专利名称：生物活性肽vapeehptllteaplnpk衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及短肽及其用途。特别地，本发明涉及具有生物活性的短肽。
相关背景技术描述 在本领域中，已知肽用于治疗疾病并作为药物组合物。例如，美国第6,191,113号专利公开了一种对平滑肌细胞生长具有抑制活性的肽，这种肽因此可用于预防及治疗与平滑肌细胞生长相关的疾病，例如动脉硬化、血管成形术之后的再狭窄、血管移植后的管腔狭窄和平滑肌肉瘤。美国第6,184,208号专利公开了另一种肽，其被发现可调节一些生理过程，例如上皮生长带的重量增加活性以及毛发生长。另外，PCT出版物WO03/006492和美国专利申请第10/237,405号揭示了某些肽以及它们的药物组合物具有生物活性并能够调节免疫反应。
因此，本发明的一个目的在于提供具有生物活性的一种或多种短肽。 发明概述 本发明的一个方面涉及多肽，所述多肽衍自含18个氨基酸的肽CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)(SEQID No.1)且发现具有生物活性，其中所述多肽不包含肽CMS-010的序列。出于试验目的，用L-氨基酸化学合成这些多肽的样品。本发明的更多方面包括分离或纯化的肽，所述肽包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由该序列组成或者由该序列组成，其中所述肽不包含肽CMS-010(SEQ ID No.1)的序列。本发明的另一个方面涉及基本上纯的肽，所述肽包含选自SEQ ID No.2-31的肽、，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。
本发明的另一个方面涉及给予包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列，其中所述给予的作用选自以下抑制免疫细胞转化，抑制NK细胞活性、增强NK细胞活性、抑制体内抗体形成、抑制细胞增殖、抑制肿瘤生长、抑制肾炎和减少蛋白尿。在某些实施方案中，抑制免疫细胞转化是指抑制通过ConA(刀豆蛋白)的体外T淋巴细胞转化。在某些实施方案中，抑制免疫细胞转化是指抑制体内T淋巴细胞转化。在某些实施方案中，抑制细胞增殖是指抑制体内肉瘤细胞发育。在某些实施方案中，抑制肾炎是指抑制抗肾表位抗体引起的肾炎。
本发明的另外各方面涉及由L-氨基酸组成的，包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。在某些实施方案中，包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽为基本上纯的形式，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。
本发明的另一个方面涉及包含肽的药物组合物，所述肽包含选自SEQ ID No.2-31的序列，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。在某些实施方案中，包含肽(所述肽包含选自SEQ ID No.2-31的序列，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列)的药物组合物包含由L-氨基酸组成的肽，。
本发明的又一个方面涉及制备药物组合物的方法，所述方法包括提供包含选自SEQ ID No.2-31的序列的肽，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列，及将所述肽与药物可接受载体混合。
本发明的还一个方面涉及减少人疾病的影响的方法，所述方法包括给予药物有效剂量的包含选自SEQ ID No.2-31的序列的肽，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。在某些实施方案中，所述人患有细胞增殖性和/或免疫性疾病。在某些实施方案中，所述细胞增殖性疾病是癌症、肉瘤和和/或肿瘤。
本发明的另外一方面涉及调节个体免疫系统的方法，所述方法包括给予药物有效剂量的包含选自SEQ ID No.2-31的序列的肽，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。
本发明的另一个方面涉及包含选自SEQ ID No.2-31的序列的肽作为药物化合物的用途，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。在某些实施方案中，所述肽用以治疗细胞增殖性疾病和/或免疫性疾病形式的疾病状态。在某些实施方案中，所述受治疗的细胞增殖性疾病是肉瘤。
本发明的又一个方面涉及包含选自SEQ ID No.2-31的序列的肽作为免疫系统调节剂的用途，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。在某些实施方案中，调节免疫系统是指增强或抑制NK细胞活性。
本发明的另外一方面涉及包含选自SEQ ID No.2-31的序列的肽作为营养添加剂的用途，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。
本发明的另一个方面涉及这样的分子，所述分子包含肽的增强衍生物，包括与所述肽可操作地连接的增强分子，所述肽包含选自SEQ ID No.2-31的序列，其中所述增强分子增强所述肽的治疗效力，所述肽不包含肽CMS-010的序列。 附图概述 如下五幅附图分别举例说明了将肽连接到类固醇分子的化学反应。
图1显示了将肽通过共价键连接到雌酮分子上的一系列化学反应。
图2显示了用于创建图1所示相同连接的第二种可选的系列反应。
图3包含设计用于将肽通过共价键连接到雌二醇分子上的一系列化学反应。
图4包含用于创建图3所示相同连接键的第二种系列化学反应。
图5说明了将肽通过共价键连接到氢化可的松分子上的方法。
优选实施方案详述 I.引言 序列为VAPEEHPTLLTEAPLNPK的肽CMS-010(SEQ ID No.1)被发现具有生物免疫调节活性(美国专利申请第10/178,684号)，具有在人类中应用的治疗潜力。本发明涉及具有生物活性的CMS-010片断和衍生物。在具体的实施方案中，本发明包括其序列如SEQ ID No.2-31所示的片断和衍生物。在某些实施方案中，所述片断可发生取代和/或增加分子基团，或者可为VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)的功能性衍生物。CMS-010片断和衍生物的用途包括调节细胞和组织。可将CMS-010片断和衍生物掺入到药物制剂和营养添加剂中。
应当理解，有可能将另外的氨基酸添加到包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽或其功能性衍生物的氨基或羧基末端，作为实施本发明的另一种方法，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。在这种实施方案中，包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽或其功能性衍生物，其中所述肽不包含CMS-010的序列，能保持本文所述的一种或多种治疗或功能特性。例如，在某些实施方案中，可将一个或多个氨基酸添加到所公开的肽，而不影响其生物功能。在某些实施方案中，含有VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)的某个部分的更小分子包含衍自VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)的单一序列段。在其他实施方案中，含有VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)的某个部分的更小分子包含两个或多个衍自VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)的分开的非邻接部分的序列段。例如，在某些实施方案中，含有VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)的某个部分的更小分子包含靠近VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)N端的序列以及靠近VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)C端附近的序列，VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)的这两个序列之间没有任何插入序列。在更多的实施方案中，还有可能添加三个或四个氨基酸，且仍保持选自CMS-010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)的片断(其中所述片断不包含CMS-010的序列)及其功能性衍生物的肽的功能。这些都称作同一种肽的变体。此外，可用肽的衍生物(如在相同功能等级内一个氨基酸保守置换另一个氨基酸)来实施本发明的另一个方面。例如，具有非极性或疏水性侧链的肽有可能将其一个侧基代替另一个侧基，而不降低其生物活性。在某些实施方案中，CMS-010肽片断其序列中可消去一、二或多个氨基酸，同时仍保持原始肽片断的生物活性。例如，可重新合成长度为10个氨基酸的CMS-010肽片断，且不带有序列中从N端起的第5个氨基酸。因此所得的变体长度只有9个氨基酸，原始序列中从N端起的第4个氨基酸与从N端起的第6个氨基酸共价连接，且仍具有含10个氨基酸的原始肽片断的相同活性。在其中从CMS-010肽片断的序列中消去两个或多个氨基酸的某些实施方案中，被消去的氨基酸在原始的肽片断序列中互相接近。在其中从CMS-010肽片断的序列中消去两个或多个氨基酸的其他实施方案中，被消去的氨基酸在原始的肽片断序列中不互相接近，相反它们在原始序列中相互间被仍保留在缩短的变体肽中的氨基酸隔开。在其中从CMS-010的肽片断中消去三个或多个氨基酸的另外实施方案中，从原始肽片断序列中消去的某些氨基酸互相接近，而从原始序列中消去的一个或多个氨基酸与原始序列中被消去的其他任何氨基酸不接近。在本发明另外的实施方案中，可将连接区/间隔区序列插入到肽中形成变体，但所述变体仍如本研究中使用的肽一样保留其活性部分。这些变体也认为是所述肽的变体。本文所用的肽类似物包括具有模拟天然氨基酸结构的氨基酸分子的肽，例如具有不同主链结构或D-氨基酸取代的类似物。又一个实例是，虽然用以合成肽的氨基酸为L旋光异构体形式，但其序列中的一个或多个氨基酸被D-型氨基酸取代的肽可具有类似的生物活性。权利要求书中所使用的术语“功能性衍生物”意在包括所述肽的片断、变体、类似物或化学衍生物。
“基本上纯的肽”是指纯度至少为10％(w/w)的肽，更优选纯度为20％，更优选为40％，更加优选为60％，进一步优选为大于90％。在最优选的实施方案中，纯度大于99％。如下文所述，基本上纯的肽可用来配制药物或营养制剂，所述药物或营养制剂可为复杂的混合物。
“调节”指通过给予或暴露于本发明的肽所导致的对细胞的作用，其中将肽给予或暴露于细胞造成细胞活性的变化。所述变化可能是增强或抑制细胞的活性。细胞活性的增强或抑制可能是细胞分裂和复制速率的增强或抑制、细胞与其他成分的反应的增强或抑制、和/或细胞产生和/或分泌蛋白质或化合物的速率的增强或抑制。
“细胞增殖”指所存在的细胞数目增加，可由细胞的转化或无限增殖化引起。细胞增殖疾病包括但不限于癌症、良性生长、肿瘤和肉瘤，可包括任何细胞数目。“免疫性疾病”指免疫细胞或免疫系统的其他部分的功能失常或有害功能。这种疾病可由细胞或分子的活性被抑制或者细胞或分子的活性被增强所引起。
包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)用在药物配方中有可能用于治疗免疫失调或疾病。这些配方可能含有包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物与其它活性或非活性成分的混合，包括其他肽，例如两个或若干个(例如3-5个)肽可以加到同一配方中，可伴有或不伴有其它成分。或者，包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物可以与这里未列出的肽一起用于制备配方。此类配方可以经静脉、肌肉、皮内、皮下或真皮内给药。给药模式也可以是经动脉注射直接作用于问题器官。给药的其他模式还可以以粉末、喷雾的方式经皮吸收，经呼吸道吸入，以及本领域已知的其它形式。配方还可以口服，并可含有可用于在口服后防止肽被胃消化的载体，或本领域已知的任何其它载体(对于经皮吸收的载体，如脂质体)。
本文所用术语“杂合肽”是指含有插入具有上述序列的原始生物活性肽或其功能衍生物中的额外肽但仍保持基本类似的活性的肽。额外肽包括前导肽，其含有例如由一或多个原核或真核细胞识别作为将该杂合肽分泌至细胞外或细胞内的信号的氨基酸序列。分泌可以是直接分泌，或通过分泌小泡间接分泌。
这里所用的术语“基本上由……组成”是指这样的一种肽或多肽，其包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)以及在其羧基和/或氨基末端具有额外氨基酸的功能衍生物的肽的氨基酸序列，并且所述功能衍生物保持本文所提供的所述肽的活性。因此，作为非限定性实例，在该实例中包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物的肽的活性可治疗和/或预防细胞增殖或免疫失调或疾病，“基本由”包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物所组成的肽或多肽将具有本文提供的与该肽有关的治疗和/或预防失调或疾病的活性，并且不具有在其内部和其自身的(即在连接到生物活性分子而进行修饰前)实质上降低肽或多肽治疗或预防细胞增殖或免疫失调的能力或构成对该肽作为上述失调或疾病的治疗剂和/或预防剂这一基本新特征的实质改变的任何特征。因此，在前述实例中，其主要活性不是治疗和/或预防细胞增殖或免疫失调，并且在其中的某处包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成及其功能衍生物(但不包含CMS-010的序列)的全长天然存在的多肽将不构成这样的肽或多肽，该肽或多肽“基本由”所述包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物(其序列包含在全长天然存在的多肽中)组成。同样，在前述实例中，其主要活性不是治疗或预防细胞增殖或免疫失调，但在其中的某处含有包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成(但不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物的肽的氨基酸序列的基因工程化肽或多肽将不构成这样的肽或多肽，该肽或多肽“基本由”所述包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(但不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物(其序列包含在基因工程化肽或多肽中)组成。
通过使用本文提供的针对VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)肽的片段或衍生物的检测治疗或预防细胞增殖或免疫失调的分析来测定肽或多肽的活性，本领域技术人员可容易地确定肽或多肽是否符合前述定义的基本上由包含选自SEQID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物组成。
在优选的实施方案中，术语“基本上由…组成”也可以指包含选自SEQ IDNo.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物之外另外还有少于5个氨基酸残基的肽和多肽。在更优选的实施方案中，该术语是指除了包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物之外另外还有2个氨基酸残基的肽。在进一步优选的实施方案中，该术语是指除了包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物之外另外还有1个氨基酸残基的肽。
药物制剂可包括任何已知的药物载体。合适的载体的实例包括本领域技术人员已知的标准药学上可接受的任何载体。这些载体包括但不限于生理盐水、水、乳液(包括油水混合物或甘油三酸酯乳液)及其他类型的试剂、填料、包衣片剂和胶囊。可根据药物组合物的给药方式选择合适的载体。
选自包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物的肽可经静脉注射、肌肉内注射、腹膜内注射、皮下注射以及皮下植入给药。所述肽还可以任一口服给药形式如片剂、胶囊、悬液、溶液等，以未经修饰的常用形式或缓释形式或胃肠道保护或不保护形式给药。所述肽可进一步以任何局部应用的形式如软膏、乳液、凝胶等经过或不经过皮促进装置(transdermalfacilitating device)给药。所述肽也可以自身或者组合其它肽序列来翻译为其遗传序列并克隆进表达系统，以产生肽分子而利用本文所述肽的活性。
每种肽的剂量可以是1ng-10g/kg体重。注射用给药的优选的剂量可以是10ng-10mg/kg，更优选1μg-1mg/kg。然而，药物的起效剂量可以低至1ng/kg体重，这可通过一个或多个肽与受体结合诱导一系列正常机体反应而起效。或者，一个或多个肽直接诱导引起全系列反应。对于口服，给药剂量可以是1ng-10g/kg体重/天，优选0.1μg-1g/kg体重/天，更优选是1μg-10mg/天。
II.基因治疗及治疗方法 基于上述肽序列的基因疗法是通过设计编码这些肽之一的核酸序列而进行。核酸可化学合成并与启动子有效连接而克隆到表达载体内。表达载体随后以基因治疗的形式给予人体，以在人体细胞内表达。本文所采用的“基因载体”一词包括这些表达载体。可以用于基因治疗的载体包括腺相关病毒(Mizuno，M等(1998)，Jpn J Cancer Res 89，76-80)、LNSX载体(Miller，A.D.等(1993)Methods Enzymol 217，581-599)和慢病毒(Goldman，M.J.等(1997)Hum GeneTher 8，2261-2268)。
用于肽输送的其它载体包括可在宿主生物体中复制的生物中的编码所需肽的表达载体，该宿主生物体希望被给予该肽而不明显影响该宿主生物体的健康。例如，表达载体可以被转移至对希望被给予该肽的宿主生物体是非致病性的生物体中。在某些实施方案中，表达载体在一种对希望被给予该肽的宿主生物体的健康没有明显有害作用的细菌或真菌生物中以产生所需的肽。例如，编码所需的肽的表达载体可以是在如乳酸菌、大肠杆菌或酵母的生物体中产生所需的肽的表达载体。在一个实施方案中，表达载体在一种哺乳动物消化道中天然存在的微生物或哺乳动物消化道耐受的微生物中产生所需的肽。可以表达所需的肽的一些微生物物种包括但不限于乳杆菌菌种，如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)，食淀粉乳杆菌(L.amylovorus)，干酪乳杆菌(L.casei)，卷曲乳杆菌(L.crispatus)，鸡乳杆菌(L.gallinarum)，加氏乳杆菌(L.gasseri)，约氏乳杆菌(L.johnsonii)，类干酪乳杆菌(L.paracasei)，植物乳杆菌(L.plantarum)，路氏乳杆菌(L.reuteri)，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)等；双歧杆菌菌种，如青春双歧杆菌(B.adolescentis)，动物双歧杆菌(B.animalus)，双歧双歧杆菌(B.bifidum)，短双歧杆菌(B.breve)，婴儿双歧杆菌(B.infantis)，乳酸双歧杆菌(B.lactis)，长双歧杆菌(B.longum)等；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或屎肠球菌(Ent.facium)；菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)；大肠杆菌(Escherichiacoli)；费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)；或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或酵母益生菌(Saccharomyces boulardii)。
化学合成的或以其它方式包括但不限于将mRNA逆转录产生cDNA分子而产生的编码本发明肽的核酸序列被掺入表达载体中，以通过本领域已知的基因工程方法基因转移进所希望的宿主中。表达载体可以是DNA载体或RNA载体。例如，表达载体可以基于质粒或病毒遗传因子。表达载体可以是染色体外复制的载体或者整合进染色体的载体。
表达载体包括与编码本发明肽的核酸可操作地连接的启动子。启动子可以是可调控的启动子，如诱导型启动子或组成型启动子。在一些实施方案中，可以选择启动子以提供所需水平的肽表达。另外，如果需要，表达载体可以包括其它序列以促进肽的产生、呈递和/或分泌。在一些实施方案中，编码本发明肽的核酸与指导肽分泌的核酸序列可操作地连接。例如，编码本发明肽的核酸可以与编码信号肽的核酸序列可操作地连接。
在一些实施方案中，被工程化以编码本发明肽的表达载体可以是适于在组成哺乳动物正常消化道菌群的细菌菌种如乳杆菌菌种和枯草芽孢杆菌中表达本发明肽的表达载体。这种表达载体的例子可参见Casas的美国专利6,100,388和Bellini的美国专利5,728,571。这些文献以其全文引入本文作参考。应理解的是促进本发明肽在不损害希望给予该肽的宿主生物体的健康的生物体中的表达的任何表达载体均可使用。
在一些实施方案中，被工程化以编码本发明肽的表达载体可以是适于在被哺乳动物消化道耐受的酵母菌种如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或更优选地酵母益生菌(Saccaromyces boulardii)(其可在人消化道中寄居并用于治疗某些形式的腹泻)中表达本发明肽的表达载体。组成性表达异源蛋白和肽的酵母表达载体可以使用，因为其非常稳定，因此在有丝分裂和减数分裂过程中可以传递至子代，所述载体可包括指导重组蛋白高水平分泌的信号肽编码序列。这种酵母载体的例子参见Jang等的美国专利6,391,585，该文献引入本文作参考。
编码本发明肽的表达载体可以经本领域已知技术导入欲表达该肽的生物体中。这些技术包括转化细菌、酵母或其它微生物的传统方法，例如经使用化学感受态细菌细胞、电穿孔或乙酸锂转化(用于酵母)，以及用这些程序无效的一些细菌菌种的转化方法的最近进展。在一些实施方案中，表达载体用Leer等(WO95/35389)公开的方法导入已知不能转化的乳酸菌中(该文献引入本文作参考)。导入的序列可以掺入微生物染色体DNA中或保持染色体外DNA元件的形式。
含有表达载体的这一基因工程微生物随后可以接种消化道、阴道、气管等以实现持久的免疫治疗。在一些实施方案中，表达本发明肽的生物体以无活性形式摄入，或者优选地，以活性形式摄入。在消化道中，这些微生物产生所述肽，通过分泌或微生物的裂解将其释放进腔内，或以其它方式将肽呈递给宿主，由此肽产生其对宿主生物体的预期作用。在其它实施方案中，在鼻通道、阴道或小肠粘膜处将肽呈递给宿主生物体。
另一种治疗方法是使用脂质体作为输送特异核酸至人体细胞的方式。核酸(如含有编码包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽，其中，所述肽不包含CMS-010的序列，及其功能衍生物的核酸序列的表达载体)在有利于细胞吸收和染色体掺入的环境中被输送，如Gao，X.和Huang，L.(1995)，Gene Ther 2，710-722和美国专利6,207,456所述。或者，使用US6,245,427的方法，肽本身可包在脂质体中并直接输送。上述所有科学出版物和专利均引入本文作参考。
可用于上述基因治疗和治疗方法的核酸序列包括编码这些肽及其功能衍生物的序列。基于简并密码子系统，许多核酸序列中的任何一种均可用于编码这些肽及其衍生物。
下述参考文献引入本文作参考 1.新药(西药)临床前研究指导原则。中华人民共和国卫生部药政局。1993，7134_135 2.徐叔云，卞如濂，陈修主编。药理实验方法学。1991，1221-1234 3.新药(西药)临床前研究指导原则。中华人民共和国卫生部药政局。1993，7140 4.何金生，李瑞珠，宗庭益。MTT还原法检测NK细胞活性的方法学研究。中国免疫学杂志，1996；1(6)356-358 5.汪谦.现代医学实验方法。人民卫生出版社。1998，482-483 6.新药(西药)临床前研究指导原则。中华人民共和国卫生部药政局。1993，7141 7.新药(西药)临床前研究指导原则。中华人民共和国卫生部药政局。1993，7132-133 8.新药(西药)临床前研究指导原则。中华人民共和国卫生部药政局。1993，7128-129 9.章元沛，苏怀德.药理学实验(第二版).人民卫生出版社.1998，137-138 10.李家泰.临床药理学(第二版).人民卫生出版社.1998，1338-1339III.肽与包含SEQ ID No.2-31、基本由SEQ ID No.2-31组成或者由SEQ ID No.2-31组成的肽(其中，所述片段不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物的结合及配方 本发明的生物活性肽可与其它具生物学效应或作用的分子相结合，以提供额外的效果或作用，或者增强它们的治疗效力。许多可能的结合分子，它们的生物学作用以及与肽相结合的方法在本领域内是熟知的。对于其它候选的结合物而言，结合到肽的化学反应可由本领域的技术人员无需经过过度实验而推导出。效应分子(effective molecule)会在下文描述。具体的例子中描述了本发明的各种肽如何与它们的效应分子相结合，以及作为结果的结合产物的特性。可以理解的是，本发明的其它肽也可在类似的反应中被结合。
包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽片段(其中，所述肽片段不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物在特定的细胞或组织类型中具有独特的医疗效力。将分子结合到肽药物的一个重要目的是为了将肽定位于被治疗个体体内的特定位置或区室。在这种方式中，肽药物及其效应分子可被集中在细胞或组织类型的特定区域，在所述的特定区域中，药物具有预期的治疗效果。这样能增加相同摩尔数量的、游离的、非结合的肽可能具有的效果。相反地，被定位在其治疗活性位点的结合肽药物的剂量可以显著的低于为取得相同治疗效果所需要的、游离的、非结合形式药物的剂量。
将肽药物定位在最容易发挥其活性的位点的另一个有益效果在于，减少了不必要的副作用。给予的肽药物是为了在特定细胞或组织类型中实现一种变化，但是所给予的肽药物在个体体内也会在其它部位发挥作用，有时带来有害的结果。通过与一个定位分子结合而将肽定位在所需要的活性位点，可以减少在该个体中其它部位的所述肽的浓度以及带来的副作用。
包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物，为了定位到个体体内全身的不同部位，可与不同的分子相结合。下文所描述的将肽定位到所需位置的任何结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其他结合技术，可被应用于本发明的任意的肽。例如，文献公开了抗乙型肝炎的药物的选择性传递到肝细胞(Fiumeetal.，Ital J Gastroenterol Hepatol，29(3)275，1997，which is incorporated herein by reference in its entirety)。在该项研究中，研究者将单磷酸阿糖腺苷(ara-AMP)，一种抗乙型肝炎病毒活性的磷酸化核苷类似物，结合到乳糖胺化的人白蛋白，一种末端为半乳糖基的高分子。肝细胞表达一种能与末端的半乳糖残基起高亲和力反应的受体蛋白。通过结合在该受体上，结合药物能够被肝细胞选择性的吸收。吸收以后，结合药物被运输到溶酶体，在那儿，结合药物两种成分之间的连接被断开，以其活性形式释放ara-AMP。在上述所引用的研究中，结合药物在治疗慢性乙肝感染的病人时，与游离的ara-AMP具有同样的效果，但不会导致临床副作用，例如施用游离的ara-AMP所导致的神经毒性。这样的途径可用于本发明的任意的肽。
在与上述相关的一个研究中，同一个研究团队(Di Stefanoet al.，Biochem.Pharmacol.，61(4)459，2001)将一种抗癌的化学疗法试剂，5-氟-2脱氧尿苷(FUdR)，结合到乳糖胺化的聚L-赖氨酸(lactosaminated poly-L-lysine)上，以达到将化合物定位在肝以及治疗肝残留癌肿的微小转移。药物被肝细胞选择性吸收，并打断FUdR与定位分子之间的连接。然后，部分游离的FUdR脱离肝细胞，产生抗癌试剂的局部治疗浓度。这种浓度对于渗透到肝脏中的转移细胞的药理学活性是足够的。由于这种结合药物是选择性集中在肝脏中，因此其剂量与游离的、非结合化合物的最小药理学活性剂量相比，显著降低。这种策略可应用到本发明的任意的肽。例如，乳糖胺化的聚L-赖氨酸与包含选自SEQID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物的结合可以显著的减少为治疗或预防细胞增殖失调(包括肝组织)的必需的剂量。
将化合物定位在体内特定组织或细胞类型已成功应用于大量的不同组织或细胞类型中。例如，肿瘤细胞常常在其表面表达非正常高水平的肽激素受体，比如铃蟾肽(bombesin)、促黄体生成素释放激素及生长激素抑制素。在一项研究中，抗癌化合物太平洋紫杉醇(紫杉醇)通过与奥曲肽(一种生长激素抑制素类似物)相结合，被选择性定位到分泌激素的肿瘤细胞，这种肿瘤细胞高密度地表达生长激素抑制素受体。结合奥曲肽的紫杉醇与游离的紫杉醇具有相同的效果，但能减少对正常细胞的毒性(Huang et al.，Chem.Biol.，7(7)453，2000)。利用Huang等人的技术，将本发明的肽与肽激素受体拮抗剂的类似物相结合，可以构建一种治疗方案，特别是针对高水平表达那种特定肽激素受体的细胞。这种途径可适用于过量表达任何数量肽激素受体的靶细胞。在另一个将药物定位到特定组织类型的例子中，聚L-天门冬氨酸被用来作为一种载体分子，特异性地将药物定位运送到结肠细胞(Leopold et al.，J.Pharmacokinet.Biopharm.，23(4)397，1995)。
除了肽药物到特定细胞或组织类型的特异性定位以外，肽与载体分子的结合可以提供增强肽药物的运输的其它方式，从而增加或从另一方面改善它们的治疗效果，所述肽为包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物。下文描述的任一结合技术以及本领域技术人员所熟悉的其它技术，可被用于本发明的任意的肽。如果化合物不能被高效地运送到其目标位置，任何药物的效力都将会受到限制。药物必须在不存在由于新陈代谢过程或降解造成实质上的活性降低的情况下才能被积极地转运到其活性位点。肽药物受肽酶活性的支配，并且，作为高度极性分子，难于完成跨脂质细胞膜及内皮细胞的运输，例如血脑屏障。与其他分子的结合提供了一种保护肽避免降解，以及增强肽药物进入细胞或机体内区室的方式，而通常情况下，细胞或机体内区室会排斥该化合物。
通过允许肽进入到体内特定区域(而通常情况下，在这些区域中，肽会被排斥)，结合技术开启了给药的新途径。在Patel等，Bioconjugate Chem.，8(3)434，1997，研究者将一种已知作为有效止痛剂的肽药物，七肽δ啡肽，与一种有机分子相结合，该有机分子经过特殊设计以允许肽穿过血脑屏障，该文章中的化学过程在下文实施例5中进行了详细描述，并在此处作为参考全文引用。这样，药物可通过静脉给药，而不用通过脑室注射。
Patel等人研究中的载体分子被设计来特异性针对那些含有血脑屏障的内皮细胞，同时也允许肽穿越这些屏障。遍及全身的内皮细胞膜，包括血脑屏障，对于表达在其表面的膜结合肽链内切酶的序列特异性及浓度是不同的。分子的设计利用这种特性来使载体分子及其运载物的定位成为可能。该分子含有三条游离端标记了二肽Arg-Pro的脂肪酸链，其与血脑屏障的肽链内切酶优先结合。亲脂性的脂肪酸链使极性的肽药物分子的转运成为可能。从而，标记二肽的甘油三酸酯分子既可实现定位也可实现跨血脑屏障的转运。
结合方法也可增强肽药物活性的动力学。下文所描述的用于增强肽活性动力学的任何结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其它结合技术都可用于包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物。Patel等人发现止痛剂肽的结合形式不仅能够从血流中进入脑，而且与游离肽相比较具有持续作用。比之颅内注射游离肽的效果，静脉给药的药物需要更长时间来发挥治疗效果，但是效果的持续时间更长，减少得更慢。研究者们发现结合肽分子在血清中非常稳定，但注射入脑室中却无效果，显示出载体分子可能是在从血流转运到脑的过程中被降解和移除。他们猜测，转运结合物及降解载体分子所需要的时间是导致动力学改变的原因。不考虑延迟的机制，在临床应用中，结合肽分子的静脉稳定性、药物作用的发生和活性的延迟意味着它可以不用频繁地给药。更低的频率以及更方便的剂量方案增强了这种药物作为可选治疗方案的应用价值。
对于本领域技术人员显然的是，Patel等人的技术和过程可以容易的适用于任何落入到有限大小范围的肽的运送，包括本发明的任意的肽。例如，本发明的一种肽，其治疗和/或预防细胞增殖或免疫失调，例如VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)片段，能够与Patel等人所用的同样的分子相结合。在一个带有影响脑的感染的个体的治疗中，结合分子可允许VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)片段从血流中进入脑，并允许VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)片段在脑内的细胞或组织中发挥作用。该技术人员也熟知改变载体分子的定位的修饰。载体分子的定位特性是在脂肪酸链末端含有二肽修饰的两种氨基酸的特点的作用。Arg-Pro二肽与发现位于血脑屏障的内皮膜表面的一组膜结合肽链内切酶优先相互作用。其他的内皮细胞和膜可能通过其它二肽组合被定位。
研究者们也利用结合状态来制造可通过消化道或者透皮被有效吸收的肽药物。下文所描述的用于增强吸收的任何结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其它结合技术，都可被用来增强肽的吸收，所述肽为包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物。Kramer等人描述了一种将肽药物结合到胆汁酸的过程。化合物口服给药之后的结合分子的吸收速度与单独的肽相比显著增强(J.Biol.Chem.，269(14)10621，1994)。Toth等人(J.Med.Chem.，42(19)4010，1999)描述了将具有抗肿瘤特性的肽药物与脂氨基酸(LAA)或脂多糖(LS)的结合，目的是为了增加吸收速度以及增强抗癌肽到其活性位点的递送。在他们的研究中，生长激素抑制素的一种衍生物与LAA或LS中的任一个相结合，这种衍生物显示出很强的抗增殖特性，但具有削弱的药代动力学。得到的结合药物具有跨皮肤和消化道上皮的改善的吸收谱，增加了抗降解的能力，并依然具有抗肿瘤细胞活性。这些技术与本发明的任意的肽相结合后将非常有用。通过增加分子的跨肠道上皮细胞的吸收速度，更多的肽可被运送到血液中并发挥其对被治疗个体的作用。
结合也可被用来提供肽药物的持续的释放。用于提供持续释放的任何结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其他结合技术，都可用于提供肽的持续释放，所述肽为包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物。如上文Patel等人的工作中所看到的，肽药物的持续的递送可通过结合方法达到。另一个例子是Kim等人的工作(Biomaterials，232311，2002)，在他们的工作中，重组人表皮生长因子(rhEGF)在被装入生物可降解的聚乳酸聚甘醇酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)微球体胶囊以前，与聚乙二醇(PEG)相结合。装入PLGA微胶囊被好几个小组用于递送不同的生长因子和形态发生蛋白(Meinel等，J.Controlled Rel.，70193，2001)。与非结合的游离rhEGF相比较，通过与PEG结合，rhEGF可避免形成不溶于水的聚合体形式以及在与PLGA形成胶囊过程中吸附在水-有机相分界面。与游离的激素相比较，具有结合激素的配方所表现出的药代动力学得到改善，显示出更持久、更稳定，以及全面增强的药物活性，研究者们推测，这是由于与PEG结合的激素具有增强的生理稳定性。类似的策略可以应用来制备本发明的任意肽的持续释放的配方。例如，由下文实施例1可看出，VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)片段及衍生物显示出有效的抗增殖及免疫调节能力。通过将PEG结合到这种肽并将结合药物加入到PLGA微球体中，随着药物的剂量给药，以及随着它从PEG结合物中释放出来，VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)片段及衍生物的抗增殖及免疫调节能力可持续更长，更稳定，更一致，并且确保肽药物到感染位点的更持续的递送。
肽药物的延长释放可显著增强其活性。下文所描述的任何用于提供肽的延长释放的结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其它结合技术，都可用于提供肽的延长释放，所述肽为包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物。Oldham等人(Int.J.Oncology，16125，2000)比较了抗癌试剂太平洋紫杉醇与该药物的一种新形式，太平洋紫杉醇结合到聚L-谷氨酸(PG-TXL)。PG-TXL相比较游离的太平洋紫杉醇，显示出具有较高的抗癌活性，提示该药物具有较好的药代动力学特性或者甚至具有更优的作用方法。然而，研究人员发现PG-TXL通过与游离药物相同的作用机理来发挥作用，通过打乱微管亚单位的聚合来诱导细胞周期停滞。证据显示，与游离肽给药相比，结合药物的更好的抗癌活性来自于游离药物从结合物中的持续并稳定的释放，并更长时间地维持其治疗浓度。本发明的具有抗感染特性的肽，其所增加的聚L-谷氨酸尾端也能够增强那些特性。
在一些例子中，肽的酶降解可能会降低肽作为药物的效力。下文所描述的减少肽的酶降解的任何结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其它结合技术，可用于减少肽的酶降解，所述肽为包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物。研究者们已开发出很多方法来保护肽免受消化道中腔体分泌的蛋白酶以及结合到膜上的肽酶的降解。后者被发现位于所有粘膜组织的表面，而跨越粘膜组织经常是肽药物的进入路线。Bernkop-Schurch等人(J.DrugTarget.，755，1999)，报道了含有胃蛋白酶抑制剂的肽药物配方的构建。一种胃酶抑素的类似物共价结合在粘膜附着聚合体(mucoadhesive polymer)上；这种新的胃蛋白酶抑制剂包含在含有胰蛋白酶的药片中。在模拟消化过程的实验室条件下的培养之后，对照药片的所有的胰蛋白酶都被代谢，然而在含有这种抑制剂的药片中大约50％的胰蛋白酶被保护不受降解。在另一项研究中，同一个研究小组利用蛋白酶抑制剂在通常会导致毒副作用的剂量下来抑制生物活性肽的降解(Bernkop-Schnurch etal.，Adv.Drug Del.Rev.，52127，2001)。该方法利用壳聚糖，一种从壳质中提取的与纤维素相关的氨基多糖，在甲壳类和其他生物体中发现的一种主要的结构多糖。通过将蛋白酶抑制剂结合到壳聚糖，以及在肽药物配方中包括这种结合分子，发现消化道蛋白酶的显著的抑制，增加了肽的生物利用率，并且没有在给予游离的蛋白酶抑制剂时可预见的副作用。在该研究中，各种蛋白酶抑制剂被单独以及联合使用来与壳聚糖载体相结合。壳聚糖-EDTA结合物同样通过结合某些蛋白酶发挥活性所必需的无机辅助因子来抑制内源性蛋白酶。对于本领域技术人员显而易见的，载体分子与效应部分之间的大量的可能的组合可以被构建来为肽配方提供有益的特性，它们中的任何一种均可容易地适用于本发明的肽。利用连接在壳聚糖的蛋白酶抑制剂，通过构建肽的口服给药配方，本发明的肽的口服给药可被用来代替肌肉注射。这种方法并没有排除在配方中使用更容易被吸收的包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物的结合形式(在上文中论述)来构建这种肽及其衍生物的更高水平的生物利用度。
除了被另一个分子定位在特定区域，肽自身可作为定位分子。下文所描述的任何利用肽来将分子定位到所希望区域的结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其它定位技术，均可用于这样的肽，该肽为包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物。例如，研究者们已使用抗癌药物二氟甲基鸟氨酸(DFMO)，并为了定位将其结合到肽上。DFMO是一种高效的细胞毒素试剂，它可有效地杀伤多种类型的癌细胞。然而，由于它会很快地从体内被清除，它的治疗价值受到限制。在该项研究中，将DFMO结合到α促黑细胞激素的一个特殊片段或含有两种氨基酸取代基的类似片段，其显示出能优先结合到人类黑素瘤细胞系上的促黑细胞激素受体(Suli-Vargha et al.，J.Pharm.Sci.，86997，1997)。为使DFMO从肽片断中通过氨基肽酶方便释放，药物被结合到肽的N末端。研究者们发现结合药物在杀伤黑素瘤细胞时比单独的非结合药物更有效。
本发明的肽的作用可部分的归因于肽自身的内在的定位能力。例如，与α促黑细胞激素片段类似，本发明的一种特定的肽可联结到某一受体，该受体被发现位于一种独特类型细胞的表面。通过使用该肽作为结合体，药物可被定位在用该药物治疗的个体体内的那些细胞的特定区域。
作为结合物的肽可发挥除定位以外的其它功能。下文所描述的任何提高肽的治疗效果的结合技术，以及本领域技术人员所熟知的其他结合技术，均可用于增强肽的治疗效果，所述肽为包含选自SEQ ID No.2-31的序列、基本由所述序列组成或者由所述序列组成的肽(其中，所述肽不包含CMS-010的序列)及其功能衍生物。Fitzpatrick等人通过在两个分子之间使用肽间隔(spacer)，改进了结合抗癌试剂(Anticancer Drug Design，101，1995)。已将甲氨蝶呤与人血清蛋白(HSA)相结合，来增加被肿瘤细胞吸收以及抗肿瘤细胞的能力。一旦被细胞吸收，一些甲氨蝶呤被溶酶体中的酶从结合物中释放，并可发挥其细胞毒素作用。通过在甲氨蝶呤与容易被溶酶体酶消化的HAS之间插入一个四氨基酸的连接(linker)肽，增加了细胞内由结合分子产生的活性甲氨蝶呤的数量。本发明的肽可通过与特殊的酶的特异性相互作用来发挥它们的作用。通过在结合分子内掺入本发明的一种肽作为药物与其载体分子之间的连接片段，或者增加另一个连接片段，药物动力学可被改变。这能够构建一种对蛋白酶的活性更具抗性或更敏感，并且随后降低或提高药物分子从结合物中的释放速度的前体药物。就像上文中结合的化学治疗试剂的例子那样，药物分子递送速度的改变可大大增强药物的作用效果。
药物对于一个特定细胞的作用可根据其它因素而被改变，例如细胞的活化状态，或者细胞周围或细胞内其它分子信号的存在情况。在一些实例中，为了药物能够发挥作用，另一个分子或信号必须存在。Damjancic等人(Exp.Clin.Endocrin.，95315，1990)研究了人心房钠尿肽(hANP)对患者内源糖皮质激素合成缺陷的影响。肽在糖皮质激素治疗的停药期间或随后使用地塞米松进行继续治疗期间给予患者。患者只有在伴随的地塞米松治疗期间给予肽激素时，才对hANP起反应并且增加利尿与钠排泄。在糖皮质激素治疗的停药期间用hANP处理无效果。协同给予类固醇激素的作用也能增强肽的活性。在Zhu等人的报道中(Acta Pharm.Sinica，28166，1993)，止痛剂肽京都啡肽(kyotorphin，简称KTP)经由一个短连接片段结合到氢化可的松，其活性与单独肽的活性相比较显著增强。单独给予氢化可的松无效果。
这些研究的结果表明，类固醇激素作为结合分子的能力或者作为配方中的成分可实现或增强生物活性肽的活性。本发明的任意的肽也可通过与类固醇激素结合或共同应用被调节或活化。Zhu等人的技术可容易的适用于类固醇分子与本发明的肽的结合。图1至5也提供了连接类固醇激素到本发明的任意的肽的逐步合成反应示例。
上述所举的例子提供了增加本发明的任意的肽的有效性及活性的典型方式。在这一领域中进一步的发展将有助于克服障碍来构建基于肽的有效的临床治疗。对于本领域技术人员显然的，开发用于肽生物化学、制药研究及临床检测的技术、试剂以及实验规程，都可容易地应用于本发明的任意的肽。实施例 背景 预料在VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)序列当中，对于生物活性来说某些氨基酸比其他氨基酸更重要。在本发明的某些实施方案中，通过找出VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)当中的一个/多个活性部分，可将序列中对肽活性没有贡献的氨基酸除去，以使生物活性分子可变得更短。还可将肽的不同活性部分进行重组，以获得具有改进的生物活性的新肽分子。生物活性肽分子的缩短同时具有生物学意义和经济意义。通过获得更短的序列，肽的生物特性得以修饰，而这种修饰可能具有潜在的治疗益处，如改进的生物半衰期、受体亲和性或副作用大小。更短的肽还可更廉价地生产，从而可降低生产成本。
为确定VAPEEHPTLLTEAPLNPK(CMS-010)当中的活性部分，我们进行了一系列的截断实验。CMS-010在从氨基末端到羧基末端的每个肽键都进行了截断。我们预料如果活性部分被截断，所得的一对肽的生物活性将降低、消失或以某种方式被改变(生物活性被激活/失活)。在找出了CMS-010当中的一个/多个活性部分后，可通过将不同的活性部分组合来构建新的一组肽。
在我们的实验中，有一组截断或重组肽经鉴定其具有的生物活性具有潜在的人类治疗或生物学用途。这组肽在下表1中给出。我们的研究于表1之后的实施例中进行介绍。
表1基于CMS-010序列的截断或重组肽实施例1肽对ConA体外诱导的小鼠T淋巴细胞转化的影响 1.1材料 1.1.1肽 所有涉及的氨基酸均为L型美国CS Bio Co. 1.1.2对照样品和其他试剂 生理盐水中国大冢制药有限公司 RPMI-1640培养基和胎牛血清(FBS)美国Gibcol Co. MTT和ConA美国Sigma Co. 1.2动物 BALB/c小鼠(H-2d，SPF，6-8周龄，体重18-22g)中国军事医学科学院1.3方法[1] 无菌分离健康小鼠的脾脏，用注射针手工分散于10％FBS RPMI-1640溶液中。使用100目直径150μm的不锈钢滤网进一步过滤分散的细胞悬液。将脾细胞悬液调整至4×106/ml的密度，以100μl/孔等分分配到96孔细胞培养板上。将肽溶于普通RPMI-1640中。分组设计如下所示。
肽组100μl肽工作液+75μl脾细胞悬液+25μl ConA工作液。
ConA对照组100μl RPMI-1640+75μl脾细胞悬液+25μl ConA工作液。
阴性对照组125μl RPMI-1640+75μl脾细胞悬液。
各孔中ConA的终浓度为5μg/ml。各孔中肽的终浓度分别为80μg/ml、16μg/ml、3.2μg/ml、0.64μg/ml和0.128μg/ml。各肽组包括三个平行孔，对照组包括八个或十二个孔。将细胞在37℃、5％CO2下培育68小时。用MTT方法，在酶标仪上以630nm为参照获得各孔的OD570nm读数。
1.4结果 表2.肽对ConA体外诱导的小鼠T淋巴细胞转化的影响 *与ConA阳性对照组相比，P＜0.05 表3.肽对ConA体外诱导的小鼠T淋巴细胞转化的影响 *与ConA阳性对照组相比，P＜0.05 1.5结论 发现CMS-010.26、CMS-010.32和CMS-010.105在合适的浓度下能够抑制ConA体外诱导的小鼠T淋巴细胞转化，与ConA阳性对照相比具有统计学显著性(P＜0.05)。
实施例2 肽对小鼠体内T淋巴细胞转化和NK细胞活性的影响 2.1材料 2.1.1肽 所有涉及的氨基酸均为L型美国CS Bio Co. 2.1.2对照样品和其他试剂 环胞菌素A瑞士Novartis Pharma AG 生理盐水中国大冢制药有限公司 RPMI-1640培养基和胎牛血清(FBS)美国Gibcol Co. MTT和ConA美国Sigma Co. 2.1.3动物 BALB/c小鼠(H-2d，SPF，6-8周龄，体重18-22g，50％雌性和50％雄性)中国军事医学科学院 2.2方法 2.2.1动物分组和给药 将动物随机分到两个肽组(200μg/kg/天和50μg/kg/天)，一个环胞菌素A组(10mg/kg/天)和一个生理盐水组(0.5ml/天)。每一组包括10只小鼠，其中一半是雌性，一半是雄性。所有的试验物质均溶于0.5ml生理盐水中进行腹膜内给药，每天一次，连续20天。在最后一次注射后的紧接一天检测T淋巴细胞转化和NK细胞活性。
2.2.2T淋巴细胞转化[1-2] 最后一次给予试验物质的后一天，通过颈椎脱臼处死小鼠。无菌分离健康小鼠的脾脏，用注射针手工分散于10％FBS RPMI-1640溶液中。使用100目直径150μm的不锈钢滤网进一步过滤分散的细胞悬液，并调整至4×106/ml。采取以下设计将细胞悬液以100μl/孔接种在96孔细胞培养板上。
试验孔100μl细胞悬液+100μl ConA 对照孔100μl细胞悬液+100μl RPMI-1640 对每只动物设置四个试验孔和四个对照孔。将细胞培养板在37℃、5％CO2下温育68小时。然后加入MTT，用酶标仪以630nm为参照读取细胞培养板的OD 570nm。刺激指数SI(％)＝(试验孔OD/对照孔OD)×100％。
2.2.3肽对NK细胞活性的影响[3-5] 使YAC-1靶细胞生长至对数期，并调整至1×105/ml的密度。将以上2.2.2节制备的小鼠脾细胞调整至4×106/ml的密度，用作效应细胞。如下将细胞悬液接种到96孔细胞培养板上 效应细孔100μl脾细胞悬液+100μRPMI-1640 试验孔100μl脾细胞悬液+100μl YAC-1细胞悬液 靶细胞孔100μl YAC-1细胞悬液+100μl RPMI-1640 对每只动物设置三个试验孔和三个效应细胞孔，每张细胞培养板设置12个靶细胞孔。将细胞培养板在37℃、5％CO2下温育4小时，然后加入MTT，用酶标仪以630nm为参照读取细胞培养板的OD 570nm。NK细胞活性(％)＝1-[(试验孔OD-效应细胞孔OD)/靶细胞孔OD]×100％ 2.3结果 2.3.1T淋巴细胞转化实验 表4.肽对小鼠T淋巴细胞转化的影响(1) **与生理盐水组相比，P＜0.01 表5.肽对小鼠T淋巴细胞转化的影响(2) *与生理盐水组相比，P＜0.05 表6.肽对小鼠T淋巴细胞转化的影响(3) **与生理盐水组相比，P＜0.01 表7.肽对小鼠T淋巴细胞转化的影响(4) **与生理盐水组相比，P＜0.01 2.3.2NK细胞活性实验 表8.肽对小鼠NK细胞活性的影响(1) *与生理盐水组相比，P＜0.05 **与生理盐水组相比，P＜0.01 表9.肽对小鼠NK细胞活性的影响(2) *与生理盐水组相比，P＜0.05 **与生理盐水组相比，P＜0.01 2.4结论 发现CMS-010.04、CMS-010.12、CMS-010.14、CMS-010.24、CMS-010.25，CMS-010.26和CMS-010.28在合适的剂量下抑制小鼠体内T淋巴细胞转化，与生理盐水对照相比具有统计学显著性(P＜0.05)。
发现CMS-010.24、CMS-010.26和CMS-010.28在合适的剂量下抑制小鼠体内NK细胞活性，与生理盐水对照相比具有统计学显著性(P＜0.05)。
发现CMS-010.11、CMS-010.13和CMS-010.14在合适的剂量下增强小鼠体内NK细胞活性，与生理盐水对照相比具有统计学显著性(P＜0.05)。 实施例3 肽对小鼠体内抗体形成的影响 3.1材料 3.1.1肽 所有涉及的氨基酸均为L型美国CS Bio Co. 3.1.2对照样品和其他试剂 环胞菌素A瑞士Novartis Pharma AG. 生理盐水中国大冢制药有限公司 3.1.3动物 BALB/c小鼠(H-2d，SPF，6-8周龄，体重18-22g，50％雌性和50％雄性)中国军事医学科学院 3.2方法 3.2.1动物分组和试验物质给药 将小鼠随机分成三个组肽组(200μg/kg/天)、环胞菌素A组(10mg/kg/天)和生理盐水组(0.5ml)。每组包括12只小鼠，其中6只为雌性，6只为雄性。
将试验物质溶于0.5ml生理盐水中，腹膜内给药，每天一次，连续20天。
3.2.2抗体产生和定量[7] 用生理盐水将绵羊红细胞(SRBC)重悬至2％(v/v)，在给予试验物质的第16天，每只小鼠腹膜内给予0.2ml重悬细胞溶液。在最后一次给予试验物质的后一天，从内眦收集血液，在室温下放置一小时，以使血清渗出。在200g下离心10分钟后，用生理盐水将血清稀释200倍。
为制备补体工作液，将10体积的新鲜豚鼠血清加入到1体积的离心机离心沉淀的SRBC中。在4℃下轻轻振摇此混合物30分钟。然后在200g下离心10分钟除去SRBC。将10体积的生理盐水加入到上清液中，获得补体工作液。
为测定小鼠抗体滴度，将0.2ml 1％SRBC悬液加入到1ml来自每只小鼠的稀释的用冰预冷的小鼠血清中。然后加入1ml补体工作液，混合物在37℃下温育20分钟。通过将各样品在冰上冷冻10分钟终止反应。然后在200g下离心样品10分钟，获得上清液。向1ml的此上清液中，加入3ml Drabkin溶液，在室温下放置10分钟，然后测量OD540nm。严格按照与样品一样的程序，测定参比裂解-50的OD540nm读数，例外的是用生理盐水代替一半的SRBC，且不经离心除去未裂解的SRBC。样品血清指数(HC50)＝样品的OD540nm/裂解-50的OD540nm×200 3.3结果 表10.肽对小鼠抗体形成的影响 *与生理盐水组相比，P＜0.05 3.4结论 发现CMS 010.26在合适的剂量下抑制小鼠体内抗体形成，与生理盐水对照组相比具有统计学显著性(P＜0.05)。
实施例4 肽对移植到KM小鼠中的S180肉瘤细胞体内生长速率的影响 4.1材料 4.1.1肽 所有涉及的氨基酸均为L型美国CS Bio Co. 4.1.2对照样品和其他试剂 生理盐水中国大冢制药有限公司 阿霉素中国浙江海正药业股份有限公司 4.1.3动物 健康雌性KM小鼠(SPF，6-8周龄，体重18-22g)中国军事医学科学院 4.2方法 4.2.1动物分组、试验物质给药和肿瘤细胞移植[8] 将S180肉瘤细胞腹膜内移植到KM小鼠中6-8天，在无菌条件下收集腹水。用10％FBS RPMI-1640将细胞浓度调整到1×10/ml，每只KM小鼠通过腋窝注 射0.2ml细胞悬液，以建立荷肉瘤小鼠模型。将移植了S180肉瘤细胞的小鼠随机分成五组肽组(两组50μg/kg/天和10μg/kg/天)、阿霉素组(2mg/kg/天)、环磷酰胺组(40mg/kg/天)和生理盐水组(0.5ml/天)。在肿瘤移植后的紧接一天开始腹膜内注射试验物质，并连续20天每天持续注射一次。
4.2.2肉瘤发展的测定 最后一次给予试验物质的后一天，从小鼠中取出肉瘤并称重。通过游标卡尺在三个位面(A，B，C)上测量每个肉瘤的直径。用以下公式计算肉瘤的体积V＝(1/6)πABC。用以下公式计算肿瘤生长抑制指数肿瘤生长抑制指数＝(对照组的肿瘤重量-处理组的肿瘤重量)/对照组的肿瘤重量×100％ 4.3结果 表11.肽对移植到小鼠中的S180肉瘤细胞体内发展的影响(1) *与生理盐水组相比，P＜0.05 表12.肽对移植到小鼠中的S180肉瘤细胞体内发展的影响(2) *与生理盐水组相比，P＜0.05 @与环磷酰胺组组相比，P＜0.05 4.4结论 发现CMS-010.103、CMS-010.02、CMS-010.03、CMS-010.04、CMS-010.05、CMS-010.07、CMS-010.08、CMS-010.09、CMS-010.11、CMS-010.13、CMS-010.14、CMS-010.15、CMS-010.16、CMS-010.17、CMS-010.18、CMS-010.19、CMS-010.20、CMS-010.21、CMS-010.22、CMS-010.23、CMS-010.24、CMS-010.25、CMS-010.27、CMS-010.29、CMS-010.31和CMS-010.32在适当剂量下，抑制移植到KM小鼠中的S180肉瘤细胞的体内发展，与生理盐水对照组相比具有统计学显著性(P＜0.05)。
实施例5肽对兔马杉肾炎的影响 5.1材料 5.1.1肽 所有涉及的氨基酸均为L型美国CS Bio Co. 5.1.2对照样品和其他试剂 地塞米松磷酸钠注射液中国天津金耀氨基酸有限公司 生理盐水中国大冢制药有限公司 卡介苗中国北京生物制品研究所 羊毛脂中国天津第六化工厂 液体石蜡中国天津第六化工厂 血清BUN的诊断试剂美国BECKMAN 443350 血清肌酸酐的诊断试剂美国BECKMAN 443340 5.1.3动物 一只雄性绵羊(8月龄)中国天津医科大学实验动物科学部 兔(MDA，雄性，2-2.5kg)中国北京富豪育种农场 5.2方法[9-10] 5.2.1绵羊抗兔肾皮质抗血清的制备 5.2.1.1兔肾皮质抗原的制备 用4ml/kg 25％尿烷通过耳静脉注射麻醉健康兔，并静脉注射1250U/kg肝素进行全身肝素化。在无菌条件下剖开兔腹部，暴露肾动脉和静脉。将导管插入肾动脉，切断肾静脉。用生理盐水灌洗肾脏，直到肾组织变为灰色。然后切除肾脏。分离肾皮质，在0.5体积冰预冷的生理盐水中使成均浆，然后在-20℃下保存。
5.2.1.2绵羊抗血清的制备 将7.5ml肾皮质均浆与2.5ml弗氏完全佐剂(羊毛脂与液体石蜡之比为1∶5，含5mg/ml卡介苗)混合。完全乳化后，将抗原注射到绵羊背部的五个不同位置，每个位置1ml，每两周注射一次，共进行三轮注射。从第四次免疫开始，用1体积的生理盐水使5g肾皮质成均浆，肌内注射到绵羊上的五个位置，每个位置1ml，每两周注射一次。每两周通过双向免疫扩散检测绵羊抗兔肾皮质抗体滴度。当滴度达到1∶32时，从颈动脉收集绵羊抗血清。将绵羊抗血清与等体积的兔红细胞混合，置于4℃下12小时，以除去抗兔红细胞抗体。然后离心收集抗血清，置于56℃下，以使补体和蛋白酶失活。将抗血清在-20℃下保存。
5.2.2动物分组、试验物质给药和马杉肾炎模型建立 将22只健康兔随机分成5组肽组(107.3μg/kg/天和58.5μg/kg/天，每组4只)、地塞米松组(0.1mg/kg/天，4只)、生理盐水处理组(1ml/天，7只)和正常健康组(3只)。在兔中建立疾病状态前，在24小时当中对每只兔测量血清BUN、肌酸酐和尿蛋白。在这些测量中如不出现异常，则通过耳静脉注射绵羊抗兔肾皮质抗血清，每次注射0.5ml，每30分钟注射一次，每只兔共注射4次，以在实验兔中建立马杉肾炎模型。正常健康(对照)兔组用生理盐水按相同方式注射。在注射抗血清的后一天，通过耳静脉注射给予试验物质，每天一次，每次注射1ml，连续进行30天。
5.2.3治疗效果检测 5.2.3.1尿蛋白的定量 每周一次在24小时当中从每只兔中收集尿液，通过磺基水杨酸方法测定蛋白质含量。
5.2.3.2病理学检查 为观察肽对从马杉肾炎兔清除绵羊抗兔肾皮质IgG抗体的影响，在最后一次给予试验物质的后一天，通过窒息将兔处死，切除右肾，冷冻切片，然后进行免疫荧光染色，以确定绵羊IgG的存在。计算每个肾小球的荧光阳性面积。每只兔检查三十个肾小球，计算每个肾小球的平均阳性面积。
5.2.3.3统计 统计学显著性通过SPSS软件的t测验来确定。
5.3结果 表13.肽对马杉肾炎兔的蛋白尿(mg/dl)的影响 *与生理盐水处理组相比，P＜0.05 表14.肽对从马杉肾炎兔清除绵羊抗兔肾皮质IgG抗体的影响 **与生理盐水处理组比较，P＜0.01 5.4结论 发现CMS-010.26能够降低蛋白尿的严重程度，促进从马杉肾炎兔体内清除绵羊抗兔肾皮质IgG抗体，与生理盐水处理对照组相比具有统计学显著性(P＜0.05)。
实施例6 肽对Heymann肾炎大鼠体内的影响 6.1材料 6.1.1肽 所有涉及的氨基酸均为L型美国CS Bio Co. 6.1.2对照样品和其他试剂 地塞米松磷酸钠注射液中国天津金耀氨基酸有限公司 生理盐水中国大冢制药有限公司 卡介苗中国北京生物制品研究所 羊毛脂中国天津第六化工厂 液体石蜡中国天津第六化工厂 血清BUN的诊断试剂美国BECKMAN 443350 血清肌酸酐的诊断试剂美国BECKMAN 443340 6.1.3动物 Wistar大鼠(SPF，6-8周龄，重量150-200g)中国北京维通利华实验动物技术有限公司 6.2方法[11-12] 6.2.1大鼠肾均浆的制备 在无菌条件下剖开健康Wister大鼠腹部。暴露门静脉和下腔静脉。将导管插入门静脉，切断下腔静脉。用生理盐水灌洗肾脏，直到肾组织变为灰色。切除肾脏，分离肾皮质。然后在冰上使肾皮质成均浆，在-20℃下保存。
6.2.2大鼠肾皮质抗原的制备 将羊毛脂与液体石蜡以1∶2v/v的比例混合，振摇下加热至70℃，然后高压灭菌。将充足的卡介苗加入到羊毛脂/石蜡混合物中，产生3mg/ml的疫苗浓度，以形成弗氏完全佐剂。将肾皮质均浆、弗氏完全佐剂和生理盐水以1∶1∶2的比例研捣混合，直到完全乳化。
6.2.3动物分组和模型建立 将20只健康Wistar大鼠随机分成两组肽组(200μg/kg/天)和生理盐水处理组(2ml/天)。每只大鼠腹膜内注射2ml抗原，每两周注射一次，共5轮注射。在第三次免疫的后一天开始通过腹膜内注射给予试验物质，每天一次，直到实验结束。
6.2.4功效检测 6.2.4.1尿蛋白的定量 尿蛋白的定量在模型建立的第三周开始。每两周一次在24小时当中从每只大鼠收集尿样，通过磺基水杨酸方法定量尿蛋白含量 6.2.5统计 样品值用SPSS软件通过t测验进行比较。
6.3结果 表15.给予的肽对Heymann肾炎大鼠的24小时尿蛋白浓度(mg/dl)的影响 *: 与生理盐水组相比，P＜0.05 6.4结论 发现CMS-010.26在合适的剂量下降低Heymann肾炎大鼠体内蛋白尿的严重程度，与生理盐水处理组相比具有统计学显著性(P＜0.05)。
实施例1-6的参考文献 1.徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学.人民卫生出版社.2002，11426-1428 2.新药(西药)临床前研究指导原则，中华人民共和国.1993，7134-135 3.徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学.人民卫生出版社.2002，11429 4.何金生，李瑞珠，宗庭益.MTT还原法检测NK细胞活性的方法学研究.中国免疫学杂志.1996，1(6)356-358 5.新药(西药)临床前研究指导原则，中华人民共和国.1993，7128-129 6.章元沛，苏怀德.药理学实验(第二版).人民卫生出版社.1998，137-138 7.徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学.人民卫生出版社.2002，11429 8.新药(西药)临床前研究指导原则，中华人民共和国.1993，7137-139 9.新药(西药)临床前研究指导原则，中华人民共和国.1993，796 10.徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学.人民卫生出版社.2002，11227-1228 11.新药(西药)临床前研究指导原则，中华人民共和国.1993，797 12.徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学.人民卫生出版社.2002，11227 实施例7 经基因工程乳杆菌菌种输送肽 以下提供了将本发明肽输送至如上所述宿主中的一个举例方法。编码选自CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)的肽及其功能衍生物的DNA序列经化学方法合成，并用本领域技术人员熟知的标准基因工程技术将这一DNA序列导入一表达载体中。所选的表达载体含有在乳杆菌中有功能的组成型启动子，一个用于以特异的5’至3’方向异入DNA序列的多克隆位点，以及一个赋予对抗生素的抗性的选择标记基因(以辅助克隆程序)，并且还可含有有助于肽的产生和/或分泌的其它序列，如信号肽序列。这种载体的一个例子参见Pavla的美国专利5,592,908，其引入本文作参考。简要地，该专利讨论了在乳杆菌菌种中有功能的若干已知启动子，以及在所述细菌中发现新启动子的方法，这些启动子的任一种均可与编码本发明肽的核酸可操作地连接以在乳杆菌中表达所述肽。编码信号肽如美国专利5,592,908所述的在乳酸乳杆菌中有活性的由16-35个多数为疏水的氨基酸组成的肽的核酸被插入启动子和编码本发明肽的核酸之间，从而编码信号肽的核酸与编码本发明肽的核酸同框。
除了肽的编码序列之外，合成的DNA序列还可包括有助于将所述DNA连接并克隆进表达载体的序列。例如，与在所述载体多克隆位点中发现的识别位点相应的限制酶识别位点可以掺入合成的DNA序列的5’和3’末端，从而所述序列可以正确方向克隆进载体中。载体和合成DNA用特定限制酶消化，然后纯化。载体和合成DNA连接反应后转化进大肠杆菌合适菌株中。转化的细菌在含有载体赋予抗性的抗生素的培养基上铺板。选择转化细菌的菌落进行生长培养和质粒制备，证实存在正确方向的合成DNA。
然后将表达载体转化进乳杆菌菌种如嗜酸乳杆菌的细菌宿主细胞中。通过载体序列中的选择标记选择转化的细胞，肽的分泌可通过进行Western印迹、进行存在于培养基中的肽的凝胶电泳和其它标准技术证实。选择细菌转化菌落并用于制备基因工程菌的大规模培养物。培养表达所需肽的基因工程菌的培养物并将其至少一部分给予宿主生物体的消化道、阴道、气管或该细菌可在其中复制的其它区域。如果需要，可以各种方式处理细菌培养物以产生由宿主肠道吸收的补剂。这些处理包括冻干或其它保存细菌的方法，另外可将细菌与载体试剂如溶液、溶剂、分散介质、缓释剂、乳液等组合。这些试剂制备补剂的用途是本领域熟知的。例如，细菌可用于制备酸奶产品或其它食品供人类消费，从而表达肽的微生物寄居在人消化道中。将乳酸菌的特殊菌株掺入食品如酸奶、泡菜、乳酪和奶油的各种不同方法参见美国专利6,036,952，其引入本文作参考。通过任一种途径摄入细菌后，工程菌可寄居在消化道中使得经消化道的粘膜层呈递和/或吸收本发明肽。
实施例8 经基因工程形式的枯草芽孢杆菌输送肽 以下提供了将本发明肽输送至如上所述宿主中的一个举例方法。编码选自CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)的肽及其功能衍生物的DNA序列经化学方法合成，并用本领域技术人员熟知的标准基因工程技术将这一DNA序列导入一表达载体中。所选的表达载体包括穿梭载体，如pTZ18R(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中均能繁殖并含有抗生素抗性基因以选择转化菌落。这一载体可以含有在枯草芽孢杆菌中有活性的启动子，如衍生自枯草芽孢杆菌SacB基因的启动子，以及编码在枯草芽孢杆菌中有活性的信号或前导肽的核苷酸序列，该信号或前导肽指导表达的异源蛋白从细菌细胞中有效输出。这种载体的一个例子参见Fahnestock的美国专利6,268,169，其引入本文作参考。简要地,如上所述,以本领域熟知的技术合成具有限制酶位点和/或促进DNA克隆的其它序列的编码本发明肽的DNA。在转化进大肠杆菌、铺板、选择和繁殖质粒产生质粒原液后，将质粒转化进枯草芽孢杆菌，并根据对铺板培养基中的抗生素的抗性选择转化子。
在遗传工程化的枯草芽孢杆菌中产生及从中分泌的肽使用本领域熟知的技术验证，如在SDS-PAGE分析或Western印迹之后，将肽放射标记以进行放射自显影检测。
培养表达所需肽的基因工程菌的培养物并将其至少一部分给予宿主生物体的消化道、阴道、气管或该细菌可在其中复制的其它区域。
实施例9 经基因工程糖酵母菌种输送肽 以下提供了将本发明肽输送至如上所述宿主中的一个举例方法。编码选自CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)的肽及其功能衍生物的DNA序列经化学方法合成，并用本领域技术人员熟知的标准基因工程技术将这一DNA序列导入一表达载体中。所选的表达载体包括一稳定维持的酵母蛋白表达载体，包括组成型酵母启动子如pADH1，使载体在酵母和大肠杆菌中均能复制的位点，赋予营养缺陷型酵母突变体以原养型的用于选择目的的一个或多个基因，多克隆位点(MCS)，以及如果需要的编码信号肽的序列。这种载体是市售的并是本领域熟知的或者可用标准技术构建。在将合成DNA插入酵母载体、转化进大肠杆菌、在选择培养基上铺板转化的大肠杆菌、选择转化的细菌菌落并从所述菌落的细菌培养物中制备质粒DNA后，将载体经熟知技术如乙酸锂转化或电穿孔转化进酿酒酵母。选择用于转化的酿酒酵母菌株是突变的营养缺陷型菌株，其需要质粒上的一种基因以在基本培养基上生长。通过将酵母在缺少该载体上提供的基因的培养基上铺板而选择转化的酵母菌落。只有接受的载体及其选择基因并表达该基因产物的酵母可在基本培养基上生长成菌落。通过进行Western印迹、存在于培养基中的肽的凝胶电泳或其它标准技术可以证实肽的表达。
选择酵母转化菌落并用于制备大规模培养物。培养表达所需肽的基因工程酵母的培养物并将其至少一部分给予宿主生物体的消化道、阴道、气管或该酵母可在其中复制的其它区域。如果需要，可以各种方式处理酵母培养物以产生由宿主肠道吸收的补剂。这些处理包括冻干或其它保存酵母的方法，另外可将酵母与载体试剂如溶液、溶剂、分散介质、缓释剂、乳液等组合。这些试剂制备补剂的用途是本领域熟知的。在另一实施方案中，转化的酵母可用本领域已知技术制备食品如发酵奶制品如酸奶和酸乳酒。与这些食品中的活乳酸菌培养物一样，转化的酵母至少短时寄居在消化道中，并经消化道腔将肽提供给宿主。
实施例10 将肽定位到特定的区域 下文提供了一种选择性地将本发明的肽递送到特定区室、器官、细胞类型或体内特定区域的示范方法。在这一例子中，通过将选自CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)的肽及其功能衍生物定位到个体的肾脏内组织来治疗细胞增殖失调。例如，CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)及其功能衍生物经由本领域所公知的化学反应通过共价键与低分子量(LMW)溶菌酶——一种特异地集中在肾脏组织的可通过商业途径获得的蛋白部分——相连。实现分子与LMW溶菌酶结合的技术已有文献公开(Folgert等，Br.J.Pharmcology，1361107，2002)。将蛋白或肽与另一种蛋白质或肽相结合的一般技术在所属领域的文献中也已公开(Fischer等，Bioconj.Chem.，12825，2001)。然后，新构建的结合肽样品通过层析方法如阳离子交换FPLC和/或梯度离心法从连接过程中所使用的化学试剂中被纯化。一旦被纯化，该结合肽给予需要治疗肾脏细胞增殖失调的个体。对于抗增殖活性，依靠CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)及其功能衍生物与LMW溶菌酶之间的连接，其会被选择性集中在肾脏组织中(依靠LMW溶菌酶对于肾的近端小管细胞的亲和力)，CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)及其功能衍生物被优先定位到肾脏组织。与相同摩尔数量的CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)及其功能衍生物自身相比较，这种优先递送形成更强的抗增殖作用。相反地，这能减少为达到抗增殖活性的某一水平的肽药物的量。
实施例11 增强肽到其活性位点的递送 下文提供了一种增强神经活性肽递送到脑的典型的方法。通过本领域技术人员所熟知的化学方法合成本发明的一种肽，其在由脑的神经细胞所表达的受体上发挥作用。或者，它也可由工程微生物表达并从这些生物体的培养物中回收得到，如上文实施例中所描述的那样。一旦以纯化的形式获得，这种肽被用于一系列的有机化学反应，来构建一个甘油三酸酯结合部分，连接到该肽。该结合部分由一个季碳中心组成，所述碳中心通过一个酰胺键连接到肽的末端羧基碳而与本发明的肽相连接。附着在季碳中心的另外三个基团由与16碳脂肪酸链的碳酯联接组成。脂肪酸链自身末端带有被认为是肽修饰(mask)的二肽基团，其增加了链的亲水性并将它们特异性地定位于血脑屏障的内皮细胞膜。这一合成过程在Patel等.，Bioconjugate Chem.，8(3)434，1997中进行了详细说明，并利用了本领域技术人员所熟悉的常用试剂与设备。
一旦在外部导入到个体，该化合物经由循环系统在全身转运，与血脑屏障的内皮细胞膜相互作用。在分子跨越血脑屏障的上皮层的运输过程中，二肽修饰及脂链的逐步降解导致本发明的肽释放到脑区室中。在那里，肽可与神经细胞表面的受体相互作用来发挥其对脑功能的影响作用。药物到达血脑屏障以及被运输到脑所需的时间，以及伴随载体部分的降解，改变了药物活力的动力学，与游离肽的脑室注射相比较，形成一个更稳定持续时间更长的效果。
实施例12 构建抗酶降解的肽配方 下文提供了一种构建用于口服给药的生物活性肽的配方的典型方法，其可抗在消化道表面内部以及沿着消化道表面所发现的蛋白酶及肽酶活性。在这个例子中，选自CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)及其功能衍生物的肽被用于制备对病人进行口服形式给药的药物配方。如Larionova等人所描述的那样(Int.J.Pharma.，189171，1999)，肽被用于与可溶性淀粉以及蛋白酶抑制剂----抑酶肽(aprotinin)，一起制备微粒，抑酶肽是一种由细胞腔分泌以及刷状缘(brush border)膜结合的多种蛋白酶的强烈的抑制剂。简单地说，可溶性淀粉，蛋白酶抑制剂抑酶肽以及本发明的肽溶解在一缓冲液中。可溶性淀粉，抑酶肽和肽的比例可根据本领域技术人员所熟悉的实验方法确定，例如，Larionova等人利用体外模拟消化试验来决定对他们研究中所用的肽最有效的比例以及制备条件。水溶液在含有5％Span-80(一种非离子型表面活性剂)的环已烷中(比例1∶3，v/v)，在机械振动的条件下被乳化。对苯二酰氯的氯仿溶液被加入到乳化液中，持续搅拌30分钟，在这期间淀粉分子与抑酶肽以及所述肽发生交联。在上述过程中所制备的微粒用环已烷、具有2％v/vTween85去污剂的95％乙醇溶液、95％乙醇及水依次洗涤。微粒在水中重悬浮并冻干。冻干的化合物可被置于明胶胶囊中，用于需要治疗的个体的口服给药。
一旦被消化吸收后，化合物随着明胶胶囊的溶解被释放。微粒在小肠中通过α淀粉酶对淀粉分子的作用而被分解，导致抑酶肽以及本发明的肽的逐步释放。有效的蛋白酶抑制剂抑酶肽在与肽相同的时间和位置协同释放，减少了肽的酶降解，并增加了从肠膜吸收获得完整肽的比例 虽然本发明用上述的方法和数据以及一些实例中的CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)及其功能衍生物的特定的实施例来描述，但可以理解的是，这仅仅是举例而不能作为对本发明的限制。同样可被理解的是CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)及其功能衍生物代表了本发明的一种实施方式，本发明的相同的原则也可应用于CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)及其功能衍生物的被修饰但未影响生物学功能的其它功能等同的肽。例如，CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)及其功能衍生物的等同肽包括那些具有保守的氨基酸取代基(即，V、A、P、E、H、L、A、N、K或T中的一个被具有处于同样的生化类型的另一个氨基酸残基所置换，例如疏水性、亲水性，正电或负电基团的)。CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)及其功能衍生物的等同肽的另一个例子是一个更长一些的肽，比如长一个或两个氨基酸，能保持同样的生物学活性。此外，对于CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)及其功能衍生物的医学应用，虽然上文所描述的疾病或失调指的是细胞增殖及免疫失调和/或疾病，但这些医学应用仅作为非限制性的例子而不能用于限制权利要求的范围。清楚地，CMS010(VAPEEHPTLLTEAPLNPK)片段(其中所述片段不包括CMS-010的序列)及其功能衍生物具有其他可能/预期的应用，例如用于调整正常人或具有免疫和/或细胞增殖失调和/或疾病的病人的免疫系统的保健食品增补剂。任何此类的应用均落入本发明的范围之内。
序列表
<110>一泰医药研究(深圳)有限公司
<120>生物活性肽VAPEEHPTLLTEAPLNPK衍生物
<130>0610785CYP
<150>US 60/566,455
<151>2004-04-28
<160>31
<170>PatentIn version 3.3
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Val Ala Pro Glu Glu
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Leu Asn Pro Lys
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Val Ala Pro Glu
1
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Asn Pro Lys
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<400>30
Val Ala Leu Leu Thr
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<223>Synthetic peptide sequence
<400>31
Val Ala Asn Pro Lys
1 权利要求
1.一种分离或纯化的肽，所述肽包含选自SEQ ID No2-31的肽，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。
2.一种分离或纯化的肽，所述肽基本由选自SEQ ID No2-31的肽组成，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。
3.一种分离或纯化的肽，所述肽由选自SEQ ID No2-31的肽组成。
4.权利要求1的肽，其中给予所述肽的作用包括选自以下的作用抑制免疫细胞转化、抑制NK细胞活性、增强NK细胞活性、抑制体内抗体形成、抑制细胞增殖、抑制肿瘤生长、抑制肾炎和减少蛋白尿。
5.权利要求4的肽，其中所述免疫细胞转化选自体外通过ConA的T淋巴细胞转化和体内T淋巴细胞转化。
6.权利要求4的肽，其中所述细胞增殖是肉瘤细胞体内发育。
7.权利要求4的肽，其中所述肾炎由抗肾表位抗体的活性引起。
8.根据权利要求1-7中任一项的肽，其中所述肽由L型氨基酸组成。
9.根据权利要求1-7中任一项的肽，其中所述肽为基本上纯的形式。
10.一种包含肽的药物组合物，所述肽包含选自SEQ ID No2-31的肽序列，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。
11.根据权利要求10的包含肽的药物组合物，所述肽由L型氨基酸组成，包含选自SEQ ID No2-31的序列，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。
12.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括提供包含选自SEQ IDNo2-31的序列的肽和将所述肽与药物可接受载体混合，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。
13.一种减轻人类疾病的影响的方法，所述方法包括给予药物有效剂量的包含选自SEQ ID No2-31的序列的肽，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。
14.权利要求13的方法，其中所述人类患上选自细胞增殖性疾病和免疫性疾病的病症。
15.权利要求14的方法，其中所述细胞增殖性疾病选自癌症、肉瘤和肿瘤。
16.一种调节个体免疫系统的方法，所述方法包括给予药物有效剂量的包含选自SEQ ID No2-31的肽序列的肽，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。
17.包含选自SEQ ID No2-31的序列的肽作为药物化合物的用途，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。
18.根据权利要求17的用途，其中所述化合物用以治疗选自细胞增殖性疾病和免疫性疾病的疾病状态。
19.根据权利要求18的用途，其中所述细胞增殖性疾病是肉瘤。
20.包含选自SEQ ID No2-31的序列的肽作为免疫系统调节剂的用途，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。
21.权利要求20的用途，其中所述调节选自增强NK细胞活性和抑制NK细胞活性。
22.包含选自SEQ ID No2-31的序列的肽作为营养添加剂的用途，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。
23.一种分子，所述分子包含肽的增强衍生物，所述增强衍生物包含与所述肽可操作连接的增强分子，所述肽包含选自SEQ ID No.2-31的序列，所述增强分子增强所述肽的治疗效力，其中所述肽不包含肽CMS-010的序列。
全文摘要
本发明公开了衍自肽CMS－010(式VAPEEHPTLLTEAPLNPK)的肽及其作为药物组合物的用途。还公开了制备药物组合物的方法，所述方法包括提供衍自CMS－010的肽和将所述肽与药物可接受载体混合。
文档编号C07K5/093GK1976947SQ200580012968
公开日2007年6月6日 申请日期2005年4月25日 优先权日2004年4月28日
发明者王伟明, 林刚 申请人:康哲医药研究(深圳)有限公司