Cd148血管生成抑制结构域的抗体的制作方法

专利名称：Cd148血管生成抑制结构域的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗CD148抗体并且涉及用于制备所述抗体的CD148 结合表位。本发明还涉及使用所述抗体抑制血管生成的方法。背景血管生成是指从现有血管形成新血管，这对于许多生理及病理 过程来说是至关重要的。通常，血管生成受到促血管生成因子和抗 血管生成因子的严格调控，但是在癌症、新血管性眼病、关节炎和 银屑病等疾病的情形下，这一过程就会出差错。Folkman, J.，Nat.Med., 1:27-31 (1995)。人们认为，血管生成在维持类风湿性关节炎的炎性组织扩张(血 管翳)中起到重要作用(Walsh等，Arthritis Res., 3:147-153 (2001)。事实 上，已知许多疾病都与未受控或不想要的血管生成相关。参见 Carmeliet等，Nature 407:249-257 (2000)。这些疾病包括但不限于眼新 血管形成例如视网膜病(包括糖尿病性视网膜病)、年龄相关性黄斑变 性、4艮屑病、成血管细胞瘤、血管瘤、动脉硬化、炎性疾病例如类 风湿性或风湿性炎性疾病(尤其是关节炎，包括类风湿性关节炎)或其 它慢性炎性疾病例如慢性哮喘、动脉粥样硬化或移植后动脉粥样硬 化、子宫内膜异位症和肿瘤性疾病例如所谓的实体瘤和液体(或血液)
瘤(例如白血病和淋巴瘤)。与不想要的血管生成相关的其它疾病对于 本领域技术人员来说是显而易见的。尽管许多信号转导系统都涉及血管生成的调控，但是最近才表征的一个内皮细胞系统涉及CD148受体酪氨酸激酶(也称为DEP-1 (密 度增强磷酸酶)、ECRTP (内皮细胞受体酪氨酸磷酸酶)、HPTPti或 BYP，这取决于不同物种和cDNA来源)。CD148是一种哺乳动物跨膜蛋白质，属于一类内皮细胞表面受 体，称为III型密度增强受体蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)。蛋白酪氨酸磷 酸化在信号转导途径中是必要因素，所述途径能控制基本细胞过程， 包括生长和分化、细胞周期进程和细胞骨架功能。配体与受体蛋白 酪氨酸激酶(PTK)的结合，在酶的靶底物中催化酪氨酸残基的自身磷 酸化，而配体与受体PTP的结合则催化脱磷酸化。耙底物的胞内酪 氨酸磷酸化水平可通过PTK和PTP间的平衡而确定。PTK在促进细 胞生长中起到重要作用，而PTP则通过抑制细胞生长而下调PTK的 活性。已经知道，CD148能促进红细胞样祖细胞分化，当与其它信 号转导蛋白交联时则能调节淋巴细胞的功能，还能抑制过量表达蛋 白质的乳癌细胞系的克隆表达。因为已经证实CD148作为细胞生长 抑制剂的作用，所以目前也已知道CD148介导阻断血管生成的抑制 信号，这对细胞迁移和增殖来说是必要的生物活性，使得CD148成 为治疗癌症的一个重要靶标，即通过激活CD148所介导的对肿瘤生 长相关血管生成的抑制作用，来进行治疗。与其它受体蛋白酪氨酸磷酸酶一样，CD148也具有胞内羧基部分，具有催化域、单个跨膜域和胞外氨基端结构域(包含5个串联的 纤连蛋白m型(FNin)重复序列，该序列具有与Ig样结构域类似的折 叠模式)。FNIII域对磷酸酪氨酸残基具有绝对特异性，对底物蛋白具 有高亲和性并且比PTK的比活大几个数量级。认为FNIII域参与蛋 白质/蛋白质间的相互作用，以激活CD148触发的CD148自身磷酸 化，由此转导的生物信号导致对血管生成的抑制。
美国专利第6,552,169号公开了人DEP-1 (CD148)相关的多核苷 酸序列，同时公开了针对由这类多核香酸所编码的多肽产生的多克 隆抗体。美国专利第6，248,327号公开了 CD148在血管生成中的作用， 并且提供了调节哺乳动物血管生成的方法，即通过给予能够与CD148 胞外域特异性结合的组合物，而且还公开了单克隆抗体的用途，所 述单克隆抗体能够与CD148胞外域的非特异区特异性结合，以激活 CD148抗血管生成活性。一种有效的CD148活化疗法可使大量癌症患者受益，因为大多 数实体瘤都需要新血管形成，以长到直径超过1-2毫米。该疗法在4见 网膜病、关节炎和银屑病等其它血管生成相关疾病中也具有广泛应 用。对于鉴定那些能特异性识别并结合CD148的新药物，具有尚未 开发的需求。这样的药物将会用于诊断性筛选和治疗性干预与CD148 活性相关的疾病状态。因此，本发明的目的是提供CD148的特异性结合剂，这样的结 合剂能够激活CD148的活性。本发明的这类药物呈抗体及其片段的 形式，所述抗体及其片段能够与CD148表位特异性结合。本文所引用的所有专利、专利申请和其它文件的公开内容都通 过引用全部结合到本文中。发明内容本发明提供与CD148表位结合的抗CD148抗体或其抗原结合 区，所述CD148表位参与对炎症和/或血管生成的抑制作用，所述抗 体可用于治疗炎症和血管生成相关疾病。在具体的实施方案中，抗 体或其抗原结合区来自人抗体或其抗原结合区。在其它实施方案中， 抗体或其抗原结合片段选自scFv、 Fab、 F(ab')2、 Fv和单链抗体，尤 其是scFv片段，更尤其是scFv-Fc融合物。在另一个具体的实施方
案中，抗体或其抗原结合区是IgG同种型，例如IgG2同种型。
本发明一方面提供与CD148表位结合的分离的抗体或其抗原结 合区，所述CD148表位定义为CD148的FNIII域2、 3、 4或5。在 一个具体的实施方案中，本发明的抗体包括与人CD148表位特异性 结合的分离的抗体或其抗原结合区，所述人CD148表位定义为一个 或多个选自SEQ ID NO: 33的^J^酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列。在又一个实施方案中，本 发明的抗体包括竟争性抑制上述单克隆抗体与人CD148表位结合的 分离的抗体或其抗原结合区，所述人CD148表位定义为一个或多个 选自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列。在一个更具体的实施方案中，本发 明的抗体包括与人CD148表位特异性结合的分离的抗体或其抗原结 合区，所述人CD148表位定义为一个或多个选自SEQ ID NO: 33的 氨基酸324-338和321-335的多肽序列，但是所述抗体或其抗原结合 区不与SEQ ID NO: 33的氨基酸残基324-331的多狀序列结合。这类 抗体的实例包括抗体Ab-l、 Ab-2、 Ab-3、 Ab-4、 Ab-5、 Ab-6、 Ab-7 和Ab國8。
本发明的另一方面提供可产生本发明抗体或其抗原结合区的杂 交瘤细胞和转染瘤细胞，以及由这些杂交瘤细胞和转染瘤细胞所产 生的抗体或其抗原结合区。杂交瘤可包含与无限增殖化细胞融合的B 细胞，所述B细胞得自转基因非人类动物，所述转基因非人类动物 的基因组包含人重链转基因和人轻链转基因。转染瘤可包含编码人 重链和人轻链的核酸。
本发明的另 一方面提供表达本发明的抗体或其抗原结合区的转 基因非人类动物，其中所述转基因非人类动物的基因组包含人重链 转基因和人轻链转基因。
本发明的另一方面提供制备与人CD148表位特异性结合的抗体 或其抗原结合区的方法，所述人CD148表位定义为一个或多个选自 SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸序列；所述方法包括用人CD148表位 或表达所述人CD148表位的细胞来免疫转基因非人类动物，所述动 物的基因组包含人重链转基因和人轻链转基因，所述人CD148表位 定义为一个或多个选自SEQ ED NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸序列；使所述动物 的B细胞产生抗体；分离所述动物的B细胞；将所述B细胞与骨髓 瘤细胞融合，形成分泌所述抗体或其抗原结合区的无限增殖化杂交 瘤细胞。
本发明的另 一 方面提供包含所述抗体或其抗原结合区和药学上 可接受的人用载体的药物组合物。 一个具体的实施方案中提供治疗 有效量的抗体或其抗原结合区，例如浓度为至少约10昭/ml。
本发明的另一方面提供抑制血管生成的方法，所述方法包括给 予有需要的患者治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合区。
本发明的另一方面提供CD148表位，与所述表位结合能激活 CD148介导的生物活性。本发明的CD148表位包括与本发明抗体或 其抗原结合区结合的分离的多肽或其任何片段，所述多肽包含一个 或多个选自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸序列，其中所述多肽不包括那 些来自CD148 4旦不是选自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸。在另一个实施方 案中，本发明提供与本发明抗体或其抗原结合区结合的分离的多肽 或其任何片段，所述多肽由一个或多个选自SEQIDNO:33的氨基酸 315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸 序列组成。在又一个实施方案中，本发明提供与本发明抗体或其抗 原结合区结合的分离的多肽或其任何片段，所述多肽主要由一个或 多个选自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸序列组成。本发明的另一方面提供免疫测定方法，所述方法包括下述步骤 (a)使试验样品与单克隆抗体或其抗原结合区接触，所述单克隆抗体 或其抗原结合区在其与人CD148结合时能够被与本发明抗体或其抗 原结合区结合的人CD148表位或其任何片段特异性结合的单克隆抗 体或其抗原结合区竟争性抑制，所述人CD148表位定义为一个或多 个选自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列；和(b)测定所述试验样品中人CD148 的存在。本发明的另一方面包括与人CD148表位特异性结合的化合物的 鉴定方法，所述人CD148表位定义为一个或多个选自SEQ ID NO: 33 的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725 的多肽序列；所述方法包括使试验化合物与人CD148表位接触足 够时间以形成复合物，所述人CD148表位定义为一个或多个选自SEQ IDNO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725 和200-725的多肽序列；然后通过检测复合物中的CD148表位或所 述化合物，来检测所述复合物的形成，因此，如果检出复合物的话， 就鉴定出与所述CD148表位结合的化合物。
本发明的又一方面是与人CD148表位特异性结合的化合物的鉴 定方法，所述人CD148表位定义为一个或多个选自SEQ ID NO: 33 的^J^酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725 的多肽序列；所述方法包括提供限定CD148表位三维结构的原子 坐标(atomic coordinate),所述CD148表位定义为 一个或多个选自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725 和200-725的多肽序列；然后根据所述原子坐标来设计或选择能够结 合CD148表位的化合物。附图描述

图1A和图1B显示本发明的抗体即1号抗体(Ab-l)重链可变区 (VH)和轻链可变区(VL)的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列重叠 (overlap)。图上的阴影区表示CDR1、 CDR2和CDR3 (分别从氨基端 到羧基端)。查询序列(Query)和读框1 (Framel)分别表示核普酸序列 和氨基酸序列。图2A和2B显示2号抗体(Ab-2)重链可变区(VH)和轻链可变区 (VL)的核普酸序列及其所编码的氨基酸序列重叠。图上的阴影区表 示CDR1 、 CDR2和CDR3 (分别从氨基端到羧基端)。图3A和3B显示3号抗体(Ab-3)重链可变区(VH)和轻链可变区 (VL)的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列重叠。图上的阴影区表 示CDR1、 CDR2和CDR3 (分别从氨基端到羧基端)。图4A和4B显示4号抗体(Ab-4)重链可变区(VH)和轻链可变区 (VL)的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列重叠。图上的阴影区表 示CDR1 、 CDR2和CDR3 (分别从氨基端到羧基端)。图5A和5B显示5号抗体(Ab-5)重链可变区(VH)和轻链可变区 (VL)的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列重叠。图上的阴影区表
示CDR1、 CDR2和CDR3(分别从氨基端到羧基端)。
图6A和6B显示6号抗体(Ab-6)重链可变区(VH)和轻链可变区
(VL)的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列重叠。图上的阴影区表
示CDR1、 CDR2和CDR3(分别从氨基端到羧基端)。
图7A和7B显示7号抗体(Ab-7)重链可变区(VH)和轻链可变区
(VL)的核普酸序列及其所编码的氨基酸序列重叠。图上的阴影区表
示CDR1、 CDR2和CDR3 (分别从氨基端到羧基端)。
图8A和8B显示8号抗体(Ab-8)重链可变区(VH)和轻链可变区
(VL)的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列重叠。图上的阴影区表
示CDR1 、 CDR2和CDR3 (分别从氨基端到羧基端)。
实施本发明的最佳方式
为了便于理解本发明，首先定义一些术语。其它定义在发明详 述中给出。
定义
单位、前缀和符号均采用SI可接受形式。除非另有说明，否则 核酸从左到右是以5，至3'的方向来书写；氨基酸序列从左到右是以 氨基至羧基方向来书写。本文记载的数值范围包括定义该范围的数 字并包括所定义范围之内的任何整数。本文所提及的氨基酸按其公 知的三字母符号或IUPAC-IUBMB命名委员会所推荐的单字母符号 来表示。同样，核苷酸也按其公知的单字母编码来表示。除非另有 说明，否则本文所用术语包括其复数形式。本文所用的各部分标题 仅用于组织的目的，不得视为对所述主题的限制。本说明书所引用 的所有文件或文件部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书 籍和论文，都通过引用全部结合到本文中，用于任何目的。当在本 申请内有任何氨基酸或核酸序列不相符的情况下，以附图为准。
标准技术用于重組DNA、寡核苷酸合成和组织培养以及转化(例
如电穿孔、脂转染)。按照生产商的说明书或者按照本领域常规方法 或本文所述方法，实施酶促反应和纯化技术。通常按照本领域众所 周知的常规方法以及本说明书全文所引用和讨论的各种一般性和具体参考文献，来实施上述技术和方法。参见例如Sambrook等， Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)),所述文献通过引用 结合到本文中。本文所述的分析化学、有机合成化学以及药物化学 和制药化学的实验室方法和技术相关的命名法是众所周知的，也是 本领域常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制 剂和给药以及对患者进行治疗。当用于本说明书时，除非另有说明，否则以下术语将理解为具 有以下含义术语"人CD148"是经鉴定为人ECRTP/DEP的蛋白质，包括 其等位变异体，参见Ostman等，尸rac Ato/ Jcac/ 91:9680-9684(1994),所述文献通过引用结合到本文中。"人CD148胞外域"是 指人CD148部分，该部分位于NCBI (National Center for Biotechnology Information)检索号AAB36687 version AAB36687.1 GI: 1685075 (1996 年11月26日提交)的约残基36-973之间(残基1-35是前导序列，在 成熟形式中不存在)，所述文献通过引用结合到本文中，并且在万维 网ncbi.nlm.nih.gov上可查才戈到。术语"抗体，，包括任何同种型或亚类或其组合的糖基化及非糖 基化免疫球蛋白，包括人抗体(包括CDR移植抗体)、人源化抗体、 嵌合抗体、多特异性抗体、单克隆抗体、多克隆抗体及其寡聚物， 无论所述抗体是通过免疫方法、重组技术、体外合成还是通过其它 方法产生的，无论是完整抗体还是部分抗体。因此，术语"抗体" 包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的抗体，例如(a)从动物(例 如小鼠)或该动物所制备的杂交瘤中分离的抗体，所述动物是具有人 免疫球蛋白基因的转基因动物，(b)从宿主细胞(例如转染瘤)中分离的
抗体，所述宿主细胞经转染并能表达所述抗体，(C)从重组、组合抗
体文库中分离的抗体,和(d)通过任何其它方法制备、表达、产生或 分离的抗体，所述方法包括免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列的 剪接。所述抗体具有来自两种不同动物的种系(germline)免疫球蛋白 序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，所述抗体可经 历体外诱变(或者体内体细胞诱变，当使用具有人免疫球蛋白序列的 转基因动物时)，因此抗体VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序 列尽管它们来自特定物种(例如人)的种系VH序列和VL序列或与 其相关的序列，但是它们在该物种体内的抗体种系库(repertoire)中并 不是天然存在的。
完整抗体是含有以二硫键相连的至少两条重链(H)和两条轻链(L) 或其抗原结合区的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH) 和重链恒定区组成，重链恒定区由三个结构域(本文缩写为CH1、 CH2 和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区 组成，轻链恒定区由一个结构域(本文缩写为CL)组成。VH区和VL 区还可进一步细分为超变区，称为互补决定区(CDR)，其中散布有更 保守的区域，称为构架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个 FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排布FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。重链可变区和轻链可变区含有与抗原相 互作用的结合结构域。抗体恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或 因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系 统的第一组分(Clq)。当与参考序列进行比较时，与重链或轻链CDR 基本相同的氨基酸序列，表现出相当大数量或程度的序列同一性， 并且有利地影响具有参考序列的抗体特异性结合抗原的特异性结 合。明确知道或者可以辨别出这样的同 一性代表了特定人单克隆抗 体氨基酸序列。基本相同的重链CDR和轻链CDR的氨基酸序列可 具有例如少量氨基酸修饰或保守取代，只要能保持结合特定抗原的 能力。术语"人单克隆抗体，，包括基本具有人CDR氨基酸序列的单
克隆抗体，所述抗体是通过重组等方法，由淋巴细胞或杂交瘤细胞 产生的。术语抗体的"抗原结合区"是指抗体的一个或多个片段，所述片段保留了与抗原(例如CD148)特异性结合的能力，而所述抗原也可 与参考抗体特异性结合，如本文所公开的一样。抗体的"抗原结合 区"可包括例如这样的多肽所述多肽包含各重链或轻链及其片段， 例如VL区、VH区和Fd区；单价片段，例如Fv区、Fab区和Fab' 区；二价片段，例如F(ab')2;单链抗体，例如单链Fv (scFv)区；Fc 片段；双抗体(diabody); Fd (由VH区和CH1区组成)、大抗体 (maxibodies)(与IgGl的Fc氨基端(CH2-CH3区)融合的二价scFV)和 互补决定区(CDR)域。这些术语的描迷参见例如Harlow和Lane， Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R. A.(编著)，New York: VCH Publisher, Inc.); Huston 等，Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun和Skerra, Meth. Enzymol.， 178:497-515 (1989)和Day, E. D.， Advanced Immunochemistry, 第2版，Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. (1990),所述文献通过引用 结合到本文中。术语"抗原结合区"也包括例如通过人单克隆抗体 经蛋白酶消化或还原而产生的片段，以及经本领域技术人员已知的 重组DNA方法而产生的片段。本领域技术人员知道，人单克隆抗体 片段的准确边界是不确定的，只要该片段保持功能活性即可。本领 域技术人员采用众所周知的重组方法，可以改造核酸，以表达具有 最终想要的功能片段，用于特定用途。此外，尽管Fv片段的VL和 VH两个区是由独立的基因所编码的，但是可以采用重组方法，通过 能够将它们连接成一条蛋白链的合成接头，将它们连接在一起，其 中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv (scFv);参见例如 Bird等(1988) Science 242:423-426; Huston等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体也包括在术语抗体的"抗
原结合区"的范围之内。可以采用本领域技术人员已知的常规技术， 获得这些抗体片段，并且采用与完整抗体相同的方法，对这些片段 进行筛选。这些片段包括得自氨基端和/或羧基端缺失的片段，但是
其中保留的氨基酸序列与例如从全长cDNA序列推导出的天然存在 序列的相应位置基本相同。抗原结合区也包括抗体片段，所述片段 保留特定互补决定区(CDR)(即重链和/或轻链的CDR1、 CDR2和/或 CDR3中的至少一个或更多个)的至少一个(例如1个、2个、3个……) 重链序列和/或至少一个(例如1个、2个、3个……)轻链序列。含有 CDR的序列与Fc区(或含有其重链恒定区2 (CH2)或重链恒定区3 (CH3)的区)的融合物包括在该定义范围之内，包括例如本文包括直接 或间接与Fc融合的scFV。抗原结合区包括但不限于来自抗体或其片 段(例如通过酶促消化或二硫键还原)的抗原结合区、用重组方法(例 如转染瘤)合成产生的抗原结合区、通过体外合成方法(例如Merrifield 树脂)产生的抗原结合区、通过这些方法的组合或通过其它方法产生 的抗原结合区。抗原结合区也可包括通过合成方法、化学方法或其 它方法连接在一起的、呈寡聚体形式的多个片段，例如CDR片段。 因此，本发明的抗原结合区包括通过多种方法产生的多肽，所述多 肽包括至少一个来自本发明VH链或VL链的CDR (例如Ab-l至 Ab-8)。
术语"VL片段"是指人单克隆抗体轻链片段，包括所有或部分 轻链可变区，包括CDR。 VL片段还可包括轻链恒定区序列。
术语"Fd片段"是指人单克隆抗体重链片段，包括所有或部分 YH重链可变区，包括CDR。 Fd片段还可包括CHl重链恒定区序歹L
术语"Fv片段，，是指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括 所有或部分重链可变区和轻链可变区，并且缺乏重链恒定区和轻链 恒定区。重链可变区和轻链可变区包括例如CDR。例如，Fv片段包 括重链和轻链的约IIO个氨基酸的所有或部分氨基端可变区。
术语"Fab片段"是指由VL区、VH区、CL区和CH1区组成
的抗体的单价抗原结合片段，该片段比Fv片段稍大。例如，Fab片 段包括重链和轻链的可变区以及所有或部分第一恒定区。因此，Fab 片段还包括例如重链和轻链的约110至约220个氨基酸残基。术语"Fab'片段"是指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，该片 段比Fab片段稍大。例如，Fab'片段包括所有轻链，所有重链可变区 以及重链的所有或部分第一和笫二恒定区。例如，Fab'片段还可包括 重链的部分或所有的220-330个氨基酸残基。术语"F(ab')2片段"是指人单克隆抗体的二价抗原结合片段，所 述片段包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段。F(ab')2片段包 括例如两条重链和两条轻链的所有或部分可变区，并且还可包括两 条重链和两条轻链的所有或部分笫一恒定区。术语"dAb片段"是指由VH区组成的片段，参见Ward等，(1989) Nature 341:544-546。术语"CDR"是指在重链和轻链多肽可变区内发现的非毗连抗 原结合位点。以下文献已经描述了该特定区Kabat等，U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)和Chothia等，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)和 MacCallum等，J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)，所述文献通过引用结 合到本文中，其中所述定义包括氨基酸残基重叠或亚类，当彼此间 进行比较时。然而，用于表示抗体或其功能片段的CDR的定义包括 在该术语范围之内，如同本文所定义和使用的一样。包含特定CDR 的准确氨基酸残基数目视CDR结构而异。本领域技术人员可以常规 确定具体CDR中哪些残基属于抗体的可变区氨基酸序列。本领域技 术人员可比较两个以上抗体序列，即通过用相同CDR定义来限定相 应序列的各区或个别氨基酸位置。术语"CDR移植"是指这样的抗体或抗原结合区其中将来自 一个物种的CDR插入到不同物种的构架中，例如移植到人构架上的 鼠CDR ("人，，抗体)。
术语"类似物"是指由至少25个氨基酸的区段组成的多肽，所 述多肽与推导出的氨基酸序列部分基本上相同，并且所述多肽具有 至少一个以下特性(1)与CD148在合适的结合条件下特异性结合，(2) 阻断CD148配体与CD148结合的能力，或(3)抑制CD148介导的血 管生成的能力。通常，多肽类似物包含相对于天然存在的序列来说 的保守氨基酸取代(或添加或缺失)。类似物的长度通常为至少20个 氨基酸，优选至少50个氨基酸或更长，通常可以与全长天然存在的 多肽一样长。
术语"分离的"是指从一种或多种化合物中分离，所述化合物 是与天然抗体或多肽一起存在的化合物，或者在用于制备抗体的合 成反应中所包括的那些化合物(例如分子、前体或其它反应产物)，优 选基本上不含任何其它污染的哺乳动物多肽，这样的多肽可能会干 扰其治疗或诊断应用。分离的分子也包括基本纯的分子。该术语可 包括天然存在的分子，例如生物合成反应产物或合成分子。当抗体 中基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体时，该抗体就被认为 是"分离的"。而且，如果一种物质与多肽或其它物质结合(而在自 然界并不与之结合)或缀合时，这种物质也是"分离的"。
术语"基本纯的"是指存在的主要物质种类(即在组合物中，以 摩尔浓度计，它比任何其它各种类的含量更丰富)，并且占所有存在 的大分子的至少约50% (以摩尔浓度计)。 一般而言，基本纯的组合 物占组合物中存在的所有大分子的约80%以上，或者约85%以上、90% 以上、95%以上和99%以上。物质经纯化成为基本同质的(通过常规 检测方法，在组合物中不能检测出污染物质)，其中组合物主要由一 种大分子组成。同样，如果在制备或配制过程中， 一种物质如上所 述是"分离的"或是"基本纯的"，然后再与其它成分混合成已知 成分的组合物，则它是"分离的"，尽管在已知成分的组合物中的 该物质并非主要存在的种类。
本文所用的术语"特异性结合"是指化合物优先或选择性识别
并结合成熟的全长或部分CD148表位或其直向同源物，使得它的亲 和力(通过例如本文所述的亲和ELISA或BIAcore测定法而测得)或它 的中和能力(通过例如本文所述的中和ELISA测定法或类似测定法而 测得)比任何其它多肽的亲和力或中和能力高至少10倍，任选高50 倍、100倍、250倍或500倍，或者甚至至少高1000倍，其中肽抗 体(peptibody)中的肽部分先与人Fc部分融合，以便在所述测定法中 进行评价。通常，抗体结合亲和力至少大约为lx107 M",并且，与 预定抗原结合的亲和力是与除预定抗原或密切相关抗原以外的非特 异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的亲和力的至少两倍。认为本文所 用的"识别"抗原的抗体或者对抗原具有"特异性"的抗体相当于"特 异性结合"抗原的抗体。然而，与人CD148特定表位、同种型或变来自其它物种的相关抗原(例如CD148类同源物)，并且所述抗体仍 然被认为是"特异性结合"特定CD148表位。术语"表位"是指能够被特异性结合剂(例如抗体)在一个或多个 结合剂的抗原结合区上识别并与之结合的任何分子部分。表位通常 由分子的化学活性表面集合(surface grouping)组成，例如氨基酸或糖 侧链，并且通常具有特殊的三维结构特征，以及特殊的电荷特征。 构象表位和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，是与前者 的结合而不是与后者的结合丧失。当解离常数约SlpM、优选约^100nM 和最优选40nM时，就认为抗体能特异性结合抗原。本发明的抗体 及其抗原结合区包括用本文定义的表位决定子产生的抗体及其抗原 结合区，或者用与本文定义的表位决定子基本相同的表位决定子而 产生的抗体及其抗原结合区。在上下文中，"基本相同"是指序列 共享足够的同一性，使得与修饰表位决定子结合的抗体能够竟争性 抑制所述抗体与如本文所述的表位决定子的结合。短语"竟争性抑制结合"是指一种抗体同另一种抗体或其抗原 结合区，都能识别、结合相同或基本相同的表位或其片段，或者对
相同或基本相同的表位或其片段具有免疫特异性。在本发明内容中，竟争性抑制单克隆抗体与人CD148表位特异性结合的分离的抗体或 其抗原结合区，能够测定对CD148结合的竟争力，所述人CD148表 位定义为选自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200_536、 533_725和200-725的氨基酸序列。通常，可以在被测抗体 或其抗原结合区存在时，通过测定与革巴蛋白(例如人CD148)结合的参 考抗体或抗原结合区的数量，来测定竟争性抑制。通常，被测抗体 或被测抗原结合区是过量存在的，例如过量5倍、10倍、25倍或50 倍。当过量存在时，竟争性结合的抗体或抗原结合区在统计学意义 上能显著抑制参考抗体或抗原结合区与人CD148胞外域的特异性结 合，通常至少10%、 25%、 50%、 75%、 90%或更高。竟争性抑制测 定法是本领域众所周知的。参见例如Harlow和Lane (1998), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York。本 文所用的结合抑制包括部分和完全抑制/阻断。当与本发明的抗CD148 抗体接触时，抑制和阻断也包括特定抗CD148抗体与CD148的结合 亲和力上的任何可检测的下降，例如结合被阻断至少约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 99%或100%。如果确定了由以下氨基酸所定义的人CD148表位的话，竟争性 抑制单克隆抗体与人CD148表位特异性结合的一种或多种抗体的鉴 定，就是一项简单技术，所述人CD148表位定义为选自SEQ ID NO: 33 的氨基酸447-725、 533-725、 715-973、 324-335、 200-536、 533-725 和200-725的氨基酸序列。 一旦产生了与人CD148表位特异性结合 的抗体时，就能简单地通过与参考抗体进行比较，容易地对竟争性 抑制那些与CD148结合的抗体进行鉴定，所述人CD148表位定义为 选自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸序列。 可以使用任一种能评价抗体竟争性的免疫筛选测定方法，容易 地对交叉反应性抗体进行鉴定。这些测定方法都是本领域的常规方法，下文将会有进一步详细描述。1997年8月26日授权的美国专利 第5,660,827号(通过引用结合到本文中)，用于进一步补充说明如何 制备这样的抗体所述抗体如同给定抗体一样，能结合相同或基本 相同的表位。例如，当待测试验抗体得自不同来源的动物或者是不同的同种 型时，可以采用一种简单的竟争测定，其中将对照和试验抗体混合 在一起(或预先吸附)并用于CD148抗原组合物，该组合物中含有本 文所述的CD148表位。因此，基于ELISA的方案和蛋白质印迹适用 于这样简单的竟争研究。在某些实施方案中，可以将对照抗体与不同数量的试验抗体(例 如1:10或1:100)预混合一段时间，然后再用于抗原组合物。在其它 实施方案中，可以将对照和不同数量的试验抗体在暴露给抗原组合 物的同时进行简单地混合。在任何情况下，通过使用同种或同种型 第二抗体，能够仅测定结合的对照抗体，其结合作用因基本上识别 同 一表位的试验抗体的存在而降低。的抗体竟争研究中，可以先用可检测标记(例如生物素或酶标或者放 射性标记)来标记对照，以便进行随后的筌定。在这些情况下，可以 将标记的对照抗体与待测试验抗体按不同比例(例如1:10或1:100)预 混合或孵育，然后(任选过一段合适的时间后)测定标记的对照抗体的 反应性，并将其与对照值进行比较，在所述对照的孵育中没有潜在 竟争性试验抗体。测定也可以是大量基于抗体杂交的免疫测定法中的任一种，可 以通过检测它们的标记来检测对照抗体，例如在生物素化抗体的情 况下使用链霉抗生物素，或者通过使用与酶标有关的生色底物(例如 3,3'5,5'-四曱基联苯胺(TMB)底物以及过氧化物酶)或者通过简单地测 定放射性标记。与对照抗体结合同一表位的抗体能够有效竟争结合， 因此能显著降低对照抗体的结合，其证据是结合标记的减少。在缺乏完全无关抗体的情况下，(标记的)对照抗体的反应性将是对照高值(control high value)。将标记抗体与完全相同类型的标记抗体 一起孵育，可得到对照低值(control low value),当竟争发生并降低标 记的抗体的结合时。在试验测定中，在试验抗体存在下，标记抗体 反应性的显著下降，表明试验抗体与标记抗体识别同一表位，即试 验抗体与标记抗体具有"交叉反应"。短语"抑制血管生成"是指相对于未处理对照来说，血管生成 水平的统计学意义上的减少。相对于阴性对照血管生成来说，示例 性的减少至少5-99%,减少至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%或90%。普遍接受的血管生成功能测定法例如角膜微袋测 定法(corneal micropocket assay)和人肾孩Lfc管内皮细胞(HRMEC)平面 迁移测定法(planar migration assay),都是本领域已知的。参见例如美 国专利第5/712,291和5，871,723号。简而言之，HRMEC平面迁移测 定是伤口闭合(woimd closure),该测定可用于在体外定量测定本发明 抗体或其抗原结合区对血管生成的抑制作用。在该测定中，用在培 养的细胞单层中的环形伤口闭合速率来测定内皮细胞迁移。伤口闭 合速率是线性的，在体内剌激和抑制血管生成的药物能动态调节伤 口闭合速率。小鼠角膜袋测定也可用于定量测定本发明抗体或其抗 原结合区对血管生成的体内抑制作用。在该测定中，将有待检测血 管生成活性或抗血管生成活性的药物以緩释形式固定在吸水性丙烯 酸聚合物小片(hydron pellet)上，将其植入到麻醉小鼠角膜上皮产生 的微袋中。测定血管化角膜缘向正常无血管角膜生长的血管生成的 现象、密度和血管生长范围。可以理解，可以修饰本发明抗体，使它们与抗体多肽序列或其 片段基本相同，同时仍能结合本发明的CD148表位。当用GAP或 BESTFIT等程序进行优化比对时，使用缺省空位权重(weight)时，如
果多肽序列共享至少80%序列同 一性、至少90%序列同 一性、至少95% 序列同一性或至少99%序列同一性，则这些多肽序列是"基本相同 的"。优选不同残基位的不同之处在于保守氨基酸取代。保守氨基 酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如， 一组具有脂族 侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一 组具有脂族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸； 一组具有含酰胺 侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺； 一组具有芳族侧链的氨基酸 是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸； 一组具有碱性側链的氨基酸是赖氨 酸、精氨酸和组氨酸； 一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和曱 硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组合是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、 苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨 酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。正如本文所讨论的，所提出的抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸 序列上的小的变化包括在本发明之内，只要氨基酸序列中的变化保 持至少75%，更优选至少80%、 90%、 95%，最优选99%。具体地讲， 提出了保守氨基酸取代。保守取代是发生在一组侧链相关的氨基酸 之内的取代。遗传编码的氨基酸通常分为以下类型(l)酸性氨基酸(天 冬氨酸、谷氨酸)；(2)碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；(3)非 极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨 酸、曱硫氨酸、色氨酸)；和(4)不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬 酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。更优选的 种类是丝氨酸和苏氨酸为脂族-羟基类；天冬酰胺和谷氨酰胺是含 酰胺类；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是脂族类；苯丙氨酸、 色氨酸和酪氨酸是芳族类。例如，有理由相信，以下独立的取代将 不会对所得分子的结合或特性产生重要影响亮氨酸被异亮氨酸或 缬氨酸取代、天冬氨酸被谷氨酸取代、苏氨酸被丝氨酸取代、或氨 基酸被结构相关氨基酸的类似取代，尤其是如果取代不涉及构架位 置内的氨基酸的话。通过测定多肽衍生物的比活，可以容易地确定
氨基酸变化是否产生功能肽。本文详细描述了测定方法。本领域普 通技术人员可以容易地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似 物。优选的氨基端和羧基端片段或类似物发生在功能区边界。将核 苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专利序列数据库进行比较，可以 鉴定出结构域和功能域。优选采用计算机比较方法，来鉴定序列基 序或预测蛋白质构象区，所述构象区发生在其它已知结构和/或功能 的蛋白质内。折叠成已知三维结构的蛋白质序列的鉴定方法是已知的。Bowie等，Science 253:164 (歷)。因此，上述实例证明，本领域 技术人员可识别序列基序和结构构象，这可用于定义本发明的结构 域和功能域。优选的氨基酸取代是这样的取代(l)降低蛋白酶解敏感性，(2) 降低氧化敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结 合亲和力，和(4)赋予或修饰所述类似物的其它理化或结构特征。类 似物可包括各种序列突变蛋白，但不是天然存在的肽序列。例如， 在天然存在的序列(优选在形成分子间接点的区域外的多肽部分)中， 可以进行单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸 取代不应基本改变母序列的结构特征(例如取代氨基酸不应倾向于石皮 坏母序列中存在的螺旋，或者破坏母序列特征性的其它类型的二级 结构)。本领域公知的多肽二级结构和三级结构的实例参见Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton编著，W. H. Freeman和 Company, New York (1984》；Introduction to Protein Structure (C. Branden和J. Tooze编著，Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); Thornton等，Nature 354:105 (l"l)，所述文献都通过引用结合到本文 中。也可使用本文公开的表位决定子的肽类似物，来产生本发明的 抗体，所述类似物可由具有类似于模板肽特性的非肽化合物组成。 这些类型的非肽化合物称为"肽模拟物，，。Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber和Freidinger TINS第392页(1985); Evans等，J.Med. Chem. 30:1229 (l987)。通常借助于计算机分子建模，来开发这 类化合物。可以使用结构上类似于治疗用肽的肽模拟物，来产生相 同的治疗或预防效果。 一般而言，通过本领域众所周知的方法，肽 模拟物的结构类似于范例多肽(paradigm polyp印tide,即具有生化特 性或药理活性的多肽)，例如人抗体，但具有一个或多个任选被选自 以下键取代的肽键—CH2NH--、 —CH2S—、 —CH2—CH2--、 —CH=CH--(顺式和反式)、—COCH2—、 —CH(OH)CH2—和CH2SO--。可以采用 共有序列的一个或多个氨基酸被同类型D-氨基酸的系统取代(例如D-赖氨酸替代L-赖氨酸)，产生更稳定的肽。另外，通过本领域已知方 法(Rizo和Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)，通过引用结合 到本文中)，可以产生包含共有序列或基本相同的共有序列变异体的 限制肽；例如，通过添加能够形成分子内二硫桥并使肽环化的内部 半胱氨酸残基。术语"双特异性分子，，包括具有至少两种不同结合特异性的任 何分子，例如蛋白质、肽或者蛋白质复合物或肽复合物。例如，所 述分子可以与(a)细胞表面抗原和(b)效应细胞表面的Fc受体结合或相 互作用。术语"多特异性分子(multispecific molecule)"或"不均一特 异性分子(heterospecific molecule)"包括具有两种以上不同结合特异 性的任何分子，例如蛋白质、肽或者蛋白质复合物或肽复合物。例 如，所述分子可以与(a)细胞表面抗原、(b)效应细胞表面的Fc受体和 (c)至少一个其它组分结合或相互作用。因此，本发明包括但不限于 针对CD148表位和其它靶(例如效应细胞上的Fc受体)的双特异性分 子、三特异性分子、四特异性分子和其它多特异性分子。术语"双 特异性抗体"也包括双抗体(diabody)。双抗体是二价双特异性抗体， 其中VH区和VL区在一条多肽链上表达，但是使用接头来表达，所 述接头太短而不允许同 一条链的两个区之间配对，从而迫使这些区 与另 一条链的互补区配对，产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger, P.等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J.，等(1994) Structure 2:1121-1123)。双特异性抗体包括两个以上的抗体、 抗体结合片段(例如Fab)、它们的衍生物或连接在一起的抗原结合区 (它们中间的至少两种具有不同特异性)。这些不同特异性包括针对效 应细胞上的Fc受体的结合特异性，以及针对把细胞(例如胂瘤细胞) 上的抗原或表位的结合特异性。术语"人抗体"是指恒定区和构架都完全由人序列组成或主要 由人序列组成的抗体，使得当将人抗体给予人宿主时，基本上不会 引起针对自身的免疫原性反应、优选没有可检测的免疫原性反应。 应当知道，"人抗体"不一定完全由人序列组成，而是可含有部分 非人类序列，只要当将该抗体给予人宿主时，不引起免疫原性反应。 例如，"人抗体，，包括将非人类(例如小鼠)CDR区移植到人构架上 的抗体。在某些实施方案中，在非人类哺乳动物中产生人抗体，所 述非人类哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠和兔子。在其它实施方 案中，在杂交瘤细胞中产生人抗体，所述杂交瘤细胞来自具有人免 疫球蛋白库的转基因动物。在其它实施方案中，完全人抗体是经重 组产生的，例如在转染瘤中。术语"人源化抗体"是指所有恒定区基本上都来源于人，而一 个或多个可变区全部或部分来源于其它物种例如小鼠的抗体。本文所用的术语"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"是指 单一分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物对特定表位表现 出单一结合特异性和亲和性。因此，术语"人单克隆抗体，，是指表 现出单一结合特异性，同时又具有来自人种系免疫球蛋白序列的可 变区和恒定区的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤 产生，所述杂交瘤包含与无限增殖化细胞融合的B细胞，所迷B细 胞得自转基因非人类动物(例如转基因小鼠)，所述转基因非人类动物 的基因组包含人重链转基因和轻链转基因。本文所用的术语"重组"用于修饰抗体时，包括通过重组方法 制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)从动物(例如小鼠)或该动物所制备的杂交瘤(下面的第I小节中有进一步描迷)中分离的抗体，所述动物是带有人免疫球蛋白基因的转基因动物，(b)从宿主细 胞(例如转染瘤)中分离的抗体，所述宿主细胞经转染并能表达所述抗 体，(c)从重组、组合人抗体文库中分离的抗体，和(d)通过任何其它 方法制备、表达、产生或分离的抗体，所述方法包括人免疫球蛋白 基因序列与其它DNA序列的剪接。所迷重组人抗体具有来自人种系 免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，所 述重组人抗体可经历体外诱变(或者体内体细胞诱变，当使用具有人Ig 序列的转基因动物时)，因此重组抗体VH区和VL区的氨基酸序列 是这样的序列尽管它们来自人种系VH序列和VL序列或与其相关 的序列，但是它们在体内的人抗体种系库中并不是天然存在的。本文所用的"异源抗体"定义为转基因非人类生物体产生的一 类抗体。该术语是指具有对应于生物体中存在的氨基酸序列或编码 的核酸序列的抗体，所述生物体不是转基因非人类动物，而是通常 来自不是转基因非人类动物的其它物种。本文所用的"异源杂种抗体(heterohybrid antibody)"是指具有来 源于不同生物体的轻链和重链的抗体。例如，具有人重链以及鼠轻 链的抗体，就是异源杂种抗体。异源杂种抗体的实例包括嵌合抗体 和人源化抗体，在上文中有论述。本文所用的"同种型转换(isotype switching)"是指抗体类别或同 种型从一类Ig变成另 一类Ig的现象。本文所用的"非转换同种型"是指在没有发生同种型转换时产 生的重链的同种型类别；编码非转换同种型的CH基因通常是紧接着 功能性重排VDJ基因下游的第一个CH基因。同种型转换分为经典 或非经典同种型转换。经典同种型转换是通过涉及转基因中至少一 个转换序列区的重组事件而发生的。非经典同种型转换是通过例如 人e-pi (theta-mu)和人e卞(theta-mu) (5-相关缺失)之间同源重组而发生 的。或者，非经典转换机制例如转基因间和/或染色体间重组，可以
发生并实现同种型转换。
本文所用的术语"转换序列"是指负责转换重组的DNA序列。 "转换供体"序列通常是p转换区，位于在转换重组过程中将被缺失 的构建体区的5'(即上游)。"转换受体"区位于构建区待缺失区和取 代恒定区(例如Y、 e等)之间。因为没有总是发生重组的特定位点，故 此最终的基因序列通常不能根椐构建体来预测。
本文所用的"糖基化模式"定义为与蛋白质共价连接、.更具体 地说与免疫球蛋白共价连接的糖单位的模式。当本领域技术人员认 为，与转基因的CH基因来源的物种相比，异源抗体的糖基化模式与 转基因非人类动物物种中的糖基化模式更为相似时，异源抗体的糖 基化模式可以被描述为与在转基因非人类动物的物种所产生的抗体 上正常发生的糖基化模式基本相似。
本文所用的术语"天然存在的"当用于物体时，是指物体可以 在自然界中被发现的事实。例如，生物体(包括病毒)中存在的、可以 从自然界的来源分离的、未在实验室中被人为有意修饰的多肽或多 核苷酸序列就是天然存在的。
本文所用的术语"重排"是指重链或轻链免疫球蛋白基因座的 构型，其中在分别编码基本上完整的VH区或VL区的构象中，V区 段紧邻D-J或J区段定位。可以通过与种系DNA比较，来鉴定重排 的免疫球蛋白基因座；重排的基因座具有至少一个重组七聚体/九聚 体同源元件。
本文所用的术语"未重排"或"种系构型"在涉及V区段时， 是指V区段未经过重组而紧邻D或J区段的构型。
本文所用的术语"转染瘤，'包括表达抗体的重组真核宿主细胞， 例如CHO细胞或NS/0细胞。
术语"转基因非人类动物"是指具有这样的基因組的非人类动 物所述基因组包含一个或多个人重链和/或轻链转基因或转染色体 (整合或不整合到动物的天然基因组DNA上)并且能够表达完全人抗
体。例如，转基因小鼠可具有人轻链转基因和人重链转基因或人重
链转染色体，使得当用CD148和/或表达CD148的细胞免疫时，该 小鼠能够产生人抗CD148抗体。人重链转基因可以整合到小鼠染色 体DNA上(例如在转基因的情况下)，例如HuMAb小鼠，或者人重 链转基因可以保持在染色体外(例如在转染色体(例如KM)小鼠的情况 下)，参见WO 02/43478。这样的转基因和转染色体小鼠能够通过经 历V-D-J重组和同种型转换，产生多种抗CD148的人单克隆抗体同 种型(例如IgG、 IgA和/或IgE)。
下面各小节进一步详细说明本发明的各个方面。
抗CD148抗体的制备
本发明用结合特定CD148表位的抗体或其抗原结合区为例来说 明，已经知道所述抗体或其抗原结合区在激活CD148介导的炎性和/ 或血管生成活性方面起作用。这样的抗体或其抗原结合区包括抗 CD148抗体及其抗原结合区，这些抗体及其抗原结合区与CD148的 结合，受到本文公开的抗体或其抗原结合区的竟争性抑制。同时待 审的美国临时专利申请号60/564,885和60/585,686中，/^开了编码 本发明抗体及其抗原结合区的多核苷酸序列、以及这些多核苷酸序 列表达的多肽序列，所述文献的内容通过引用全部结合到本文中。
本发明提供抗CD148抗体，所述抗体结合与人CD148表位基本 相同的表位，所述人CD148表位定义为一个或多个选自SEQIDNO: 33的氨基酸447-725、 533-725、 715-973、 324-335、 200-536、 533-725 和200-725的多肽序列。在另 一个实施方案中，本发明提供与人CD148 表位或基本相同的表位结合的抗CD148抗体及其抗原结合区，所述 表位定义为一个或多个选自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列。在另一个实施 方案中，本发明提供与人CD148表位或基本相同的表位特异性结合
的分离的抗体或其抗原结合区，所述表位定义为一个或多个选自SEQ IDNO:33的#^酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725 和200-725的多肽序列。在另 一个实施方案中，本发明提供与人CD148 表位或基本相同的表位特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合区， 所述表位定义为一个或多个选自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列。可以 通过以下公开的多种方法中的任一种，制备这类抗体或其抗原结合 区，例如，通过用至少第一 CD148抗原性组合物免疫动物，然后从 免疫动物中选择与本发明单克隆抗体基本上有交叉反应的抗体。
可以通过一个或多个受体竟争、ELISA、共沉淀和/或功能测定 和本文所述的交叉反应测定法或这些方法的组合，容易地鉴定具有 所述特性组合的抗体。
本发明所包括的抗体，包括IgG、 IgA、 IgGl-4、 IgE、 IgM和IgD 抗体，例如IgGlK或IgGU同种型，或IgG4K或IgG4X同种型。在 一个具体的实施方案中，本发明的抗体是IgG2同种型。在一个实施 方案中，人抗体是在转基因非人类动物(例如转基因小鼠)中产生的， 所述动物通过经历V-D-J重组和同种型转换，能够产生多种抗CD148 的人抗体同种型(例如IgG、 IgA和/或IgE)。因此，本发明的方面不 仅包括抗体、抗体片段及其药物组合物，而且还包括产生多克隆抗 体的转基因非人类动物、B细胞、宿主细胞转染瘤和杂交瘤。在体外 或体内使用本发明抗体来检测表达CD148的细胞或相关的交叉反应 生长因子受体，或者抑制表达CD148的细胞的生长、分化和/或运动 的方法，也都包括在本发明之内。本发明还包括含本发明抗体的药 物制剂以及通过给予本发明抗体来治疗生理障碍的方法。
可以通过各种不同的方法构建本发明的抗体和抗原结合区，所 述方法包括通过免疫动物(例如用刺激产生抗体的抗原，所述抗体能
够特异性结合并竟争性抑制Ab-l至Ab-8抗体中的至少一个的结合)； 通过杂交瘤(例如使用来自转基因或非转基因动物的B细胞)；通过重 组方法(例如CHO转染瘤；参见Morrison, S. (1985) Science 229:1202))，或者通过体外合成方法(例如固相多肽合成)。
在某些实施方案中，抗体和抗原结合区是人或人源化的。非人 抗体的人源化方法是本领域众所周知的。基本上可以按照以下文献 的方法实施人源化Winter及合作者(Jones等，Nature, 321 :，522 (1986); Riechmann等，Nature, 332: 323 (1988); Verhoeyen等，Science, 239: 1534 (1988))。简而言之，将人恒定区基因与合适人或非人类可 变区基因连接。例如，在DNA水平上，将代表母鼠单克隆抗体的抗 原结合位点(CDR或互补决定区)的氨基酸序列移植到人可变区构架 序列上。人恒定区基因序列可参见Kabat等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242。 容易从已知 克隆中得到人C区基因。所需效应子功能(例如补体结合，或抗体依 赖性细胞毒性的活性)将会指导对抗体同种型的选择。在某些实施方 案中，同种型是IgG2。
也可通过包括但不限于噬菌体展示、逆转录病毒展示、核糖体 展示以及其它技术在内的各类展示技术，产生人抗体或人源化抗体 或抗原结合区，使用本领域众所周知的技术，所得分子可经历其它 的成熟过程，例如亲和力成熟，这些技术都是本领域众所周知的。 Hanes和Plucthau， PNAS USA 94:4937-4942 (1997)(核糖体展示), Parmley和Smith, Gene 73:305-318 (1988) (p篮菌体展示)，Scott TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla等，PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel 等，Nucl, Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom等，Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell和McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992)和美国专利第5,733,743号。
通过计算机建模，可以帮助鉴定合适的人抗体序列。建模是本 领域众所周知的，用于例如避免非人类CDR区与人可变构架区的非
天然并列(juxtaposition),这样的并列会产生非天然的构象限制并伴随 结合亲和力的丧失。用于产生免疫球蛋白分子三维图像的计算机硬 件和软件是很容易获得的。 一般而言，分子模型的产生，是从免疫 球蛋白链或其区的分解结构(solved structure)开始的。将有待建模的 链与分解的三维结构链或区进行比较，比较氨基酸序列相似性，然 后选择表现出最大的序列相似性的链或区，作为构建分子模型的出 发点。考虑到在建的免疫球蛋白链或区的实际氨基酸与开始结构之 间的差异，修改开始的分解结构。然后将修改结构装配成复杂的免 疫球蛋白。最后，通过能量最小化来改进模型，证实所有原子彼此 间都在合适的距离内，键长和键角都在化学上可接受的限制之内。可以产生转基因动物(例如小鼠)，在没有产生内源免疫球蛋白的 情况下，所述动物在免疫后能够产生完全人抗体库。例如，在嵌合 小鼠和种系突变小鼠中，抗体重链连接区(Jh)基因的纯合缺失导致内 源抗体产生被完全抑制。在所述种系突变小鼠中， 一旦抗原攻击， 人种系免疫球蛋白基因阵列的转移就会导致产生人抗体。参见例如 Jakobovits等，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits 等，Nature, 362: 255 (1993); Brugge腿nn等，Year in Immunol., 207: 33 (1993)。已经描述了市售转基因小鼠品系，例如XenoMouse;参见Green 等，Nature Genetics 7:13-21 (1994)。产生本发明抗体或其抗原结合区的重组方法中，首先是免疫球 蛋白重链和轻链所需区域的分离的核酸，例如Ab-1至Ab-8中任一 种中存在的分离的核酸。这些区可包括例如重链和轻链的所有或部 分可变区。这些区尤其包括重链和/或轻链的至少一个CDR，通常是 来自Ab-1至Ab-8的至少一个CDR对。可以通过本领域已知的体外 寡核苷酸合成法，直接合成编码本发明抗体或其抗原结合区的核酸。 或者，采用本领域已知的重组方法合成小片段，再连接成大片段。 可以通过切割完整蛋白质，例如用蛋白酶或化学切割，制备抗体结 合区，例如Fab或F(ab')2。或者可以设计截短的基因。 为了表达抗体或其抗原结合区，可以通过标准分子生物学技术(例如PCR扩增、位点定向诱变)，得到编码部分或全长轻链和重链 的DNA，然后可以插入到表达载体内，使得所述基因与转录和翻译 调节序列有效连接。可以将编码本发明抗体或其抗原结合区的核酸 克隆到合适的表达载体中并在合适宿主中表达。合适的载体和宿主 细胞系统允许例如Ab-l至Ab-8中至少 一个的重链可变区和轻链可 变区的共表达和装配，或其含有CDR的多肽的共表达和装配。本领 域技术人员可以决定合适的表达系统。包含本发明多核苷酸的核酸可用于转染合适哺乳动物或非哺乳 动物宿主细胞。在某些实施方案中，为了表达轻链和重链，通过标 准技术，将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语"转 染"的不同形式包括各种技术，所述技术常用于将外源DNA导入原 核或真核宿主细胞中，所述技术例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管从理论上说，无论原核宿主细胞还是真核宿主 细胞都可以表达本发明的抗体，但是最典型的还是在真核细胞、最 优选哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为这些真核细胞、尤其是哺 乳动物细胞与原核细胞不同，能够装配和分泌适当折叠且具有免疫 活性的抗体或抗原结合区。表达载体包括质粒、逆转录病毒、粘粒、YAC、源自EBV的附 加体等。常用栽体是编码功能完整的人CH (重链恒定区)或CL (轻链恒定区)免疫球蛋白序列的载体，带有经改造的合适限制位点，使得 任何VH序列或VL序列可以容易地插入并表达。在这些载体中，剪 接通常发生在插入J区的剪接供体位点和在人C区前的剪接受体位 点之间，也可在人CH外显子内的剪接区上。聚腺苷酸化和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点。选择与所用表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。本发明的抗体重链可变区核酸和抗体轻链可变区核酸可以插入到不同 的载体中，或者通常将这两个基因都插入到同一表达载体中。可以 通过标准方法，将核酸插入到表达载体中(例如将互补的限制位点连 接在抗体核酸片段和载体，或平端连接，如果没有限制位点的话)。本文所迷的Ab-l至Ab-8的重链可变区和轻链可变区可用于产生任 何抗体同种型的全长抗体基因，即通过将它们插入到已经编码所需 同种型(和亚类)的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得在载 体内VH区段与CH区段有效连接，而且在载体内VL区段与CL区 段有效连接。或者，表达载体可编码信号肽，所述肽能促进抗体或 抗原结合区链从宿主细胞中分泌出来。抗体或抗原结合区链基因可 以克隆到载体中，使得信号肽与抗体/抗原结合区链基因的氨基端符 合读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来 自非免疫球蛋白的信号肽)。本发明的表达载体除了携带包含CDR的序列之外，还携带有控 制序列在宿主细胞中表达的调节序列。术语"调节序列"包括启动 子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)，这些元件控 制抗体链基因的转录或翻译。这些调节序列参见例如Goeddel; Gene Expression Technology。 Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego， Calif. (1990)。本领域技术人员知道，表达载体的设计(包 括调节序列的选择)可取决于以下因素有待转化的宿主细胞的选择、 所需的蛋白质表达水平等。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调 节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件， 例如来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40 (SV40)、腺病毒(例如腺病 毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或 者，可以使用非病毒调节序列，例如泛蛋白启动子或(3珠蛋白启动子。本发明的表达载体除了携带抗体或抗原结合区核酸和调节序列 之外，还可携带其它序列，例如在宿主细胞中调节载体复制的序列(例 如复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因便于选择其中已导 入载体的宿主细胞(参见例如美国专利第4，399,216号、第4,634,665 号和笫5,179,017号，全都属于Axel等)。例如，选择性标记基因通
常使已导入载体的宿主细胞具有抗药性，例如抗G418、潮霉素或曱 氨蝶呤。优选的选择性标记基因包括二氬叶酸还原酶(DHFR)基因(用 于用甲氨蝶呤选择/扩增dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。优选的用于表达本发明重组抗体或抗原结合区的哺乳动物宿主 细胞包括中国仓鼠卯巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，参见 Urlaub和Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220，使 用DHFR选择性标记，例如参见R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621)、 NS/0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2.0细胞。 尤其是对于使用NS/0骨髓瘤细胞来说，另一个优选的表达系统是GS 基因表达系统，参见WO 87/04462、 WO 89/01036和EP 338 841。当 将本发明的表达栽体导入哺乳动物宿主细胞中时，产生抗体或抗原 结合区，即通过将宿主细胞培养足够长的时间，以在宿主细胞中表 达抗体或抗原结合区，或者更优选使所述抗体或抗原结合区分泌到 宿主细胞生长的培养基中。一旦表达，可以按照HPLC纯化、分步柱层析法、凝胶电泳等 本领域标准方法(参见例如Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982)，纯化本发明的抗体和抗原结合区。在某些实施方案中， 用层析和/或电泳技术纯化多肽。示例性的纯化方法包括但不限于硫 酸铵沉淀；PEG沉淀；免疫沉淀；离心后进行热变性；层析，包括 但不限于亲和层析(例如A蛋白-琼脂糖凝胶)、离子交换层析、排阻 层析和反相层析；凝胶过滤；羟基磷灰石层析；等电聚焦；聚丙烯 酰胺凝胶电泳；以及这些技术和其它技术的组合。在某些实施方案 中，用快速蛋白质液相层析或高压液相层析(HPLC)来纯化多肽。产生抗CD148人单克隆抗体的杂交瘤的制备本发明的另 一方面包括产生本发明的抗体或其抗原结合区的杂 交瘤细胞。杂交瘤细胞可包含与无限增殖化细胞融合的B细胞，所 述B细胞得自转基因非人类动物，所述转基因非人类动物的基因組包含人重链转基因和轻链转基因，其中杂交瘤产生可检测量的本发 明的单克隆抗体或其抗原结合区。可以按照标准方案，分离小鼠脾细胞，用PEG使小鼠脾细胞与 小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后根据抗原-特异性抗体的产生，对所得 杂交瘤进行筛选。例如，使用50% PEG,将得自免疫小鼠脾淋巴细 胞的单细胞悬液与1/6数量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细 胞(ATCC， CRL 1580)融合。将细胞接种在平底微量滴定板中，浓度 约为2xl05,然后在含有20。/。胎儿克隆血清(fetal Clone Serum)、 18% "653"条件培养基、5% origen (IGEN)、 4mM L-谷氨酰胺、lmM L-谷氨酰胺、lmM丙酮酸钠、5mMHEPES、 0.055mM 2-巯基乙醇、50 单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和lxHAT (Sigma;融合后24小时加入HAT)的选择培养基中，孵育2周。2周 后，将细胞在用HT替代HAT的培养基中进行培养。然后各孔用ELISA 法筛选人抗CD148单克隆IgM和IgG抗体。 一旦发生大量杂交瘤生 长时，通常在10-14天后观察培养基。将分泌的抗体杂交瘤再次接种， 再次筛选，如果对人IgG仍然呈阳性，则可以通过有限稀释，将抗 CD148单克隆抗体亚克隆至少两次。然后，体外培养稳定的亚克隆， 以便在组织培养基中产生少量抗体，供表征用。产生抗CD148人单克隆抗体的转染瘤的制备也可采用例如本领域众所周知的重组DNA技术和基因转染方法 的组合(Momson, S. (1985) Science 229:1202),用宿主细胞转染瘤产 生本发明的人抗体。转染瘤细胞可包括编码人重链和人轻链的核酸， 其中转染瘤产生可检测量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合区。例如，为了表达抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学 技术(例如PCR扩增、位点定向诱变)，得到编码部分或全长轻链和 重链的DNA,然后可以将其插入到表达栽体内，使得所述基因与转 录和翻译控制序列有效连接。在上下文中，术语"有效连接"是指
抗体基因与载体相连接，使得载体中的转录和翻译控制序列起到它 们预定的功能，即调节抗体基因的转录和翻译。选择与所用表达宿 主细胞相容的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链 基因可以插入到不同的载体中，或者更通常的是将两个基因都插入 到同一表达载体中。可以通过标准方法，将抗体基因插入到表达栽 体中(例如将互补的限制位点连接在抗体基因片段和载体，或平端连 接，如果没有限制位点的话)。本文所述的抗体的轻链可变区和重链 可变区可用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因，即通过将它们 插入到已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得在栽体内VH区段与CH区段有效连接，而且在栽体内VL 区段与CL区段有效连接。或者，重组表达载体可编码信号肽，所述 肽能促进抗体链从宿主细胞中分泌出来。抗体链基因可以克隆到载 体中，使得信号肽与抗体链基因的氨基端符合读框地连接。信号肽 可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号 肽)。本发明的重组表达载体除了携带抗体链基因外> 还携带控制抗 体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语"调节序列，，包括启 动子、增强子和其它控制抗体链基因转录或翻译的表达控制元件(例 如聚腺普酸化信号)。这些调节序列参见例如Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)。本领域技术人员知道，表达载体的设计(包括调节序列的选择)可取决于以下因素有待转化的宿主细胞的选择、所需的蛋 白质表达水平等。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包 括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件，例如来自 巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40 (SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚 期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可以使 用非病毒调节序列，例如泛蛋白启动子或P珠蛋白启动子。本发明的重组表达载体除了携带抗体链基因和调节序列之外，
还可携带其它序列，例如在宿主细胞中调节栽体复制的序列(例如复 制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因便于选择其中已导入栽体的宿主细胞(参见例如美国专利第4,399,216、 4,634,665和5,179,017 号，全都属于Axel等)。例如，选择性标记基因通常使已导入载体的 宿主细胞具有抗药性，例如抗G418、潮霉素或曱氨蝶呤。优选的选 择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于用甲氨蝶呤选择/ 扩增dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。在一个本发明的优 选的实施方案中，抗体链基因和调节序列在"splitdhfr载体"PDC323 和PDC324中表达，参见Bianchi, A.A.和McGrew， J.T. (2003) "High-level expression of full antibodies using tran-complementing expression vectors," Bioengineering and Biotechnology, 84 (4): 439-444; McGrew,J.T.和Bianchi， A.A. (2002) "Selection of cells expressing heteromeric proteins,"美国专利申请号20030082735,所述文献的内容通过引用 结合到本文中。为了表达轻链和重链，通过标准技术，将编码重链和轻链的表 达载体转染到宿主细胞中。术语"转染"的不同形式包括各种技术， 所述技术常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞中，所述技术 例如电穿孔、磷酸钩沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管从理论上说， 无论原核宿主细胞还是真核宿主细胞都可以表达本发明的抗体，^f旦 是最典型的还是在真核细胞、最优选哺乳动物宿主细胞中表达抗体， 因为这些真核细胞、尤其是哺乳动物细胞与原核细胞不同，能够装 配和分泌适当折叠且具有免疫活性的抗体。优选的用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞，包括中 国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，参见Urlaub和 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220,使用DHFR 选择性标记，例如参见R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621)、 NS/0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2.0细胞。尤其是对 于使用NS/0骨髓瘤细胞来说，另一个优选的表达系统是GS基因表 达系统，参见WO 87/04462、 WO 89/01036和EP 338 841。当将编码 抗体基因的重组表达载体导入到哺乳动物宿主细胞中时，产生抗体， 即通过将宿主细胞培养足够长的时间，以在宿主细胞中表达抗体， 或者更优选使所述抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中。采用标准 蛋白质纯化方法，可以从培养基中回收抗体。使用部分抗体序列来表达完整抗体抗体与靶抗原的相互作用，主要是通过位于6个重链和轻链互 补决定区(CDR)上的氨基酸残基。为此，比起CDR外的序列来说，CDR 内氨基酸序列的各抗体间更多样化。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原的相互作用，所以可以表达模拟天然存在的特异性抗体特性的 重组抗体，即通过构建表达栽体，所述载体包括移植到来自不同抗序歹寸(参见例如Riechmann, L.等，1998, Nature 332:323-327; Jones， P. 等，1986, Nature 321:522-525; Queen, C.等，1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033)。这样的构架序列可得自包括种系抗体基因序 列的公共DNA数据库。这些种系序列不同于成熟抗体基因序列，因 为它们不包含完全装配的可变区基因，这样的基因是在B细胞成熟 期间由V(D)J连接而成。种系基因序列在单个平均跨越可变区上也不同于高亲和性第二库抗体的序列。例如，体细胞突变很少发生在 构架区的氨基端部分内。例如，体细胞突变很少发生在构架区1的 氨基端部分内和构架区4的羧基端部分内。此外，许多体细胞突变 都不会显著改变抗体的结合特性。因此，没有必要为了再次产生具 有类似于原抗体的结合特性的完整重组抗体，而获得特定抗体的完 整DNA序列(参见PCT/US99/05535, 1999年3月12曰申请，所述 文献通过引用结合到本文中，用于所有目的)。通常，跨越CDR区的 部分重链和轻链序列就足以达到此目的。部分序列用于测定哪些种 系可变区和连接区基因区段赋予重组抗体可变区基因。然后，种系
序列用于补平可变区中缺少的部分。在蛋白质成熟过程中，切割重 链和轻链前导序列，并不对最终抗体的这些特性造成影响。为此， 必须使用相应种系前导序列，用于表达构建体。为了添加缺少的序列，通过连接或PCR扩增，将克隆的cDNA序列与合成寡核苷酸连 接在一起。或者，可以将完整可变区合成为一组短的重叠寡核苷酸， 再通过PCR扩增来组合，以产生完整的合成可变区克隆。该方法具 有一些优势，例如消除或包含特定限制位点，或优化特定密码子。
来自杂交瘤的重链和轻链转录产物的核苷酸序列用于设计重叠 的合成寡核苷酸组，以产生合成V序列，所述V序列带有与天然序 列相同的氛基酸编码能力。合成重链和K链序列以3种方式与天然序 列不同重复核苷酸碱基间隔排列，以利于寡核苦酸合成和PCR扩 增；按照Kozak法则(Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870)掺 入最佳翻译起始位点；而且HindIII位点是改造的翻译起始位点的上 游。
对于重链可变区和轻链可变区，将优化的编码链和相应非编码 链序列大约在相应非编码寡核苷酸的中点断裂成30-50个核普酸。因 此，对于每条链来说，寡核苷酸可以装配成跨越150-400个核苷酸区 段的重叠的双链组中。再将所得混合物用作模板，产生150-400个核 苷酸的PCR扩增产物。通常，单个可变区寡核苷酸组可断裂成两种 混合物，将其分别扩增，产生两种重叠的PCR产物。再通过PCR扩 增，将这些重叠产物组合在一起，形成完整可变区。在PCR扩增中， 也希望包括重链或轻链恒定区(包括K轻链的Bbsl位点，或Agel位点， 如果是Y重链的话)的重叠片段，以产生易于克隆到表达载体构建体中 的片段。
再将重建的重链和轻链可变区与克隆的启动子、翻译起始序列、 恒定区、3'非翻译序列、聚腺苷酸化序列和转录终止序列连接在一起， 形成表达载体构建体。可以将重链和轻链表达构建体组合成一个载 体，共转染、连续转染或分别转染到宿主细胞中，在其中融合而形 成同时表达两条链的宿主细胞。下面描述用于构建人IgGK表达载体的质粒。构建所述质粒，使得PCR扩增的V重链和VK轻链cDNA序列可用于再次构建完整重 链和轻链小基因(minigene)。这样的质粒可用于表达完全人抗体或嵌 合IgGlK或IgG4K抗体。可以构建类似质粒，用于表达其它重链同 种型，或者用于表达含有人轻链的抗体。因此，在本发明的另一方面，本发明的人抗CD148抗体的结构 特征可用于产生结构相关的人抗CD148抗体，所述结构相关的人抗 CD148抗体保留了本发明抗体的至少一个功能特征，例如与CD148 结合。更具体地讲，可以通过重组方法，将抗CD148抗体的一个或 多个CDR区与已知的人构架区和CDR结合，产生另外的重组改造 的本发明人抗CD148抗体。因此，本发明的抗CD148抗体可用于制备抗CD148抗体，即通 过制备包含以下部分的抗CD148抗体(l)人重链构架区和人重链 CDR;和(2)人轻链构架区和人轻链CDR,其中所述抗体仍保留结合 CD148的能力。采用标准结合测定法(例如ELISA),可以测定抗体结合CD148 的能力。因为本领域众所周知，抗体重链和轻链CDR3区在抗体针 对抗原的结合特异性/亲和性中起到非常重要的作用，所以如上所述 制备的本发明重组抗体优选包含抗CD148抗体的重链CDR3和轻链 CDR3。这些抗体还可包含抗CD148抗体的CDR2。这些抗体还可包 含抗CD148抗体的CDR1。因此，本发明还提供包含以下部分的抗 CD148抗体(l)人重链构架区、人重链CDR1区、人重链CDR2区 和人重链CDR3区。其中人重链CDR3区是抗CD148抗体的CDR3; 和(2)人轻链构架区、人轻链CDR1区、人轻链CDR2区和人轻链CDR3 区，其中人轻链CDR3区是抗CD148抗体的CDR3，其中所述抗体 结合CD148。该抗体还可包含抗CD148 '抗体的重链CDR2和/或轻链 CDR2。该抗体还可包含抗CD148抗体的重链CDR1和/或轻链CDR1 。
优选上迷工程抗体的CDR1、 CDR2和/或CDR3包含与本文公 开的抗CD148抗体一样的准确的氨基酸序列。然而，普通技术人员 能理解，准确CDR序列中可能有一些变动，同时仍能保留抗体有效 结合CD148的能力(例如保守取代)。因此，在另一个实施方案中， 工程抗体可由与抗CD148抗体的一个或多个CDR具有例如90%、 95%、 98%或99.5。/o同一性的一个或多个CDR组成。人抗CD148单克隆抗体结合的表征为了表征本发明抗人CD148人单克隆抗体的结合特性，通过例 如ELISA,测定来自免疫小鼠的血清。简而言之，用浓度为0.25jLig/ml 的纯化CD148的PBS溶液包被;敞量滴定板，再用5%牛血清白蛋白 的PBS溶液进行封闭。向各孔中加入经CD148免疫小鼠的血浆稀释 液，在"。C孵育1-2小时。该板用PBS/吐温洗涤，再与山羊-抗人IgG Fc-特异性多克隆试剂(与碱性磷酸酶缀合)在37。C醉育1小时。洗涤 后，该板用pNPP底物(lmg/ml)显色，在OD 405-650进行分析。优 选使用具有最高效价的小鼠进行融合。如上所述的ELISA测定也可用于筛选对CD148抗原表现出阳性 反应的杂交瘤。可以将与CD148以高亲和力结合的杂交瘤亚克隆， 再进一步表征。可以从每个杂交瘤中选出一个保留亲代细胞反应性 的克隆(通过ELISA),制成5-10个小瓶的细胞库，贮存于-14。C,用 于抗体纯化。为了纯化人抗CD148抗体，可以让选定的杂交瘤在两升;^走动培 养瓶中生长，用于单克隆抗体纯化。过滤上清液，浓缩，然后用A 蛋白-琼脂糖凝胶(Pharmacia, Piscataway, N丄)进行亲和层析。用凝胶 电泳和高效液相层析检查洗脱的IgG,保证纯度。緩沖液可更换成 PBS，通过OD，，用消光系数1.43，确定浓度。将单克隆抗体等分 并贮存于-80。C:为了检查所选人抗CD148单克隆抗体是否结合独特表位，用市
售试剂(Pierce, Rockford， 111.),使每种抗体都生物素化。可采用未标 记的单克隆抗体和生物素化单克隆抗体，使用如上所述的CD148包 被的ELISA板，进行竟争性研究。可以用链霉抗生物素蛋白-碱性磷 酸酶探针，来检测生物素化MAb的结合。为了确定纯化抗体的同种型，可以进行同种型ELISA。微量滴 定板的各孔可以在4'C、用10g/ml抗人Ig包被过夜。用5% BSA封 闭后，将该板与10g/ml单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度 下反应2小时。再让各孔分别与人IgGl或人IgM-特异性碱性磷酸酶 -缀合探针反应。如上所述，使板显色并对其进行分析。为了证明单克隆抗体与表达CD148的活细胞结合，可使用流式 细胞术。简而言之，将表达CD148的细胞系(在标准生长条件下培养) 与不同浓度的单克隆抗体的PBS溶液(含0.1% Tween 80和20%小鼠 血清)混合，于37。C孵育1小时。洗涤后，让细胞与萸光素标记的抗 人IgG抗体反应，反应条件与第一抗体染色条件相同。通过^f吏用 FACScan仪器，利用光散射和侧向散射性能对单细胞进行门控(gate) 来分析样品。可以使用一个替代测定，用焚光显微镜(加上或替代)流 式细胞术测定。如上所述，细胞可以进行精确染色，然后用焚光显 微镜检查。该方法可以看到各个细胞，但是基于抗原密度，可能会 降低灵敏度。还可通过蛋白质印迹，测定抗CD148人IgG对CD148抗原的 反应性。简而言之，从表达CD148的细胞制备细胞提取物，进行十 二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将各抗原转移到 硝酸纤维素膜上，用20%小鼠血清封闭，再用待测单克隆抗体进行 探测。人IgG的结合可以用抗人IgG石咸性磷酸酶来检测，并且用 BCIP細T底物片(Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.)来显色。产生人单克隆抗CD148抗体的转基因非人类动物用携带部分人免疫系统、而非小鼠系统的转基因小鼠，可以产 生抗CD148多肽的人单克隆抗体。这些转基因小鼠在本文中称为 "HuMAb"小鼠，含有编码未重排的人重链(jLi和力和k轻链免疫球 蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(minilocus)以及致使内源p链 和k链基因座失活的把突变(Lonberg,等(1994) Nature 368(6474): 856-859)。因此，所述小鼠表现出小鼠IgM或k表达减少，并且对免疫 有应答，所引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变， 产生高亲和力的人IgGK单克隆抗体(Lonberg， N.等(1994)，出处同上； 有关综述参见Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N.和Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol.笫13巻65-93，以及Harding, F.和Lonberg， N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546)。 HuMAb小鼠的制备在下文有详细描述， 还可参见Taylor， L.等(1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J.等(1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choi等(1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen， J.等(1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon等(1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg等,(1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L.等(1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N.和Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F.和Lonberg， N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D.等(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851,所有这些文献 的内容都通过引用全部结合到本文中。另参见美国专利号5,545,806、 5,569,825、 5，625,126、 5,633,425、 5,789,650、 5,877,397、 5,661,016、 5,814,318、 5,874,299、和5，770，429 (所有这些专利都授予Lonberg和 Kay,以及GenPharai International);美国专利第5，545，807号(Surani 等)；1998年6月11日公布的国际公布号WO 98/24884; 1994年11 月10日公布的WO 94/25585; 1993年12月23日公布的WO 93/1227; 1992年12月23日公布的WO 92/22645; 1992年3月19日/>布的 WO 92/03918,所有这些文献的公开内容都通过引用全部结合到本文 中。另一方面，可以用转基因小鼠来产生人抗CD148抗体。为了产生完全人抗CD148单克隆抗体，可以用CD148抗原纯化 或富集制备物和/或表达CD148的细胞，来免疫HuMAb小鼠，参见 Lonberg， N.等(1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D.等(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851和WO 98/24884。优选的小鼠在首 次输注时是6-16周龄。例如，可以用CD148抗原纯化或富集制备物 (5-20|ig)(例如从表达CD148的LNCaP细胞中纯化的)，腹膜内免疫 HuMAb小鼠。当使用CD148抗原的纯化或富集制备物进行免疫却 不产生抗体的情况下，也可以用表达CD148的细胞(例如胂瘤细胞系) 来免疫小鼠，以促进免疫应答。使用不同抗原所积累的经验表明，HuMAb转基因小鼠当首次用 抗原和完全弗氏佐剂腹膜内(IP)免疫，然后每隔一周用抗原和不完全 弗氏佐剂腹膜内免疫(最多共6次)时，该动物的应答最佳。在免疫方 案过程中，可以用眶后(retroorbital)放血获取血浆样品，监测免疫应 答。可以通过ELISA (如下所述)对血浆进行筛选，用具有足够效价 的抗CD148人免疫球蛋白的小鼠进行融合。在处死小鼠并取出脾脏 之前3天，可以将抗原静脉内给予小鼠，对小鼠进行加强免疫。预 期对于每种抗原需要进行2-3次融合。每种抗原都要免疫很多小鼠。 例如，可以总共免疫12只HC07和HC012品系的HuMAb小鼠。在又一个方面，本发明提供能够表达与本发明CD148表位特异 性结合的人单克隆抗体的转基因非人类动物，例如转基因小鼠。在 一个优选的实施方案中，转基因非人类动物(例如转基因小鼠(HuMAb 小鼠))的基因组包含人重链转基因和轻链转基因。在一个实施方案 中，转基因非人类动物(例如转基因小鼠)已经用CD148抗原纯化或 富集制备物和/或表达CD148的细胞进行了免疫。优选转基因非人类 动物(例如转基因小鼠)通过经历V-D-J重组和同种型转换，能够产生 多种抗CD148的人单克隆抗体同种型(例如IgG、 IgA和/或IgE)。同种型转换可通过例如经典或非经典同种型转换而发生。响应外源抗原刺激、具有异源抗体库的转基因非人类动物的i殳计，要求在转基因动物体内所含有的异源免疫球蛋白转基因，在B 细胞发育途径中正确发挥功能。在一个优选的实施方案中，异源重 链转基因的正确功能包括同种型转换。因此，构建本发明的转基因， 从而产生同种型转换和以下功能中的一个或多个(l)高水平和细胞 类型特异性的表达，(2)功能性基因重排，(3)激活等位基因排斥和对 等位基因排斥应答，(4)表达足够的初级库，(5)信号转导，(6)体细胞 超突，(7)在免疫应答期间转基因抗体基因座的显性化。并非所有上述标准都要满足。例如，在转基因动物内源免疫球 蛋白基因座被功能性破坏的实施方案中，转基因不必激活等位基因 排斥。此外，在转基因包括功能性重排的重链和/或轻链免疫球蛋白 基因的实施方案中，功能性基因重排的第二条标准是不必要的，至 少对于已经重排的转基因来说。有关分子免疫学的背景，参见 Fundamental Immunology,第2版(1989), Paul William E.编著.Raven Press, N.Y.，所述文献通过引用结合到本文中。在某些实施方案中，用于产生本发明人单克隆抗体的转基因非 人类动物，在转基因动物生殖细胞中含有重排、未重排或者重排与 未重排的组合的异源免疫球蛋白重链和轻链转基因。每个重链转基 因包含至少一个Ch基因。另外，重链转基因可含有功能性同种型转 换序列，所述序列在转基因动物B细胞中能够支持编码多个Ch基因 的异源转基因的同种型转换。这样的转换序列可以是天然发生在来 自与转基因Ch基因相同来源的科系免疫球蛋白基因座中的那些序 列，或者这样的转换序列可以是来自发生在接受转基因构建体的物 种(转基因动物)中的序列。例如，用于制备转基因小鼠的人转基因构 建体可产生更高频率的同种型转换事件，如果它结合与小鼠重链基 因组内天然发生的转换序列类似的转换序列的话，因为据推测小鼠 转换序列经优化可与小鼠转换重组酶系统起作用，而人转换序列则 不能。转换序列可以分离得到并通过常规克隆方法进行克隆，或者 可以从重叠的合成寡核苷酸从头合成转换序列，所述寡核普酸是根据免疫球蛋白转换区序列相关的公开的序列信息而设计的(Mills等， Nucl. Acids Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras等，Intl. Immunol. 1:631-642 (1989),所述文献通过引用结合到本文中)。对于每种上迷转基因 动物，在转基因动物B细胞的重要部分发现了功能性重排的异源重 链和轻链免疫球蛋白转基因(至少10%)。用于产生本发明转基因动物的转基因包含重链转基因，所述转 基因包含编码至少一个可变区基因区段、 一个多样性基因区段、一 个连接基因区段和至少一个恒定区基因区段的DNA。免疫球蛋白轻 链转基因包含至少一个可变区基因区段、 一个连接基因区段和至少 一个恒定区基因区段的DNA。编码轻链和重链基因区段的基因区段 对转基因非人类动物来说是异源的，因为它们来源于或对应于编码 免疫球蛋白重链和轻链基因区段的DNA,所述DNA来自不是转基 因非人类动物的物种。可以构建这样的转基因使得各个基因区段 是未重排的(即没有重排)，以便编码功能性免疫球蛋白轻链或重链。 当暴露给CD148抗原时，这样的未重排转基因支持V、 D和J基因 区段的重组(功能性重排)，优选支持将全部或部分D区基因区段掺入 到转基因非人类动物内的所得重排免疫球蛋白重链中。转基因也可包含未重排"小基因座"。这样的转基因通常包含 C、 D和J区段以及V基因区段亚类的基本部分。在这样的转基因构 建体中，不同调节序列，例如启动子、增强子、类别转换区、用于RNA 加工的剪接供体序列和剪接受体序列、重组信号等，都包含来自异 源DNA的相应序列。这样的调节序列可摻入到来自与用于本发明的 非人类动物相同或相关物种的转基因。例如，人免疫球蛋白基因区 段可以结合到带有啮齿类免疫球蛋白增强子序列的转基因中，用于 转基因小鼠。或者，合成调节序列可掺入到转基因，其中这样的合 成调节序列与已知天然存在于哺乳动物基因组中的功能性DNA序列
不同源。按照公认的法则，例如那些用于规定剪接受体位点或启动 子/增强子基序的容许序列的法则，来设计合成调节序列。例如，小 基因座包括部分基因组免疫球蛋白基因座，与天然存在的种系Ig基因座相比，所述基因座具有非必需DNA部分(例如间插序列；内含 子或其部分)的至少一个内部(即不在该部分的末端)^:失。转基因动物也可用于产生抗CD148的人抗体，所述动物含有至 少1个、通常2-10个、有时25-50个或更多个转基因拷贝(参见WO 98/24884的实施例12)(例如pHCl或pHC2),并用含有一个拷贝的 轻链转基因的动物来繁育(参见WO 98/24884的实施例5、 6、 8或14)， 后代用缺失JH的动物来繁育(参见WO 98/24884的实施例10)，所述 文献的内容通过引用结合到本文冲。繁育动物，达到这三个性状的 每一个都是纯合的。这些动物具有以下基因型单拷贝(每套单倍染 色体)的人重链未重排小基因座(参见WO 98/24884实施例12)、单拷 贝(每套单倍染色体)的重排人K轻链构建体(参见WO 98/24884的实施 例14)和在每个内源小鼠重链基因座上具有缺失，该缺失去除了所有 功能性JH区段(参见WO 98/24884实施例10)。这类动物用Jh区段缺 失纯合的小鼠来繁育(WO 98/24884实施例10)，产生对JH缺失纯合 而对人重链和轻链构建体半合的后代。给所得动物注射抗原，用于 产生针对这些抗原的人单克隆抗体。因为从这种动物分离的B细胞仅含每个基因的单拷贝，所以从 这种动物分离的B细胞对于人重链和轻链来说是单特异性的。此外， 它们对于人重链或小鼠重链来说可以是单特异性的，因为这两类内 源小鼠重链基因拷贝因跨越JH区的缺失而成为非功能性的，所述缺 失是4耍WO 98/24884的实施例9和实施例12而引入的。此外，B细 胞的基本部分对于人轻链或小鼠轻链来说可以是单特异性的，因为 单拷贝重排人K轻链基因的表达将会在B细胞的重要部分等位且同种 型地排除内源小鼠K和入链基因的重排。优选的实施方案的转基因小鼠表现出能产生免疫球蛋白主要库，理想的是基本类似于天然小鼠。因此，例如，在内源Ig基因已失活的实施方案中，免疫球蛋白总体水平范围约为0.1-10mg/ml血清， 优选0.5-5mg/ml,理想的至少约1.0mg/ml。当能够影响IgM-IgG转 换的转基因导入到转基因小鼠中时，成年小鼠血清IgG/IgM之比优 选为10:1。在未成年小鼠体内的IgG/IgM之比要低得多。 一般而言， 约10%以上，优选40-80%的脾脏和淋巴结B细胞只表达人IgG蛋白。 该库将会理想地接近于非转基因小鼠所表现的那样，通常高至少约 10%，优选25-50%以上。 一般而言，产生至少约一千种不同免疫球 蛋白(理想的是IgG)，优选104-106以上，这主要取决于引入到小鼠基 因组的不同V、 J和D区的数量。这些免疫球蛋白通常识别约一半或 更多的高度抗原性的蛋白质，例如葡萄球菌A蛋白。通常，免疫球 蛋白所表现出的对预先选定抗原的亲和力为至少约107 M-1,优选至 少约1(^M"，更优选至少约101Q M"、 1011 M"、 10"M"以上，例如 高达1013 M"或更高。在某些实施方案中，优选产生具有预定库的小鼠，以限制对响 应预定抗原类型的抗体中存在的V基因进行的选择。具有预定库的 重链转基因可包含例如人Vh基因，所述基因优先用于针对预测抗原 类型的人类抗体反应。或者，可以因不同原因，从确定库中排除某 些VH基因(例如具有编码预定抗原高亲和性V区的低可能性；具有 经历体细胞突变和亲和性修饰的低倾向性；或者对某些人具有免疫 原性)。因此，在含不同重链或轻链基因区段的转基因重排之前，可通过杂交或DNA测序。如上所述，可以用CD148抗原纯化或富集制备物和/或表达 CD148的细胞，来免疫本发明的转基因小鼠。小鼠将会产生B细胞， 所述细胞通过转基因内转换重组(顺式转换)经历类别转换，并表达可 与CD148反应的免疫球蛋白。免疫球蛋白可以是人序列抗体，其中 重链和轻链多肽由人转基因序列编码，所述序列可包含来自体细胞
突变和V区重组连接的序列，以及种系编码序列；可以认为这些人 序列免疫球蛋白与人Vl或Vh基因区段和人t或Jl区段所编码的多 肽序列基本相同，虽然其它非种系序列也是体细胞突变和不同V-J和 V-D-J重组结合的结果。对于这样的人序列抗体，每条链的可变区通 常至少80%由人种系V、 J以及(在重链情况下)D基因区段编码；通 常至少85%的可变区由转基因上存在的人种系序列编码；通常90% 或95%或更高可变区序列由转基因上存在的人种系序列编码。然而， 因为非种系序列是通过体细胞突变和VJ和VDJ连接引入的，所以人 序列抗体通常具有某些可变区序歹q(较少具有恒定区序列)，这些序列 不由小鼠种系中的人转基因上的人V、 D或J基因区段编码。通常， 这样的非种系序列(或各核苷酸位置)在CDR或其附近成蔟，或者在 已知体细胞突变成簇的区域成簇。
与预定抗原结合的人序列抗体可来自同种型转换，从而产生包 含人序列Y链(例如Yl、 Y2a、 y2B或y3)和人序列轻链(例如k轻链)的人 抗体。这类同种型转换的人序列抗体通常含有一个或多个体细胞突 变，通常是在可变区内并且通常在CDR的约10个残基内，这是亲 和力成熟和抗原对B细胞的选择的结果，尤其是随后对第二(或其后) 抗原进行刺激的结果。
一旦将小鼠种系改造成含有功能性YAC (所述YAC具有扩大的 V区段库，该取代基本上不存在于含有J和C基因区段的人Ig转基 因中)，可以将性状扩增并繁育到其它遗传背景中，包括这样的遗传 背景其中将具有扩大的V区段库的功能性YAC繁育到具有不同人 Ig转基因的小鼠种系中。具有扩大的V区段库的多功能性YAC可繁 育到种系中，与人Ig转基因(或多个人Ig转基因)一起发挥作用。尽 管对于本文的YAC转基因来说，这样的转基因当整合到基因组中时， 基本上可缺失酵母序列，例如酵母自主复制所需的序列；但是当不 再需要在酵母中进行复制(即在导入小鼠ES细胞或小鼠原合子之 前)，所述序列也可任选通过遗传工程(例如限制消化和脉冲场凝胶电 泳或其它合适的方法)而去除。人序列免疫球蛋白表达性状的繁育方法包括繁育具有人Ig转基因、任选也具有带有扩大的V区段库的功 能性YAC的转基因小鼠。Vh基因区段和、基因区段都可存在于YAC 上。技术人员可将转基因小鼠繁育到任何所需背景中，包括带有其 它人转基因的背景，所述其它人转基因包括人Ig转基因和/或编码其 它人淋巴细胞蛋白的转基因。本发明也提供高亲和性人序列免疫球 蛋白，所述免疫球蛋白由具有扩大的V区库YAC转基因的转基因小 鼠产生。尽管以上描述了本发明转基因动物的优选实施方案，其它 实施方案也包括在内，其中包括(l)含有未重排重链和重排轻链免 疫球蛋白转基因的转基因动物；(2)含有未重排重链和未重排轻链免 疫球蛋白转基因的转基因动物；(3)含有重排重链和未重排轻链免疫 球蛋白转基因的转基因动物；(4)含有重排重链和重排轻链免疫球蛋 白转基因的转基因动物。与CD148结合的双特异性/多特异性分子在本发明的又一个实施方案中，抗CD148的人单克隆抗体或其 抗原结合区可以衍生或者与另一个功能性分子(例如另一个肽或蛋白 (例如Fab'片段)连接，产生可结合多个结合位点或耙表位的双特异性 分子或多特异性分子。例如，本发明的抗体或抗原结合区可以功能 性连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价締合或其它方法)一个 或多个其它结合分子，例如另一个抗体、抗体片段、肽或结合模拟 物。因此，本发明包括双特异性分子和多特异性分子，所述分子包 含至少一个针对CD148的第一结合特异性和针对第二耙表位的第二 结合特异性。在本发明的一个具体实施方案中，第二靶表位是Fc受 体，例如人FcyRI(CD64)或人Fcot受体(CD89)。因此，本发明包括双 特异性分子和多特异性分子，所述分子能够同时结合表达Fc7R、 FcaR 或FcsCR的效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多型核白细胞(PMN))
和表达CD148的靶细胞。这些双特异性分子和多特异性分子将表达 CD148的细胞导向效应细胞，并且与本发明的人单克隆抗体一样， 触发Fc受体介导的效应细胞活性，例如吞谨表达CD148的细胞，抗 体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、释放细胞因子或产生超氧化 物阴离子(superanion)。本发明的双特异性分子和多特异性分子除了包含抗Fc结合特异 性和抗CD148结合特异性之外，还可包括笫三结合特异性。在一个 实施方案中，笫三结合特异性分子是抗增强因子(EF)部分，例如结合 表面蛋白的分子，所述蛋白参与细胞毒活性并因而增加针对靶细胞 的免疫应答。"抗增强因子部分"可以是抗体、功能性抗体片段或 配体，它们结合给定分子(例如抗原或受体)并因而导致针对Fc受体 或靶细胞抗原的结合决定子的作用增强。"抗增强因子部分"可结 合Fc受体或靶细胞抗原。或者，抗增强因子部分可结合这样的实体， 所述实体不同于第一和笫二结合特异性所结合的实体。例如，抗增 强因子部分可结合细胞毒T细胞(例如通过CD2、 CD3、 CD8、 CD28、 CD4、 CD40、 ICAM-1或其它免疫细胞，从而增强针对革巴细胞的免 疫应答)。在一个实施方案中，本发明的双特异性分子和多特异性分子包 含作为结合特异性的至少一种抗体或其抗体片段，包括例如Fab、 Fab'、 F(ab')2、 Fv或单链Fv。抗体也可以是轻链二聚体或重链二聚体， 或其任何最小片段，例如Fv或单链构建体，参见Ladner等的美国专 利第4,946,778号，所述文献的内容通过引用结合到本文中。在另 一个实施方案中，本发明的双特异性分子和多特异性分子 包括存在于效应细胞表面的FcaR或FcyR的结合特异性，以及耙细 胞抗原(例如CD148)的第二结合特异性。在另一个实施方案中，Fc受体的结合特异性是由人单克隆抗体 提供的，人免疫球蛋白G (IgG)并不阻断这样的结合。本文所用的术 语"IgG受体"是指位于1号染色体上的8个Y-链基因中的任一个。
这些基因编码总共12个跨膜或可溶性受体同种型，它们分为3类Fey 受体FcyRI (CD64)、 FcyRII(CD32)和FcyRIII (CD16)。在一个优选 的实施方案中，Fcy受体是人高亲和性FcyRI。人FcyRI是72 kDa分 子，表现出对单体IgG的高亲和力(10S-109]^1)。这些优选的单克隆抗体的制备和表征参见Fanger等，PCT申请 WO 88/00052和美国专利第4,954,617号，所述文献通过引用全部结 合到本文中。这些抗体结合FcyRI、 FqRII或FcyRIII表位，其结合 位点不同于FcY受体结合位点，因此，生理水平的IgG基本上不阻断 它们的结合。用于本发明的特异性抗FcyRI抗体是MAb22、 MAb32、 MAb44、 MAb62和MAb 197。产生MAb 32的杂交瘤可得自美国典 型培养物保藏中心(American Type Culture Collection), ATCC保藏号 HB9469。抗FcyRI MAb 22、MAb 22的F(ab')2片段可得自Medarex， Inc. (Aiinandale, N丄)。在其它实施方案中，抗Fcy受体抗体是羊克隆抗体 22的人源化形式(H22)。 H22抗体的制备和表征参见Graziano, R. F. 等(1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002和PCT/US93/10384。产生H22 抗体的细胞系于1992年11月4日保藏于美国典型培养物保藏中心， 名称为HA022CL1,保藏号为CRL 11177。在再一些优选的实施方案中，Fc受体的结合特异性是由结合人 IgA受体(例如Fca受体(FcaRI (CD89)))的抗体提供的，人免疫球蛋白 A (IgA)优选并不阻断这样的结合。术语"IgA受体"包括位于19号 染色体上的一个a-基因的基因产物(FcaRI)。已知该基因编码几种55-110 kDa的可变剪接的跨膜同种型。FcaRI (CD89)在单核细胞/巨噬细 胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞中是组成型表达的，但在非效应 细胞群体中却不是这样。FcaRI对于IgAl和IgA2来说具有中等亲和 力(约等于5xl07 M-1)，当暴露给细胞因子(例如G-CSF或GM-CSF (Morton等，Critical Reviews in Immunology 16:423-440 (1996》)时，会 增加该亲和力。已经描述了 4种FcaRI-特异性单克隆抗体，分别是 A3、 A59、 A62和A77，它们结合IgA配体结合区外的FcaRI，参见
例如Monteiro等，J. Immunol. 148:1764 (1992)。在另一个实施方案中，本发明的抗体为scFv片段与人IgGl同 种型的Fc部分(CH2 & CH3)直接融合的形式(在本文中称为scFv-Fc 构建体)。scFv-Fc融合构建体参见例如Fredericks等，Protein Engineering Design and Selection 17:95-106 (2003), Powers等，J. Imunological Methods 251:123-135 (2001), Shu等，PNAS 90:7995-7999 (1993)， Hayden等，Therapeutic Immunology 1:3-15 (1994)。FcaRI和FcyRI是用于本发明的优选的触发受体，因为它们(l) 主要是在免疫效应细胞(例如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞) 中表达；(2)高水平表达(例如每细胞5,000-100,000); (3)是细胞毒活 性(例如ADCC、吞噬作用)的介导物；(4)介导抗原的增强抗原呈递， 所述抗原包括耙向它们的自身抗原。在其它实施方案中，本发明的双特异性分子和多特异性分子还 包含结合特异性，该特异性识别、例如结合把细胞抗原，例如CD148。 在一个具体的实施方案中，结合特异性是由本发明的人单克隆抗体 提供的。尽管优选人单克隆抗体，但是可用于本发明的双特异性分子和 多特异性分子的其它抗体是鼠单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和人源 化单克隆抗体。通过本领域已知的重组DNA技术，可制备嵌合小鼠-人单克隆 抗体(即嵌合抗体)。例如，将编码鼠(或其它物种)单克隆抗体分子的 Fc恒定区的基因用限制酶消化，去除编码鼠Fc的区域，并且取代编 码人Fc恒定区的基因的相应部分。(参见Robinson等，国际专利公开 PCTYUS86/02269; Akira等，欧洲专利申请184,187; Taniguchi, M.，欧 洲专利申请171,496; Morrison等，欧洲专利申请173,494; Neuberger 等，国际申请WO 86/01533; Cabilly等，美国专利第4，816,567号； Cabilly等，欧洲专利申请125，023; Better等，Science 240:1041-1043 (1988); Liu等，PNAS 84:3439-3443 (1987); Liu等，1987, J. Immunol.139:3521-3526; Sun等(1987) PNAS 84:214-218; Nishimura等，Cane. Res. 47:999-1005 (1987); Wood等，Nature 314:446-449 (1985); Shaw 等，丄Natl Cancer Inst. 80:1553-1559 (1988)。还可用来自人Fv可变区的相应序列，置换不直接参与抗原结合 的Fv可变区序列，使嵌合抗体进一步人源化。有关人源化嵌合抗体 的一般性综述参见Morrison, Science 229:1202-1207 (1985)和Oi等， BioTechniques 4:214 (1986)。这些方法包括分离、操作和表达核酸序 列，所述核酸序列编码来自至少一条重链或轻链的所有或部分免疫 球蛋白Fv可变区。这类核酸的来源是本领域技术人员众所周知的， 例如，可得自7E3， 一种产生抗GPIIbII;抗体的杂交瘤。然后可将编 码嵌合抗体或其片段的重组DNA克隆到合适表达载体中。或者，还 可通过CDR取代而制备合适的人源化抗体，参见美国专利笫5,225，539 号；Jones等，Nature 321:552-525 (1986); Verhoeyan等，Science 239:1534 (1988); Beidler等，J. Immunol. 141:4053-4060 (1988)。特定人抗体的CDR可以用至少一部分非人类CDR取代，或仅 有部分CDR可以用非人类CDR取代。只需要取代人源化抗体与Fc 受体结合所需的CDR部分。可以通过任何方法，使抗体人源化，只要所述方法能够用来自 非人类抗体的CDR取代人抗体的至少部分CDR。 Winter介绍了 一种 方法，可用于制备本发明的人源化抗体(英国专利申请GB 2188638A, 1987年3月26日申请)，所述文献的内容通过引用结合到本文中。 可以采用国际申请WO 94/10332 (发明名称是Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes (针对人单核吞噬细胞上免疫球蛋白G的Fc受体的人源化抗体))所描 述的寡核苷酸定点诱变方法，用非人类CDR取代人CDR。本发明范围之内还包括嵌合抗体和人源化抗体，其中具有特异 性氨基酸取代、缺失或添加。具体地讲，优选的人源化抗体在构架 区具有氨基酸取代，例如为了改善与抗原的结合。例如，在具有小
鼠CDR的人源化抗体中，位于人构架区的氨基酸可以被位于小鼠抗 体相应位置上的氨基酸取代。在某些情况下，这样的取代已知能改 善人源化抗体与抗原的结合。具有氨基酸添加、缺失或取代的抗体 在本文中称为修饰抗体或改变抗体。术语修饰抗体也包括以下抗体，例如已通过抗体部分的缺失、 添加或取代而修饰的单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。例如， 可通过缺失恒定区并用能增加抗体半寿期(例如血清半寿期)、稳定性 或亲和性的恒定区来取代所缺失的恒定区，从而修饰抗体。任何修 饰都包括在本发明的范围之内，只要双特异性分子和多特异性分子 具有至少一个对FqR具有特异性的抗原结合区，并能触发至少一个 效应子功能。可以使用化学技术(参见例如D. M. Kranz等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807 (1981)、 "polydoma"技术(参见美国专利第4,474,893 号(Reading))或重组DNA技术，制备本发明的双特异性分子和多特 异性分子。具体地讲，可以^使用本领域已知的方法以及本文所提供的实施 例中描述的方法，将组成结合特异性分子例如抗FcR和抗CD148结 合特异性分子缀合，制备本发明的双特异性分子和多特异性分子。 例如，可分别产生双特异性分子和多特异性分子的每种结合特异性， 再相互连接。当结合特异性分子是蛋白质或肽时，可以用各种各样 的偶联剂或交联剂进行共价缀合。交联剂的实例包括A蛋白、碳二 .亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-疏代乙酸酯(SATA)、 5,5'-二硫代双 (2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)、 N-琥珀酰 亚胺基-3_(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基) 环己烷-l-曱酸硫代琥珀酰亚胺基酯(sulfo-SMCC)(参见例如 Karpovsky等(l984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, M A等(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。其它方法包括以下文献中介绍的方法Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan等(Science (1985) 229:81-83)和Glennie等(J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375)。优选的 缀合剂是SATA和sulfo-SMCC，这两种都得自Pierce Chemical Co. (Rockford， IL)。任何"接头"基团都是任选的。如果有的话，其化学结构并不 重要，因为它们主要是作为间隔基。接头优选由氨基酸经肽键连接 在一起而构成。因此，在优选的实施方案中，接头是由1-20个氨基 酸经肽键连接而构成的，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。 本领域技术人员可以理解，这些氨基酸中的一个或多个可被糖基化。 在一个更优选的实施方案中，这l-20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、 脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。甚至更优选的接头大部分 是由无立体位阻的氨基酸(例如甘氨酸和丙氨酸)所构成的。因此，优 选的结构是聚甘氨酸(尤其是(Gly).sub.5、 (Gly).sub.8)、聚(Gly-Ala)和 聚丙氨酸。也优选Gly和Ala的组合。也可以用非肽接头。例如，可以使用烷基接头，例如-NH-(CH.sub.2)s-C(0)—,其中s=2-20。这些烷基接头还可被任一无立体位 阻的基团(例如低级烷基(例如Cl-C6)低级酰基、卣素(例如C1、 Br)、 CN、 NH2、苯基等)取代。示例性的非肽接头是PEG接头，分子量为 100-5000 kDa,优选100-500 kDa。可以按照与上述方法相同的方法， 改变肽接头，以形成衍生物。当结合特异性分子是抗体(例如两个人源化抗体)时，它们可以通 过两条重链的C端铰链区的二硫键缀合在一起。在一个具体的优选 实施方案中，在缀合之前，铰链区经修饰后含有奇数、优选一个巯 基残基。或者，两个结合特异性分子可以在同一栽体中编码并且在同一 宿主细胞中表达和装配。该方法尤其可用于以下情况双特异性分 子和多特异性分子是MabxMAb、 MabxFab、 FabxF(ab')2或配体xFab 融合蛋白。本发明的双特异性分子和多特异性分子，例如双特异性 分子，可以是单链分子，例如单链双特异性抗体、包含一个单链抗
体和结合决定子的单链双特异性分子、或者两个包含结合决定子的 单链双特异性分子。双特异性分子和多特异性分子也可以是单链分 子，或者可包括至少两个单链分子。双特异性分子和多特异性分子的制备方法参见例如美国专利第5,260,203号、美国专利第5,455,030 号、美国专利第4,881,175号、美国专利第5,132,405号、国专利第 5,091,513号、美国专利第5,476,786号、美国专利第5,013,653号、 美国专利第5,258,498号和美国专利笫5，482,858号。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、 FACS分 析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定，可以证实双特异性 分子和多特异性分子与其特异性靶的结合。这些测定方法的每一种 通常都是检测具体目标蛋白质-抗体复合物是否存在，即通过使用对 目标复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体)。例如，可以使用能识 别并特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段，检测FcR-抗体复合物。或者，可以使用各种其它免疫测定方法来检测复合物。 例如，可以给抗体加上放射性标记并用于放射免疫测定(RIA)(参见 例^口 Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, 1986 年3月，所述文献通过引用结合到本文中)。可以通过这些方法，使 用Y计数器或闪烁计数器，或者通过放射自显影技术，检测放射性同 位素。抗体及其抗原结合区也可与载体结合，用于定向给予指定位置。 在一个实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合区，所述抗体或其抗原结合区与至少一个载体(Fl, F2)通过肽的N-端、C-端或一个氨基酸残基侧链相结合。也可使用多个栽体；例如Fc在两端，或者Fc在一端，而PEG基团在另一端或侧链。Fc区是一个优选的栽体。Fc区可与肽的N端或C端或这两端融合。如上所述，Fc变异体是本发明范围之内的合适载体。天然Fc可 以经专门的修饰，形成本发明的Fc变异体，只要保持与补救受体 (salvage receptor)的结合。参见例如WO 97/34631和WO 96/32478。 在这样的Fc变异体中，可以去除天然Fe的一个或多个位点，所述 位点提供本发明融合分子不需要的结构特征或功能活性。可以通过 以下方法去除这些位点例如取代或缺失残基，将残基插入到所述 位点中，或者截短含有所述位点的部分。插入或取代的残基也可以 是改变的氨基酸，例如肽模拟物或D-氨基酸。因为许多原因，Fc变 异体可能是需要的，其中的一些原因如下所述。示例性的Fc变异体 包括这样的分子和序列，其中1. 去除参与二硫键形成的位点。这样的去除，可避免与用于产 生本发明分子的宿主细胞中存在的其它含半胱氨酸的蛋白质发生反 应。为了此目的，N-端含半胱氨酸的区段可以被截短，或者半胱氨 酸残基可以缺失或被其它氨基酸(例如丙氨酰、丝氨酰)取代。甚至当 半胱氨酸残基被去除时，单链Fc区仍可形成二聚体Fc区，该区是 非共价结合的。2. 修饰天然Fc，使其与所选宿主细胞更相容。例如，可以去除 典型天然Fc N-端附近的PA序列，该序列在大肠杆菌(五.co/z')中可被 消化酶(例如脯氨酸亚氨基肽酶)识别。也可以添加N-端甲硫氨酰残 基，尤其是在大肠杆菌等细菌细胞中重组表达分子时。3. 去除天然Fc N-端部分，以防止在所选宿主细胞中表达时N-端不均一性。为了此目的，可以缺失N-端开始的前20个氨基酸残基 中的任一个，尤其是在l、 2、 3、 4和5位上的残基。4. 去除一个或多个糖基化位点。通常糖基化的残基(例如天冬酰 胺)可具有细胞溶解效应。这些残基可缺失或用未糖基化残基(例如丙 氨酸)取代。5. 去除参与补体相互作用的位点，例如Clq结合位点。例如， 可以缺失或取代人IgGl的EKK序列。补体募集对于本发明分子来 说可能不利，所以可避免用这样的Fc变异体。
6. 去除影响与Fc受体但不是补救受体结合的位点。天然Fc可 具有与某些白细胞相互作用的位点，这些位点对本发明的融合分子 来说是不需要的，所以可以被去除。7. 去除ADCC位点。ADCC位点是本领域已知的。有关1gGl 的ADCC位点，参见例如Molec. Immunol. 29 (5):633-9 (1992)。这些 位点对本发明的融合分子来说也是不需要的，可以被去除。8. 当天然Fc来自非人类抗体时，天然Fc可以被人源化。通常， 为了使天然Fc人源化，可以用人类天然Fc中正常存在的残基取代 非人类天然Fc中的所选残基。抗体人源化技术是本领域众所周知的。一种替代载体是能够与补救受体结合的蛋白质、多肽、肽、抗 体、抗体片段或小分子(例如肽模拟物化合物)。例如，可用作栽体的 多肽参见美国专利第5,739,277号，1998年4月14日授予Presta等。 也可以通过噬菌体展示，来选择与FcRn补救受体结合的肽。这类补 救受体结合化合物也可包括在"载体"含义之内以及本发明的范围 之内。应选择半寿期增加(例如通过避免蛋白酶识别的序列)和免疫原 性下降(例如通过支持非免疫原性序列，正如在抗体人源化中发现的 那样)的所述载体。如上所述，聚合物栽体也可用于Fl和F2。化学部分用作栽体 的连接方法是目前现有的方法，参见例如专利合作条约(Patent Cooperation Treaty, PCT)国际公布号WO 96/11953，发明名称是"N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods", 所述文献通过引用全部结合到本文中。该PCT申请公开了水溶性聚 合物与蛋白质N-端的选择性连接。优选的聚合物载体是聚乙二醇(PEG)。 PEG可以具有任何常规分 子量，可以是直链也可以是支链。PEG的平均分子量范围优选约2 千道尔顿(kDa)至约100 kDa,更优选约5 kDa至约50 kDa，最优选 约5 kDa至约10 kDa。 PEG基团通常是通过酰化或还原性烷基化， 通过PEG部分上的活性基团(例如餒基、氨基、巯基或酯基)与本发
明化合物连接。用于合成肽的PEG化(PEGylation,加入聚乙二醇)的策略包括 通过在溶液中形成共轭键，将各自携带可彼此反应的特定官能团的 肽与PEG部分结合在一起。用本领域已知的常规固相合成，可以容 易地合成肽。肽在特定位点上用合适官能团"预先活化"。在与PEG 部分反应之前，纯化并彻底表征前体。肽与PEG的连接通常在水相 中进行，可以通过反相分析型HPLC容易地进行监测。通过制备型 HPLC可以容易地纯化PEG化肽，并通过分才斤型HPLC、氨基酸分 析和激光解吸质i普进行表征。多糖聚合物是可用于蛋白质修饰的另 一 类水溶性聚合物。葡聚 糖是多糖聚合物，由主要以al-6键连接的各葡萄糖亚单位组成。可 以得到多种分子量范围的葡聚糖，容易得到的分子量为约1 kDa至约 70kDa。葡聚糖是用作本发明载体的合适水溶性聚合物，可以单独或 与另一个载体(例如Fc)联用。参见例如WO 96/11953和WO 96/05309。已经报道了与治疗用或诊断用免疫球蛋白缀合的葡萄糖的 应用；参见例如欧洲专利公布号0 315 456,所述文献通过引用结合 到本文中。当葡聚糖用作本发明的载体时，优选约1 kDa至约20 kDa 的葡聚糖。抗体缀合物/免疫毒素另一方面，本发明的特征在于与治疗部分缀合的人抗CD148单 克隆抗体或其片段，所述治疗部分例如细胞毒素、药物或放射性同 位素。当与细胞毒素缀合时，这些抗体缀合物被称为"免疫毒素"。 细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何药物。实 例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依未丁、丝 裂霉素、依'托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、 秋水仙素、多柔比星、柔红霉'素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、 普卡霉素、放线菌素D、 l-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡
因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗药包括但不限于抗代谢药(例如曱氨蝶呤、6-巯基噤呤、6-硫鸟噤呤、 阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶decarbazine)、烷化剂(例如氮芥、thioepa苯丁 酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺 (cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C 和顺-二氯二胺铂(II) (DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(旧称 道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素D(旧称放线菌素)、博 来霉素、普卡霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱 和长春花碱)。可以与本发明抗体缀合的治疗用细胞毒素的其它实例 包括加利车霉素和倍癌霉素。本发明的抗体可以与放射性同位素(例 如放射性碘)缀合，得到用于治疗CD148相关疾病例如癌症的细胞毒 性放射性药物。本发明的抗体缀合物可用于修饰给定的生物反应，其药物部分 不得视为对经典化学治疗药的限制。例如，药物部分可以是具有所 需生物活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质可包括例如酶活性毒素或 其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素 或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子或干4^0素-丫；或生物反应调 节剂，例如淋巴因子、白介素-1 ("IL-r)、白介素-2 ("IL-2")、白介素 -6 ("IL-6")、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子("GM-CSF")、粒细胞集落 刺激因子("G-CSF")或其它生长因子。将所述治疗部分与抗体缀合的技术是众所周知的，参见例如 Arnon等，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 等(编著)，第243-56页(Alan R. Liss， Inc. 1985); Hellstrom等， "Antibodies For 'Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (笫2版), Robinson等(编著)，第623-53页(Marcel Dekker， Inc. 1987); Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications,Pinchera等(编著)，第475-506页(1985); "Analysis, Results, And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin等(编著)，第303-16页(Academic Press 1985),和Thorpe等，"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)。药物组合物抗CD148抗体的药物组合物包括在本发明范围内。包含抗体的 药物组合物详见例如美国专利第6,171,586号(Lam等)，2001年1月 9曰授权。这类组合物包含治疗有效量或预防有效量的如上所述的抗 体或其片段、变异体、衍生物或融合物，以及药学上可接受的载体 和/或药学上可接受的盐。在一个优选的实施方案中，药物组合物包 含与CD148表位结合并激活CD148活性的抗体以及药学上可接受的 载体和/或药学上可接受的盐。通常，特异性结合剂将是足够纯化的， 供动物给药用。药学上可接受的载体本文所用的"药学上可接受的载体"包括生理上相容的任何和 所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸 收延迟剂等。在具体的实施方案中，载体适于静脉内、肌内、皮下、 胃肠外、脊柱或表皮给药(例如通过注射或输注)。根据给药途径，活 性化合物即抗体、双特异性分子和多特异性分子，可用材料进行包 衣，以保护所述化合物免遭酸或其它自然条件的作用而失活。在另 一个具体的实施方案中，药物组合物与药学上可接受的载体配制在 一起，用于人类。可用于本发明药物组合物的合适水性或非水性载体的实例包括 水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合 物、植物油(例如橄榄油)和注射用有机酯类(例如油酸乙酯)。可以通
过例如使用包衣材料(例如卵磷脂)，通过在分散条件下保持所需粒 径，以及通过使用表面活性剂，乂人而保持适当的流动性。这些组合物也可含有辅剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分 散剂。通过灭菌工艺(参见上文)并通过加入不同抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯曱酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)，能够确保预防耀 生物的存在。组合物中最好还可包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。 另外，可以通过添加延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)达到注射用 药物形式的延迟吸收。"药学上可接受的盐"是指保持母体化合物所需生物活性、又 没有任何不想要的毒理学效应的盐(参见例如Berge， S. M.等(1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19)。这类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加 成盐包括由无毒无机酸和无毒有;^几酸衍生的盐，所述无机酸例如盐 酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，所述有机酸 例如脂族一羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族 酸、脂族磺酸和芳族磺酸等。碱加成盐包括由碱土金属衍生的盐(例 如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等)以及由无毒有机胺(例如N,N'-二千基 乙二胺、N-曱基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、 普鲁卡因等)衍生的盐。本发明的药物组合物可含有用于调节、维持或预防以下特性的 制剂材料例如pH、渗透压、粘度、澄明度、颜色、等渗性、气味、 无菌性、稳定性、溶出率或释放率、组合物的吸收或渗透性。合适 的制剂材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、 精氨酸或赖氨酸)；抗孩t生物药；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚斩u酸钠 或亚硫酸氬钠)；緩冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸 盐、磷酸盐、其它有机酸)；增量剂(例如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂[例 如乙二胺四乙酸(EDTA)];络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯:院酮、p-环糊精或羟丙基-P-环糊精)；填充剂；单糖；二糖和其它糖(例如葡萄 糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；
着色剂；矫味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷 酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵、 苯曱酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸曱酯、对羟基苯 曱酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂 或润湿剂(例如pluronics、 PEG、脱水山梨酸酯、聚山梨酯(例如聚山 梨酯20、聚山梨酯80)、曲拉通、三羟曱基M甲烷、卵磷脂、胆固 醇、四丁酚醛(tyloxapal));稳定增强剂(蔗糖或山梨醇)；张力增强剂(例 如卣化碱金属(优选氯化钠或氯化钾、甘露醇、山梨醇)；给药载体； 稀释剂；赋形剂和/或药用辅料。(Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版,A. R. Gennaro编著，Mack Publishing Company, 1990)。本领域技术人员可根据例如预期给药途径、给药方式和所需剂 量，确定最佳药物组合物。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,出处同上。这样的组合物可影响特异性抗体的物理状态、 稳定性、体内释放率和体内清除率。药物组合物中主要溶媒或载体可以是水性或非水性的。例如， 合适的溶媒或载体可以是注射用水、生理盐水或人工脑脊液，可补 充其它常用于胃肠外给药的组合物的材料。中性緩沖盐溶液或掺入 血清白蛋白的盐水是另 一示例性载体。其它示例性的药物组合物包 括Tris緩沖液(约pH7.0-8.S)或乙酸盐緩冲液(约pH4.0-5.5),这些緩 沖液中还可包含山梨醇或其合适代用品。在本发明的一个实施方案 中，可通过将含有所需纯度的所选组合物与任选的配方剂混合在一 起，制备呈冻干饼或水溶液形式的结合剂组合物(Remington's Pharmaceutical Sciences,出处同上)。此外，结合剂产物可用合适贝武 形剂(例如蔗糖)配制成冻干剂。可选择用于胃肠外给药的药物组合物。或者，可选择用于吸入 或肠内给药用组合物，例如口服、耳用、眼用、直肠或阴道用。这 类药学上可接受的组合物的制备方法是在本领域技术范围内。
制剂成分的浓度是给药部位能够接受的浓度。例如，用于使组合物保持在生理pH或稍低pH的緩冲液的pH范围通常为约5至约8。 当本发明的化合物是作为药物给予人和动物时，它们可单独给 予，或者作为含有0.01-99.5%、更优选0.1-90%的活性成分以及药学 上可接受的载体的药物组合物。举例来说，本发明的药物组合物可 含有抗CD148抗体或其抗原结合区，其浓度为约lmg/ml至约 30mg/ml,或者约5mg/ml至约30mg/ml。在某些实施方案中，本发明的人单克隆抗体可以配制为确保适 当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高度亲水性化合物。 为了保证本发明的治疗用化合物能够穿过BBB (如果需要的话)，可 以将它们配制在例如脂质体中。关于脂质体的制备方法，参见例如 美国专利第4,522,811号、第5,374,548号和笫5,399,331号。脂质体 可包含一个或多个选择性运输到特定细胞或器官的部分，因而能增 加把向给药(参见例如V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:68》。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如美国专利第 5,416,016号(Low等))；甘露糖苦(Umezawa等，(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038);抗体(P. G. Bloeman等(1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais等(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 表面A蛋白受体(Briscoe等(1995) Am. J. Physiol. 1233:134)，这些不 同类型的部分都可包括在本发明的制剂以及本发明分子的组分之 内；p120 (Schreier等(1994) J. Biol. Chem. 269:9090);另参见K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273。在一个本发明的实施方案中， 本发明的治疗用化合物配制在脂质体中；在一个更优选的实施方案 中，脂质体包含靶向部分。在一个最优选的实施方案中，通过快速 大剂量注射(推注)到接近肿瘤或感染的部位而给予脂质体中的本发明 治疗用化合物。组合物必须具有流动性，使得容易注射。它在制造 和贮存条件下必须稳定，并且必须防止细菌和真菌等微生物的污染 作用。治疗有效量无论所选给药途径如何，都可采用本领域技术人员已知的常规 方法，将用于合适水合形式和/或本发明药物组合物的本发明4匕合物 配制成药学上可接受的剂型。与未经治疗的患者相比，"治疗有效量"优选抑制肿瘤生长至少约20%,更优选至少约40%,甚至更优 选至少约60%,还更优选至少约80%。可以在预测对人类肿瘤功效 的动物模型系统中，评价化合物抑制癌症的能力。或者，可以通过 技术人员已知的测定方法，检查化合物的抑制能力(例如体外抑制能 力)，来评价组合物的这一特性。治疗有效量的治疗用化合物可以缩 小患者的肿瘤大小，或改善其它症状。本领域普通技术人员能够根 据患者体型、患者症状的严重程度、具体组合物或所选给药途径等 因素，来确定所述剂量。用于治疗的有效量的药物组合物将取决于治疗情况和治疗对 象。本领域技术人员能理解，治疗用合适的剂量水平将会部分因以 下因素的变化而异所给予的分子、所用抗体或抗原结合区的适应 症、给药途径和患者体型(体重、体表或器官大小)和状况(年龄和一 般健康状况)。因此，临床医师可决定剂量并调整给药途径，以获得 最佳疗效。优选的抗CD148抗体或其抗原结合区在溶液中能够充分结合 CD148，其浓度小于lpM，优选小于0.1^M,更优选小于O.OlnM。 "充分"是指观察到因抗CD148抗体或其抗原结合区的调节作用， 使内皮细胞增殖和迁移至少降低50%,降低50%在本文中称为IC50值。当给予生理上可耐受的组合物时，治疗有效量的本发明抗CD148 抗体或其抗原结合区的通常剂量足以达到的血浆浓度(根据单次给予 抗体后的cmax数据)为例如约0.01pg/ml至约300吗/ml。在另一个实
施方案中，浓度可以是约lug/ml至约300ug/ml。在又一个实施方案 中，浓度可以是约lpg/ml至约75ng/ml。在再一个实施方案中，浓 度可以是约15pg/ml至约50pg/ml。当然，剂量因给药频率和持续时 间而异。当给予生理上可耐受的组合物时，治疗有效量的呈多肽形式的 本发明抗CD148抗体或其抗原结合区的多肽含量足以达到的血浆浓 度为约0.001jxg/ml至约10ng/ml，或约0.05昭/ml至约1.0|Lig/ml。才艮 据多肽分子量为约15,000克/摩尔(即15,000Da),血浆浓度(摩尔浓度) 可以是例如约O.OOOIiliM至约lmM。换句话说，按体重算的剂量可 以是约0.01mg/kg至约30mg/kg,或约0.05mg/kg至约20mg/kg，每 天给予一次或多次，持续给予一天或几天。通常的剂量范围为约 0.1mg/kg至约100mg/kg以上，这取决于上述因素。在其它实施方案 中，剂量范围为lmg/kg至约100mg/kg;或5mg/kg至约100mg/kg。对于任何化合物，最初可以在细胞培养测定或动物模型(例如d、 鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴子)中，估计治疗有效剂量。动物才莫型也 可用于确定合适浓度范围和给药途径。这样的信息随后可用于确定 用于人体的有用剂量和给药途径。可根据需要治疗患者的相关因素，来确定准确剂量。可以调整 剂量和给药，以提供足够水平的活性化合物或维持所需效果。要考 虑的因素包括疾病状态的严重程度、患者一般健康状况、患者年龄、 体重和性别、给药时间和频率、药物联用、反应敏感性和对治疗的 反应如何。长效药物组合物可每3-4天、每周、每两周给予一次，这 取决于特定制剂的半寿期和清除率。给药频率取决于所用制剂中结合剂分子的药代动力学参凄t。通 常给予组合物，直到剂量已达到所需效果。因此，组合物可在一段 时间内以单剂量、或多剂量(以相同或不同浓度/剂量)给予，或以连续 输注方式给予。更准确的合适剂量可按常规方式确定。可以通过使 用合适剂量-反应数据，确定合适剂量。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以不同，以 达到能有效实现特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应的活 性成分用量，而且对患者无毒。所选剂量水平将取决于各种药^动 力学因素，包括具体使用的本发明组合物或其酯、盐或酰胺的活性、 给药途径、给药时间、具体使用的化合物的排泄率、治疗持续时间、 与具体使用的组合物联用的其它药物、化合物和/或材料、患者的年 龄、性别、体重、病症、 一般健康状况和所治疗患者先前的医疗史、 以及医学领域众所周知的其它因素。具有本领域普通知识的医师或兽医可容易地确定有效量的所需药物组合物并开出处方。例如，医师或兽医在开始使用本发明化合 物时，在药物组合物中本发明化合物的剂量低于要达到所需疗效的 水平，然后再逐步增加剂量，直到达到所需效果。 一般而言，本发 明组合物的合适日用量是有效产生疗效的最低剂量的化合物用量。 这样的有效量通常取决于上述因素。优选的给药途径可以是静脉内、 肌内、腹膜内或皮下，优选给予粑部位附近。如有必要，治疗用组合物的有效日用量可在一天内、以合适间隔分别给予2、 3、 4、 5、 6......次亚剂量，任选以单位剂型给予。尽管本发明的化合物可以单独给 予，但是优选以药物制剂(组合物)的形式给予化合物。组合物可以是无菌的并且具有流动性，使得可以通过注射给予 该组合物。载体除了可以是水之外，还可以是等渗緩冲盐溶液、乙 醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。 可以通过例如使用包衣材料(例如卯磷脂)，通过在分散条件下保持所 需粒径，以及通过使用表面活性剂，从而保持适当的流动性。在许 多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇 或山梨醇)和氯化钠。可以通过向组合物中添加延迟吸收剂(例如单石更 脂酸铝和明胶)达到注射用药物形式的长期吸收。当如上所述适当地保护活性化合物时，化合物可以口服给予， 例如与惰性稀释剂或可同化的可食载体一起给予。
本发明组合物(例如人抗体、多特异性分子和双特异性分子)的给 药方法是本领域已知的。所用分子的合适剂量取决于患者年龄和体重以及具体使用的药物。所述分子可以与放射性核素(例如1311、 90Y、 105Rh、铟-lll等)偶联，参见Goldenberg，D.M.等(1981) Cancer Res. 41: 4354-4360和EP 0365 997。另一方面，本发明涉及免疫缀合 物，所述缀合物包含与放射性同位素、细胞毒剂(例如加利车霉素和 倍癌霉素)、细胞抑制剂或化疗药物连接的本发明抗体。本发明的组 合物(例如人抗体、多特异性分子和双特异性分子)也可以与抗感染药 连接。给药途径药物组合物的给药途径按照已知方法进行，例如口服、通过以 下途径注射静脉内、腹膜内、脑内(实质内(intra-parenchymal))、脑 室内、肌内、目艮内、动脉内、门静脉内(intraportal)、损害内途径、髓 内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内注射、鼻内、肠内、局部、 舌下、尿道内、阴道内或直肠，以及通过緩释系统或通过植入禁置二 如有必要，可以通过快速注射(推注)或连续输注(滴注)或植入装置给 予组合物。或者，可以通过将吸附或包埋所需分子的膜、海绵或另一合适 材料植入体内，局部给予组合物。当使用植入装置时，该装置可植 入到任何合适的组织或器官中，可以通过扩散、定时释放大丸剂或 连续给予所需分子。在某些情况下，最好以离体方式使用药物组合物。在这类情况 下，可从患者体内取出细胞、组织或器官，暴露给药物组合物，然 后再将这些细胞、组织和/或器官重新植入患者体内。在其它情况下，可以使用例如本文所述的方法，通过植入某些 经基因工程改造的细胞，以表达和分泌所述多肽，从而给予本发明 的结合剂(例如抗体或其抗原结合区)。所述细胞可以是动物细胞或人
体细胞，可以是同源、异源或异种细胞。任选细胞是无限增殖化细 胞。为了减少免疫反应的机会，可以将细胞包成胶嚢，以免向周围 组织浸润。包胶嚢材料通常是生物相容性的、半渗透性聚合外壳或 膜，能允许释放蛋白质产物，但防止细胞受到患者免疫系统或来自 周围组织的其它有害因素的破坏。治疗用组合物可以用本领域已知的医疗装置来给予。例如，在 一个优选的实施方案中，本发明的治疗用组合物可以用例如以下文献中公开的无针皮下注射装置来给予美国专利5，399，163、 5,383,851、 5，312,335、 5,064,413、 4,941，880、 4,790,824或4,596,556。 可用于本发明的众所周知的植入物和组件的实例包括美国专利笫 4,487,603号，它公开了一种用于以受控速率分配药物的可植入微量 输注泵；美国专利第4，486，194号，它公开了 一种用于透过皮肤给药 的治疗装置；美国专利第4,447,233号，它公开一种用于以精确的输 注速率递药的药物输注泵；美国专利笫4,447，224号，它公开了一种 用于连续递药的可变流动可植入输注装置；美国专利笫4,439,1%号， 它公开了 一种具有多室区室的渗透性递药系统；和美国专利第 4,475,196号，它公开了一种渗透性递药系统。这些专利都通过引用 结合到本文中。许多其它这样的植入物、递药系统和组件是本领域 技术人员已知的。当需要胃肠外给药时，用于本发明的治疗用组合物可以呈无热 源的、胃肠外可接受的水溶液剂形式，其中包含所需特异性结合剂 以及药学上可接受的溶媒。用于胃肠外注射的特别合适的溶媒是无 菌蒸馏水，其中结合剂配制成无菌、等渗溶液，被适当保存。又一 种制剂可包括所需分子与例如注射用孩t球体、生物可蚀解的颗粒、 聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、微珠或脂质体等试剂的制剂，以便 能提供控释或緩释产品，可通过緩释型注射剂给药。也可使用透明 质酸，它可具有在循环中延长持续时间的效果。引入所需分子的其 它合适方法包括可植入给药装置。
另一方面，适于胃肠外给药用的药物制剂可配制在水溶液中，优选在生理相容的緩冲液(例如Hanks溶液、林格液)或生理緩冲盐溶 液中。注射用水性混悬剂可含有增加混悬剂粘度的物质，例如羧甲 基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。而且，活性化合物的混悬剂可以制 成合适的注射用油性混悬剂。合适的亲脂溶剂或溶^^某包括脂肪油(例 如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯、甘油三酯)或脂质体。非 脂聚阳离子氨基聚合物也可用于给药。任选混悬剂也可含有合适的 稳定剂或增加化合物溶解度的增溶剂以及允许制备高浓度溶液剂。在另一个实施方案中，药物组合物可配制成用于吸入给药。例 如，结合剂可配制成吸入用干粉。多肽或核酸分子吸入溶液剂也可 与抛射剂一起配制，用于给予气溶胶，在又一个实施方案中，溶液 剂可以雾化。肺部给药进一步描述于以下文献PCT申请号 PCT/US94/001875，所述文献描述了化学修饰蛋白的肺部给药。使用适于口服给药剂量的本领域众所周知的药学上可接受的载 体，也可配制供口服给药的药物组合物。所述载体能让药物组合物 配制成片剂、丸剂、锭剂、胶嚢剂、液体制剂、凝胶剂、糖浆剂、 膏剂(slurry)、混悬剂等，供患者服用。在本发明的一个实施方案中，片剂和胶嚢剂)的载体一起配制。例如，胶嚢剂可以设计成在胃肠道 内释放制剂的活性部分，当生物利用度最佳、而系统前(pre-systemic) 降解最低时。可以包括其它添加剂，以促进结合剂分子的吸收。稀 释剂、矫味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂 和粘合剂也可使用。口服用药物制剂可制备如下通过将活性化合物与固体赋形剂 混合在一起，然后加工所得颗粒状混合物(任选在碾磨后)，以得到片 心或或锭心。如有必要，可添加合适的辅料。合适的赋形剂包括碳 水化合物或蛋白质填充剂，例如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇和 山梨醇；玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉或其它植物
淀粉；纤维素，例如曱基纤维素、羟丙基曱基-纤维素或羧曱基纤维 素钠；树胶，包括阿拉伯树胶和西黄蓍胶；和蛋白质，例如明胶和 胶原。如有必要，可加入崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷 酮、琼脂和海藻酸或其盐，例如藻酸钠。锭心可用于包上合适的包衣，例如浓糖液，其中也可含有阿4立 伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普胶、聚乙二醇和/或二氧 化钛、抛光溶液和合适的有机溶剂或混合溶剂。片剂或锭剂包衣中 可添加染料或颜料，用于产品的识别，或者用于表征活性化合物的 用量，即剂量。可供口服的药物制剂还包括明胶制成的两节式(push-fit)胶嚢剂， 以及明胶制成的软质密封胶嚢剂和包衣，例如甘油或山梨醇。两节 式胶嚢剂可含有活性成分以及填充剂或粘合剂(例如乳糖或淀粉)、润 滑剂(例如滑石粉或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂。在软质胶嚢剂中， 活性化合物可溶于或悬浮于合适的液体中，例如含有或不含稳定剂 的脂肪油、液体或液态聚乙二醇。另 一种药物组合物可涉及将有效量的结合剂与适于制备片剂的 无毒赋形剂混合在一起。将片剂溶于无菌水、或其它合适溶媒中， 可以制备单位剂型的溶液剂。合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释 剂，例如碳酸4丐、碳酸钠或碳酸氬钠、乳糖或磷酸4丐；或粘合剂， 例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，例如硬脂酸镁、》更脂酸或 滑石粉。另外的药物组合物对本领域技术人员来说是显而易见的，包括 含有结合剂分子的緩释或控释制剂。本领域技术人员也知道各种其 它緩释或控释制剂的配制技术，例如脂质体载体、生物可蚀解的獨: 粒或多孔珠和緩释型注射剂。参见例如PCT/US93/00829,所述文献 描述了多孔聚合微粒的控制释放，以给予药物组合物。緩释制剂的 其它实例包括成型产品形式的半透性聚合物基质，例如膜片或微胶 嚢剂。緩释基质可包括聚酯、水凝胶、聚交酯(美国专利笫3,773,919
号，EP 58,481)、 L-谷氨酸和Y-乙基-L-谷氨酸的共聚物[Sidman等， Biopolymers, 22:547-556 (1983)]、聚(2-羟乙基-曱基丙烯酸酯)[Langer 等，J. Biomed. Mater. Res" 15:167-277, (1981)]和[Langer等，Chem. Tech., 12:98-105 (1982)]、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，出处同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。緩释组合物也包括脂质体，脂质体可 用本领域已知的几种方法中的任一种来制备。参见例如Eppstein等， Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82:3688-3692 (1985); EP 36，676; EP 88，046; EP 143,949.供体内给药用的药物组合物通常必须是无菌的。可通过除菌滤 膜过滤而做到这一点。当组合物是冻干的，则可在冻干前后和重配 前后，用该方法除菌。胃肠外给药用组合物可以冻干形式或以溶液 形式贮存。另外，胃肠外组合物通常放置在带有无菌接口(access port) 的容器中，例如带有塞子的静脉内溶液袋或小瓶，而塞子可用皮下 注射针头剌穿。当配制成药物组合物时，它可贮存在无菌小瓶中，作为溶液剂、 混悬剂、凝胶剂、乳剂、固体或脱水或冻干粉针剂。这样的制剂可 以即用形式(ready-to-use form)或临用前需要重配的形式(例如冻干形 式)来贮存。在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于产生单剂量给药单 位的药盒。每个药盒可以包括第一容器和第二容器，其中笫一容器 中装有干燥的蛋白质，第二容器中装有水性制剂。本发明范围之内 还包括药盒，所述药盒包含单室和多室预灌装注射器(例如液体注射 器和冻干注射器(lyosyringe))。联合疗法另一方面，本发明提供组合物，例如药物组合物，其中含有一 种或多种本发明的人抗体或其抗原结合区，以及药学上可接受的载 体。在另一个实施方案中，组合物包含多种(例如两种以上)本发明的
分离的人抗体或其抗原结合区。在一个更具体的实施方案中，组合物中的每种抗体或其抗原结合区与不同的预先选择的CD148表位结 合。在一个实施方案中，联合药物中使用具有补体活性的人抗CD148 单克隆抗体，例如作为包含两种以上的人抗CD148单克隆抗体的药 物组合物。例如，抑制血管生成或表达CD148的细胞生长的人单克 隆抗体，也可以与另一种能在效应细胞存在下介导对扭细胞高效杀 伤的人抗体联合使用。在另一个实施方案中，组合物包括一种或多种本发明的双特异 性分子或多特异性分子(例如含有至少一个针对Fc受体的结合特异性 和至少一个针对CD148的结合特异性的分子)。因此，本发明包括将本发明的抗体或其抗原结合区给予同 一 患 者，并联合给予一种或多种其它的合适药物，各自都按照适于所述 药物的合适方案来给予。这包括同时给予本发明的特异性结合剂以 及一种或多种合适药物。本文所用的术语"同时给予"包括基本上 同时给予一种或多种本发明的抗体以及一种或多种其它合适药物。本文所用的术语"非同时"给予包括在不同时间内、以任何顺 序(无论是否重叠)给予一种或多种本发明的抗体或其抗原结合区以及 一种或多种其它合适药物。这包括但不限于用联合疗法中的各组分， 以及方案(其中药物可交替使用，或者其中一种组分是长期给予，而 其它组分则是间歇给予)，来序贯治疗(例如预处理、后处理或重叠处 理)。可以在同一组合物或单独的组合物中，以及通过相同或不同给 药途径，给予各组分。与生长因子的联合疗法可包括细胞因子、淋巴因子、生长因子 或其它造血因子，例如M-CSF、 GM-CSF、 TNF、 IL-1、 1L-2、 IL-3、 IL画4、 IL-5、 IL-6、 IL陽7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL-ll、 IL誦12、 IL-13、 IL國14、 IL-15、 IL誦16、 IL-17、 IL國18、 IFN、 TNF0、 TNF1、 TNF2、 G曙CSF、 Meg-CSF、 GM-CSF、血小板生成素、干细胞因子和红细胞生成素。
其它组合物可包括已知的血管生成素(angiopoietin)，例如Ang-l、 -2、 -4、 —Y和/或人Ang样多肽和/或血管内皮生长因子(VEGF)。生长因 子包括血管生成素、骨形态发生蛋白-1、骨形态发生蛋白-2、骨形态 发生蛋白-3、骨形态发生蛋白-4、骨形态发生蛋白-5、骨形态发生蛋 白-6、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-8、骨形态发生蛋白-9、 骨形态发生蛋白-10、骨形态发生蛋白-11、骨形态发生蛋白-12、骨 形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-14、骨形态发生蛋白-15、骨形 态发生蛋白受体IA、骨形态发生蛋白受体IB、脑衍生神经营养因子、 睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、细胞因子诱导的嗜中 性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2、细 胞因子诱导的嗜中性粒细胞趁化因子2、内皮细胞生长因子、内皮素 1、表皮生长因子、上皮衍生嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长 因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细 胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成 纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子 10、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶 质细胞系衍生神经营养因子受体-1 、神经胶质细胞系衍生神经营养因 子受体-2、生长相关蛋白、生长相关蛋白-1、生长相关蛋白-2、生长 相关蛋白-3、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长 因子受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样 生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质形成细胞生长因子、 白血病抑制因子、白血病抑制因子受体-1、神经生长因子、神经生长 因子受体、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、胎盘生长因子、胎盘 生长因子2、血小板衍生内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、 血小板衍生生长因子A链、血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生 长因子AB、血小板衍生生长因子B链、血小板衍生生长因子BB、 血小板衍生生长因子受体-1、血小板衍生生长因子受体-2、 pre-B细 胞生长刺激因子、干细胞因子、干细胞因子受体、转化生长因子-1、
转化生长因子-2、转化生长因子-1、转化生长因子-1.2、转化生长因 子-2、转化生长因子-3、转化生长因子-5、潜伏转化生长因子-1、转 化生长因子-1结合蛋白I、转化生长因子-I结合蛋白II、转化生长因 子-I结合蛋白III、肿瘤坏死因子受体I型(TNF-Rl)、肿瘤坏死因子 受体II型(TNF-R2)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体、血管内皮生长 因子和嵌合蛋白质及其生物活性片段或免疫活性片段。可以理解，本发明的抗体或其抗原结合区可以与一种或多种抗 炎药一起给予。本文所用的术语"抗炎药"通常是指能减少患者的 炎症或肺胀的任何药物。本文列举了大量示例性抗炎药，但是可以 理解,也有其它合适抗炎药在本文中没有具体列举，但也包括在本 发明之内。抗炎药可以是例如抑制炎性细胞因子与其受体间相互作用的化 合物。用于与本发明特异性结合剂联用的细胞因子抑制剂的实例包 括例如TGF-(3拮抗剂(例如抗体)，以及针对涉及炎症的白介素的拮抗 剂(例如抗体)。这类白介素在本文中有说明，优选包括但不限于IL-1、 IL画2、 IL-3、 IL國4、 IL-5、 IL誦6、 IL-8、 IL-9、 IL-ll、 IL國12、 IL-13、 IL-17 和IL-18。参见Feghali等，Frontiers in Biosci., 2:12-26 (1997)。示例性 抗体拮抗剂也包括针对21-28kD细胞表面糖蛋白CD52的抗体(例如 CamPath , Berlex Laboratories),抗IL-8抗体(和抗IL8-RB抗体)、抗 B-FGF抗体(和抗B-FGF受体抗体)、抗TWEAK抗体(和抗TWEAK 受体(即TWEAKR)抗体)、抗Adam/解联蛋白抗体、抗eph受体、抗 肝配蛋白抗体和抗PDGF-BB抗体。本发明的特异性抗体或其抗原结合区也可与蛋白激酶A 1型抑 制剂联用，以增强HIV感染者的T细胞增殖，所述患者同时接受抗 逆转录病毒疗法。神经生长因子(N GF)也可以与本发明的抗体或其抗原结合区联 用，以治疗某些病症。所述病症包括神经变性行疾病、脊髓损伤和 多发性硬化。可用该联合疗法治疗的其它病症是青光眼和糖尿病。
优选的联合疗法涉及将本发明的抗体或其抗原结合区以及一种或多种合适的IL-1抑制剂一起给予患者。IL-1抑制剂包括但不限于 IL-1的受体结合肽片段、针对IL-1或IL-lp或IL-1受体I型的抗体、 以及重组蛋白，所述重组蛋白包含IL-1或其修饰变异体的全部或部 分受体，包括遗传修饰的突变蛋白、多聚体形式和緩释制剂。特异 性拮抗剂包括IL-Ira多肽、IL-ip转化酶(ICE)抑制剂、拮抗型I IL-1 受体抗体、I型IL-1受体和II型IL-1受体的IL-1结合形式、抗IL-1 (包 括IL-la和IL-1(3和其它IL-1家族成员)的抗体、以及称为IL-1 Trap (Regeneron)的治疗药。IL-Ira多肽包括IL-Ira形式(参见美国专利第 5,075,222号)和修饰形式和变异体(包括以下文献中描述的那些美国 专利笫5,922,573号、WO 91/17184、 WO 92/16221和WO 96/09323)。 IL-1(3转化酶(ICE)抑制剂包括肽酰ICE抑制剂和小分子ICE抑制剂， 包括以下文献中描述的那些PCT专利申请WO 91/15577、 WO 93/05071、 WO 93/09135、 WO 93/14777和WO 93/16710;欧洲专利 申请0 547 699 。非肽酰化合物包括以下文献中介绍的那些化合物PCT 专利申请WO 95/26958、美国专利第5，552,400号、美国专利第 6,121,266号和Dolle等，J. Med. Chem., 39，笫2438-2440页(1996)。 其它ICE抑制剂描述于以下文献美国专利6,162,790、 6,204,261、 6,136,787、 6,103,711、 6,025,147、 6,008,217、 5,973，111、 5,874，424、 5,847,135、 5,843,904、 5,756，466、 5,656,627、 5,716,929。 I型IL-1受 体和II型IL-1受体的IL-1结合形式描述于以下文献美国专利 4,968,607、 4,968，607、 5,081,228、 Re 35,450、 5,319,071和5,350,683。 其它合适的IL-1拮抗剂包括但不限于衍生自IL-1的肽，所述肽能够 竟争性抑制IL-1信号受体、IL-1 RI型的结合。有关某些IL-1 (和其 它细胞因子)拮抗剂的其它指南可参见美国专利笫6，472,179号。另外，TNF抑制剂是合适的，包括但不限于TNF-a受体结合肽 片段、反义寡核苷酸或抑制TNF-a产生的核酶、针对TNF-a的抗体 和重组蛋白，所述重组蛋白包括TNF-a或其^f參饰变异体的所有或部
分受体，包括遗传修饰的突变蛋白、多聚形式和緩释制剂。TACE(胂 瘤坏死因子-a转化酶)抑制剂，例如TAPI (Immunex Corp.)和GW-3333X (Glaxo Wellcome Inc.),也是合适的。抑制IgA-oc-lAT复合物 形成的分子也是合适的，例如EP 0 614 464 B中公开的肽，或针对该 复合物的抗体也是合适的。其它合适的分子包括但不限于TNF-a-抑 制二糖、葡糖胺的硫酸衍生物，或美国专利第6,020,323号所介绍的 其它类似糖。合适的分子还包括肽TNF-a抑制剂(公开于美国专利第 5,641,751和5,519，000号)和含有D-氨基酸的肽(公开于美国专利笫 5,753,628号)。另外，TNF-a转化酶抑制剂也是合适的。WO 01/03719 介绍了更多可与本发明联用的药物。合适的化合物还包括但不限于小分子，例如沙利度胺或沙利度 胺类似物、己酮可可石威或基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂或其它小分 子。用于该目的的合适的MMP抑制剂包括例如美国专利第 5,883,131、 5，863，949和5,861,510号所介绍的那些，以及美国专利第 5,872,146号所介绍的巯基烷基肽酰化合物。能够减少TNF-a产生的 其它小分子包括例如美国专利5,508,300、 5,596,013和5,563,143所 介绍的分子。其它合适的小分子包括但不限于MMP抑制剂(例如参 见美国专利第5/747,514号和第5，691，382号)，以及异羟肟酸衍生物(例 如参见美国专利第5,821,262号)。合适的分子还包括例如能抑制磷酸 二酯酶IV和TNF-a产生的小分子，例如取代的肝衍生物(WO 96/00215)、喹啉磺酰胺(美国专利第5,834,485号)、芳基呋喃衍生物 (WO 99/18095)和杂双环衍生物(WO 96/01825; GB 2 291 422 A)。也 可使用抑制TNF-a和IFN-y的噻唑衍生物(WO 99/15524)、以及抑制 TNF-a和其它促炎细胞因子的黄嘌呤衍生物(参见例如美国专利 5,118,500、 5,096,906和5,196,430)。用于治疗本文所述病症的其它小 分子包括美国专利第5,547,979号中公开的小分子。联合疗法中可以一起给药的药物和药物类型的其它实例包括但 不限于抗病毒药、抗生素、镇痛药(例如对乙酰氨基酚、可待因、萘 碌酸右丙氧酚、盐酸氧可酮、酸式酒石酸氬可酮(hydrocodone bitartmte)、曲马多)、皮质类固醇、炎性细胞因子拮抗剂、调节疾病 的抗风湿药(DMARD)、非甾体类抗炎药(NSAID)和长效抗风湿药 (SAARD)。示例性的疾病调节性抗风湿药(DMARD)包括但不限于 Rheumatrex (曱氨蝶呤)；Enbrel (依那西普)；Remicade (英夫利 昔单抗(infliximab)); Humira (阿达木单抗(adalimumab)); Segard (阿 非莫单抗(afdimomab)); Arava (来氟米特)；Kineret (阿那白滞素 (anakinra)); AravaTM (来氟米特)；D-青霉胺；Myochrysine; Plaquenil; Ridaura顶(金诺芬)；Solganal;来那西普(Hoffman-La Roche); CDP870 (Celltech); CDP571 (Celltech)、以及EP 0 516 785 Bl、美国专利第 5,656,272号、EP 0 492 448 Al中介绍的抗体；奥那西普(Serono; CAS 注册号199685-57-9); MRA (Chugai); Imuran (硫峻噪呤)；NFKB 抑制剂；磷酰胺制剂TM (环磷酰胺)；环孢菌素；硫酸羟氯喹；米诺环 素(二甲胺四环素)；柳氮磺吡啶；和金化合物，例如口服金、硫代苹 果酸金钠和金硫葡糖。合适的分子还包括例如来自TNF-a受体分子、而非p55和p75 TNFR的胞外区的可溶性TNFR，例如WO 99/04001中介绍的TNFR, 包括来自该TNFR的TNFR-Ig。其它合适的TNF-ot抑制剂也适用于 本发明。这些抑制剂包括不仅适用如本文所述的针对TNF-a或TNFR 的抗体，而且也适用来自TNF-a的肽(所述肽可作为TNF-a的竟争性 抑制剂，例如美国专利笫5，795,859号或美国专利第6,107,273号中 描述的那些)、TNFR-IgG融合蛋白(例如含有p55 TNF-a受体胞外部 分的融合蛋白)、可溶性TNFR (而非IgG融合蛋白)或降低内源TNF-a水平的其它分子(例如TNF-a转化酶抑制剂(参见例如美国专利第 5,594,106号)、或小分子或TNF-a抑制剂)，本文描述了许多这样的 分子。对于抗TNF的抗体，尽管有经验的卫生保健提供者可按患者的 具体需要来确定优化剂量，但是抗TNF-a抗体的示例性优选剂量范 围为0.1-20mg/kg，更优选l-10mg/kg。抗TNF-a抗体的另一个优选 剂量范围为0.75-7.5mg/kg体重。本发明也可使用特异性结合剂和一种或多种非甾体抗炎药 (NSAID)的任一种。NSAID具有抗炎作用，至少部分抑制前列腺素 的合成。Goodman和Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan第7版(1985)。 NSAID按其性质可分为九大类(l)水杨 酸衍生物；(2)丙酸衍生物；(3)乙酸衍生物；(4)芬那酸类(fenamic acids) 衍生物；(5)羧酸衍生物；(6)丁酸衍生物；("昔康类(oxicams); (8)吡 唑；和(9)吡唑啉酮。NSAID的实例包括但不限于AnaproxTM、 Anaprox DS (奈普生钠)；Ansaid (氟比洛芬)；Arthrotec (双氯芬酸钠+米 索前列醇(misoprostil)); Cataflam.TM./VoltarenTM (双氯芬酸钟)； ClinorilTM (舒林酸)；Daypro (螺丙溱)；Disalcid (双水杨酯)； Dolobid (二氟尼柳)；EC Naprosyn (奈普生钠)；Feldene (吡罗 昔康)；IndocinTM、 Indocin SRTM (。引咮美辛)；LodineTM、 Lodine XLTM (依托度酸)；Motrin (布洛芬)；Naprelan (奈普生)；Naprosyn (奈 普生)；OrudisTM、(酮洛芬)；OruvailTM (酮洛芬)；Relafen (萘丁美 酮)；TolectinTM、(托美丁钠)；Trilisate (三水杨酸胆磁j美)；Cox-1 抑制剂；Cox-2抑制剂，例如Vioxx (罗非考昔)；Arcoxia (艾托 考昔)、Celebrex (塞来考昔)；Mobic (美洛昔康)；Bextra.TM.(伐 i也考昔)、DynastatTM巾白雷考昔(paracoxib)4内；PrexigeTM (lumiracoxib) 和nambumetone。其它合适的NSAID包括但不P艮于以下s-乙酰氨 基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟基丁酸、阿米西群、阿尼扎芬、 安曲非宁、千达酸、苄达赖氨酸、苄达明、b叩rozin、溴哌莫、布可 隆、丁苯唑酸、环丙喹宗、氯克昔酯、达齐胺、地波沙美、地托咪 定、g关苯p比胺、difenpyramide 、 difisalamine、 J4他p坐(ditazo1)、依莫 法宗、曱磺酸法奈替唑、芬氟咪唑、夫洛非宁、氟咪唑、氟尼辛、 氟丙会宗、福吡托林、磷柳酸、p瓜美柳、愈创蓝油烃(guaiazolene)、 异尼辛(isonixira)、盐酸来苯胺、来氟米特、洛非咪唑、氯替法唑、 氯胺烟酸细胞溶素(lysin clonixinate)、美西拉宗、萘丁美酮、尼克吲 哚、尼美舒利、奥古蛋白、奥帕诺辛、奥沙西罗(oxaceprolm)、奥沙 帕多、瑞尼托林、派立索哇、柠檬酸派立索唑、p底福將、piproxen、 吡拉唑酸、吡非尼酮、普罗喹宗、普罗沙唑、梭孢壳素B(thielavinB)、 替氟咪唑、替美加定、托来汀、托帕朵、色胺以及那些按公司代码 来命名的药物，例如480156S、 AA861、 AD1590、 AFP802、 AFP860、 A177B、 AP504、 AU8001、 BPPC、 BW540C、 C顧OIN 127、 CNIOO、 EB382、 EL508、 F1044、 FK-506、 GV3658、 ITF182、 KCNTEI6090、 KME4、 LA2851、 MR714、 MR897、 MY309、 ONO.sub.3144、 PR823、 PV102、 PV亂R830、 RS2131、 SCR152、 SH440、 SIR133、 SPAS510、 SQ27239、 ST281、 SY6001、 TA60、 TAI-901 (4-苯曱酰基-l-茚满羧 酸)、TVX2706、 U60257、 UR2301和WY41770。该组药物内也包括 具有与NSAID类似的镇痛和抗炎特性的结构相关NSAID。合适的SAARD或DMARDS包括但不限于阿洛铜钠、金诺芬、 金硫葡糖、金硫醋苯胺(aurothioglycamide)、硫唑嘌呤、布唾那钠、 布西拉明、3-金硫-2-丙醇-l-磺酸钩、苯丁酸氮芥、氯喹、氯丁扎利、 铜克索林、环磷酰胺、环孢菌素、氨苯砜、15-脱氧精胍菌素、双醋 瑞因、葡糖胺、金盐(例如环壹金盐、金硫丁二钠、金硫代硫酸钠)、 羟氯喹、雍基脲、凯布宗、左旋咪唑、氯苯扎利、蜂毒肽、6-巯基嘌 呤、甲氨蝶呤、咪唑立宾、麦考酚酸吗乙酯、myoml、氮芥、D-青霉 胺、吡咬咪唑(pyridinol imidazole)(例如SKNF86002和SB203580)、 雷帕霉素、硫醇类、胸腺生成素和长春新碱。该组药物内也包括具 有类似的镇痛和抗炎特性的结构相关SAARD或DMARD。信号级联中的激酶抑制剂也是与本发明的特异性结合剂联用的 合适药物。它们包括但不限于能够抑制P-38 (也称为"RK"或 "SAPK-2" , Lee等，Nature, 372:739 (1994》的药物。作为丝氨酸/苏 氨酸激酶的P-38已有描述(参见Han等，Biochimica Biophysica Acta, 1265:224-227 (1995)。已经知道P-38抑制剂干预胞外刺激物与IL-1 和TNF-ot从细胞冲分泌，所述细胞通过抑制位于信号途径上的激酶 而参与阻断信号转导。其它合适的是MK2抑制剂和tpl-2抑制剂。另外，T细胞抑制 剂也是合适的，包括例如ctla-4、 CsA、 Fk-506、 0X40、 OX40R-Fc、 OX40抗体、OX40配体、OX40配体抗体、lck和ZAP70。类视色素 (包括口服类视色素)以及TGF-(3拮抗剂也是合适的。与本发明特异性结合剂联用的其它合适药物包括例如任何一种 或多种水杨酸衍生物、其前体药物的酯或药学上可接受的盐。这类 水杨酸衍生物、其前体药物的酯及其药学上可接受的盐包括醋氨 沙洛、阿洛普令、阿司匹才木、贝i若酯、溴水杨醇(bromosaligenin)、乙 酰水杨酸钙、三水杨酸胆碱镁二氟尼柳、依特柳酯、芬度柳、龙胆 酸、乙二醇水杨酸酯、水杨酸咪唑、赖氨酸乙酰水杨酸、5-羟基水杨 酸、水杨酸吗啉、水杨酸l-萘酯、奥沙拉秦、帕沙米特、乙酰水杨 酸苯酯、水杨酸苯酯、醋水杨胺、水杨酰胺O-乙酸、双水杨酯和柳 氮磺吡啶。该组药物内也包括具有类似镇痛和抗炎特性的结构相关 的水杨酸衍生物。其它合适的药物包括例如丙酸衍生物、其前体药 物的酯或药学上可接受的盐。丙酸衍生物、其前体药物的酯及其药 学上可接受的盐包括阿明洛芬、苯嗨洛芬、布氯酸、卡洛芬、右 、引咮洛芬、非诺洛芬、氟诺洛芬、氟洛芬、氟比洛芬、呋洛芬、布 洛芬、布洛芬铝、异丁普生、吲哚洛芬、异洛芬、酮洛芬、洛索洛 芬、咪洛芬、奈普生、瞎丙嗪、吡酮洛芬、pimeprofen、吡洛芬、普 拉洛芬、丙替溱酸、pyridoxiprofen、舒洛芬、漆洛芬酸和硫螺洛芬。物。其它适用的药物是乙酸衍生物、其前体药物的酯或其药学上可 接受的盐。乙酸衍生物、其前体药物的酯及其药学上可接受的盐包 括阿西美辛、阿氯芬酸、氨芬酸、丁苯羟酸、桂美辛、氯吡酸、 地美辛、双氯芬酸钠、依托度酸、联苯乙酸、芬氯酸、苯克洛酸、 芬克洛酸、芬替酸、呋罗芬酸、葡美辛、异丁芬酸、吲哚美辛、三苯唑酸、伊索克酸、氯那唑酸、曱溱酸、奥沙美辛、oxpinac、吡美 辛、丙谷美辛、舒林酸、他美辛、噻拉米特、硫平酸、托美丁、齐 多美辛和佐美酸。该组药物内也包括具有类似镇痛和抗炎特性的结 构相关的乙酸衍生物。本文所述的其它适用的药物是芬那酸衍生物、 其前体药物的酯或药学上可接受的盐。芬那酸衍生物、其前体药物 的酯及其药学上可接受的盐包括恩芬那酸、依托芬那酯、氟芬那 酸、异尼辛、甲氯芬那酸、甲氯芬那酸钠、medofenamic acid、甲芬 那酸(mefanamic acid)、尼氟酸、他尼氟酯、特洛芬那酯、托芬那酸 和乌芬那酯。该组药物内也包括具有类似镇痛和抗炎特性的结构相 关的芬那酸衍生物。其它适用的药物是羧酸衍生物、其前体药物的酯及其药学上可 接受的盐，包括环氯茚酸、二氟尼柳、氟苯柳、inoridine、酮咯酸 和替诺立定。该组药物内也包括具有类似镇痛和抗炎特性的结构相 关的羧酸衍生物。其它合适的药物是丁酸衍生物、其前体药物的酯 或药学上可接受的盐。丁酸衍生物、其前体药物的酯及其药学上可 接受的盐包括布马地宗、丁布芬、芬布芬和联苯丁酸。该组药物类、其前体药物的酯或其药学上可接受的盐也是合适的。昔康类、 其前体药物的酯及其药学上可接受的盐包括屈瞎昔康、依诺利康、 伊索昔康、吡罗昔康、舒多昔康、替诺昔康和4-羟基-l，2-苯并噻嗪1,1-二氧化物4-(N-苯基)-甲酰胺。该组药物内也包括具有类似镇痛和抗 炎特性的结构相关的昔康类。吡唑、其前体药物的酯或其药学上可 接受的盐也是合适的。可使用的吡唑、其前体药物的酯和其药学上 可接受的盐包括二苯咪唑和依匹唑。该组药物内也包括具有类似 镇痛和抗炎特性的结构相关的吡唑。此外，吡唑啉酮、其前体药物 的酯或其药学上可接受的盐是合适的。可^f吏用的吡唑啉酮、前体药 物的酯和其药学上可接受的盐包括apazone、阿扎丙宗、千哌立隆(benzpiperylon)、非普拉宗、莫非布宗、吗拉宗、幾布宗、保泰松、 哌布宗、丙基安替比林、雷米那酮、琥布宗和噻唑啉并保泰松 (thiazolinobutazone)。该组药物内也包括具有类似镇痛和抗炎特性的 结构相关的吡唑啉酮。其它合适的药物是用于治疗TNF-介导的疾病的皮质类固醇、其 前体药物的酯或其药学上可接受的盐。皮质类固醇、其前体药物的 酯及其药学上可接受的盐包括氢化可的松和衍生自氬化可的松的化 合物，例如21-乙酰氧基-孕烯诺龙、阿氯米松(alclomerasone)、阿尔 孕酮、安西奈德、倍氯米松、倍他米松、戊酸倍他米松、布地奈德、 氯泼尼松、氯倍他索、丙酸氯倍他索、氯倍他松、丁酸氯倍他松、 氯可托龙、氯泼尼醇、皮质酮、可的松、可的伐唑、地夫可特 (deflazacon)、地奈德、去轻米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、 二氟泼尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟氯奈德、氟米松、新戊酸氟 米松、氟尼缩松、氟轻松(flucinolone acetonide)、醋酸氟轻松、 fluorocinolone acetonide、氟可丁酉旨、氟可龙、己酸氟可龙、戊酸二 氟可龙、氟米龙、醋酸氟培龙、醋酸氟泼尼定、氟泼尼龙、氟氢缩 松、福莫可他、哈西奈德、面米松、醋酸卣泼尼松、氬可他酯、氬 化可的松、醋酸氬化可的松、丁酸氬化可的松、磷酸氬化可的松、 氢化可的松21-琥珀酸钠、特布酸氢化可的松、马泼尼酮、甲轻松、 曱泼尼松、曱泼尼龙、莫米松糠酸酯、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼 松龙、泼尼松龙21-氨基乙酸二乙酯、泼尼松龙磷酸钠、泼尼松龙琥 珀酸钠、泼尼松龙21-间磺基苯曱酸钠、泼尼松龙21-硬脂酸乙醇酸 钠、泼尼松龙叔丁乙酯、泼尼松龙21-醋酸三曱酯、泼尼松、强的松 龙戊酸酯、泼尼立定、泼尼立定21-二乙氨基醋酸酯、替可的松、曲 安西龙、曲安奈德、苯曲安奈德和己曲安奈德。该组药物内也包括 具有类似镇痛和抗炎特性的结构相关的皮质类固醇。抗;徵生物药(及其前体药物的酯或药学上可接受的盐)也适用于本 文所述的联用。合适的抗微生物药包括例如氨千青霉素、羟氨千青 霉素、金霉素、杆菌肽、头孢他啶、头孢曲松、头孢P塞肟、头孢克洛(cephachlor)、头孢氨千、头孢拉定、环丙沙星、克拉维酸、氯唑 西林、双氯西林(dicloxacillan)、红霉素、氟氯西林(flucloxacillan)、 庆大霉素、短杆菌肽、曱氧西林(methicillan)、新霉素、苯唑西林 (oxacillan)、青霉素和万古霉素。该组药物内也包括具有类似镇痛和 抗炎特性的结构相关的抗」微生物药。其它合适的化合物包括但不限于BN 50730;替尼达普；E 5531; tiapafantPCA4248;尼美舒利；panavir;咯利普兰；RP 73401;肽T; MDL 201,449A; (lR,3S)-顺-l-[9-(2,6-二氨基-"票呤基)]-3-羟基-4-环戊 烯盐酸盐；(lR,3R)-反-l-[9-(2,6-二氨基)噪呤]-3-乙酰氧基环戊烷； (lR,3R)-反-l-[9-腺苷)-3-叠氮基-环戊烷盐酸盐和(lR,3R)-反-l-[6-幾基 -噤呤-9-基)-3-叠氮基-环戊烷。已经发现，在某些情况下(例如哮喘)，IL-4可诱导炎性效应，其 中IL-4在肺部过量表达，导致上皮细胞肥大并积累淋巴细胞、嗜酸 性粒细胞和嗜中性粒细胞。该反应是其它Th2细胞因子所诱导的促 炎反应的主要特征的代表。如上所述，因此，1L-4抑制剂也可用于 本发明。另外，可以理解，某些免疫抑制剂药物也可用于治疗关节 炎，包括但不限于iNOS抑制剂和5-脂氧合酶抑制剂。已经知道，生姜具有某些抗炎特性，因此适合作为抗炎药用于 本发明，例如与软骨素联用。本发明的药物组合物也可用于联合疗法，即与其它药物和疗法 联用，用于治疗CD148活化相关疾病。本发明的抗体和抗原结合区 也可与其它药物和疗法联合用于治疗癌症或胂瘤。所述药物包括但 不限于体外合成制备的化学組合物、抗体、抗原结合区、放射性核 素及其组合和它们的缀合物。药物可以是激动剂、拮抗剂、别构调 节剂、毒素，或者，总的来讲可以起到抑制或剌激其把标(例如受体 或酶活化或抑制)的作用，因此促进细胞死亡或阻止细胞生长。其它 疗法也包括例如放射治疗、化学治疗和使用抗肿瘤药的靶向治疗等。
在一个具体的实施方案中，人抗CD148抗体或其抗原结合片^:可以 与一种或多种治疗药联合给予，所述治疗药例如抗血管生成药、抗 胂瘤药、化疗药、免疫抑制药、抗炎药或抗4艮屑病药。人抗CD148 抗体或其抗原结合片段也可与其它已知疗法联用，所述疗法例如物 理治疗，例如放射治疗、热疗(hyperthermia),移植(例如骨髓移植)、 手术治疗、日光治疗或光线疗法。在本文中没有具体列出的其它联 合疗法也包括在本发明的范围之内。示例性的抗肺瘤药包括例如多柔比星(阿霉素)、顺铂、硫酸博来 霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和环磷酰胺、羟基脲，所述药物单独 使用时，仅在对患者有毒或亚毒性水平时才有效。顺铂经静脉内给 药，剂量为100mg/m2，每4周一次；而阿霉素经静脉内给药，剂量 为60-75mg/m2,每21天一次。其它示例性的抗肿瘤药包括 HERCEPTIN (曲妥单抗，可用于治疗乳癌和其它形式的癌症)和 RITUXAN (利妥昔单抗)、ZEVALIN (替伊莫单抗)和 LYMPHOCIDE (依帕珠单抗，可用于治疗非霍奇金淋巴瘤和其它 形式的癌症)、GLEEVAC (可用于治疗.慢性髓细胞性白血病和胃肠 道基质肿瘤)和BEXXARtm (碘131托西莫单抗，可用于治疗非霍奇 金淋巴瘤)。可用于联合化疗的其它抗肿瘤药包括例如烷化剂，包括氮芥， 例如氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥；亚硝基 脲，例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(甲基-CCNU);乙烯亚胺/甲基蜜胺，例如曲他胺(thriethylenemelamine, TEM)、三乙烯、硫代磷酰胺(塞替派)、六曱基蜜胺(HMM、六曱蜜胺)； 磺酸烷基酯，例如白消安；三嗪，例如达卡巴嗪(DTIC);抗代谢药， 包括叶酸类似物(例如曱氨蝶呤和三曱曲沙)，嘧啶类似物(例如5-氟 尿嘧啶、氟脱氧尿苷、吉西他滨、阿糖胞苷(AraC、阿糖胞嘧啶)、5-氮杂胞苷、2,2'-二氟脱氧胞苷)，嘌呤类似物(例如6-巯基嘌呤、6-硫 鸟噤呤、硫唑。票呤、2'-脱氧考福霉素(喷司他丁 )、
erythrohydroxynonyladenine (EHNA)、磷酸氟达拉滨和2-氯脱氧腺普 (克拉屈滨、2-CdA));天然产物，包括抗有丝分裂药，例如紫杉醇、 长春花属生物碱(包括长春花碱(VLB)、长春新碱和长春瑞滨)、泰索 帝、雌莫司汀和磷酸雌莫司汀；ppipodophylotoxin，例如依托泊苦和 替尼泊苷；抗生素，例如放射菌素D、道诺霉素(柔红霉素)、多柔比 星、米托蒽醌、伊达比星、博来霉素、普卡霉素(光辉霉素)、丝裂霉 素C和放线菌素；酶，例如L-天冬酰胺酶；生物反应调节剂，例如 干扰素-a、 IL-2、 G-CSF和GM-CSF;其它药物，包括铂配位络合物 (例如顺钠和卡柏)，蒽二S同(anthracenedione)(例如米托蒽醌)，取代的 脲(例如羟基脲)，曱基肼衍生物(包括N-甲基肼(M1H)和丙卡巴肼)， 肾上腺皮质抑制药，例如米托坦(o,p'-DDD)和氨基格鲁米特；激素和 拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，例如泼尼松及其等同物、 地塞米松和氨基格鲁米特；孕酮，例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮 和醋酸曱地孕酮；雌激素，例如二乙基己烯雌酚和乙炔雌二醇等同 物；抗雌激素，例如他莫昔芬；雄激素，包括丙酸睾酮和氟曱睾酮/ 等同物；抗雄激素，例如氟他胺、促性腺激素释放激素类似物和亮 丙立德；和非甾体抗雄激素，例如氟他胺。
示例性的抗血管生成药包括ERBITUXTM (IMC-C225)、 KDR (激酶域受体)抑制剂(例如与激酶域受体特异性结合的抗体和抗原结合 区)、抗VEGF药(例如特异性结合VEGF或可溶性VEGF受体或其 配体结合区的抗体或抗原结合区，例如AVASTINtm或VEGF-TRAP ) 和抗VEGF受体药(例如与其特异性结合的抗体或抗原结合区)、EGFR 抑制剂(例如与其特异性结合的抗体或抗原结合区)例如ABX-EGF (panitumumab)、 IRESSA (吉非替尼)、TARCEVA (埃罗替尼)、 抗Angl和抗Ang2药(例如与其特异性结合、或与其受体(例如Tie2/Tek) 特异性结合的抗体或抗原结合区)和抗Tie-2激酶抑制剂(例如与其特 异性结合的抗体或抗原结合区)。本发明的药物组合物也可包含特异 性结合并抑制生长因子的活性的一种或多种药物(例如抗体、抗原结
合区或可溶性受体)，所述药物例如肝细胞生长因子(HGF，也称为分 散因子)拮抗剂，以及与其受体"c-met"特异性结合的抗体或抗原结合区。其它抗血管生成药包括Campath、IL-8、B-FGF、Tek拮抗剂(Ceretti 等，美国公布号2003/0162712;美国专利第6,413,932号)、抗TWEAK 药(例如特异性结合的抗体或抗原结合区、或可溶性TWEAK受体拮 抗剂；参见Wiley,美国专利第6,727,225号)、拮抗整联蛋白与其配 体的结合的ADAM解联蛋白域(Fanslow等，美国7>布号 2002/0042368)、特异性结合的抗印h受体和/或抗肝配蛋白抗体或抗 原结合区(美国专利第5，981，245; 5,728,813; 5,969,110; 6,596,852; 6,232,447; 6,057,124号及其同族专利)、和抗PDGF-BB拮抗剂(例如 特异性结合的抗体或抗原结合区)以及与PDGF-BB配体特异性结合 的抗体或抗原结合区、和PDGFR激酶抑制剂(例如与其特异性结合 的抗体或抗原结合区)。其它示例性的抗血管生成药包括Ang-1和 CD148 (及其受体)的拮抗剂、VEGF (Avastin、 VEGF-TRAP等)、VEGF 受体和IL-8、 B-FGF和KDR小分子抑制剂和其它血管生成介导物。其它抗血管生成药/抗肿瘤药包括SD-7784 (Pfizer,美国)；西 仑吉肽(Merck KGaA，德国，EPO 770622); pegaptanib octasodium (Gilead Sciences,美国)；Alphastatin (BioActa,英国)；M-PGA (Celgene, 美国，US 5712291);伊洛马司他(Arriva，美国，US 5892112); emaxanib (Pfizer,美国，US 5792783); vatalanib (Novartis，瑞士)； 2-甲氧基雌二 醇(EntreMed,美国)；TLC ELL-12 (Elan,爱尔兰)；醋酸阿奈可他 (Alcon,美国)；a國D148 Mab (Amgen,美国)；CEP-7055 (C印halon,美 国)；抗Vn Mab (Crucell,荷兰)DAC:抗血管生成药(ConjuChem,加 拿大)；Angiocidin (InKine Pharmaceutical,美国)；KM-2550 (Kyowa Hakko,曰本)；SU-0879 (Pfizer,美国)；CGP-79787 (Novartis,瑞士，EP 970070); ARGENT技术(Ariad,美国)；YIGSR-Stealth (Johnson & Johnson，美国)；血纤蛋白原-E片段(BioActa,英国)；血管生成抑制
剂(Trigen,英国)；TBC-1635 (Encysive Pharmaceuticals,美国)；SC-236 (Pfizer,美国)；ABT-567 (Abbott,美国)；Metastatin (EntreMed,美国)； 血管生成抑制剂(Trip印，瑞典)；乳腺丝抑蛋白(Sosei,曰本)；2-甲氧 基雌二醇(Oncology Sciences Corporation,美国)；ER-68203-00 (IVAX, 美国)；Benefin (Lane Labs,美国)；Tz-93 (Tsumura,日本)；TAN-1120 (Takeda,日本)；FR-111142 (Fujisawa,日本，JP 02233610);血小板因 子4(RepliGen,美国，EP 407122);血管内皮生长因子拮抗剂(Borean, 丹麦)；癌症治疗(University of South Carolina,美国)；贝伐单抗(pINN) (Genentech,美国);血管生成抑制剂(SUGEN,美国)；XL 784 (Exelixis, 美国);XL647 (Exelixis，美国);MAb，a5p3整联蛋白，第二代(Applied Molecular Evolution,美国和Medlmmune,美国)； 一见网膜病的基因治 疗(Oxford BioMedica,英国)；enzastaurin hydrochloride (USAN) (Lilly, 美国)；CEP 7055 (Cephalon,美国和Sanofi-Synthelabo，法国)；BC 1 (Genoa Institute of Cancer Research,意大利)；血管生成才中制剂 (Alchemia,澳大利亚)；VEGF拮抗剂(Regeneron,美国)；rBPI 21和 BPI衍生血管生成药(XOMA,美国)；P188(Progen,澳大利亚)；西仑 吉肽(pINN) (Merck KGaA,德国；Munich Technical University,德、国， Scripps Clinic and Research Foundation,美国)；西妥昔单4元(INN) (Aventis，法国)；AVE 8062 (Ajinomoto,日本)；AS 1404 (Cancer Research Laboratory,新西兰)；SG 292 (Telios,美国)；内皮生长抑素 (Boston Childrens Hospital,美国)；ATN 161 (Attenuon，美国)；血管 生长抑素(Boston Childrens Hospital,美国)；2-甲氧基雌二醇(Boston Childrens Hospital,美国)；ZD 6474 (AstraZeneca,英国)；ZD 6126 (Angiogene Pharmaceuticals,英国)；PPI 2458 (Praecis,美国)；AZD 9935 (AstraZeneca,英国)；AZD 2171 (AstraZeneca,英国)；vatalanib (pINN), (Novartis,瑞士和Schering AG,德国)；组织因子途径抑制剂 (EntreMed, 美国)；pegaptanib (Pinn) (Gilead Sciences, 美国)； xanthorrhizol (Yonsei University,韩国)；疫苗，基于基因，VEGF國2
(Scripps Clinic and Research Foundation,美国)；SPV5.2 (Supratek,力口 拿大)；SDX 103 (University of California at San Diego，美国)；PX 478 (ProlX，美国)；METASTATIN (EntreMed,美国)；肌原蛋白I (Harvard University,美国)；SU 6668 (SUGEN,美国)；OXI4503 (OXiGENE,美 国)；o-胍(Dimensional Pharmaceuticals,美国)；motuporamine C (British Columbia University,力口拿大)；CDP 791 (Celltech Group,英国)； atiprimod (pINN) (GlaxoSmithKline,英国)；E 7820 (Eisai,日本)；CYC 381 (Harvard University,美国)；AE 941 (Aeteraa,力口拿大)；疫苗，血 管生成(EntreMed,美国)；尿激酶纤溶酶原激活物抑制剂(Dendreon, 美国)；oglufanide(p匪)(Mdmotte，美国)；HIF-lct抑制剂(Xenova,英 国)；CEP 5214 (Cephalon，美国)；BAY RES 2622 (Bayer,德国)； Angiocidin (InKine,美国)；A6 (Angstrom,美国)；KR 31372 (Korea Research Institute of Chemical Technology, 韩国)；GW 2286 (GlaxoSmithKline,英国)；EHT 0101 (ExonHit,法国)；CP 868596 (Pfizer，美国)；CP 564959 (OSI，美国)；CP 547632 (Pfizer,美国)； 786034 (GlaxoSm池Kline,英国)；KRN 633 (Kirin Brewery,日本)； 给药系统，目艮内，2-曱氧基站,二醇(EntreMed,美国)；anginex (Maastricht University,荷兰和Minnesota University,美国)；ABT 510 (Abbott,美国)；AAL 993 (Novartis,瑞士)； VEGI (ProteomTech,美 国)；肿瘤坏死因子-a抑制剂(National Institute on Aging,美国)；SU 11248 (Pfizer,美国和SUGEN美国)；ABT 518 (Abbott，美国)；YH16 (Yantai Rongchang,中国)；S國3APG (Boston Childrens Hospital,美国 和EntreMed,美国)；MAb KDR, (ImClone Systems,美国)；MAb a5 pi (Protein Design,美国)；KDR激酶抑制剂(Celltech Group,英国和 Johnson & Johnson,美国)；GFB 116 (South Florida University,美国和 Yale University,美国)；CS 706 (Sankyo,日本)；考布他汀A4前体药 物(Arizona State University,美国)；软骨素酶AC (IBEX,加拿大)； BAY RES 2690 (Bayer，德国)；AGM 1470 (Harvard University,美国，Takeda,日本和TAP,美国)；AG 13925 (Agouron,美国)； Tetrathiomolybdate (University of Michigan,美国)；GCS 100 (Wayne State University,美国)CV 247 (Ivy Medical,英国)；CKD 732 (Chong Kim Dang,韩国)；MAb血管内皮生长因子(Xenova,英国)；伊索拉 定(丽)(Nippon Shinyaku,日本)；RG 13577 (Aventis，法国)；WX 360 (Wilex，德国)；角鲨胺(p丽)(Genaera,美国)；RPI 4610 (Sirna，美 国)；癌症治疗(Marinova,澳大利亚)；类肝素酶抑制剂(InSight,以色 列)；KL3106(Kolon，韩国)；Honokiol (Emory University,美国)；ZK CDK(ScheringAG,德国)；ZK Angio (Schering AG,德国)；ZK 229561 (Novartis,瑞士； Schering AG,德国)；XMP 300 (XOMA,美国)；VGA 1102 (Taisho,曰本)；VEGF受体调节剂(Pharmacopeia,美国)；VE-钩粘着蛋白-2拮抗剂(ImClone Systems,美国)；Vasostatin (National Institutes of Health,美国)；疫苗，Flk-1 (ImClone Systems,美国)；TZ93 (Tsumura,曰本)；TumStatin (Beth Israel Hospital,美国)；截短的可溶 性FLT 1 (血管内皮生长因子受体1) (Merck & Co，美国)；Tie-2配体 (Regeneron,美国)；血小板反应蛋白1抑制剂(Allegheny Health, Education and Research Foundation,美国》本发明的药物组合物也可包括一种或多种生长因子抑制剂药 物，例如肝细胞生长因子(HGF,也称为分散因子，及其受体"c-met") 拮抗剂。与本发明组合物(例如人抗体、多特异性分子和双特异性分子)连 接的耙特异性效应细胞(例如效应细胞)也可用作治疗药。草巴向效应细 胞可以是人白细胞，例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细月包。其 它细胞包括嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞和其它携带IgG受体或IgA 受体的细胞。如有必要，效应细胞可得自受治疗的患者。可以细胞 悬液/生理上可接受的溶液的形式，给予乾特异性效应细^^。所给予 的细胞数约为108-109，但也可因治疗目的而异。 一般而言，数量应 足以定位于靶细胞(例如表达CD148的肿瘤细胞)并能通过例如吞噬 作用而起到杀伤细胞的作用。给药途径也可以不同。采用靶-特异性效应细胞的治疗，也可以与其它技术联用，以去 除靶细胞。例如，使用本发明的组合物(例如人抗体、多特异性分子 和双特异性分子)和/或用这些组合物武装起来的效应细胞的抗肿瘤治 疗，可以与化疗联用。另外，联合免疫疗法可用于将两种不同细胞毒效应细胞群体靶向肺瘤细胞排斥。例如，与抗FcyRi或抗CD3连 接的抗CD148抗体可用于与IgG受体或IgA受体特异性结合剂联用。本发明的双特异性分子和多特异性分子也可用于调节效应细胞 的FcotR或FcyR水平，例如通过加帽和消除细胞表面的受体。抗Fc 受体混合物也可用于该目的。在补体存在时，也可使用具有补体结合位点的本发明组合物(例 如人抗体、多特异性分子和双特异性分子)，例如结合补体的IgGl、 IgG2、 IgG3或IgM部分。在一个实施方案中，可以通过添加补体或 含有补体的血清，用本发明的结合剂和合适效应细胞，对包含輩巴细 胞的细胞群体进行离体处理。可以通过补体蛋白的结合，改善包被 本发明结合剂的靶细胞的吞噬作用。在另一个实施方案中，包被本 发明的组合物(例如人抗体、多特异性分子和双特异性分子)的靶细胞 也可以被补体溶解。在又一个实施方案中，本发明的组合物不激活 补体。本发明的组合物(例如人抗体、多特异性分子和双特异性分子)也 可以与补体一起给予。因此，本发明范围内也包括含有人抗体、多特异性分子或双特异性分子和血清或补体的组合物。这些组合物的 优势在于补体的位置非常接近人抗体、多特异性分子或双特异性分 子。或者，可以单独给予本发明的人抗体、多特异性分子或双特异 性分子和补体或血清。本发明范围内也包括装有本发明组合物(例如人抗体、多特异性 分子和双特异性分子)和使用说明书的药盒。药盒还可装有至少一种 附加药物，例如补体或一种或多种本发明的其它人抗体(例如具有补
体活性的人抗体，该抗体与CD148抗原上不同于第一人抗体的表位) 结合。在其它实施方案中，还可用调节(例如增强或抑制)Fca或Fcy受 体表达或活性的药物，对患者进行补充治疗，例如用细胞因子治疗 患者。在治疗中与多特异性分子 一 起给予的优选细胞因子包括粒细 胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、 干扰素-y (IFN-力和肿瘤坏死因子(TNF)。在另一个实施方案中，还可用淋巴因子制剂对患者进行补充治 疗。用淋巴因子制剂，诱导不高度表达CD148的癌细胞，可进行这 样的治疗。淋巴因子制剂可使CD148在肿瘤细胞中更均匀地表达，达到更有效的治疗。适于给药的^fr巴因子制剂包括干扰素-y、肿瘤坏 死因子及其组合。它们可经静脉内给予。淋巴因子的合适剂量是 io，ooo-i,ooo,ooo单位/患者。本发明的组合物(例如人抗体、多特异性分子和双特异性分子)也 可用于靶向表达Fc丫R或CD148的细胞，例如用于标记所述细月包。对 于这样的用途，可以将结合剂与待测分子连接在一起。因此，本发 明提供离体或体外表达Fc受体(例如FcyR)或CD148的细胞的定位方 法。可检测标记可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。在一个实施方案中，本发明提供检测样品中是否存在CD148抗 原或定量检测CD148抗原的方法，所述方法包括在允许形成抗体 或其部分与CD148的复合物的条件下，使样品和对照样品接触与 CD148特异性结合的人单克隆抗体或其抗原结合区。然后;f企测形成的复合物，其中样品与对照样品之间复合物形成有差异就说明样品 中存在CD148抗原。在再一个实施方案中，本发明提供在体内或体外检测表达Fc的 细胞是否存在或其数量的方法。所述方法包括(i)给予患者本发明的 组合物(例如多双特异性分子或双特异性分子或其片段)，所述组合物 与可检测标记缀合在一起；(ii)将患者暴露于检测所述可检测标记的
装置，以鉴定含有表达Fc的细胞的部位。本发明的用途和方法本发明提供与CD148表位结合的抗体或其抗原结合区，用于治 疗人类疾病和病理症状。可激活CD148活性或其它细胞活性的药物 可与其它治疗药联用，以增强其疗效或降低潜在副作用。一方面，本发明提供用于治疗以不想要的或异常的细胞CD148 活性7jc平为特;^正的疾病和病症的药物和方法。这些疾病包4舌癌症和其它过度增殖性疾病，例如增生、银屑病、接触性皮炎、免疫性疾 病和不育症。首先，可以测定本发明组合物(例如人抗体、多特异性分子和双 特异性分子)的治疗或体外诊断用途相关的结合活性。例如，可以用 本文所述的ELISA和流式细胞术测定，检测本发明的组合物。此外， 也可以测定这些分子在触发至少 一种效应物介导的效应细月包活性方 面的活性，包括对表达CD148的细胞的细胞溶解作用。效应细胞介 导的吞噬作用的测定方案如本文所述。本发明的组合物(例如人抗体、多特异性分子和双特异性分子)在 治疗和诊断CD148相关疾病中还具有其它用途。例如，人单克隆抗 体、多特异性分子或双特异性分子可用于在表达CD148的细月包中促 进CD148诱导的脱磷酸化，以抑制表达CD148的细胞生长，或者抑 制表达CD148的细胞的血管生成。本发明的抗CD148抗体可用于治 疗任何血管生成依赖性疾病，包括但不限于眼新血管形成，例如牙见 网膜病(包括糖尿病性视网膜病)、年龄相关性黄斑变性、4艮屑病、成 血管细胞瘤、血管瘤、动脉硬化，炎性疾病，例如类风湿性或风湿 性炎性疾病(尤其是关节炎，包括类风湿性关节炎)或其它慢性炎性疾 病，例如慢性哮喘、动脉粥样硬化或移植后动脉粥样硬4t、子宫内 膜异位症和肿瘤性疾病，例如所谓的实体瘤和液体(或血液)瘤(例如 白血病和淋巴瘤)。与不想要的血管生成相关的其它疾病对于本领域
技术人员来说是显而易见的。在一个具体的实施方案中，人抗体及其衍生物用于在体内治疗、预防或诊断各种CD148相关的肿瘤性疾病。CD148相关疾病的实刊 包括各种癌症，例如膀胱癌、乳癌、子宫癌/宫颈癌、结肠癌、^!腺 癌、结肠直肠癌、肾癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌、鳞 状细胞癌、肺(非小细胞)癌、食道癌和头颈部癌。本发明也提供治疗动物(包括人)的癌症的方法，所述方法包括给 予动物有效量的能激活CD148活性的抗体或其抗原结合区。本发明 还涉及抑制癌细胞生长的方法，所述癌细胞生长包括在生物体系统 内的细胞增殖、侵袭和转移的过程。该方法包括使用本发明的化合 物作为癌细胞生长的抑制剂。优选该方法用于抑制或减少活体动物 例如哺乳动物的细胞生长、侵袭、转移或肿瘤发生率。本发明的方 法也适用于测定系统，例如测定癌细胞生长及其特性，以及鉴定可 影响癌细胞生长的化合物。用本发明方法能治疗的癌症优选发生在哺乳动物内。哺乳动物 包括例如人和其它灵长类，以及宠物或陪伴动物(例如狗和猫)，实验 室动物(例如大鼠、小鼠和兔)和农场动物(例如马、猪、羊和牛)。肿瘤或赘生物包括细胞繁殖不受控制并且是进行性的组织细胞 的生长。某些这样的生长是良性的，但是另一些则是恶性的并可导 致生物体死亡。恶性肿瘤或癌症不同于良性生长，它们除了表现出 侵袭性细胞增殖之外，还可侵袭周围组织并可转移。此外，恶性肿 瘤的特征是，它们表现出更多地丧失分化(更多的去分化)并且丧失彼 此间和与其周围组织间的组织性。该特性也称为"退行发育 (anaplasia)"。由本发明可治疗的肿瘤还包括实体瘤，即癌和肉瘤。癌包括源 自上皮细胞的恶性肿瘤，这类肿瘤浸润(侵袭)周围组织并且会转移。 腺癌是源自腺体组织、或构成可识别的腺体组织的组织的癌。另一 个广泛的范畴即癌症包括肉瘤，这类肿瘤的细胞着生在象胚胎结締
組织一样的纤维或均质体内。本发明也能治疗骨髓或淋巴系统的癌 症，包括白血病、淋巴瘤和其它癌症，这些癌症通常不存在瘤块， 而是分布在血管或淋巴网状系统内。适于用本发明来治疗的癌症或肿瘤细胞的种类包括例如产生ACTH的胂瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、 肾上腺皮质癌、膀胱癌、脑癌、乳癌、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白 血病、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、皮肤性T细胞淋巴瘤、 子宫内膜癌、食道癌、尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)、胆嚢癌、毛细胞 性白血病、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin，s lymphoma),卡波西 肉瘤(Kaposi's sarcoma)、肾癌、肝癌、肺癌(小细胞和非小细胞)、恶 性腹水、恶性胸腔积液、黑素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、成神经 细胞瘤、胶质瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌(生殖 细胞癌)、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、皮肤癌、 软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、滋养层赘生 物(trophoblastic neoplasm)、 子宫癌、睾丸萃肖膜癌(vaginal cancer)、夕卜 阴癌和维尔姆斯瘤(Wilms' tumor)。本发明在本文中特别说明了对某些实验限定的癌症类型的治 疗。在这些说明性治疗中，使用了标准现有技术的体外和体内模型。 这些方法可用于鉴定希望能有效用于体内治疗方案的药物。然而， 可以理解，本发明的方法并不限于治疗这些肿瘤类型，而是延伸到 任何器官系统所来源的任何实体瘤。对于在侵袭或转移方面与CD148 活性相关的癌症来说，特别容易受到本发明方法的抑制，甚至能诱 导其消退。也可以使用本发明的化合物(例如肽抗体(peptibody))以及其它抗 癌化疗药(例如任何常规化疗药)，实施本发明。特异性结合剂与所述 其它药物的联用可加强化疗方案。熟练医师知道大量化疗方案都能 与本发明的方法结合使用。可以使用任何化疗药，包括烷化剂、抗 代谢药、激素和拮抗剂、放射性同位素以及天然产物。例如，本发
明的化合物可以与以下药物一起给予抗生素(例如多柔比星和其它 蒽环类似物)、氮芥类(例如环磷酰胺)、嗜啶类似物(例如5-氟尿嘧咬)、 顺钼、羟基脲、紫杉醇及其天然和合成衍生物等。作为另一个实例， 在混合型肿瘤(例如乳腺癌，其中肿瘤包括促性腺激素依赖性细胞和 促性腺激素非依赖性细胞)的情况下，化合物可以与亮丙立德或戈舍 瑞林(LH-RH的合成肽类似物)联合给予。包括使用四环素化合物以 及另一种治疗方式(例如手术、放射疗法等)在内的其它抗肿瘤方案， 在本文中也称为"辅助抗肿瘤方式"。因此，本发明的方法可以与 这类常规方案一起使用，以减少副作用并增强功效。因此，本发明提供用于治疗包括实体瘤和白血病在内的各种癌 症的组合物和方法。可治疗的癌症种类包括但不限于乳腺癌、前列 腺癌和结肠腺癌；所有类型的肺部支气管癌；骨髓瘤；黑素瘤；肝 癌；成神经细胞瘤；乳头状瘤；胺前体摄取脱羧细胞瘤(apudoma); 迷芽瘤；腮原瘤；恶性类癌综合征；类癌心脏病；癌(例如Walker癌、 基细胞癌、basosquamous、 Brown-Pearce癌、导管癌、Ehrlich瘤、Krebs 2癌、梅克尔细胞癌、粘蛋白癌、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、乳头 状癌、硬癌、支气管癌、支气管源性癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)； 组织细胞障碍；白血病；恶性组织细胞增多症；霍奇金病；免疫增 殖性小细胞肺细胞癌；非霍奇金淋巴瘤；浆细胞瘤；网状内皮细胞 增生病；黑素瘤；软骨母细胞瘤；软骨瘤；软骨肉瘤；纤维瘤；纤 维肉瘤；巨细胞瘤；组织细胞瘤；脂肪瘤；脂肪肉瘤；间皮瘤；粘 液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；颅咽管瘤；无性细胞瘤； 错构瘤；间质瘤；中肾瘤；肌肉瘤；成釉细胞瘤；牙骨质瘤；牙瘤； 畸月台瘤；胸腺瘤；tophoblastic tumor。此夕卜，也可治疗以下类型的癌 症腺瘤；胆管瘤；胆脂瘤；cyclindroma;嚢腺癌；嚢腺瘤；粒膜 细胞瘤；两性胚细胞瘤；肝细胞瘤；汗腺腺瘤；胰岛细胞瘤；Leydig 细胞瘤；乳头状瘤；睾丸支持细胞瘤；卵泡膜细胞瘤；平滑肌瘤； 平滑肌肉瘤；成肌细胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；横紋肌瘤；横紋肌肉瘤；
室管膜瘤；神经节瘤；胶质瘤；成神经管细胞瘤；脑膜瘤；神经鞘 瘤；成神经细胞瘤；神经上皮瘤；神经纤维瘤；神经瘤；副神经节 瘤；非嗜铬副神经节瘤；血管角化瘤；血管淋巴样增生并伴有嗜酸 粒细胞增多；硬化性血管瘤；血管瘤病；血管球瘤；血管内皮细胞 瘤；血管瘤；血管外皮细胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤； 淋巴管肉瘤；松果体瘤；癌肉瘤；软骨肉瘤；叶状嚢肉瘤；纤维肉 瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白血病性肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉 瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；横紋肌肉瘤；肉瘤；赘生物；纤 维瘤病；和子宫颈发育异常。本发明的另 一方面是使用本发明的材料和方法，来预防和/或治 疗任何过度增殖的皮肤病(包括银屑病和接触性皮炎)或其它过度增殖 性疾病。优选的对CD148具有特异性的特异性结合剂可以与其它药 物联用，用于治疗表现出这些临床症状的人。可以通过本文所述的 给药途径以及本领域技术人员众所周知的其它途径，使用任何不同 的载体，给予所述特异性结合剂。本发明的其它方面包括治疗各种涉及血管生成的视网膜病(包括 糖尿病性视网膜病和年龄相关性黄斑变性)，以及雌性生殖道障碍/疾 病，例如子宫内膜异位症、子宫纤维瘤和其它在雌性生殖期间与异 常功能的血管增殖(包括子宫内膜孩i血管生长)相关的这类病症。本发明的再一方面涉及治疗异常血管生长，包括脑动静脉畸形 (AVM)、治疗具有消化性溃疡病史患者的胃肠粘膜损伤和修复、胃 及十二指肠粘膜溃疡，包括中风所致的局部缺血、各种肺血管疾病、治疗患有非肝门静脉血压过高的患者的肝病和肝门静脉血压过高。本发明的另一方面是采用本发明的组合物和方法预防癌症。这 类药物可包括特异性结合剂，例如抗CD148抗体或其抗原结合区。CD148表位结合分子的鉴定本发明的CD148表位和抗体可用于鉴定能激活CD148活性的药 物，所述药物可用于治疗某些生理障碍，包括但不限于抑制血管生成。在本发明的一方面，提供与人CD148表位特异性结合的化合物 的鉴定方法，所述人CD148表位定义为一个或多个选自SEQIDNO: 33的氨基酸447-725、 533-725、 715-973、 324-335、 200-536、 533-725 和200-725的多肽序列；所述方法包括使试验化合物与人CD148 表位接触足够时间以形成复合物，所述人CD148表位定义为一个或 多个选自SEQ ID NO: 33的氨基酸447-725、 533-725、 715-973、 324-335、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列；然后通过检测 复合物中的所述CD148表位或所述化合物，来检测复合物的形成， 因此，如果检出复合物的话，就鉴定出与所述CD148表位结合的化 合物。例如，用编码目标蛋白的DNA转染的细胞，用不同药物处理， 然后进行共免疫沉淀。因为CD148参与转导与抑制所述生理障碍(例 如血管生成)有关的生理信号，所以能激活CD148活性的药物的鉴定 将提供可用于治疗生理障碍的药物，或使用先导化合物，用于治疗 药开发的药物。药物可以通过引发CD148脱磷酸化的方式，来结合 本文定义的CD148表位而激活CD148。可用于激活CD148的药物包 括肽、抗体、核酸、反义化合物或核酶。核酸可编码抗体或反义化 合物。肽可以是结合蛋白序列的至少4个氨基酸。或者，肽可以是4-30 个氨基酸(或8-20个氨基酸)，所述肽与结合蛋白质毗连全长的氨基 酸具有至少75%同一性。可以通过本领域普通技术人员众所周知的 技术，使用例如本文所述的转染宿主细胞、细胞系、细胞模型或动 物，测定药物；所述技术例如公开以下文献美国专利笫5,622,852 和5,773,218号，以及PCT申请公布号WO 97/27296和WO 99/65939， 所述文献都通过引用结合到本文中。可在体内或体外测定药物的调 节作用。可以提供药物，用于在噬菌体展示文库或组合文库中进行 测定。筛选药物的示例性方法是测定药物对蛋白质复合物形成的效 果。本发明的CD148表位也可用于制备生物活性目标多肽或小分子
多肽的结构类似物，这些结构类似物可与CD148表位作用(例如激动 剂、拮抗剂、抑制剂)，以便形成药物，所述药物是例如多肽的更具 活性或更稳定形式，或者所述药物例如可在体内增加或干扰多肽功 能。本发明一方面提供与人CD148表位特异性结合的化合物的鉴定 方法，所述人CD148表位定义为一个或多个选自SEQ ED NO: 33的 氨基酸447-725、 533-725、 715-973、 324-335、 200-536、 533-725和 200-725的多肽序列，所述方法包括提供限定CD148表位三维结 构的原子坐标，所述CD148表位定义为一个或多个选自SEQIDNO: 33的氨基酸447-725、 533-725、 715-973、 324-335、 200-536、 533-725 和200-725的多肽序列；然后根据所述原子坐标来设计或选择能够结 合所述CD148表位的化合物。用于合理药物设计的一些方法包括三 维结构分析、丙氨酸扫描、分子建模和使用抗独特型抗体。这些技 术是本领域技术人员众所周知的。这些技术可包括提供限定由所述 笫 一多肽与所述第二多肽形成的蛋白复合物三维结构的原子坐标， 根据所述原子坐标来设计或选择能够干扰笫 一 多肽与笫二多肽之间 相互作用的化合物。鉴定了调节或影响多肽活性的物质之后，可以对其做进一步研 究。此外，可以制备所述物质和/或将其用于制剂，即制备或配制， 或者将其用于组合物，例如药物、药物组合物或药物。这些都可以 给予个体。已鉴定作为多肽功能调节剂的物质可以是天然肽或非肽。通常 优选非肽"小分子"用于各种体内药物用途。因此，可以设计物质 的模拟物(尤其是在肽的情况下)，用于药物用途。已知药物活性化合物模拟物的设计，对于开发基于"先导"化 合物的药物来说是已知的。在以下情况下，需要这一该方法当活 性化合物是不同的，或者其合成很昂贵，或者它不适于特定给药方 法，例如纯肽对口服组合物来说就是不合适的活性药，因为它将在 消化道内很快被蛋白酶降解。通常采用模拟物设计、合成和测定，
以避免随机筛选大量分子的目标特性。采用分光技术、X射线衍射数据和MNR等各种来源的数据，一 旦发现药效团，则按其物理性能例如立体化学、键、大小和/或电荷， 模拟其结构。在这样的建模过程中，可采用计算机分析、相似性作 图(其模拟药效团的电荷和/或体积，但不是原子间的键)和其它技术。然后选择模板分子，在模板分子上可以接枝模拟药效团的化学 基团。可以方便地选择模板分子及其上接枝的化学基团，从而容易 合成模拟物，所述模拟物可能是药理上可接受的，并且在体内不降 解，同时又保留先导化合物的生物活性。或者，当模拟物是基于肽 的模拟物时，可以通过将肽环化而增加它的刚性，使它更稳定。然 后可以篩选由该方法发现的模拟物，看它们是否具有目标特性，或 者看其表现程度如何。还可以进行进一步优化或修饰，得到一种或 多种最终模拟物，用于体内或临床试验。结合测定免疫结合测定通常采用捕获剂，以特异性结合、且通常是固定 所分析的靶抗原。捕获剂是特异性结合分析物的部分。在本发明的 一个实施方案中，捕获剂是特异性结合本发明的CD148表位的抗体 或其抗原结合区。这些免疫结合测定是本领域众所周知的[Asai编著， Methods in Cell Biology,笫37巻，Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc.， New York (1993)]。免疫结合测定经常使用标记物，所述标记物可显示由捕获剂与 抗原形成的结合复合物的存在。标记物可以是包含结合复合物的分 子中的一部分；即它可以是标记的特异性结合剂或标记的抗特异性 结合剂抗体。或者，标记物可以是笫三分子，通常是另一种抗体， 它可以与结合复合物结合。标记物可以是例如带有标记的抗特异性 结合剂抗体。对结合复合物具有特异性的第二抗体可以缺乏标记， 但是可以与笫四分子结合，这第四种分子对属于第二抗体成员的抗
体种类具有特异性。例如，第二抗体可以用可检测部分(例如生物素) 修饰，然后该部分又可与第四分子(例如酶标的链霉抗生物素)结合。能够特异性结合免疫球蛋白恒定区的其它蛋白质(例如A蛋白或G蛋 白)也可用作标记物。这些结合蛋白是链球菌细胞壁的正常成分，对 不同物种的免疫球蛋白恒定区表现出强烈的非免疫原性反应性。 Akerstrom， J. Immunol., 135:2589-2542 (1985); Chaubert， Mod. Pathol., 10:585-591 (1997)。在测定过程中，每次混合试剂后都可能需要孵育和/或洗涤步骤。 孵育步骤可以不同，约5秒至几小时，优选约5分钟至约24小时。 然而，孵育时间将取决于测定方式、分析物、溶液体积、浓度等。 通常可以在环境温度下进行测定，尽管它们也可以在一段温度范围 内进行。A. 非竟争性结合测定免疫结合测定可以是非竟争性测定。这些测定具有大量捕获的 分析物，它们可以被直接测定。例如在一个优选的"夹心，，测定中， 捕获剂(抗体)可以直接结合在固体基质上并被固定。再用这些固定的 捕获剂去捕获(结合)试验样品中的抗原。由此固定的蛋白质再结合标 记物，例如带有标记的笫二抗体。在另一个优选的"夹心"测定中， 第二抗体缺乏标记，但是可以结合标记抗体，所述标记抗体对第二 抗体来源物种的抗体具有特异性。第二抗体也可用可检测部分(例如 生物素)修饰，而该部分又可被笫三标记分子(例如链霉抗生物素)特 异性结合。参见Harlow和Lane, Antibodies, A Laboratory Manual,第 14章，Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988),所述文献通过引用 结合到本文中。B. 竟争性结合测定免疫结合测定可以是竟争性测定。可以通过以下方法，间接测
定样品中的分析物数量通过测定所添加的替代分析物，或与样品 中的分析物竟争捕获剂(抗体)。在一个优选的竟争性结合测定中，将 已知量的分析物(通常带有标记)加入到样品中，再使样品接触捕获 剂。与抗体结合的标记的分析物数量，同样品中分析物的浓度成反 》匕(参见Harlow和Lane, Antibodies, A Laboratory Manual,第14章,第 579-583页，出处同上)。在另一个优选的竟争性结合测定中，将捕获剂固定在固体基质 上。可以通过测定蛋白/抗体复合物中的蛋白量，或者通过测定未结 合的蛋白量，来测定与捕获剂结合的蛋白量。可以通过提供带标记 的蛋白质，来检测蛋白量。Harlow和Lane (出处同上)。再一个优选的竟争性结合测定中，采用了半抗原抑制。在此， 将已知分析物固定在固体基质上。将已知量的抗体加入到样品中， 再使样品接触固定的分析物。与固定的分析物结合的抗体数量，同 样品中分析物的数量成反比。可以通过检测抗体的固定部分或保留 在溶液中的部分，来检测固定的抗体数量。当抗体被标记、或者被 随后添加的标记部分间接标记(所述标记部分特异性结合如上所述的 抗体)时，可以进行检测。C.竟争性结合测定的应用竟争性结合测定可用于交叉反应性测定，以便让技术人员能确 定被本发明肽抗体所识别的蛋白质或酶复合物是否是所需蛋白'质但 不是交叉反应分子，或者确定肽抗体对抗原是否具有特异性但不是 结合非相关抗原。在该项测定中，可将抗原固定在固体支持物上， 将未知蛋白混合物加入到测定中，与肽抗体竟争性结合固定的蛋白 质。竟争分子也结合一个或多个与所述抗原无关的抗原。蛋白质与 肽抗体竟争性结合固定的抗原的能力，与固定到固体支持物上的相 同蛋白进行比较，以确定蛋白混合物的交叉反应性。
D. 其它结合测定本发明也提供蛋白质印迹方法，以检测或定量检测样品中存在 的CD148表位或其片段。该技术通常包括采用凝胶电泳，按分子量 大小来分离样品蛋白，再将蛋白质转移到合适的固体支持物(例如硝 酸纤维素滤膜、尼龙滤膜或衍生化尼龙滤膜)上。将样品与特异性结 合CD148表位的抗体或其抗原结合区一起孵育，再检测所得复合物。 这些肽抗体可直接标记，或者随后采用特异性结合肽抗体的标记抗 体来测定。E. 诊断测定本发明的衍生结合剂(例如肽和肽抗体或其片段)可用于诊断以 CD148或亚基表达为特征的病症或疾病，或者可用于正在使用CD148 及其片段活化剂、CD148活性激动剂或抑制剂进行治疗的患者的监 测测定。CD148的i貪断测定包括利用抗体和标记来测定人体液或细 胞及组织^是取物中CD148的方法。本发明的抗体可以有或无^f奮饰。 在一个优选的诊断测定中，通过将抗体与标记或报道分子等连接而 标记抗体。已知大量的标记和报道分子，它们中的某些已在本文中 描述。具体地讲，本发明用于诊断人类疾病。本领域已知使用对相应蛋白质具有特异性的抗体对CD148进行 测定的多种方案。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测 定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。优选两位点的基于单克隆的免 疫测定，该测定使用对CD148上的两个非干扰表位具有反应性的单 克隆抗体，但是也可采用竟争性结合测定。这些测定在例如以下文 献中有说明Maddox等，J. Exp. Med., 158:1211 (1983)。为了提供诊断依据，通常要建立人CD148表达的正常值或标准 值。该测定通过以下方法来完成在本领域众所周知的适于形成复 合物的条件下，将正常受试者(优选人)的体液或细胞提取物与抗 CD148抗体混合。可以通过将抗体与已知数量的CD148蛋白结合，
与对照和疾病样品进行比较，定量测定标准复合物形成的数量。然 后，将得自正常样品的标准值与得自可能受疾病影响的患者的样品进行比较。标准值和患者值之间的偏差表明CD148在疾病状态中的 作用。对于诊断应用，在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结 合区通常用可检测部分标记。可检测部分可以是能够直接或间接产 生可检测信号的任何部分。例如，可检测部分可以是放射性同位素， 例如3H、 4C、 32P、 35S或125I;荧光化合物或化学发光化合物，例如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；或酶，例如碱性磷酸酶、P-半乳 糖苷酶或辣根过氧化物酶。Bayer等，Meth. Enz., 184: 138-163, (1990)。下述实施例将进一步说明本发明，这些实施例不应视为限制性 实施例。本申请全文中所引用的所有附图和所有参考文献、专利和 已公布专利申请的内容都通过？I用结合到本文中。实施例1 -抗CD148表位抗体的产生采用以下筛选方法，鉴定了本发明的抗体重链和轻链区的亲本 形式。针对huCD148蛋白革巴标，体外查询了 Cambridge Antibody Technologies (CAT)的重组scFv (单链可变区片段)噬菌体展示文库。 筛选了超过10,000个克隆，用噬菌体展示进行回收(第2和第3轮输 出)，然后鉴定了超过250种独特的scFv抗体，所述抗体与CD148 特异性结合。在这些试剂中，根据其预测的治疗潜力，选取83种用 于进一步研究。例如，分离了几种抗体，通过竟争性ELISA或TRF (时 间分辨荧光)报告进行测定，所述抗体能够与N24竟争性结合同一表 位。通过ELISA或TRF (例如把结合，与链霉抗生物素结合进行比 较),根据其相对高的信噪比，选取其它抗体；或者因为它们与鼠CD 148 直向同源物具有交叉反应性，所以选取它们。测定所有抗CD148抗 体与muCD148 (对于体内小鼠研究)交叉反应的能力，以及结合细胞表达的huCD148的能力。8种scFv人N24类似物抗体表现出与IgG4、 大抗体(maxibodies) (二价scFv-Fc)或这两者竟争N24的最高竟争性， 表达这8种以及7种其它克隆，证实其结合活性和特异性。克隆原 始小鼠N24抗体，将Vh和VL基因亚克隆到不同抗体"平台"上， 在比较结合(即ELISA或FACS)和功能性体外和体内试验中作为阳性 对照。完成了最初"top 14"先导候选抗体的主要功能性筛选。在体 外平面迁移测定中，这些克隆中有8种能激动huCD148。此外，在 体内小鼠角膜袋测定中，这些与muCD148具有交叉反应的先导克隆 中有4种抑制FGF-2诱导的血管生成。图1-8所示的8种抗体在人 内皮细胞迁移测定和角膜袋测定中，都能够抑制血管生成，在20|ig/ml 浓度时，在体外与对照相比，具有至少20%的能力。按照以上方法产生的抗体见图1-8。图1A和图1B显示本发明 的抗体即1号抗体(Ab-l)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的核苷酸 序列及其所编码的氨基酸序列重叠。图上的阴影区表示CDR1、 CDR2 和CDR3 (分别从氨基端到羧基端)。查询序列和读框l分别表示核苷酸序列和氨基酸序列。图2A和2B显示2号抗体(Ab-2)重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列重叠。图上的阴影区表 示CDR1、 CDR2和CDR3 (分别从氨基端到羧基端)。图3A和3B显示3号抗体(Ab-3)重链可变区(VH)和轻链可变区 (VL)的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列重叠。图上的阴影区表 示CDR1 、 CDR2和CDR3 (分别从氨基端到羧基端)。图4A和4B显示4号抗体(Ab-4)重链可变区(VH)和轻链可变区 (VL)的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列重叠。图上的阴影区表 示CDR1、 CDR2和CDR3(分别从氨基端到羧基端)。图5A和5B显示5号抗体(Ab-5)重链可变区(VH)和轻链可变区 (VL)的核苦酸序列及其所编码的氨基酸序列重叠。图上的阴影区表 示CDR1、 CDR2和CDR3 (分别从氨基端到羧基端)。
图6A和6B显示6号抗体(Ab-6)重链可变区(VH)和轻链可变区 (VL)的梭苷酸序列及其所编码的氨基酸序列重叠。图上的阴影区表 示CDR1 、 CDR2和CDR3 (分别从氨基端到羧基端)。图7A和7B显示7号抗体(Ab-7)重链可变区(VH)和轻链可变区 (VL)的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列重叠。图上的阴影区表 示CDR1 、 CDR2和CDR3 (分别从氨基端到羧基端)。图8A和8B显示8号抗体(Ab-8)重链可变区(VH)和轻链可变区 (VL)的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列重叠。图上的阴影区表 示CDR1 、 CDR2和CDR3 (分别从氨基端到氯基端)。实施例2 - CD148结合表位的作图合成对应于人CD148 —级蛋白质序列胞外域的合成肽15聚体， 并与PVDF膜上的部分共价N-连接。不同组成的肽序列有3个氨基 酸重叠。含肽膜与MeOH预孵育10分钟，用PBST洗涤3次，与4%牛 奶/PBST —起孵育过夜。将膜用PBST洗涤3次后，与稀释在4%牛 奶中的lpM抗CD148抗体一起孵育3小时。再将膜洗涤3次，然后 与抗人Fc-HRP或抗小鼠Fc-HRP(Jackson)—起孵育1小时。用PBST 洗涤3次后，用Super Signal试剂盒(Pierce)测定结合。在使用一次后，立即用水将含肽膜洗涂2次，再与DMF—起孵 育过夜，从而再生含肽膜，用于新的实验。将膜用水洗涤2次后， 用再生緩冲液A(1。/。 SDS、 0.1%|3-巯基乙醇、8M尿素)洗涤几小时， 然后再用再生緩冲液B (50% EtOH、 10%乙酸)洗涤2次。单独使用 第二抗体对膜进行染色并显影，证实再生步骤的效果。完成再生步 骤后，将膜用MeOH漂清，干燥并贮存于-2(TC。按照上述方法，测定Ab-l、 Ab-2、 Ab-3和Ab-5、鼠抗CD148 抗体和抗CD148抗体143-41 (Biosource)与含肽膜的结合，结果如下鼠抗体能与以下肽结合1号膜上的肽114-117以及2号膜上的
肽90-93 (114 & 90: GPVDPSSGQQSRD1E (残基315-329),115 & 91: DPSSGQQSRD1EVLL (残基318-332),116 & 92: SGQQSRD1EVLLVGL (残基321-335)，117 & 93: QSED1EVLLVGLEPG (残基324-338)),它们具有共同表 位QSRDTE (残基324-329)。鼠抗体也结合八肽QSRDTEVLL (残基 324-332)。Ab-l结合l号膜上的肽116和117以及2号膜上的肽92和93 (116 & 92: SGQ0SRD1EYLLYGL (残基321-335), 117 & 93: QSRPTEVLLVGLEPG (残基324-338》，它们具有共同表位 QSRDTEVLLVGL (残基324-335),但是不结合八肽QSRDTEVL (残 基324-331)。所测的其它抗CD148抗体都没有表现出结合这些含肽 膜的证据。因此，Ab-l抗体结合具有氨基酸残基324-338和321-335 序列的肽，但是不结合具有人CD148氨基酸残基324-331的序列的 八肽。根据肽作图结果，鼠抗CD148抗体的最小所需表位缩小到6个 氨基酸QSRDTE(残基324-329)。 Ab-l所需的最小表位也经测定为12 个氨基酸QSRDTEVLLVGL (残基324-335)。因为其它所测的抗CD148 抗体都显示出不与含肽膜结合，所以可以确定，这些抗体的表位是 结构依赖性的。实施例3-FLAG、多聚组氨酸和Fc融合蛋白的构建和测定将以下构建体亚克隆到p412哺乳动物表达载体，IgK前导序列 和Flag多聚组氨酸标记融合物都邻接其N-端huCD14S-ECTO (残 基36-973); huCD148-NFn111 (残基36-210); huCD148-FnlII2一3 (残基 175-536); huCD148-Fn1114—5 (残基533-725); huCD148-Cterm:(残基 715-973)。将这些克隆瞬时转染到COS PKB (E5)细胞中，用IMAC 柱纯化。用两种不同的ELISA方法，测定不同抗CD148抗体的结合。第
一种方法是在Ni-NTA板上进行的直接ELISA。Ni-NTA板(Invitrogen) 用4个稀释度(1:10-1:10.000)的5种蛋白质/3°/0 BSA/PBS包被，并在 4'C孵育过夜。该板用PBST洗涤，与1]Lig/ml Ab-2-huIgG4、 Ab-5-huIgG4、鼠抗CD148抗体和143-41 (Biosource)—起在室温下赙育2 小时。再次洗涂后，该板与抗hu-IgG4-HRP(Zymed)或抗小鼠-FC-HRP (Jackson)在室温下孵育1小时。再次洗涤后，加入lOO)ul 10mg ABTS (Amersham)和45ml 0.05M柠檬酸(pH 4.0)和77pl 30% H202,使信号 显影。第二种方法是间接ELISA。在4。C，将Maxisorp板用5pg/ml抗 huFc或抗muFc (Jackson)包被过夜。该板用PBST洗涤后，再用3% BSA/PBS封闭1.5小时。再次洗涤后，该板与5貼/ml Ab-2-huIgG4、 Ab-5-huIgG4、鼠抗CD148抗体和143-41 (Biosource)在室温下孵育2 小时。再次洗涤该板，与2个稀释度(1:10, 1:100)的5种蛋白质在室 温下聘育2小时，再次洗涤，然后与抗FLAG M2-HRP (Sigma)在室 温下孵育1小时。不出所料，基于肽作图，鼠抗CD148抗体结合huCD148-Fn1112—3 蛋白(残基175-536)。市售143-41抗体(Biosource)结合huCD148-NFn111 蛋白(残基36-210)。另外，Ab-5结合huCD148-Fn1114—5蛋白(残基 533-725)和huCD148-Cterm蛋白(残基715-973)。因为该纯化方法的蛋白质收率非常低，所以将FLAG poly-his标 记转变成Fc标记。再次将构建体转染到CHO PBK E5细胞中，用A 蛋白柱纯化，通过另一种ELISA法测定抗CD148抗体的结合。 Maxisorp板用5fxg/ml 4元huFc (Jackson)在4°C包净皮过夜，洗'条,再用 3Q/o奶/PBS封闭1.5小时。该板经再次洗涤后，与5ng/ml不同CD148-Fc 构建体一起在室温下孵育2小时。再次洗涤后，将该板与lpg/mlAb-2-huIgG4、 Ab-5-huIgG4、 Ab-l-huIGg4、鼠抗CD148抗体和143-41 (Biosource)在室温下孵育2小时。该板经再次洗涤后，与抗huIgG4-HRP(Zymed)或抗小鼠Fc-HRP(Jackson)在室温下將育1小时。
将分别带有Flag、 Poly-His tags或Fc tag的5个CD148构建体， 在293 E5细胞中瞬时表达，并分别用MAC柱或A蛋白柱纯化。如 方法所述，通过ELISA,检测抗CD148克隆与不同构建体的结合。 当使用Flag、 Poly-His tags构建体时，人抗CD148克隆Ab-5同时结 合Fnl11(5 (残基533-725)片段和C-端片段(残基715-973);而当使用 Fctag构建体时，则结合FnIII4—5 (残基533-725)。它也结合带有这 两种标记的全长ECTO域蛋白(残基36-973)。人抗CD148克隆Ab-2 显示出结合带有这两种标记的全长ECTO域蛋白(残基36-973)以及低 水平地结合带有Fc标记的FnlH4—5 (残基533-725),但不结合任何其 它3种构建体。人抗CD148克隆Ab-l仅在ELISA中用于Fc构建体。 它仅结合FnlII2一3片段(残基175-536)。在所有测定中，市售鼠抗CD148 143-41 (Biosource)都结合全长ECTO域蛋白(残基36-973)和NFnIII片 段(残基36-210)，但不结合任何其它3种构建体。在所有测定中，鼠 抗CD148抗体用作阳性对照，因为已知它能识别残基324-332中的 八肽。鼠抗CD148抗体识别所有测定中的FnlH2—3片段(残基175-1536) 以及带有Fc标记的全长ECTO域蛋白(残基36_973)。根据所有3次ELISA的综合结果，结论是市售鼠抗CD148 143-41 (Biosource)抗体识别结构依赖性表位，所述表位存在于残基 36-210内。Ab誦5识别FnlII4一5 (残基533-725)片段和C-端片段(残基 715-973)。这些片段彼此之间具有11个AA的重叠。因此，这11个 AA对于Ab-5的结合是必不可少的。实施例4-抗生物素蛋白融合蛋白的构建和测定将以下构建体亚克隆到pCep4-抗生物素蛋白-N载体中 huCD148-NFnlH (残基36-210); huCD148画FnlII2一3 (残基36-536); huCD148誦F週4一5 (2)(残基36-715); huCD148-FnlII4一，(残基36-725); huCD148隱ECTO (残基36-973); huCD148Fn1112—3—4—5 (残基 200-725); huCD148FnlIB一4一5 (残基447-725); huCD148-FnlII4一5 (only)(残基533-725); huCD148-FnIII—5 (残基616-725); huCD148-Fnin一5.5 (残基672-725)。按照生产商的方案，使用脂转染胺试剂(Lipofectamine 2000， Invitrogen)，将所有抗生物素蛋白表达构建体都转染到293 T细胞中。 转染后2天，收集条件培养基，用生物素珠(Spherotechlnc.)测定抗生 物素蛋白-融合蛋白水平。对于每种构建体来说，使用5pl珠子。这 些珠子与3% BSA在室温下一起孵育30分钟而预封闭，用0.2% BSA/PBS洗涤一次后，加入到200)li1各种条件培养基中，再孵育1 小时。2次洗涤后，加入lpg/ml抗抗生物素蛋白-FITC (载体)，再孵 育30分钟，然后再次洗涤珠子，重悬于500pl洗涤緩冲液中，用FACS 读数。根据表达水平的结果，可以确定结合测定中所用的条件培养 基的用量。结合测定方案与上述方案相同，只是用lpg/ml FITC标记 的抗CD148 Ab-2替代抗抗生物素蛋白-FITC，并加入Ab-5抗体。该 测定方法的一个改动包括将抗生物素蛋白融合蛋白与目标FITC标记 的抗体以及50x过量的未标记抗体共孵育，以测定未标记抗体是否 能有效竟争/阻止待测FITC-标记的抗体的结合。该竟争测定可用于 测定任何抗体是否可与另 一个抗体竟争性结合同一表位空间。Ab-2和Ab-5都能识别全长huCD148-ECTO (残基36-973)和 huCD148-Fn1114—5 (残基36_725)构建体。然而，这些抗体都不与 huCD148-NFnl11 (残基36-210)、 huCD148-Fn1112—3 (残基36-536)和 huCD148-Fnni4一5 (2)(残基36-715)构建体结合。Ab-5也结合 huCD148Fn1112—3—4—5 (残基200-725); huCD148Fn1113—4—5 (残基 447-725)和huCD148-FnlII4一5 (only)(残基533-725)构建体，但不结合 huCD148-Fnl11—5 (残基616-725)和huCD148-FnlII一5.5 (残基672-725) 构建体。Ab-2结合huCD148Fn1112—3—4—5 (残基200-725); huCD148FnlIB—4_5 (残基447-725)构建体，但不结合huCD148-FnlII4一5 (only)(残基533-725)、 huCD148-FnlII一5 (残基616-725)和 huCD148-FnlII一5.5 (残基672-725)构建体。
在竟争测定中，Ab-2能够完全抑制Ab-5与huCD148-ECTO构 建体的结合以及与FnlII4一5构建体的结合。Ab-5能够完全竟争Ab-2 与huCD148-ECTO的结合，但仅部分抑制Ab-2与huCD148-Fn1114—5构建体的结合。因为Ab-2和Ab-5都结合全长huCD148-ECTO (残基36_9")和 huCD148-Fn1114—5 (残基36-725)构建体，但不结合huCD148-FnlII4一5 (2)(残基36-715)构建体，后者与huCD148-FnIII4_5 (残基36-725)构 建体的不同之处仅在于C端的11个AA,而且因为这些抗体都不识 别我们的肽结合膜中的任何肽，所以结论是在残基715-725中的11 个AA对于这些抗体的结合来说是必要的，但并非充分的。根据这些 抗体与构建体 huCD148FnlII2一3—4—5 (残基 200-725)、 huCD148FnIII3_4—5 (残基447-725)、 huCD148-FnlII4一5 (only)(残基 533-725)、 huCD148國Fn111—5 (残基616-725)和huCD148-FnIII_5.5 (残 基672-725)的结合结果，可以确定Ab-5的最小结合区是残基533-725,而Ab-2的最小结合区是残基447-725。实施例5-平面迁移测定中抗CD148抗体的抗血管生成活性基本按照美国专利第6,248,327号所述，采用平面内皮细胞迁移 (伤口闭合)测定，在体外定量测定图1-8中公开的所有抗体对血管生 成的抑制作用，所述文献通过引用全部结合到本文中。在该测定中， 用在培养的细胞单层中的环形伤口闭合速率来测定内皮细胞迁移。 伤口闭合速率是线性的，在体内刺激和抑制血管生成的试剂能有效 控制伤口闭合速率。按照以下文献所述，分离并培养原代人肾微血管内皮细胞 HRMEC，在笫三代，融化后使用Martin等，In Vitro Cell Dev Biol 33:261, 1997。用硅头钻床(silicon-tipped drill press)，在长满HRMEC 单层中重复打出圆形"伤口"(直径600-800微米)。在制造伤口的时 间，向培养基(DMEM + 1% BSA)中补充20ng/ml PMA (佛波醇-12-豆 蔻酸-13-乙酸酯)，单独或者在5-50吗/ml对照或Ab-l至Ab-8的存在 下。用显微镜和图像分析软件(Bioquant, Nashville, TN),测定残留伤 口面积与时间(0-12小时)的函数。对每种试剂和试剂组合，通过残留 伤口面积对时间作图的线性回归，计算相对迁移率。Ab-l、 Ab-2、 Ab-3、 Ab-4、 Ab-5、 Ab-6、 Ab-7和Ab-8各自以 剂量反应方式抑制PMA诱导的内皮迁移，迁移率显著降低到未刺激 水平范围15-50)iig/ml。实施例6-在角膜袋测定中，抗CD148抗体的抗血管生成活性基本按照美国专利第6,248,327号所述，在小鼠角膜袋测定中， 测定本发明抗体体内抑制血管生成的能力。在该测定中，将有待检 测血管生成或抗血管生成活性的试剂以緩释形式固定在吸水性丙烯 酸聚合物小片上，将其植入到麻醉小鼠角膜上皮产生的微袋中。测 定血管化角膜缘向正常无血管角膜生长的血管生成的现象、密度和 血管生长范围。聚乙烯醇海绵小片含有FGF-2 (50ng/小片)、bFGF和IgG (12昭/ 小片，对照)或bFGF和Ab-l至Ab-8 (12^g/小片)。将小片经手术植 入角膜基质微袋中，所述艰i袋是由6-8周龄雄性C57BL/6小鼠的中 到后角膜缘的lmm显微解剖而产生的。5天后，在新血管对FGF-2 响应的高峰期，用MZ9.5 steriomicrosope (Leica),以35-50°初始角(从 极性轴到子午线)，对含有小片的角膜拍照。用相减滤色器(Adobe Photoshop 4.0)使图像数字化并进行处理，用血红蛋白含量来描绘已 建立的微血管。用图像分析软件(Bioquant, Nashville, TN)计算形成血 管的角膜图像部分中血管形.成区的血管密度，以及整个角膜内的总 血管密度。Ab-2、 Ab-4、 Ab-5和Ab-7抑制bFGF诱导的角膜血管生成，将 血管密度明显降低到小于仅用FGF所诱导的密度。
权利要求
1. 一种与人CD148表位特异性结合的分离的抗体或其抗原结合 区，所述人CD148表位定义为一个或多个选自SEQ ID NO: 33的氨 基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列。
2. 权利要求1的分离的抗体或其抗原结合区，其中所述抗体或 其抗原结合区抑制血管生成。
3. 权利要求1或2的分离的抗体或其抗原结合区，其中所述抗 体或其抗原结合区是单克隆抗体。
4. 权利要求1-3中任一项的分离的抗体或其抗原结合区，其中 所述抗体或其抗原结合区是人抗体或其抗原结合区。
5. 权利要求1-4中任一项的分离的抗体或其抗原结合区，其中 所述抗体或其抗原结合区是选自scFv、 Fab、 F(ab')2、 Fv和单链抗体 的抗体片段。
6. 权利要求1-5中任一项的分离的人抗体或其抗原结合区，其 中所述抗体或其抗原结合区包含scFv片段。
7. 权利要求1-6中任一项的分离的抗体或其抗原结合区，其中 所述抗体或其抗原结合区包含scFv-Fc融合物，或者是scFv-Fc融合 物。
8. —种竟争性抑制权利要求l- 中任一项的单克隆抗体与人 CD148表位的结合的分离的抗体或其抗原结合区，所述人CD148表 位定义为一个或多个选自SEQIDNO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列。
9. 权利要求8的分离的抗体或其抗原结合区，其中所述抗体或 其抗原结合区抑制血管生成。
10. 权利要求8或9的分离的抗体或其抗原结合区，其中所述抗 体或其抗原结合区是单克隆抗体。
11. 权利要求8-10中任一项的分离的抗体或其抗原结合区，其 中所述抗体或其抗原结合区是人抗体。
12. 权利要求8-11中任一项的分离的抗体或其抗原结合区，其 中所述抗体或其抗原结合区是选自scFv、 Fab、 F(ab')2、 Fv和单链抗 体的抗体片段。
13. 权利要求8-12中任一项的分离的人抗体或其抗原结合区， 其中所述抗体或其抗原结合区包含scFv片段。
14. 权利要求8-13中任一项的分离的抗体或其抗原结合区，其 中所述抗体或其抗原结合区包含scFv-Fc融合物，或者是scFv-Fc融 合物。
15. —种杂交瘤细胞，它产生权利要求1-14中任一项的抗体或 其抗原结合区。
16. —种转染瘤细胞，它产生^l利要求1-14中任一项的抗体或 其抗原结合区。
17. 权利要求1-14中任一项的分离的抗体或其抗原结合区，它 由杂交瘤产生，所述杂交瘤包含与无限增殖化细胞融合的B细胞， 所述B细胞得自转基因非人类动物，所述转基因非人类动物的基因 组包含人重链转基因和人轻链转基因。
18. 权利要求1-14中任一项的分离的抗体或其抗原结合区，它 由转染瘤产生，所述转染瘤包含编码人重链和人轻链的核酸。
19. 权利要求15的杂交瘤细胞或权利要求16的转染瘤细胞所产 生的单克隆抗体或其抗原结合区。
20. —种表达权利要求1-14中任一项的抗体或其抗原结合区的 转基因非人类动物，其中所述转基因非人类动物的基因组包含人重链转基因和人轻链转基因。
21. —种产生与人CD148表位特异性结合的抗体或其抗原结合 区的方法，所述人CD148表位定义为一个或多个选自SEQEDNO:33 的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725 的氨基酸序列；所述方法包括用人CD148表位或表达所述人CD148 表位的细胞来免疫转基因非人类动物，所述动物的基因组包含人重 链转基因和人轻链转基因，所述人CD148表位定义为一个或多个选 自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸序列；使所述动物的B细胞产生抗体； 分离所述动物的B细胞；将所述B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成分 泌所述抗体或其抗原结合区的无限增殖化杂交瘤细胞。
22. —种药物组合物，所述组合物包含权利要求1-14或17-19 中任一项的抗体或其抗原结合区以及药学上可接受的人用载体。
23. 权利要求22的组合物，其中所述抗体或其抗原结合区以治 疗有效量存在。
24. 权利要求22或23的组合物，其中所述抗体或其抗原结合区 的浓度为至少约10)Lig/ml。
25. 权利要求22-24中任一项的组合物，其中所述抗体或其抗原 结合区是IgG抗体或其抗原结合区。
26. 权利要求1-14或17-19中任一项的抗体或抗原结合区，其用于治疗。
27. 有特定用途的权利要求26的抗体或抗原结合区，其中所述 抗体或抗原结合区用于抑制血管生成。
28. 权利要求1-14或17-19中任一项的抗体或抗原结合区在制备用于抑制血管生成的药物组合物中的用途。的抗体或抗原结合区，其中所述抗体或其抗原结合区是IgG抗体或 其抗原结合区。
29.
30. 有特定用途的或者有权利要求28或29的用途的权利要求 26-27或29中任一项的抗体或抗原结合区，其中所述抗体或其抗原 结合区包括scFv、 Fv、 Fab'、 Fab、双抗体、线性抗体或抗体的F(ab')2 抗原结合片段。
31. —种与权利要求1-14或17-19中任一项的抗体结合的分离 的多肽或其任何片段，所述多肽由选自SEQ ID NO: 33的氨基酸 315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸 序列组成。
32. —种与权利要求1-14或17-19中任一项的抗体结合的分离 的多肽或其任何片段，所述多肽主要由选自SEQIDNO:33的氨基酸 315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸 序列组成。
33. —种与权利要求1-14或17-19中任一项的抗体结合的分离 的多肽或其任何片段，所述多肽包含选自SEQ ID NO: 33的氨基酸 315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的氨基酸 序列，其中所述多肽不包括那些来自CD148但不是选自SEQIDNO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725 的氨基酸。
34. —种免疫测定方法，所述方法包括下述步骤(a)使试验样 品与单克隆抗体或其抗原结合区接触，所述单克隆抗体或其抗原结 合区在其与人CD148结合时能够被与人CD148表位特异性结合的单 克隆抗体或其抗原结合区竟争性抑制，所述人CD148表位定义为一 个或多个选自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、200-536、 533-725和200-725的多肽序列；和(b)测定所述试验样品中 人CD148的存在。
35. 权利要求34的免疫测定，其中所述抗体或其抗原结合区激 活CD148诱导的对血管生成的抑制。
36. —种与人CD148表位特异性结合的化合物的鉴定方法，所 述人CD148表位定义为一个或多个选自SEQ ID NO: 33的氨基酸 315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序 列；所述方法包括使试验化合物与人CD148表位接触足够时间以 形成复合物，所述人CD148表位定义为一个或多个选自SEQ ID NO: 33的氨基酸315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725 的多肽序列；然后通过检测复合物中的所述CD148表位或所述化合 物，来检测所述复合物的形成，因此，如果检出复合物的话，就鉴 定出与所述CD148表位结合的化合物。
37. —种与人CD148表位特异性结合的化合物的鉴定方法，所 述人CD148表位定义为一个或多个选自SEQ ID NO: 33的氨基酸 315-329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序 列；所述方法包括提供限定CD148表位三维结构的原子坐标，所 述CD148表位定义为一个或多个选自SEQ ID NO: 33的氨基酸31S 329、 318-332、 321-335、 324-338、 324-329、 324-332、 324-335、 447-725、 533-725、 715-973、 200-536、 533-725和200-725的多肽序列；然后 根据所述原子坐标来设计或选择能够结合所述CD148表位的化合 物。
全文摘要
描述了抗CD148抗体及其抗原结合区，以及包含这样的抗体和抗原结合区的药物组合物。也描述了使用这样的抗体和抗原结合区结合CD148表位并激活CD148功能例如抑制血管生成的方法。还描述了可用于激活CD148功能和抗血管生成活性的表位以及能与之结合的化合物的鉴定方法。
文档编号C07K16/00GK101124246SQ200580020383
公开日2008年2月13日 申请日期2005年4月22日 优先权日2004年4月23日
发明者J·F·斯马瑟斯, R·卡里夫, W·C·范斯洛夫三世 申请人:安姆根有限公司