专利名称：活化胶原蛋白支架材料及其专用融合活性修复因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及活化胶原蛋白创伤修复支架材料及其具有胶原蛋白特异结合能力的融合活性修复因子。
背景技术：
由创伤、感染、肿瘤以及发育异常等原因造成的骨缺损是骨科临床每天都要面临的问题。人骨多形性蛋白BMP2具有很强的骨诱导活性。它是一个全长396个氨基酸残基的糖基化蛋白，包括一段由19个氨基酸残基组成的信号肽，由263个氨基酸残基组成的pro-region以及由114个氨基酸残基组成的成熟肽。成熟肽含有7个半胱氨酸和一个N-糖基化位点，其功能形式是通过一对二硫键联系形成的同型二聚体，每个单体内的其余六个半胱氨酸形成三个链内二硫键(Wozney，J.M.et al.Novelregulators of bone formationmolecular clones and activities.Scienee 242，1528-34，1988)。但是天然BMP2含量很少，从人或动物骨基质中分离纯化BMP2具有很大局限性。目前，人们着重研究通过基因工程的方法制备重组BMP2，以满足临床和基础研究的需要。此外，功能类似于BMP2其它的可以诱导组织再生和创伤修复的因子还包括BMP3，PDGF，FGF，EGF，TGF，VEGF，NGF，NT3/4等。
胶原材料是常用的骨修复材料。胶原是骨的主要有机成分，I型胶原及其交联纤维结构是骨细胞外基质中最丰富的蛋白。胶原结构对矿物沉积具有诱导作用，其表面含有矿物沉积的位点，可有效引发和控制矿化过程，促进骨形成并诱发至植入物中。传统的胶原载体是通过胶原分子的分子结构阻止BMP2成分弥散，维持宿主靶细胞周围的BMP2浓度，这样一方面也要求其孔径不能太大，但孔径过小又不利于成骨细胞的生长，这就需要控制一定的胶原孔径，给工艺学上带来一定难度。另一方面，使用目前的生物材料作为BMP2的载体，BMP2的用量很大，往往要达到毫克级(Kirker-Head，C.A.，Gerhart，T.N.，Armstrong，R.，Schelling，S.H.& Carmel，L.A.Healingbone using recombinant human bone morphogenetic protein 2 and copolymer.ClinOrthop Relat Res，205-17(1998)；Kokubo，S.et al.Bone regeneration byrecombinant human bone morphogenetic protein-2 and a novel biodegradablecarrier in a rabbit ulnar defect model.Biomaterials 24，1643-51(2003))。由于目前市场上BMP2很昂贵，仅sigma公司用于实验研究的BMP2，每10μg售价达500美元，国内病人很少能负担起BMP2的使用费用，另外，几毫克的BMP2，相当于从一头牛抽提的BMP2总和，而且这样大量地使用BMP2，安全性也很令人担忧。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有胶原蛋白特异结合能力，可用于活化胶原蛋白创伤修复支架材料的融合活性修复因子。
本发明所提供的用于活化胶原蛋白创伤修复支架材料的专用融合活性修复因子，是在修复因子的氨基端(N端)或羧基端(C端)融合胶原结合结构域(collagen bindingdomain，CBD)得到的融合蛋白；所述胶原结合结构域是由7-27个氨基酸残基组成的蛋白，其保守序列为序列表中的SEQ ID №1。
所述修复因子可为BMP2、BMP3、PDGF、FGF、EGF、TGF、VEGF、NGF或NT3/4等可以诱导组织再生和创伤修复的因子，优选为BMP2。
序列表中的SEQ ID №1由7个氨基酸残基组成。
其中，在BMP2的N端融合胶原结合结构域得到的融合活性修复因子可具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列，序列表中的SEQ ID №2由159个氨基酸残基组成，其胶原结合结构域的保守序列为自氨基端第22-28位氨基酸残基；编码此融合活性修复因子的DNA序列为序列表中的SEQ ID №3，序列表中的SEQ ID №3由477个碱基组成。
上述融合蛋白可按照基因工程领域的常规方法制备。
本发明的第二个目的是用上述专用融合活性修复因子活化的胶原蛋白创伤修复支架材料。
本发明所提供的活化胶原蛋白支架材料，是加载有上述专用融合活性修复因子的胶原蛋白。
所述专用融合活性修复因子的加载量为1-4000pmol蛋白/mg胶原蛋白。
本发明提供了一种活化胶原蛋白创伤修复支架材料及其专用融合活性修复因子。该专用融合活性修复因子是通过基因工程的方法在BMP2等修复因子的氨基端或羧基端融合CBD，以加强修复因子与胶原的结合，在修复因子与胶原蛋白之间建立一种较强的物理化学力，即可将BMP2等修复因子固定在胶原蛋白支架上，从而显著提高骨损伤的修复能力，同时也可以大大减少BMP2等修复因子的用量，并降低了使用风险。本发明制备方法简便，可应用于大规模工业化生产，并将在医学领域特别是骨损伤的修复中发挥巨大作用。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
图1为对经纯化和复性的表达蛋白的15％ SDS-PAGE检测结果图2为浓度逐渐递增的天然BMP2及专用融合活性修复因子rhBMP2-h与I型胶原蛋白结合量的统计结果图3为等量天然BMP2及专用融合活性修复因子rhBMP2-h对I型胶原的结合能力的检测结果图4为专用融合活性修复因子rhBMP2-h的细胞活性检测结果图5为天然BMP2及专用融合活性修复因子rhBMP2-h的异位骨诱导实验结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、专用融合活性修复因子的制备及其活性鉴定一、专用融合活性修复因子的制备1、专用融合活性修复因子原核表达载体的构建根据已知的人BMP2(hBMP2)的cDNA序列(GenBank号为650)设计PCR扩增引物，并在正向引物中引入胶原结合结构域(CBD)“TKKTLRT”(序列表中的SEQ ID №1)的编码序列，引物序列如下hBMP2F15’-TACCGGTAGCGCGGGCAGTGCTGCGGGTTCTGGCGGTGTCGACCAAGCCAAACAC-3’hBMP2F25’-CCGCATATGACTAAGAAAACCCTGCGTACTGGTACCGGTAGC-3’hBMP2R5’-CCGCTCGAGCTATTAACGACAACCACAACC-3’以人BMP2 cDNA全长为模板，在引物hBMP2F1和hBMP2R的引导下进行PCR扩增，30μl PCR反应体系为正、反向引物各1pmol/μl、dNTPs 200μmol/μl、Taq酶3ul；PCR反应条件为先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸10min。反应结束后，对扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增得到一条长度约400bp的DNA片段。对该片段进行回收并纯化后，作为第二次PCR的模板，再在引物hBMP2F2和hBMP2R的引导下进行第二次PCR扩增，PCR反应体系及反应条件同上，扩增结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条长度约430bp的条带，对其进行回收并纯化后，用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切后与经相同酶双酶切的原核表达载体pET-28a(Novagen)在16℃下，用T4DNA连接酶连接12-24小时，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，对该表达载体多克隆位点区进行测序，结果插入序列与预期序列相符，具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №3由477个碱基组成，编码序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列，包括CBD区，linker区和hBMP2成熟肽编码区，在插入区前还融合一段组氨酸亲和标签，其CBD区的保守序列为序列表中SEQ ID №2自氨基端第22-28位氨基酸残基，linker区为自氨基端第31-43位氨基酸残基，hBMP2成熟肽为自氨基端第46-159位氨基酸残基，表明得到了正确的含有专用融合活性修复因子编码序列的重组质粒，命名为pET-28a-BMP2-h。
2、专用融合活性修复因子的原核表达将步骤1构建的原核表达载体pET-28a-BMP2-h转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将筛选到的阳性单克隆转接于LB液体培养基中，37℃培养12-24小时，再以2％接种比例转接于100mL LB液体培养基中，37℃培养3小时至OD600值达到0.8，加入终浓度为1mM的IPTG，相同条件下继续诱导培养4小时。培养结束后，离心收集菌体，用PBS洗涤后再次离心收集菌体，用10mL PBS重悬菌体，超声破碎菌体，对裂解液进行15％ SDS-PAGE检测，检测结果表明得到了蛋白粗提液，表达蛋白以包涵体的形式存在。
3、专用融合活性修复因子的纯化和复性首先将步骤2经超声破碎的菌体离心收集包涵体。将稀释复性得到的蛋白溶液进行超滤浓缩处理，然后将蛋白质溶剂体系用50mM MES缓冲液(购自GIBCO公司)置换，冷冻干燥后低温保存。对经纯化和复性的表达蛋白进行15％ SDS-PAGE检测，检测结果如图1所示(泳道M为Marker，泳道1为经纯化的表达蛋白(还原条件下)，泳道2为经复性的表达蛋白)，泳道1的纯化结果表明15KD的目的蛋白已经达到相当纯度，由于BMP2的活性形式是通过一对二硫键形成的二聚体形式，在非还原条件下可看到其二聚体条带，泳道2的检测结果表明复性形成的二聚体已达到30％，将经纯化的专用融合活性修复因子命名为rhBMP2-h。
二、专用融合活性修复因子的胶原结合活性鉴定1、专用融合活性修复因子的胶原结合能力分析1)检测等量胶原对不同量天然BMP2及专用融合活性修复因子的结合量将浓度逐渐递增的天然BMP2及步骤一制备的专用融合活性修复因子加载在用等量的I型胶原制备的胶原膜上，充分吸附后，经PBS洗涤掉不能结合的蛋白，通过测定与融合标签结合的抗体所产生的特异可定量的颜色反应得到蛋白结合量，统计结果如图2所示(横坐标为蛋白加载量，纵坐标为在405纳米测定的吸光值)，在蛋白浓度达到一定域值后，胶原对蛋白的结合能力都能到达相同的饱和量。而在到达这个域值前，在相同的蛋白加载量情况下，经改造得到的rhBMP2-h的保留量明显高于天然BMP2(rhBMP-2)，即前者的结合效率明显高于后者。实验结果表明，经过改造的BMP2对胶原的结合能力比天然BMP2显著增强。
2)检测等量天然BMP2及专用融合活性修复因子对I型胶原的结合能力将等量的天然BMP2及步骤一制备的专用融合活性修复因子加载在I型胶原制备的胶原膜上，待充分吸附后分别用不同浓度的尿素洗脱，通过测定与融合标签结合的抗体所产生的特异可定量的颜色反应得到蛋白结合量，蛋白结合量的统计结果如图3所示(横坐标为尿素浓度，纵坐标为在405纳米测定的吸光值)，经改造得到的rhBMP2-h对胶原的结合曲线明显高于天然BMP2，而且在低剂量的尿素水平，天然BMP2在胶原上的保留量大幅降低，很快接近其本底水平。
上述实验从不同角度验证了BMP2对胶原的特异结合能力，表明经过改造得到的专用融合活性修复因子rhBMP2-h对胶原的结合能力得到显著提高。
三、专用融合活性修复因子的细胞活性检测BMP2对细胞的作用主要是促进细胞向成骨细胞分化。Hiraki通过体细胞培养发现，BMP2对成骨样细胞MC3T3-E1有强烈刺激作用，用100ng/mL BMP2能使这种细胞的ALPase(碱性磷酸酶)活性增加5-20倍(Hiraki，Y.et al.Bone morphogeneticproteins(BMP-2 and BMP-3)promote growth and expression of the differentiatedphenotype of rabbit chondrocytes and osteoblastic MC3T3-E1 cells in vitro.J Bone Miner Res 6，1373-85(1991).)，此外，其对成肌细胞C2C12也具有强烈地转分化作用，可以抑制其向肌细胞方向分化转而向成骨细胞方向分化。现使用小鼠成肌细胞系C2C12(购自协和医科大学基础医学院细胞库)对步骤一制备的专用融合活性修复因子的体外活性进行检测，方法为用不同浓度的rhBMP2-h刺激C2C12细胞，作用三天后检测ALPase的活性，阳性对照组采用的是由CHO细胞产生的rhBMP-2(购自Sigma公司)，实验对照组是不带有胶原结合结构域的天然BMP2(rhBMP-2)，结果如图4所示(横坐标为蛋白浓度，纵坐标为ALPase活性)，随着rhBMP2-h浓度剂量的升高，ALPase活性也随之升高，显示出剂量依赖效应，且经过统计分析，各实验组与对照组都存在极显著差异(P＜0.05)，上述实验结果表明经过稀释复性的专用融合活性修复因子具有较高的生物活性。
实施例2、动物实验—异位骨诱导体内检测BMP2诱骨活性大多采用经典的异位成骨的方法，即将BMP2植入骨组织以外的异位组织中，植入后不同时间做组织学切片、X-线照相等检查，观察其在该组织中的诱骨活性(Wozney，J.M.et al.Novel regulators of bone formationmolecular clones and activities.Science 242，1528-34(1988).；Urist，M.R.Boneformation by autoinduction.1965.Clin Orthop Relat Res，4-10(2002).)。
本实施例采用上述相同的方法对天然BMP2及实施例1制备的专用融合活性修复因子的进行活性测定，具体实验方法及结果如下实验分三组天然BMP2(rhBMP-2)组、专用融合活性修复因子rhBMP2-h组和对照组。首先将胶原(来源于牛肌腱)制成1cm×1cm×0.1cm的正方形薄片，每mg胶原加载30pmol蛋白，对照组只加载PBS，冷冻干燥后备用。
选用成年雄性SD大鼠，背部皮下包埋制备好的上述加载不同蛋白的胶原材料块。包埋4周后，取出包埋物，切片并进行HE染色，结果如图5所示(a，b，c标尺5毫米；d，e，f标尺30微米)。图5中的a、d图分别表示没有加载任何蛋白的对照组植入的胶原材料块及组织学切片观察结果，由于所制备的胶原膜支架材料具有良好的生物降解性能，可见包埋物已部分降解，整体变薄变软，边缘变得不平整，组织学切片上的反映是没有任何骨形成的迹象。b、e图分别表示加载天然BMP2的实验组植入的胶原材料块及组织学切片观察结果，由于rhBMP-2本身具有异位诱骨能力，将其加载在胶原材料上，通过胶原结构在一定程度上阻止了rhBMP-2成分的扩散，启动了一定的骨化过程，诱导了少量间充质细胞向骨系细胞分化，因而粉末出少量胶原基质和钙离子沉积于材料之上，表观的表现是包埋物比阴性对照组厚，其降解速度也变慢，其组织学切片显示有少量编织骨(woven bones，WB)形成。c、f图本别表示加载专用融合活性修复因子rhBMP2-h的实验组的胶原材料块及组织学切片观察结果，改造过的rhBMP2-h与胶原具有特异的结合作用，且作用力较强，植入体内不易扩散稀释，始终在作用位点保持较高的浓度，诱导大量间充质细胞向骨系细胞分化。分化形成的骨系细胞又可以分泌出大量新的胶原基质和钙离子沉积在原有胶原材料上，原有材料降解释放出的rhBMP2-h又有部分可能结合在新形成的胶原上，其表观表现是胶原材料块的降解速度变慢，大小变化不明显，而且由于大量钙离子的沉积作用，材料更硬，组织学切片显示有板层骨(lamella bones，LB)形成，并可见骨基质(bone marrows)形成。上述实验结果表明加载专用融合活性修复因子的经活化的胶原材料的异位诱骨效果明显优于对照。
序列表<160>3<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr1 5<210>2<211>159<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro1 5 10 15Arg Gly Ser His Met Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr Gly Thr Gly Thr20 25 30Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Gly Val Asp Gln Ala Lys35 40 45His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu
50 55 60Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro65 70 75 80Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu85 90 95Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val100 105 110Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu115 120 125Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val130 135 140Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg145 150 155<210>3<211>477<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60atgactaaga aaaccctgcg tactggtacc ggtagcgcgg gcagtgctgc gggttctggc120ggtgtcgacc aagccaaaca caaacagcgg aaacgcctta agtccagctg taagagacac180cctttgtacg tggacttcag tgacgtgggg tggaatgact ggattgtggc tcccccgggg240tatcacgcct tttactgcca cggagaatgc ccttttcctc tggctgatca tctgaactcc300actaatcatg ccattgttca gacattggtc aactctgtta actctaagat tcctaaggca360tgctgtgtcc cgacagaact cagtgctatc tcgatgctgt accttgacga gaatgaaaag420gttgtattaa agaactatca ggacatggtt gtggagggtt gtggttgtcg ttaatag 47权利要求
1.融合活性修复因子，是在修复因子的氨基端或羧基端融合胶原结合结构域得到的融合蛋白；所述胶原结合结构域是由7-27个氨基酸残基组成的蛋白，其保守序列为序列表中的SEQ ID №1。
2.根据权利要求1所述的专用融合活性修复因子，其特征在于所述修复因子为BMP2、BMP3、PDGF、FGF、EGF、TGF、VEGF、NGF或NT3/4。
3.根据权利要求2所述的专用融合活性修复因子，其特征在于所述修复因子为BMP2。
4.根据权利要求3所述的专用融合活性修复因子，其特征在于所述融合活性修复因子具有序列表中SEQ ID№2的氨基酸残基序列；编码此融合活性修复因子的DNA序列为序列表中的SEQ ID №3。
5.活化胶原蛋白支架材料，是加载有权利要求1所述的融合活性修复因子的胶原蛋白。
6.根据权利要求5所述的活化胶原蛋白支架材料，其特征在于所述专用融合活性修复因子的加载量为1-4000pmol蛋白/mg胶原蛋白。
全文摘要
本发明公开了活化胶原蛋白支架材料及其专用融合活性修复因子。该专用融合活性修复因子，是在修复因子的氨基端或羧基端融合胶原结合结构域得到的融合蛋白；所述胶原结合结构域是由7－27个氨基酸残基组成的蛋白，其保守序列为序列表中的SEQ ID №1。活化的胶原蛋白支架材料，是加载有上述专用融合活性修复因子的胶原蛋白。本发明制备方法简便，可应用于大规模工业化生产，将在创伤医学领域发挥巨大作用。
文档编号C07K14/435GK1807459SQ20051013279
公开日2006年7月26日 申请日期2005年12月26日 优先权日2005年12月26日
发明者陈冰, 戴建武 申请人:烟台正海生物技术有限公司, 中国科学院遗传与发育生物学研究所