球肾炎的抑制作用。他们总结认为，迷迭香酸在体内可通过纤维溶解和抗氧化活性来抑制系膜细胞的增殖和肾小球基质的集聚。关于迷迭香酸的研究已表明其在制药、食品、化妆品等领域中具有重要的应用价值。
迷迭香酸的药材来源甚广，资料报道在丹参、迷迭香、肾茶、紫苏草、头状山香、轮生山香、香峰花、鼠尾草、裂叶荆芥和夏枯草等均发现迷迭香酸，但大多由于含量较低，导致制备方法研究基本处于实验室阶段。传统的迷迭香酸提取工艺是药材粉碎后热水提取，乙酸乙酯萃取得浸膏后上硅胶柱分离，氯仿-甲醇洗脱。此工艺消耗时间长，易造成有机溶剂残留，不适合工业生产。
本发明通过对迷迭香酸的药材来源进行广泛筛选，最终确定以含量较高的丹参、迷迭香、紫苏草、头状山香、轮状山香和夏枯草为原料进行迷迭香酸的提取工艺研究，开拓出一条适用于工业化生产的高纯度迷迭香酸的制备工艺，为迷迭香酸的进一步研究和应用奠定了基础。
发明内容
本发明提供了一种迷迭香酸的制备方法，该方法为将含迷迭香酸的药材以适量极性溶剂提取后，提取液加入抗氧剂或PH调节剂调至酸性后放置，过滤，滤液上聚酰胺树脂、离子交换树脂或大孔树脂柱层析，用水或低浓度的有机溶剂溶液洗脱后再用中等浓度的有机溶剂溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩脱醇后调pH至酸性，放置，结晶，过滤，干燥，即得。
本发明人对有资料报道含迷迭香酸的药材丹参、迷迭香、肾茶、紫苏草、头状山香、轮生山香、香峰花、鼠尾草、裂叶荆芥和夏枯草按本工艺进行处理，所得产品的13C-NMR、1H-NMR结果与文献报道吴志军，欧阳明安等，苣叶丹参的多酚类化合物，云南植物研究，1999，21(3)393-398相符，确证均为迷迭香酸。在此基础上进行了迷失香酸的含量测定。备选药材均购自毫州药材市场，干燥、粉碎过三号筛。各取100mg，精密称重，置具塞锥形瓶中，加甲醇溶液20mL，密塞，称定重量，超声处理30min，静置，上清液用0.45μm膜过滤，取滤液作供试品溶液；另精密称取迷迭香酸对照品适量，加甲醇制成0.2mg/ml的溶液作为对照品溶液。分别精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以迷迭香酸对照品作外标，分别计算备选药材中迷迭香酸的含量。结果(见表1)发现丹参、紫苏草、头状山香、轮生山香和夏枯草中迷迭香酸含量高于0.3％，具有开发利用的价值。
表1.不同药材中迷迭香酸的含量测定结果
1.用特选溶剂粗提药材中包括迷迭香酸在内的目标成分。
所用溶剂可为水、酸性水、乙醇、甲醇、丙酮或其水溶液，其中酸性水可以为盐酸水溶液、硫酸水溶液等无机酸水溶液或抗坏血酸水等有机酸水溶液，优选为乙醇水溶液，乙醇浓度为0～100％，优选为10～50％。
提取方法可以是浸渍、渗漉或超声萃取。浸渍法是取粉碎后可过三号筛的药材加提取溶剂一次性浸渍提取或多次浸渍提取。每次浸渍用5～20倍量溶剂，浸渍时间为2～8小时。渗漉法是取粉碎后可过三号筛的药材装于一有机玻璃制成的渗漉柱或桶中，边装边适当压实，渗漉柱或桶上端留出约1/5体积。加溶剂至所有药材浸没，静止浸泡4小时。打开渗漉柱下端阀门，使渗漉液缓缓流出，每小时流出渗漉液约为药材干重的一倍，同时不断注入溶剂至渗漉柱上端，渗漉12～16倍量可比较完全地提取出迷迭香酸。超声法是取粉碎后可过三号筛的药材，加溶剂一次性提取或多次提取。每次提取用5～20倍量，提取时间为0.5～2小时。
2.加入抗氧剂或调pH，并沉降杂质。
迷迭香酸上的酚羟基易氧化，在中性或碱性条件下尤为严重。为保证它在溶剂中的稳定性，将上述粗提液中加入抗氧剂或调pH至酸性，静置4～24小时，溶液变混浊并逐渐析出沉淀，采用过滤、离心或自然沉降法去除沉淀。抗氧剂可以是亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、抗坏血酸、焦亚硫酸钠，优选为亚硫酸氢钠和抗坏血酸。抗氧剂的用量为提取液体积的0.001％～10％，优选为0.005％～1％，再优选为0.005％～0.01％。PH调节剂为盐酸、硫酸或抗坏血酸。加入抗氧剂的目的是延缓溶液中的溶解氧对迷迭香酸的氧化作用。另外提取液中含有大量的胶质成分，加入抗氧剂或调pH后，可产生盐析效果而去除这部分杂质。
本发明人设计了以下对比实验来考察抗氧剂或调pH对提取液中迷迭香酸的保护作用并比较了醇沉、酸化去除杂质的效果取丹参粗提液5份，其中四份分别加入0.01％的亚硫酸氢钠、0.01％的抗坏血酸、以盐酸调至pH＝2、以95％乙醇调至醇浓度为75％，另外一份不做任何处理。5份溶液在用HPLC检测其中的迷迭香酸含量后除菌、密封，室温下放置两天，观察溶液状态，HPLC检测溶液中的迷迭香酸含量并与两天前比较。结果表明，处理过的提取液均出现沉淀，目测沉淀的量基本相同，而加入抗氧剂或调pH的水提液中迷迭香酸含量明显比其它两种溶液稳定。
表2不同方法处理丹参水提液后迷迭香酸的变化
3.采用柱层析技术分离纯化迷迭香酸柱层析的步骤为(1).采用特选层析介质制备色谱柱；(2).将药材提取液上层析柱，用水、或低浓度的有机溶剂水溶液去除杂质；(3).以适当浓度的有机溶剂水溶液洗脱，得到高纯度的迷迭香酸溶液。
上述步骤(1)中，特选层析介质是指大孔树脂类、离子交换树脂或聚酰胺树脂，优选聚酰胺树脂。
上述步骤(2)中，洗脱用水中可含一定量的酸或盐。
上述步骤(2)和步骤(3)中，有机溶剂可以是醇或丙酮。
上述步骤(2)中，可以只以水洗脱杂质，或只用一定浓度的醇-水溶液或丙酮-水溶液，也可以依次采用水、一定浓度的醇-水溶液或丙酮-水溶液。所用醇可以是乙醇、甲醇、丁醇等低元醇，优选为乙醇。
将加入抗氧剂或调pH至酸性后静置4～24小时后的药材提取液上清液加水稀释至适当浓度后上至层析柱；上样量(以原药材干重计算)与树脂量之比为1∶0.5～10，优选为1∶2。上样完成后，先用水或低浓度的有机溶剂水溶液洗去大部分杂质，再换用中等浓度的有机溶剂水溶液洗脱得到高纯度的迷迭香酸溶液。
上述所用低浓度的有机溶剂水溶液，有机溶剂浓度为15％～35％，优选30％，洗脱体积为3～15个柱体积，优选为5～8个柱体积。
上述所用中等浓度的有机溶剂水溶液，有机溶剂浓度为35％～85％，优选60％，洗脱体积为3～15个柱体积，优选为3～5个柱体积。
4.结晶与干燥结晶与干燥的步骤为(1).浓缩柱层析的收集液；(2).调浓缩液至酸性，低温放置；(3).过滤，干燥结晶，滤液可转入下一循环。
上述步骤(1)中，浓缩可以采用常温常压，也可常压加热，或加热减压。优选为加热减压，加热温度为0～100℃，优选50～80℃；减压时真空度为0～-0.1MPa。
上述步骤(2)中，调酸性所用酸为盐酸、硫酸或其它无机酸，优选为盐酸；溶液终pH为1～6，优选为1～3。
上述步骤(3)中，干燥所用方法可以是晾干，也可常压加热。优选为加热减压，加热温度为0～100℃，优选50～80℃；减压时真空度为0～-0.1MPa。
按步骤1～4操作，通过HPLC跟踪检测各操作单元中迷迭香酸的回收率，结果见表3。
表3不同操作单元中迷迭香酸的回收率*
*取药材，粉碎过三号筛，加50倍量溶剂超声提取30min，HPLC检测上清液中迷迭香酸的含量。以此确定药材中迷迭香酸的量，定为100％。
在本发明所涉及的迷迭香酸制备方法中，溶剂提取药材时采用常温或低温，避免了迷迭香酸的降解；提取液加入抗氧剂或酸化，不但有利于保持迷迭香酸的稳定性，同时产生的盐析效果可有效去除胶质等杂质，达到粗分离的目的，减轻后续步骤的压力；最终步骤采用酸性条件下结晶，不但可获得高纯度的制品，还使本工艺可基本忽略不同种类药材中杂质对最终产品的影响，完全适用于不同植物来源的迷迭香酸的提取。
图1为实施例1制备的迷迭香酸制品色谱图，各成分在色谱分析中保留时间、面积百分比等数值见表4。
表4实施例1制备的各成分保留时间、面积百分比
图2为迷迭香酸对照品色谱图，各成分在色谱分析中保留时间、面积百分比等数值见表5。
表5对照品制备的各成分保留时间、面积百分比
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。
实施例1迷迭香酸的制备溶剂提取(浸渍法)取丹参粉碎可过三号筛，称50Kg，按其重量的20倍量加50％乙醇，室温浸泡4小时并适当搅拌，分离提取液，残渣按原药材重量的10倍加50％乙醇，室温浸泡6小时并适当搅拌，分离提取液。合并两次提取液，用过滤或离心的方法去除其中的固体杂质。滤液中加入抗氧剂亚硫酸氢钠，亚硫酸氢钠的用量为提取液体积的0.005％。静置6小时，溶液变混浊并逐渐出现沉淀，过滤去除沉淀。
将上述滤液用水调醇浓度至20％左右，加至聚酰胺柱，上柱样品量(以原药材干重计算)与树脂量之比为1∶2。先用5个柱体积的20％乙醇洗柱，去除大部分未与聚酰胺树脂结合的杂质，再用30％的乙醇水溶液洗5个柱体积，然后用60％乙醇洗脱5个柱体积，基本可将迷迭香酸收集完全。最后用95％乙醇洗脱3个柱体积后用去离子水洗10～20个柱体积，再生柱子。
收集上述用60％乙醇洗脱时的流出液，在60℃、真空度-0.1Mpa的条件下减压脱醇浓缩至适当体积后用盐酸调pH至2左右，低温放置，析出颗粒状迷迭香酸，过滤，真空减压干燥结晶。得迷迭香酸含量为94.2％的产品273g。
实施例2迷迭香酸的制备与实施例1基本相同，所不同的是，药材选用紫苏草。最终得到迷迭香酸含量为92.6％的产品136g。
实施例3迷迭香酸的制备与实施例1基本相同，所不同的是，药材选用头状山香。最终得到迷迭香酸含量为95.8％的产品256g。
实施例4迷迭香酸的制备与实施例1基本相同，所不同的是，药材选用轮生山香。最终得到迷迭香酸含量为94.1％的产品178g。
实施例5迷迭香酸的制备与实施例1基本相同，所不同的是，药材选用夏枯草。最终得到迷迭香酸含量为96.2％的产品183g。
实施例6迷迭香酸的制备与实施例1基本相同，所不同的是，提取过程采用渗漉法。具体方法如下取粉碎后可过三号筛的丹参装于一有机玻璃制成的渗漉柱或桶中，边装边适当压实，渗漉柱或桶上端留出约1/5体积。加50％乙醇至所有药材浸没，静止浸泡4小时。打开渗漉柱下端阀门，使渗漉液缓缓流出，每小时流出渗漉液约为丹参干重的一倍，同时不断注入50％乙醇至渗漉柱上端。渗漉13倍量后以HPLC检测发现流出液色谱图中迷迭香酸峰乙接近基线，停止渗漉。最终得到迷迭香酸含量为94.6％的产品286g。
实施例7迷迭香酸的制备与实施例1基本相同，所不同的是，提取液上柱前加入抗坏血酸代替亚硫酸氢钠。最终得到迷迭香酸含量为97.1％的产品278g。
实施例8迷迭香酸的制备与实施例1基本相同，所不同的是，提取液上柱前加盐酸调pH＝2代替加入亚硫酸氢钠。最终得到迷迭香酸含量为96.3％的产品285g。
实施例9迷迭香酸的制备与实施例1基本相同，所不同的是，在聚酰胺层析分离纯化迷迭香酸的单元操作中采用不同浓度的甲醇-水溶液代替乙醇-水溶液。最终得到迷迭香酸含量为91.2％的产品268g。
实施例10迷迭香酸的制备与实施例1基本相同，所不同的是，在聚酰胺层析分离纯化迷迭香酸的单元操作中采用经盐酸调pH＝2的去离子水代替20％乙醇洗除杂质。最终得到迷迭香酸含量为93.1％的产品272g。
实施例11迷迭香酸的制备与实施例1基本相同，所不同的是，在聚酰胺层析分离纯化迷迭香酸的单元操作中采用不同浓度的丙酮-水溶液代替乙醇-水溶液。最终得到迷迭香酸含量为93.3％的产品272g。
实施例12迷迭香酸的制备与实施例1基本相同，所不同的是，柱层析步骤采用AB-8型大孔树脂代替聚酰胺。最终得到迷迭香酸含量为95.7％的产品265g。
实施例13迷迭香酸的制备与实施例1基本相同，所不同的是，柱层析步骤采用离子树脂代替聚酰胺。最终得到迷迭香酸含量为90.3％的产品242g。
本发明所要求保护的具体技术方案，不限于上述实施例所表达的技术方案的具体组合。
权利要求
1.一种迷迭香酸的制备方法，其特征为将含迷迭香酸的药材以适量极性溶剂提取，提取液加入抗氧剂或pH调节剂调至酸性后放置，过滤，滤液上聚酰胺树脂、离子交换树脂或大孔树脂柱层析，用水或低浓度的有机溶剂溶液洗脱后再用中等浓度的有机溶剂溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩脱醇后调pH至酸性，放置，结晶，过滤，干燥。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所用溶剂可以为水、酸性水、乙醇、甲醇、丙酮或其水溶液中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是所用溶剂优选为乙醇水溶液。
4.根据权利要求2所述的制备方法，酸性水为盐酸水溶液、硫酸水溶液或抗坏血酸水溶液。
5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征是抗氧剂是亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、抗坏血酸或焦亚硫酸钠，抗氧剂用量为提取液体积的0.001％～10％，PH调节剂为盐酸、硫酸或抗坏血酸。
6.根据权利要求5所述的制备方法，抗氧剂优选为亚硫酸氢钠或抗坏血酸，用量优选为提取液体积的0.005％～1％。
7.根据权利要求6所述的制备方法，抗氧剂用量更优选为提取液体积的0.005％～0.01％。
8.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征是层析介质优选为聚酰胺树脂。
9.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征是低浓度的有机溶剂是指有机溶剂浓度为15％～35％，中等浓度的有机溶剂是指有机浓度为35％～85％。
10.根据权利要求9所述的制备方法，低浓度有机溶剂优选为30％，中等浓度有机溶剂优选为60％。
全文摘要
本发明提供了迷迭香酸的制备方法，该方法为将含迷迭香酸的药材以适量溶剂浸渍、渗漉或超声提取后，提取液加入抗氧剂或调pH至酸性后放置，过滤，滤液上聚酰胺树脂或离子交换树脂或大孔树脂柱层析。该方法非常适合工业化大生产。
文档编号C07C69/73GK1995007SQ200510131129
公开日2007年7月11日 申请日期2005年12月26日 优先权日2005年12月26日
发明者曲桂武, 岳喜典 申请人:山东绿叶天然药物研究开发有限公司