用于治疗狼疮的方法

专利名称：用于治疗狼疮的方法
技术领域：
本发明关注利用特殊剂量给药摄生法和方案在受试者中治疗狼疮的方法，以及附有所述用途之说明书的试剂盒。
背景技术：
狼疮自身免疫性疾病，诸如系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力(MG)和特发性血小板减少性紫癜(ITP)等，仍然是临床上重要的人类疾病。正如其名称所暗示的，自身免疫性疾病通过身体自身的免疫系统造成其严重破坏。尽管各种类型自身免疫性疾病间的病理学机制有所不同，但是有一种普遍的机制涉及患者血清中存在的某些抗体(在此称为自身反应性抗体或自身抗体)与自身核或细胞抗原的结合。
狼疮是涉及攻击结缔组织的抗体的自身免疫性疾病。据估计，这种疾病影响近1百万美国人，主要是年龄20-40之间的女性。狼疮的主要形式是一种系统性的疾病(系统性红斑狼疮；SLE)。SLE与抗核抗体的产生、循环中的免疫复合物以及补体系统的激活有关。在年龄20至60的女性中，SLE的发病率大约为700人中有一人。SLE可影响任何器官系统，并可引起严重的组织损伤。SLE中存在不同特异性的众多自身抗体。SLE患者常常产生具有抗DNA、抗Ro和抗血小板特异性且能起始诸如肾小球肾炎、关节炎、浆膜炎、新生儿完全性心脏传导阻滞和血液学异常某些疾病的临床特征的自身抗体。这些自身抗体还可能涉及中枢神经系统紊乱。Arbuckle等人描述了SLE临床发作前自身抗体的形成(Arbuckle et al.，N.Engl.J.Med.349(16)1526-1533(2003))。
狼疮不治疗是可以致命的，因为它从攻击皮肤和关节发展到攻击内部器官，包括肺、心和肾(主要关注肾病)。狼疮主要表现为连续的突然发作，伴随着少许或无疾病表现的居间期。
肾损伤，通过尿中蛋白尿数量测量，是SLE中与致病性有关的最剧烈损伤区域之一，并且是该疾病至少50％的死亡率和发病率的原因。
将对双链天然DNA有免疫反应性的抗体的存在用作SLE的诊断标志。
目前，对于已诊断患有SLE的患者没有真正有疗效的治疗方法。在实践上，医师通常采用许多强免疫抑制性药物，诸如高剂量的皮质类固醇，例如泼尼松(prednisone)，或者硫唑嘌呤或环磷酰胺，可在发作期给予这些药物，但对于那些频繁发作的患者也可以持续给药。即使通过有效的治疗减轻了症状和延长了寿命，许多这些药物对所治疗的患者具有潜在的有害副作用。此外，这些免疫抑制性药物干扰人们产生所有抗体的能力，不仅是自身反应性抗DNA抗体。免疫抑制剂还削弱身体对其它潜在病原体的防御，从而使患者极易患上感染和其它潜在的致命疾病，诸如癌症。在有些这类情况中，当前治疗形态的副作用与该疾病的持续低水平表现结合，可能引起严重的损伤和早死(premature death)。近来的治疗摄生法包括环磷酰胺、甲氨喋呤、抗疟药、激素治疗(例如DHEA)和抗激素疗法(例如抗促乳激素药溴隐亭(bromocriptine))。
利用抗体治疗SLE的方法也已有描述。Diamond等人(美国专利4,690,905)的方法包括产生针对抗DNA抗体的单克隆抗体(该单克隆抗体在该专利中称为抗独特型抗体)，然后用这些抗独特型抗体从患者系统中去除致病性抗DNA抗体。然而，为了治疗而取走大量血液可能是危险且复杂的过程。美国专利6,726,909公布了治疗SLE的方法，其中对患者施用抗体组合物，所述抗体组合物包含纯化的抗DNA抗独特型抗体，且所述施用需要注射或其它等同的施用模式。
高剂量静脉内免疫球蛋白(IVIG)输注也已用于治疗某些自身免疫性疾病。迄今为止，用IVIG治疗SLE得到了各种结果，包括狼疮肾炎的消除(Akashi et al.，J.Rheumatology 17375-379(1990))，以及在少数情况中，蛋白尿和肾损伤的加剧(Jordan et al.，Clin Immunol.Immunopathol.53S164-169(1989))。
CD20抗体及使用它的治疗方法淋巴细胞是在造血过程中在骨髓中生成的多种类型白细胞之一。有两种主要的淋巴细胞群B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)。本文特别感兴趣的淋巴细胞是B细胞。
B细胞在骨髓中成熟，然后离开骨髓并在它们的细胞表面表达抗原结合抗体。当幼稚B细胞初次遇到其膜结合抗体特异性的抗原时，细胞开始快速分裂，且其后代分化成为记忆B细胞和称做“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞具有较长的寿命，并继续表达与最初的亲本细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不生成膜结合抗体，但改为生成可分泌形式的抗体。分泌型抗体是体液免疫的主要效应分子。
CD20抗原(也称做人B淋巴细胞限制分化抗原，Bp35)是位于前B淋巴细胞(pre-B)和成熟B淋巴细胞上、具有约35kD分子量的疏水性跨膜蛋白质(Valentine et al.，J.Biol.Chem.264(19)11282-11287(1989)；及Einfeld etal.，EMBO J.7(3)711-717(1988))。该抗原也在超过90％的B细胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson et al.，Blood 63(6)1424-1433(1984))，但在造血干细胞、原B细胞(pro-B)、正常浆细胞或其它正常组织上没有发现(Tedder et al.，J.Immunol.135(2)973-979(1985))。CD20调节细胞周期起始和分化的激活过程的早期步骤(Tedder et al.，见上文)，并可能作为钙离子通道起作用(Tedder et al.，J.Cell.Biochem.14D195(1990))。
假如CD20在B细胞淋巴瘤中表达，则该抗原可用做“靶向”此类淋巴瘤的候选者。本质上，这种靶向作用可概括如下对患者施用对B细胞CD20表面抗原特异的抗体。这些抗CD20抗体特异结合正常和恶性B细胞的CD20抗原(表面上)；抗体与CD20表面抗原结合可导致赘生性B细胞的破坏和消减。此外，可将具有破坏肿瘤潜力的化学试剂或放射性标记物与抗CD20抗体偶联，使得该试剂特异“投递”至赘生性B细胞。不考虑方法，首要目标是破坏肿瘤；具体方法可根据所使用的具体抗CD20抗体来决定，因此可利用的靶向CD20抗原的方法可能变化相当大。
rituximab(利妥昔单抗，RITUXAN)抗体是针对CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人单克隆抗体。rituximab就是1998年4月7日发布的美国专利5,736，137(Anderson等人)中称为“C2B8”的抗体。rituximab指示用于治疗患有复发的或难治的低级或滤泡性CD20阳性B细胞非何杰金氏淋巴瘤的患者。作用机制的体外研究表明rituximab结合人补体并通过补体依赖性细胞毒性(CDC)溶解淋巴样B细胞系(Reff et al.，Blood 83(2)435-445(1994))。此外，它在抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)测定法中具有显著活性。最近，rituximab在氚标记胸苷掺入测定法中显示出具有抗增殖效果，并直接诱导凋亡，而其它抗CD19和CD20抗体则不然(Maloney et al.，Blood 88(10)637a(1996))。在试验中还观察到rituximab与化学疗法和毒素之间的协同作用。具体而言，rituximab使耐药性人B细胞淋巴瘤细胞系对多柔比星(doxorubicin)、CDDP、VP-16、白喉毒素和蓖麻毒蛋白的细胞毒性作用敏感(Demidem et al.，Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3)177-186(1997))。体内临床前研究显示rituximab可能通过补体和细胞介导的过程从猕猴的外周血、淋巴结和骨髓中消减B细胞(Reff et al.，Blood 83(2)435-445(1994))。
美国在1997年11月批准将rituximab用于治疗患有复发的或难治的低级或滤泡性CD20阳性B细胞NHL的患者，每周一次，一剂375mg/m2，共四剂。2001年4月，食品和药品管理局(FDA)批准了用于治疗低级NHL的其它要求复治(每周一次，共四剂)和额外的剂量给药摄生法(每周一次，共八剂)。有超过300,000名患者暴露于rituximab，或是作为单一疗法或是联合免疫抑制剂或化疗药物。还已经作为维持疗法用rituximab治疗患者，可长达2年(Hainsworth et al.，J.Clin.Oncol.211746-51(2003)；Hainsworth etal.，J.Clin.Oncol.204261-7(2002))。
也已在B细胞和自身抗体表现出在疾病病理生理学中发挥作用的多种非恶性自身免疫性紊乱中研究了rituximab。Edwards et al.，Biochem.Soc.Trans.30824-828(2002)。已有报导，rituximab潜在减轻例如类风湿性关节炎(RA)(Leandro et al.，Ann.Rheum.Dis.61883-888(2002)；Edwards et al.，Arthritis Rheum.46(Suppl.9)S46(2002)；Stah1 et al.，Ann.Rheum.Dis.62(Suppl.1)OP004(2003)；Emery et al.，Arthritis Rheum.48(9)S439(2003))、狼疮(Eisenberg，Arthritis Res.Ther.5/4157-159(2003)；Leandro et al.，ArthritisRheum.462673-2677(2002)；Gorman et al.，Lupus 13312-316(2004))、免疫性血小板减少性紫癜(D′Arena et al.，Leuk.Lymphoma 44561-562(2003)；Stasi et al.，Blood 98952-957(2001)；Saleh et al.，Semin.Oncol.27(Supp 12)99-103(2000)；Zaia et al.，Haematolgica 87189-195(2002)；Ratanatharathornet al.，Ann.Int.Med.133275-279(2000))、纯红细胞再生障碍(Auner et al.，Br.J.Haematol.116725-728(2002))、自身免疫性贫血(Zaja et al.，Haematologica 87189-195(2002)，勘误见Haematologica 87336(2002))、冷凝集素疾病(Layios et al.，Leukemia 15187-8(2001)；Berentsen et al.，Blood1032925-2928(2004)；Berentsen et al.，Br.J.Haematol.11579-83(2001)；Bauduer，Br.J.Haematol.1121083-1090(2001)；Damiani et al.，Br.J.Haematol.114229-234(2001))、重度胰岛素耐受的B型综合征(Coll et al.，N.Engl.J.Med.350310-311(2004))、混合性冷球蛋白血症(DeVita et al.，Arthritis Rheum.46 Suppl.9S206/S469(2002))、重症肌无力(Zaja et al.，Neurology 551062-63(2000)；Wylam et al.，J.Pediatr.143674-677(2003))、韦格纳氏(Wegener)肉芽肿(Specks et al.，Arthritis & Rheumatism 442836-2840(2001))、难治的寻常型天疱疮(Dupuy et al.，Arch.Dermatol.14091-96(2004))、皮肌炎(Levine，Arthritis Rheum.46(Suppl.9)S1299(2002))、斯耶格伦氏(Sjgren)综合征(Somer et al.，Arthritis & Rheumatism 49394-398(2003))、活动性II型混合性冷球蛋白血症(Zaja et al.，Blood 1013827-3834(2003))、寻常型天疱疮(Dupay et al.，Arch.Dermatol.14091-95(2004))、自身免疫性神经病(Pestronk et al.，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 74485-489(2003))、副肿瘤性视性眼阵挛-肌阵挛综合征(Pranzatelli et al.，Neurology60(Suppl.1)PO5.128A395(2003))、以及复发-缓和型多发性硬化(RRMS)(Cross et al.，(abstract)“Preliminary Results from a phase II trial of rituximabin MS”，美国多发性硬化研究与治疗委员会第八次年会，20-21(2003))的征候和症状。
已在类风湿性关节炎(RA)患者中进行了II期研究(WA16291)，提供了有关rituximab的安全性和功效的48周跟踪数据。Emery et al.，Arthritis Rheum.48(9)S439(2003)；Szczepanski et al.，Arthritis Rheum.48(9)S121(2003)。将总共161名患者随机平分为四个治疗组甲氨蝶呤、仅rituximab、rituximab加甲氨蝶呤、以及rituximab加环磷酰胺(CTX)。rituximab治疗摄生法为第1天和第15天静脉内施用1克。大多数RA患者对输注rituximab有很好的耐受，而36％的患者在其首次输注期间发生至少一种不良后果(与30％接受安慰剂的患者相比)。总而言之，认为大多数不良后果在严重程度上是温和至中度的，而且所有处理组之间很平衡。在48周中四个组共有19件严重的不良事件，其中rituximab/CTX组稍多一些。所有组之间的感染发生率很平衡。该RA患者群体中严重感染的平均比率为每100患者-年4.66，低于基于社会的流行病学研究中所报告的RA患者中需要住院治疗的感染比率(每100患者-年9.57)。Doran et al.，Arthritis Rheum.462287-2293(2002)。
所报导的rituximab在少数神经学紊乱患者中的安全谱，包括自身免疫性神经病(Pestronk et al.，见上文)、视性眼阵挛-肌阵挛综合征(Pranzatelli etal.，见上文)、和RRMS(Cross et al.，见上文)，与在肿瘤学或RA中所报导的类似。正在RRMS患者中进行的rituximab联合干扰素-β(IFN-β)或醋酸格拉默的研究者发起试验(IST)(Cross et al.，见上文)中，接受治疗的10名患者中有1个在首次输注rituximab后发生中度发烧和打寒战，之后入院彻夜观察，而其他9名患者完成了四次输注摄生法，没有报告任何不良事件。
关注CD20抗体和CD20结合分子的专利和专利出版物包括美国专利5,776,456、5,736,137、5,843,439、6,399,061和6,682,734，以及US2002/0197255、US 2003/0021781、US 2003/0082172、US 2003/0095963、US2003/0147885(Anderson等人)；美国专利6,455,043、US 2003/0026804和WO 2000/09160(Grillo-Lopez，A.)；WO 2000/27428(Grillo-Lopez和White)；WO 2000/2743 3和US 2004/0213784(Grillo-Lopez和Leonard)；WO2000/44788(Braslawsky等 人)；WO 2001/10462(Rastetter，W.)；WO2001/10461(Rastetter和White)；WO 2001/10460(White和Grillo-Lopez)；US 2001/0018041、US 2003/0180292、WO 2001/34194(Hanna和Hariharan)；US 2002/0006404和WO 2002/04021(Hanna和Hariharan)；US 2002/0012665和WO 2001/74388(Hanna，N.)；US 2002/0058029(Hanna，N.)；US2003/0103971(Hariharan和Hanna)；US 2002/0009444和WO 2001/80884(Grillo-Lopez，A.)；WO 2001/97858(White，C.)；US 2002/0128488和WO2002/34790(Reff，M.)；WO 2002/060955(Braslawsky等人)；WO 2002/096948(Braslawsky等人)；WO 2002/079255(Reff和Davies)；美国专利6,171,586和WO 1998/56418(Lam等人)；WO 1998/58964(Raju，S.)；WO 1999/22764(Raju，S.)；WO 1999/51642和美国专利6,194,55 1、6,242,195、6,528,624和6,538,124(Idusogie等人)；WO 2000/42072(Presta，L.)；WO 2000/67796(Curd等人)；WO 2001/03734(Grillo-Lopez等人)；US 2002/0004587和WO2001/77342(Miller和Presta)；US 2002/0197256(Grewal，I.)；US 2003/0157108(Presta，L.)；WO 04/056312(Lowman等人)；US 2004/0202658和WO2004/091657(Benyunes，K.)；WO 2005/000351(Chan，A.)；US 2005/0032130A1(Beresini等人)；US 2005/0053602A1(Brunetta，P.)；美国专利6,565,827、6,090,365、6,287,537、6,015,542、5,843,398和5,595,721(Kaminski等人)；美国专利5,500,362、5,677,180、5,721,108、6,120,767和6,652,852(Robinson等人)；美国专利6,410,391(Raubitschek等人)；美国专利6,224,866和WO00/20864(Barbera-Guillem，E.)；WO 2001/13945(Barbera-Guillem，E.)；WO2000/67795(Goldenberg)；US 2003/0133930和WO 2000/74718(Goldenberg和Hansen)；US 2003/0219433和WO 2003/68821(Hansen等人)；WO2004/05 8298(Goldenberg和Hansen)；WO 2000/76542(Golay等人)；WO2001/72333(Wolin和Rosenblatt)；美国专利6,368,596(Ghetie等人)；美国专利6,306,393和US 2002/0041847(Goldenberg，D.)；US 2003/0026801(Weiner和Hartmann)；WO 2002/102312(Engleman，E.)；US 2003/0068664(Albitar等人)；WO 2003/002607(Leung，S.)；WO 2003/049694、US 2002/0009427和US 2003/0185796(Wolin等人)；WO 2003/061694(Sing和Siegall)；US2003/0219818(Bohen等人)；US 2003/0219433和WO 2003/068821(Hansen等人)；US 2003/0219818(Bohen等人)；US 2002/0136719(Shenoy等人)；WO 2004/032828(Wahl等人)；以及WO 2002/56910(Hayden-Ledbetter)。还可参见美国专利5,849,898和EP 330,191(Seed等人)；EP 332,865 A2(Meyer和Weiss)；美国专利4,861,579(Meyer等人)；US 2001/0056066(Bugelski等人)；WO 1995/03770(Bhat等人)；US 2003/0219433 A1(Hansen等人)；WO 2004/035607(Teeling等人)；US 2004/0093621(Shitara等人)；WO2004/103404(Watkins等人)；WO 2005/000901(Tedder等人)；US2005/0025764(Watkins等人)；WO 2005/016969和US 2005/0069545 A1(Carr等人)；WO 2005/014618(Chang等人)；US 2005/0079174(Barbera-Guillem和Nelson)；以及US 2005/0106108(Leung和Hansen)。其中某些格外包括狼疮的治疗。
关注用rituximab进行治疗的出版物包括Perotta and Abuel，“Response ofchronic relapsing ITP of 10 years duration to rituximab”，Abstract#3360 Blood10(1)(part 1-2)p.88B(1998)；Perotta et al.，“Rituxan in the treatment ofchronic idiopathic thrombocytopenic purpura(ITP)”，Blood 9449(abstract)(1999)；Matthews，R.，“Medical Heretics”，New Scientist(7 April，2001)；Leandroet al.，“Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with Blymphocyte depletion”，Ann Rheum Dis，supra；Leandro et al.，“Lymphocytedepletion in rheumatoid arthritisearly evidence for safety，efficacy and doseresponse”Arthritis and Rheumatism 44(9)S370(2001)；Leandro et al.，“Anopen study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus”，Arthritis and Rheumatism 462673-2677(2002)，其中在2周期间，每名患者接受两次500mg rituximab输注、两次750mg环磷酰胺输注、和高剂量口服皮质类固醇，且其中两名接受治疗的患者分别在第7和8个月时复发，且已经用不同方案复治；Weide et al.，“Successful long-term treatment of systemiclupus erythematosus with rituximab maintenance therapy”，Lupus 12779-782(2003)，其中用rituximab治疗一名患者(375mg/m2×4，每周重复一次)，并且每5-6个月投递更多的rituximab应用，然后每三个月接受375mg/m2rituximab的维持疗法，而且用rituximab成功的治疗了患有难治的SLE的第二名患者，且每三个月接受维持疗法，两名患者对rituximab疗法都有较好的响应；Edwards and Cambridge，“Sustained improvement in rheumatoidarthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes”，Rheumatology40205-211(2001)；Cambridge et al.，“B lymphocyte depletion in patients withrheumatoid arthritisserial studies of immunological parameters”，ArthritisRheum.46(Suppl.9)S1350(2002)；Edwards et al.，“B-lymphocyte depletiontherapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders”，Biochem.Soc.Trans.，supra；Edwards et al.，“Efficacy and safety of rituximab，a B-cell targetedchimeric monoclonal antibodyA randomized，placebo controlled trial in patientswith rheumatoid arthritis”，Arthritis and Rheumatism 46(9)S197(2002)；Edwards et al.，“Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patientswith rheumatoid arthritis”，N.Engl.J.Med.3502572-82(2004)；Pavelka et 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关于用抗CD20抗体治疗狼疮，参见例如，“B lymphocyte depletion in thetreatment of systemic lupus(SLE)Phase I/II trial of rituximab(Rituxan(R))inSLE”，Anolik et al.，Arthritis And Rheumatism 46/9S289-S289(September2002)；“A phase I trial of rituximab(anti-CD20)for treatment of systemic lupuserythematosus”，Albert et al.，Arthritis And Rheumatism 48(12)3659-3659(December 2003)；“B cell depletion in autoimmune disease”，Gorman et al.，Arthritis Research and Therapy 5/SUPPL.4S17-S21(2003)；“B-cellrepopulation occurs mainly from naive B cells in patients with rheumatoidarthritis and systemic lupus erythematosus treated with rituximab”，Leandro et al.，Arthritis And Rheumatism 48(9)S464-S464(September 2003)；“Rituximabexpanding role in therapy for lymphomas and autoimmune diseases”，Rastetter etal.，Annual review of medicine 55477-503(2004)；“B-cell biology”，Weinsteinet al.，Rheumatic Disease Clinics of North America 30/1159-174(2004)；“Treatment of refractory autoimmune diseases with ablative immunotherapy”，Cohen and 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rheumatoid arthritisTherituximab(anti-CD20)experience”，Shaw et al.，Annals of the RheumaticDiseases 62/SUPPL.255-59(2003)；“Severe hypercoagulable state andconcomitant life threatening bleeding successfully treated with rituximab”，Ahnet al.，Blood 102/11108b(November 16 2003)；以及“Graft-versus-Kaposi′sSarcoma effect and reversal of Lupus Anticoagulant Syndrome and ThalassemiaIntermedia after non-myeloablative allogeneic stem cell transplant”，Patel et al.，Blood 98/11 Part 2370b (November 16 2001)。还可参阅“Remission ofProliferative Lupus Nephritis Following B Cell Depletion Therapy Is Precededby Down-Regulation of the T Cell Costimulatory Molecule CD40 Ligand”，Sfikakis et al.，Arthrit.Rheumat.52(2)501-513(2005)和“B Cell Deletion inSLE”，D.Isenberg在2005年3月4日召开的第六届欧洲狼疮会议上的演讲，包括关于复治7名患者的幻灯片38。
狼疮患者，诸如那些显示出狼疮肾炎临床迹象的SLE患者和那些狼疮肾炎患者，需要划算且安全的治疗方法，帮助减轻组织损伤，所述组织损伤最终导致肾衰竭，以及由他们的疾患所引起的对长期血液透析和/或肾移植的需要。
发明概述本发明至少部分涉及在患有狼疮诸如SLE或狼疮肾炎的受试者中提供安全有效的治疗摄生法的CD20抗体剂量的选择。因此，本发明正如所要求的。第一方面，本发明涉及在受试者中治疗狼疮的方法，包括对受试者施用有效量的CD20抗体，以提供约0.5至4克的初次抗体暴露，随后是约0.5至4克的第二次抗体暴露，其中第二次暴露是直到距初次暴露约16至54周时才提供的，且每次抗体暴露是以单剂(as a single dose)或者分两或三剂(astwo or three separate doses)向给受试者提供抗体。
在此第一方面的一个实施方案中，伴随着初次暴露和/或更后面的暴露施用第二药物，其中所述CD20抗体是第一药物。在一个优选的实施方案中，所述第二药物是化疗剂、免疫抑制剂、抗疟药、胞毒剂、整联蛋白拮抗剂、细胞因子拮抗剂或激素。在一个更优选的实施方案中，所述第二药物是免疫抑制剂、抗疟药或化疗剂。在另一个优选的实施方案中，伴随着初次暴露施用免疫抑制剂、抗疟药或化疗剂。在其它实施方案中，它是伴随着第二次暴露和/或更后面的暴露和/或伴随着初次暴露施用的，优选伴随着所有暴露。在一个仍更优选的实施方案中，施用皮质类固醇、羟氯喹、氯喹、奎纳克林(quinacrine)、甲氨喋呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤、霉酚酸吗乙酯(mycophenolatemofetil)或6-巯基嘌呤。另一方面，所述免疫抑制剂、抗疟药或化疗剂在第二次暴露时不施用，或者以低于初次暴露时的用量施用。在此方法中，优选所述受试者先前从未用CD20抗体治疗过。
在另一个实施方案中，未对受试者施用所述CD20抗体以外的其它药物以治疗狼疮。
在另一个优选的实施方案中，所述受试者具有水平提高的渗透性CD20细胞(infiltrating CD20 cell)、抗核抗体(ANA)、抗双链DNA(dsDNA)抗体、抗Sm抗体、抗核核蛋白抗体、抗磷脂抗体、抗核糖体P抗体、抗Ro/SS-A抗体、抗Ro抗体或抗La抗体，或者两种或多种此类细胞或抗体的组合。
此外，本发明提供了包括以下各项的制品(a)装有CD20抗体的容器；和(b)附有关于在受试者中治疗狼疮的说明书的包装插页，其中所述说明书指出了对受试者施用一定量的抗体，它有效提供约0.5至4克的初次抗体暴露，随后是约0.5至4克的第二次抗体暴露，其中第二次暴露是直到距初次暴露约16至54周时才提供的，且每次抗体暴露是以单剂或者两个或三个分开剂量(separate doses)的抗体提供给受试者的。
本发明在此涉及将用CD20抗体治疗狼疮的必要之外更频繁需求减少或最小化的剂量给药数量和摄生法。在施用CD20抗体的同时、之前或之后施用免疫抑制剂、抗疟药或化疗剂通常是此类患者的标准治疗，本发明在此还优选减少、最小化或消除此类需求，以尽可能多的避免此类标准治疗的副作用，以及降低成本并使患者更方便，诸如时间上的便利。然而，本发明还考虑了此类伴随治疗的应用。
附图简述

图1A是比较鼠源2H7(SEQ ID NO1)、人源化2H7.v16变体(SEQ IDNO2)和人κ轻链亚组I(SEQ ID NO3)每种的轻链可变区(VL)氨基酸序列的序列对比。2H7和hu2H7.v16的VL的CDR如下CDR1(SEQ ID NO4)、CDR2(SEQ ID NO5)和CDR3(SEQ ID NO6)。
图1B是比较鼠源2H7(SEQ ID NO7)、人源化2H7.v16变体(SEQ IDNO8)和人重链亚组III共有序列(SEQ ID NO9)每种的重链可变区(VH)氨基酸序列的序列对比。2H7和hu2H7.v16的VH的CDR如下CDR1(SEQID NO10)、CDR2(SEQ ID NO11)和CDR3(SEQ IDNO12)。
在图1A和图1B中，每条链中的CDR1、CDR2和CDR3都包括在括号内，侧翼为框架区FR1-FR4，如图所示。2H7指鼠源2H7抗体。两行序列之间的星号指示这两种序列之间不同的位置。残基编号依照Kabat等人，《Sequences of Immunological Interest》，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.，1991，插入显示为a、b、c、d和e。
图2显示了成熟2H7.v16轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO13)。
图3显示了成熟2H7.v16重链的氨基酸序列(SEQ ID NO14)。
图4显示了成熟2H7.v31重链的氨基酸序列(SEQ ID NO15)。2H7.v31的轻链与2H7.v16相同。
图5显示了成熟2H7.v16和2H7.v511轻链(分别是SEQ ID NO13和16)的对比，采用Kabat可变区残基编号和Eu恒定区残基编号。
图6显示了成熟2H7.v16和2H7.v511重链(分别是SEQ ID NO14和17)的对比，采用Kabat可变区残基编号和Eu恒定区残基编号。
发明详述I.定义“狼疮”在用于本文时指涉及攻击结缔组织的抗体的自身免疫性疾病或紊乱。狼疮的主要形式是一种系统性的，系统性红斑狼疮(SLE)，包括皮肤SLE和亚急性皮肤SLE，以及其它类型的狼疮(包括肾炎、肾外的、大脑炎、小儿科的、非肾脏的、盘状的和脱发(alopecia)型狼疮)。
“B细胞”是在骨髓中成熟的淋巴细胞，包括幼稚B细胞、记忆B细胞或效应B细胞(浆细胞)。本文中的B细胞可以是正常的或非恶性的B细胞。
“B细胞表面标志”或“B细胞表面抗原”在本文中指在B细胞表面上表达的、可用能结合它的拮抗剂靶向它的抗原。例示性B细胞表面标志包括CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白细胞表面标志(描述参见《The Leukocyte Antigen Facts Book》，第2版，1997，Barclay等人编，Academic Press，Harcourt Brace & Co.，New York)。其它B细胞表面标志包括RP105、FcRH2、B细胞CR2、CCR6、P2X5、HLA-DOB、CXCR5、FCER2、BR3、Btig、NAG14、SLGC16270、FcRH1、IRTA2、ATWD578、FcRH3、IRTA1、FcRH6、BCMA和239287。特别感兴趣的B细胞表面标志较之哺乳动物的其它非B细胞组织优先在B细胞上表达，且可在前体B细胞和成熟B细胞二者上表达。优选的B细胞表面标志在本文中是CD20和CD22。
“CD20”抗原或“CD20”是在超过90％来自外周血或淋巴样器官的B细胞表面上发现的一种约35kDa非糖基化磷蛋白。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞二者上，但在干细胞上不表达。文献中CD20的其它名称包括“B淋巴细胞限制抗原”和“Bp35”。例如，Clark et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)821766(1985)中描述了CD20抗原。
“CD22”抗原或“CD22”，也称为BL-CAM或Lyb8，是分子量约130(缩短的)至140kD(未缩短的)的1型整合膜糖蛋白。它在B淋巴细胞的细胞质和细胞膜二者中表达。CD22抗原在B细胞淋巴细胞分化的早期出现，大约在与CD19抗原相同的阶段。与其它B细胞标志不同，CD22膜表达局限于成熟B细胞(CD22+)和浆细胞(CD22-)之间包含的分化晚期。例如，Wilson et al.，J.Exp.Med.173137(1991)和Wilson et al.，J.Immunol.1505013(1993)中描述了CD22抗原。
“抗体拮抗剂”在本文中指在结合B细胞上的B细胞表面标志后破坏或消减哺乳动物中的B细胞和/或干扰一种或多种B细胞功能(例如通过降低或阻止由B细胞引发的体液反应)的抗体。优选的是，抗体拮抗剂能够在用其处理的哺乳动物中消减B细胞(即降低循环中的B细胞水平)。这种消减可通过各种机制来实现，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)、抑制B细胞增殖、和/或诱导B细胞死亡(如通过凋亡)。本发明范围内的拮抗剂包括抗体、合成或天然序列肽、及与B细胞表面标志结合的小分子拮抗剂，任选与胞毒剂偶联或融合。优选的拮抗剂包括抗体。
术语“抗体”在本文中使用其最广的含义，具体覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展示所需生物学活性。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
为了本文的目的，“完整抗体”指包含重链和轻链可变区及Fc区的抗体。
“结合B细胞表面标志的抗体”指在结合B细胞表面标志后破坏或消减哺乳动物中的B细胞和/或干扰一种或多种B细胞功能(例如通过降低或阻止由B细胞引发的体液反应)的分子。优选的是，该抗体能够在用其处理的哺乳动物中消减B细胞(即降低循环中的B细胞水平)。这种消减可通过各种机制来实现，诸如ADCC和/或CDC、抑制B细胞增殖、和/或诱导B细胞死亡(如通过凋亡)。优选的是，所述B细胞表面标志是CD20，因此结合B细胞表面标志的抗体是结合CD20的抗体，或“CD20抗体”。
CD20抗体的实例包括“C2B8”，现在称作“rituximab”(利妥昔单抗，“RITUXAN”)(美国专利5,736,137)；钇[90]标记的2B8鼠源抗体，称作“Y2B8”或“Ibritumomab Tiuxetan”(ZEVALIN)，可从IDEC Pharmaceuticals，Inc.购买(美国专利5,736,137；2B8于1993年6月22日保藏于ATCC，编号HB11388)；鼠源IgG2a“B1”，也称作“Tositumomab”(托西莫单抗)，任选用131I标记以产生“131I-B1”抗体或“碘131 Tositumomab”抗体(BEXXARTM)，可从Corixa购买(还可见美国专利5,595,721)；鼠源单克隆抗体“1F5″(Press et al.，Blood 69(2)584-591(1987)及其变体，包括“框架修补”或人源化1F5(WO 03/002607，Leung，S.；ATCC保藏物HB-96450)；鼠源2H7和嵌合2H7抗体(美国专利5,677,180)；人源化2H7；HUMAX-CD20TM抗体(Genmab，丹麦)；WO 2004/035607(Teeling等人)中所列的人单克隆抗体；AME-133TM抗体(Applied Molecular Evolution)；A20抗体或其变体，诸如嵌合或人源化A20抗体(分别是cA20或hA20)(US2003/0219433，Immunomedics)；及单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2，可从国际白细胞分类研究组(International Leukocyte TypingWorkshop)获得(Valentine等人，在《Leukocyte Typing III》中，McMichael编，第440页，Oxford University Press，1987)。
术语“rituximab”或“RITUXAN”在本文中指针对CD20抗原的基因工程嵌合鼠/人单克隆抗体，在美国专利5,736,137中称作“C2B8”，包括其保持结合CD20能力的片段。
纯粹为了本文的目的且除非另有说明，“人源化2H7”指人源化CD20抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体在体内有效消减灵长类B细胞，该抗体在其重链可变区(VH)中至少包含来自抗人CD20抗体的CDR H3序列SEQID NO12(图1B)和基本上人重链亚组III(VHIII)的人共有框架(FR)残基。在一个优选的实施方案中，该抗体还包含重链CDR H1序列SEQ ID NO10和CDR H2序列SEQ ID NO11，更优选还包含轻链CDR L1序列SEQ ID NO4、CDR L2序列SEQ ID NO5、CDR L3序列SEQ ID NO6和基本上人轻链κ亚组I(VκI)的人共有框架(FR)残基，其中VH区可连接人IgG链恒定区，其中所述区可以是例如IgG1或IgG3。在一个优选的实施方案中，此类抗体包含VH序列SEQ ID NO8(v16，如图1B所示)，任选还包含VL序列SEQ ID NO2(v16，如图1A所示)，它可在重链中具有氨基酸替代D56A和N100A以及在轻链中具有S92A(v96)。优选的是，所述抗体是包含轻链和重链氨基酸序列分别为SEQ ID NO13和14(如图2和3所示)的完整抗体。在另一个优选的实施方案中，所述抗体是包含轻链和重链氨基酸序列分别为SEQ ID NO13和15(如图2和4所示)的2H7.v31。本文中的抗体还可在Fc区中包含至少一个改进ADCC和/或CDC活性的氨基酸替代，诸如其中氨基酸替代是S298A/E333A/K334A的抗体，更优选具有重链氨基酸序列SEQ ID NO15(如图4所示)的2H7.v31。任何这些抗体还可在Fc区中包含至少一个降低CDC活性的氨基酸替代，例如至少包含替代K322A。见美国专利6,528,624 B1(Idusogie等人)。
优选的人源化2H7是如下完整抗体或抗体片段，其包含轻链可变区序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO2)；和重链可变区序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWV
GAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO8)。
当人源化2H7抗体是完整抗体时，优选的是，它包含轻链氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO13)；和重链氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO14)或重链氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO15)。
在本发明的优选实施方案中，基于2H7型式16的变体的V区将具有v16的氨基酸序列，除了下表指出的氨基酸替代的位置。除非另有说明，2H7变体将具有与v16相同的轻链。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，随后引起靶细胞溶解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)中第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所描述的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95652-656(1998)中所公开的。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应物功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应物功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。
术语“Fc受体”和“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质域。激活受体FcγRIIA在其胞质域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见Daёron，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 425-34(1994)；及de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126330-341(1995))。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括未来将会鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24249(1994))。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时分子溶解靶物的能力。补体激活途径是由补体系统第一组分(C1q)结合与关联抗原复合的分子(如抗体)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202163(1996)中所描述的。
“生长抑制性”抗体指那些阻止或降低表达抗体所结合的抗原的细胞增殖的抗体。例如，抗体可在体外和/或在体内阻止或降低B细胞增殖。
“诱导凋亡”的抗体指那些根据标准凋亡测定法诸如膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂和/或膜囊形成(称作凋亡小体)的测定，诱导例如B细胞的程序性细胞死亡的抗体。
“天然抗体”通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的分子量约150,000道尔顿的异型四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在具有不同免疫球蛋白同种型的重链中有所变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变区(VH)，接着是多个恒定区。每条轻链在一端具有一个可变区(VL)，而另一端是一个恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区排列在一起，而轻链的可变区与重链的可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。
术语“可变的”指可变区中的某些部分在抗体序列中差异广泛且用于每种特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区中称作高变区的三个区段。可变区中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在某些情况中形成β-折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示出多种效应物功能，诸如ADCC中抗体的参与。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段，它具有两个抗原结合位点，并且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。正是在这种构造中，各个可变区的三个高变区相互作用而在VH-VL二聚体表面确定了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。本文中Fab’-SH是其中恒定区的半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，根据其恒定区的氨基酸序列，可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将抗体归入不同的类别。完整抗体有五种主要的类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同抗体类别对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，该Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述参见Plückthun，在《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》中，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，269-315，1994。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的描述于例如EP 404,097；WO 1993/11161；及Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，1993。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指由一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的变体外，这种变体通常以极少量存在。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，每种单克隆抗体针对抗原上的同一决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的优越性体现在它们未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示由基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler et al.，Nature256495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clackson et al.，Nature 352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)中描述的技术由噬菌体抗体库分离。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们显示出所需的生物学活性(美国专利4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(如旧大陆猴类(Old World Monkey)，诸如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变区抗原结合序列以及人恒定区序列的“灵长类化(primatized)”抗体(美国专利5,693,780)。
非人源(如鼠源)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人源免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人源免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人源免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人源残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体将包含基本上不少于至少一个、通常两个如下可变区，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人源免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有的FR是人源免疫球蛋白序列的FR，除了上文所述的FR替代。任选的是，人源化抗体还将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区，通常是人源免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.，Nature 321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(如轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变区中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)和/或来自“高变环”的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变区中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987))。“框架”或“FR”残基指本文定义的高变区残基以外的可变区残基。
“裸的(naked)”抗体指未偶联异源分子，诸如细胞毒性模块或放射性标记物的抗体(本文所定义的)。
“分离的”抗体指已经由其天然环境的一种成分鉴别和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分指将会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry方法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)通过使用考马斯蓝或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE达到同质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
本文中的“受试者”指人类受试者。通常，此类受试者符合狼疮治疗的条件。为了本文的目的，此类符合条件的受试者是正在发生或已经发生狼疮的一种或多种征候、症状或其它指标，或者已经诊断有狼疮，无论是例如最近诊断、先前诊断有新的发作，或者长期类固醇依赖及新的发作，或者是有风险形成狼疮。符合狼疮治疗条件的受试者可任选作为已经对浸润性CD20细胞水平升高筛选的受试者或者使用检测诸如下述自身抗体的测定法筛选的受试者而得到鉴定，其中定性且优选定量评估自身抗体生成。与SLE有关的例示性此类自身抗体有抗核抗体(ANA)、抗双链DNA(dsDNA)抗体、抗Sm抗体、抗核核蛋白抗体、抗磷脂抗体、抗核糖体P抗体、抗Ro/SS-A抗体、抗Ro抗体和抗La抗体。
肾炎狼疮发作定义为1)在一个月的时间内Scr增加＞30％，或2)肾病综合征的复发或出现，或3)就蛋白尿基线＞1gm/24小时而言尿蛋白提高3倍或如实施例1所指出的。对于狼疮肾炎，治疗条件可通过下文实施例1所注的肾标准所定义的肾炎发作证明。
SLE的诊断可依照美国风湿病学学会(ACR)的当前标准。活动性疾病可通过一个不列颠群岛狼疮活动组(British Isles Lupus Activity Group，BILAG)的“A”标准或两个BILAG“B”标准来定义，如实施例2中所注明的。修改自文献Tan et al.，“The Revised Criteria for the Classification of SLE”ArthRheum 25(1982)，用于诊断SLE的某些征候、症状或其它指标可以是面颊疹诸如面颊皮疹、盘形皮疹或红色突起斑点；光过敏诸如对阳光的反应，导致皮疹出现或增加；口腔溃疡诸如鼻或口中的溃疡，通常是不痛的；关节炎，诸如涉及两个或更多外周关节的非侵蚀性关节炎(其中关节周围的骨骼未遭破坏的关节炎)；浆膜炎、胸膜炎或心包炎；肾紊乱，诸如尿中蛋白质过多(高于0.5gm/天或用测试棒达到3+)和/或细胞脱落物(衍生自尿和/或白细胞和/或肾小管细胞的异常成分)；神经学征候、症状或其它指标，癫痫发作(抽搐)和/或无药物的精神病或已知引起所述后果的代谢紊乱；以及血液学征候、症状或其它指标，诸如溶血性贫血或白血球减少症(白血球计数低于每立方毫米4,000个细胞)或淋巴球减少症(低于每立方毫米1,500个淋巴细胞)或血小板减少症(低于每立方毫米100,000个血小板)。白血球减少症和淋巴球减少症必须在两个或更多时刻检测到。血小板减少症必须在无已知会诱发它的药物时检测到。本发明不局限于狼疮的这些征候、症状或其它指标。
“治疗”受试者在本文中指治疗性处理和预防性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有狼疮的受试者以及要预防狼疮的受试者。因此，受试者可能已经诊断为患有狼疮或者可能有患上狼疮的倾向或易感性。
狼疮的“症状”指受试者发生的结构、功能或感觉方面的任何病态现象或偏离正常及疾病的迹象。
表述“有效量”指有效预防、改善或治疗狼疮的抗体量。
“抗体暴露”指接触或暴露于在约1天至约5周的一段时间里施用的一剂或多剂中的本文抗体。所述剂量可以一次性给予，或者在该暴露期内以固定的或无规律的间隔给予，诸如例如每周一剂达四周或相隔约13-17天的一段时间的两剂。正如本文详述的，初次和稍后的抗体暴露彼此在时间上隔开。
术语“免疫抑制剂”在本文中用于辅助疗法时指作用于抑制或掩盖本文所治疗哺乳动物的免疫系统的物质。这将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。此类药剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利4,665,077)；非类固醇抗炎药(NSAID)；更昔洛韦(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮质激素诸如皮质醇(cortisol)或醛甾酮(aldosterone)、抗炎药诸如环加氧酶抑制剂、5-脂加氧酶抑制剂、或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂，诸如硫唑嘌呤(azathioprine)或麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil，MMF)；烷化剂，诸如环磷酰胺；溴隐亭(bromocryptine)；达扎唑(danazol)；氨苯砜(dapsone)；戊二醛(如美国专利4,120,649中所述，它掩盖MHC抗原)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇，诸如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物，如泼尼松(prednisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone)；二氢叶酸还原酶抑制剂，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)(口服或皮下)；羟氯喹(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(leflunomide)；细胞因子或细胞因子受体抗体，包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体(infliximab或adalimumab)、抗TNFα免疫黏附素(依那西普(etanercept))、抗肿瘤坏死因子-β抗体、抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛T(pan-T)抗体，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(90年7月26日出版的WO 1990/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T细胞受体(Cohen等人，美国专利5,114,721)；T细胞受体片段(Offner et al.，Science251430-432(1991)；WO 1990/11294；Ianeway，Nature 341482(1989)；及WO1991/01133)；及T细胞受体抗体(EP 340,109)，诸如T10B9。
术语“胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意欲包括放射性同位素(如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素或其片段。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类，诸如噻替哌(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺；烷基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))、苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类，诸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类(enediyne)抗生素(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33183-186(1994)))；蒽环类(dynemicin)抗生素，包括dynemicin A；二碳磷酸盐类(bisphosphonate)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、羟甲雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼； 丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)； 西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurinA、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌(thiotepa)；类紫杉醇(taxoid)，如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)、ABRAXANETM紫杉醇的不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造纳米颗粒剂型(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE多西他塞(doxetaxel)(Rhne-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；NAVELBINE长春瑞宾(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊拜膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸，诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任何物质的制药学可接受的盐、酸或衍生物。
该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene)；抑制调节肾上腺中雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏罗唑(vorozole)、FEMARA来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX阿纳托唑(anastrozole)；及抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及粘着性细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Ralf和H-Ras；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；PROLEUKINrIL-2；LURTOTECAN拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIXrmRH；及上述任何物质的制药学可接受的盐、酸或衍生物。
术语“细胞因子”指由一种细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体及其制药学可接受的衍生物和盐。
术语“激素”指多肽激素，通常由具有导管的腺器官分泌。激素包括例如生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；促乳素；胎盘催乳激素；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素(activin)；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；及血小板生成素。在用于本文时，术语激素包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列激素的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体及其制药学可接受的衍生物和盐。
术语“生长因子”指促进生长的蛋白质，包括例如肝生长因子；成纤维细胞生长因子；血管内皮生长因子；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板衍生生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；及集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)、和粒细胞CSF(G-CSF)。在用于本文时，术语生长因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列生长因子的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体及其制药学可接受的衍生物和盐。
术语“整联蛋白”指容许细胞结合和应答胞外基质且涉及多种细胞功能诸如伤口愈合、细胞分化、肿瘤细胞归巢和凋亡的受体蛋白质。它们是涉及细胞-胞外基质和细胞-细胞相互作用的细胞黏附受体大家族的一部分。功能性整联蛋白由非共价结合的两个跨膜糖蛋白亚基组成，称为α和β。α亚基彼此都享有一定同源性，β亚基也是如此。受体总是含有一条α链和一条β链。例子包括α6β1、α3β1、α7β1、LFA-1等。在用于本文时，术语整联蛋白包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列整联蛋白的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体及其制药学可接受的衍生物和盐。
为了本发明的目的，“肿瘤坏死因子-α(TNF-α)”指包含Pennica et al.，Nature 312721(1984)或Aggarwal et al.，JBC 2602345(1985)中所述氨基酸序列的人TNF-α分子。
“TNF-α抑制剂”在本文中指在一定程度上抑制TNF-α的生物学功能的药剂，通常通过结合TNF-α和中和其活性。本文具体涵盖的TNF抑制剂的例子是依那西普(etanercept)(ENBREL)、infliximab(英夫利昔单抗，REMICADE)和adalimumab(阿达木单抗，HUMIRATM)。
“减轻疾病的抗风湿药”或“DMARD”的例子包括羟氯喹、柳氮磺吡啶、甲氨喋呤、来氟米特、依那西普、英夫利昔单抗(加上口服和皮下甲氨喋呤)、硫唑嘌呤、D-青霉胺、金(口服)、金(肌肉内)、米诺环素(minocycline)、环孢菌素、葡萄球菌蛋白A免疫吸附，包括其盐和衍生物等。
“非类固醇抗炎药”或“NSAID”的例子是乙酰水杨酸、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)，包括其盐和衍生物等。
本文中“整联蛋白拮抗剂或抗体”的例子包括LFA-1抗体，诸如可从Genentech购买的efalizumab(RAPTIVA)，或α4整联蛋白抗体，诸如可从Biogen购买的natalizumab(ANTEGREN)，或二氮杂环苯丙氨酸衍生物(WO2003/89410)、苯丙氨酸衍生物(WO 2003/70709、WO 2002/28830、WO2002/16329和WO 2003/53926)、苯基丙酸衍生物(WO 2003/10135)、烯胺衍生物(WO 2001/79173)、丙酸衍生物(WO 2000/37444)、链烷酸衍生物(WO 2000/32575)、取代苯基衍生物(美国专利6,677,339和6,348,463)、芳香胺衍生物(美国专利6,369,229)、ADAM解联蛋白结构域多肽(US2002/0042368)、针对αvβ3整联蛋白的抗体(EP 633945)、氮桥二环氨基酸衍生物(WO 2002/02556)等。
“皮质类固醇”指具有类固醇的一般化学结构，模拟或提高天然存在皮质类固醇的效果的数种合成的或天然存在的物质的任一种。合成的皮质类固醇的例子包括泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)(包括甲泼尼龙(methylprednisolone))、地塞米松(dexamethasone)、曲安西龙(triamcinolone)和倍他米松(betamethasone)。
“包装插页”用于指通常包括在治疗性产品的商品包装中的说明书，它们包含有关涉及此类治疗性产品应用的适应征、用法、剂量、施用、禁忌症、与该包装产品联合的其它治疗性产品、和/或警告的信息。
直至“距初次暴露”或距任一前次暴露的某段时间时才施用或提供某一暴露意味着距施用前次暴露的任何一剂的时间算起的第二次或更后面的暴露的时间，如果所述暴露中施用超过一剂的话。例如，当初次暴露中施用两剂时，根据距前次暴露中施用第一剂或第二剂的时间的算起，直到至少约16-54周时才给予第二暴露。类似的，当施用三剂时，第二暴露可以距前次暴露中第一剂、第二剂或第三剂的时间算起。优选的是，“距初次暴露”自第一剂的时间算起。
“药物”指治疗狼疮或其症状或副作用的活性药物。
II.治疗本发明提供了在符合治疗条件的受试者中治疗狼疮的方法，包括对受试者施用有效量的结合B细胞表面标志的抗体(优选CD20抗体)，以提供约0.5至4克(优选约1.5至3.5克，更优选约1.5至2.5克)的初次抗体暴露，随后是约0.5至4克(优选约1.5至3.5克，更优选约1.5至2.5克)的第二次抗体暴露，其中第二次暴露是直到距初次暴露约16至54周(优选约20至30周，更优选约46至54周)时才提供的，且每次抗体暴露是以单剂或者作为两个或三个分开剂量的抗体提供给受试者的。为了本发明的目的，第二次抗体暴露指在初次抗体暴露后下次用CD20抗体处理受试者，其中在初次暴露和第二次暴露之间没有居间的CD20抗体处理或暴露。
所述方法优选包括对受试者施用有效量的CD20抗体以提供约0.5至4克(优选约1.5至3.5克，更优选约1.5至2.5克)的第三次抗体暴露，第三次暴露是直到距初次暴露约46至60周(优选约46至55周，更优选约46至52周)时才提供的。优选的是，直至距初次暴露至少约70-75周以后才提供再次的抗体暴露(further antibody exposure)，仍更优选直至距初次暴露约74至80周以后才提供再次的抗体暴露。
可以以单剂的抗体或者作为两个或三个分开剂量的抗体(即包括第一剂和第二剂或者第一剂、第二剂和第三剂)给受试者提供本文中的任何一次或多次抗体暴露。每次抗体暴露所采用的具体剂数(无论是一剂、两剂或三剂)取决于例如所治疗狼疮的类型、所采用抗体的类型、是否采用下文所述的第二药物或采用哪种类型、及施用的方法和频率。在施用分开剂量时，优选第二剂或第三剂在距施用前一剂的时间约1-20天、更优选约6-16天、且最优选约14-16天时施用。优选分开剂量在约1天-4周的总时间内施用，更优选约1-20天(例如在6-18天的一段时间内)。在这样的一个方面，分开剂量约每周一次施用，且第二剂在距第一剂约一周时施用且任何第三剂在距第二剂约一周时施用。优选抗体的每次此类分开剂量为约0.5-1.5克，更优选约0.75-1.3克。
在一个实施方案中，给受试者提供至少约3次抗体暴露，例如约3-60次暴露，且更优选约3-40次暴露，最优选约3-20次暴露。优选的是，此类暴露以每个约24周的间隔施用。在一个实施方案中，每次抗体暴露是以单剂的抗体提供的。在一个替代的实施方案中，每次抗体暴露是作为分开剂量的抗体提供的。然而，不是每次抗体暴露都需要以单剂或分开剂量提供的。
抗体可以是裸抗体(naked antibody)，或者可以偶联另一分子，诸如胞毒剂，诸如放射性化合物。本文中优选的抗体是rituximab、人源化2H7(例如包含SEQ ID NO2和8中的可变区序列)、或HUMAX-CD20TM抗体(Genmab)，更优选rituximab或人源化2H7。
在一个实施方案中，受试者先前从未用诸如免疫抑制剂等药物处理以治疗狼疮和/或先前从未用针对B细胞表面标志的抗体治疗过(例如先前从未用CD20抗体治疗过)。在另一个实施方案中，受试者先前曾经用药物处理以治疗狼疮和/或先前曾经用此类抗体治疗过。在另一个实施方案中，CD20抗体是施用于受试者以治疗狼疮的唯一药物。在另一个实施方案中，CD20抗体是用于治疗狼疮的药物之一。在另一个实施方案中，受试者未患类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，受试者未患多发性硬化。在另一个实施方案中，受试者未患狼疮以外的自身免疫性疾病。为了最后一种陈述的目的，“自身免疫性疾病”在本文中指由个体自身组织或器官引起的并针对个体自身组织或器官的疾病或紊乱或其共分离(co-segregate)或表现或由其产生的疾患。在一个实施方案中，它指由B细胞产生的与正常身体组织和抗原起反应的抗体的产生所引起的或加剧的疾患。在其它实施方案中，自身免疫性疾病指涉及对自身抗原(例如核抗原)的表位特异的自身抗体分泌的疾病。
所述抗体以任何合适方式施用，包括肠胃外、局部、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和/或损伤内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。还设想了膜/鞘内施用(参阅例如US 2002/0009444，Grillo-Lopez，A concerning intrathecal delivery of a CD20 antibody)。此外，还可合适的通过脉冲输注来施用抗体，例如用剂量逐渐减少的抗体。优选静脉内或皮下给药，更优选静脉内输注。每次暴露可以使用相同的或不同的施用方式来提供。在一个实施方案中，每次暴露通过静脉内施用。在另一个实施方案中，每次暴露通过皮下施用给予。在又一个实施方案中，所述暴露通过静脉内和皮下施用二者给予。
在一个实施方案中，以缓慢的静脉内输注而非静脉内推注或快速注射来施用CD20抗体。例如，在CD20抗体的任何输注之前约30分钟施用甲泼尼龙(例如静脉内约80-120mg，更优选静脉内约100mg)。所述CD20抗体是通过例如专用线路输注的。
对于多剂量CD20抗体暴露的初次剂量，或者对于单一剂量，如果所述暴露只包括唯一剂量的话，此类输注优选以约50mg/小时的速率开始。这可逐步提高，例如，每约30分钟速率提高约50mg/小时直至约400mg/小时的最大值。然而，如果受试者正发生输注相关反应，则输注速率优选降低至例如当前速率的一半，例如从100mg/小时降低至50mg/小时。优选的是，此类CD20抗体剂量(例如约1000mg总剂量)的输注用约255分钟(4小时15分钟)完成。优选的是，受试者在开始输注前大约30至60分钟通过口腔接受醋氨酚/对乙酰氨基酚(例如约1g)和盐酸苯海拉明(diphenhydramine HCl)(例如约50mg或相似药剂的等效剂量)的预防性处理。
如果给予超过一次的CD20抗体输注(剂量)以完成整个暴露，则优选在此输注实施方案中以高于初次输注的速率开始第二次或随后的CD20抗体输注，例如约100mg/小时。此速率可以逐步提高，例如每约30分钟速率提高约100mg/小时直至约400mg/小时的最大值。发生输注相关反应的受试者优选将输注速率降低至该速率的一半，例如从100mg/小时降低至50mg/小时。优选的是，此类第二次或随后的CD20抗体剂量(例如约1000mg总剂量)的输注用约195分钟(3小时15分钟)完成。
还可以与结合B细胞表面标志的抗体一起(例如与CD20抗体一起)施用第二药物，诸如胞毒剂、化疗剂、抗疟药、免疫抑制剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂或抗体、生长因子、激素、整联蛋白、整联蛋白拮抗剂或抗体。
例如，抗体可以与以下药剂组合化疗剂；干扰素类药物，诸如IFN-β-1a(REBIF和AVONEX)或IFN-β-1b(BETASERON)；寡肽，诸如醋酸格拉默(glatiramer acetate)(COPAXONE)；胞毒剂，诸如米托蒽醌(NOVANTRONE)、甲氨喋呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥和硫唑嘌呤；静脉内免疫球蛋白(丙种球蛋白)；淋巴细胞消减性疗法，例如米托蒽醌、环磷酰胺、CAMPATHTM抗体、抗CD4、克拉屈滨(cladribine)、全身照射、骨髓移植；皮质类固醇，例如甲泼尼龙、泼尼松诸如低剂量泼尼松、地塞米松或糖皮质激素，例如经由关节注射，包括系统性皮质类固醇疗法；非淋巴细胞消减性免疫抑制性疗法，例如MMF或环孢菌素；“抑制素(statin)”类降低胆固醇的药物，包括西立伐他汀(cerivastatin)(BAYCOLTM)、氟伐他汀(fluvastatin)(LESCOLTM)、阿托伐他汀(atorvastatin)(LIPITORTM)、洛伐他汀(lovastatin)(MEVACORTM)、普伐他汀(pravastatin)(PRAVACHOLTM)和辛伐他汀(simvastatin)(ZOCORTM)；雌二醇；睾酮，任选提高的剂量(Stuveet al.，Neurology 8290-301(2002))；激素代替疗法；抗疟药，诸如羟氯喹、氯喹或奎纳克林；针对狼疮继发的或相关的症状(例如痉挛、失禁、疼痛、疲劳)的治疗；TNF抑制剂；DMARD；NSAID；抗整联蛋白抗体或拮抗剂；血浆去除术；左旋甲状腺素；环孢菌素A；促生长素抑制素类似物；细胞因子；抗细胞因子拮抗剂或抗体；抗代谢物；免疫抑制剂；康复性手术；放射碘；甲状腺切除术；其它B细胞表面标志拮抗剂/抗体；等等。
如果将CD20抗体称为第一药物，则此类第二药物的更具体例子包括化疗剂、胞毒剂、抗整联蛋白、抗疟药诸如例如羟氯喹、氯喹或奎纳克林、丙种球蛋白、抗CD4、克拉屈滨、皮质类固醇、MMF、环孢菌素、抑制素类降低胆固醇的药物、雌二醇、睾酮、激素代替药物、TNF抑制剂、DMARD、NSAID、左旋甲状腺素、环孢菌素A、促生长素抑制素类似物、细胞因子拮抗剂或细胞因子受体拮抗剂、抗代谢物、免疫抑制剂和/或其它B细胞表面标志抗体，诸如rituximab和人源化2H7的组合。仍更优选的是化疗剂、免疫抑制剂、胞毒剂、整联蛋白拮抗剂、抗疟药、细胞因子拮抗剂或激素，或一种或多种这些药物的组合。
这些第二药物通常以与上文所用相同的剂量和施用途径或者迄今所用剂量的大约1-99％使用。如果确实使用此类第二药物，那么优选它们以低于不存在CD20抗体时的量使用，尤其是在抗体的后续服药超过初始服药的情况下，以便消除或降低由此引起的副作用。
在伴随抗体暴露施用有效量的第二药物时，它可以伴随任何暴露施用，例如只伴随一次暴露或者伴随超过一次暴露。在一个实施方案中，第二药物伴随初次暴露施用。在另一个实施方案中，第二药物与初次和第二次暴露一起施用。在又一个实施方案中，伴随所有暴露施用第二药物。
联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药用配制剂的共施用(同时施用)，以及任一次序的连续施用，其中优选有一段时间两种(或所有)活性剂同时发挥其生物学活性。在一个优选的实施方案中，在初次暴露后，降低或消除此类药剂的量以减少受试者对具有副作用的药剂诸如泼尼松和环磷酰胺的暴露，尤其是在所述药剂是皮质类固醇时。在另一个实施方案中，第二药物的量未降低或消除。
在一个优选的实施方案中，伴随初次暴露施用免疫抑制剂、抗疟药或化疗剂，更优选皮质类固醇、甲氨喋呤、环磷酰胺、羟氯喹、氯喹、奎钠克林、硫唑嘌呤、霉酚酸吗乙酯或6-巯基嘌呤。在另一方面，免疫抑制剂、抗疟药或化疗剂在随后的暴露中不施用，或者施用量低于初次暴露的用量。然而，任选伴随超过一次暴露施用此类药剂，包括所有的暴露，量与初次暴露相同或相似。
如果狼疮是狼疮肾炎，优选施用约2-3克CD20抗体作为初次暴露，更优选约2克。在另一个优选的实施方案中，如果施用3克，持续约3周每周施用约1克CD20抗体作为初次暴露。在另一个优选的实施方案中，如果施用2克，先施用约1克CD20抗体，随后在约两周内施用另一次约1克所述抗体作为初次暴露。在另一方面，第二次暴露距初次暴露约6个月，且施用约2克的量。在又一方面，第二次暴露距初次暴露约6个月，且先施用约1克所述抗体，随后在约2周内施用另一次约1克所述抗体。
优选的是，对于狼疮肾炎，在施用CD20抗体之前和/或同时施用皮质类固醇，诸如甲泼尼龙和/或泼尼松。优选的是，紧接着第一次抗体暴露受试者以约1000mg/天静脉内接受甲泼尼龙达2天。对于第一次抗体暴露，该处理优选后继以约0.75mg/kg/天的初始剂量口服泼尼松达约4周并在约16周时逐渐减少至约10-15mg/天。优选的是，在输注初始剂量的后续剂量CD20抗体之前大约30-60分钟静脉内施用约100mg甲泼尼龙。还优选第二次暴露时施用的泼尼松量低于初次暴露时的用量，或者其中在第二次暴露时不施用泼尼松，或者第二次暴露时施用的泼尼松量低于初次暴露时的用量，但在第三或更后面的暴露时不施用。另外/或者，优选在初次抗体暴露时施用MMF，伴随施用MMF和皮质类固醇是特别优选的。优选的是，最初以约1500mg/天以分开剂量(每天3次)与CD20抗体一起给予MMF，并根据耐受情况，将受试者的用药量在大约第4周逐渐增加至约3g/天、分开剂量(每天3次)的目标剂量。如果必需减少剂量，那么允许以约250-500mg降幅减少。在另一方面，可在初次抗体暴露时对受试者施用环磷酰胺，无论是否有皮质类固醇。如果施用环磷酰胺，优选在第二次暴露时不施用或在第二次暴露时施用但用量低于初次暴露时的用量。还优选其中第三或更后面的暴露时不施用环磷酰胺。
如果所述狼疮是系统性红斑狼疮，优选施用约2克CD20抗体作为初次暴露。还优选其中先施用约1克CD20抗体，随后在约两周内施用另一次约1克所述抗体作为初次暴露。优选的是，第二次暴露距初次暴露约6个月，且施用量为约2克。在另一个优选的实施方案中，第二次暴露距初次暴露约6个月，且先施用约1克所述抗体，随后在约两周内施用另一次约1克所述抗体。
对于SLE，优选在初次暴露之前和/或同时施用泼尼松，诸如在初次暴露前一周施用约0.4-1mg/kg/天的量。更优选的是，根据他们的BILAG得分和预研究的泼尼松剂量，受试者在7天时间里接受0.5mg/kg/天、0.75mg/kg/天或1.0mg/kg/天的初次口服泼尼松摄生法。在初次施用CD20抗体后约16天时，优选给予受试者逐渐减少的泼尼松，在约10周内达到少于约10mg/天的泼尼松剂量。根据耐受情况，受试者将继续逐渐减少他们的皮质类固醇剂量直至少于或等于约5mg/天的目标剂量。仍更优选第二次暴露时施用的泼尼松量低于初次暴露时的用量，或者其中第二次暴露时不施用泼尼松，或者其中第二次暴露时施用的泼尼松量低于初次暴露时的用量，但在第三或更后面的暴露时不施用。在另一优选的方面，除了泼尼松之外，还施用了抗疟药，诸如羟氯喹、氯喹或奎钠克林，或甲氨喋呤、霉酚酸吗乙酯、硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤。可在一次或多次暴露期间施用，诸如初次或第二次暴露或更后面的暴露或所有暴露期间。在这样的实施方案中，抗疟药、甲氨喋呤、霉酚酸吗乙酯、硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤任选只在初次暴露期间施用，或者任选在第二次暴露时也施用但用量低于初次暴露时的用量。
有关产生、修饰和配制此类抗体的方法的讨论如下。
III.抗体的生产本发明的方法和制造产品可以使用或掺入结合B细胞表面标志的抗体，尤其是结合CD20的抗体。因此，本文将描述用于生成此类抗体的方法。
将用于生成或筛选抗体的CD20抗原可以是例如包含所需表位的可溶形式的CD20或其部分。或者/另外，在其细胞表面表达CD20的细胞可用于生成或筛选抗体。可用于生成抗体的其它形式的CD20对本领域熟练技术人员是显而易见的。
下面的描述例示了用于生产依照本发明使用的抗体的方法。
(i)多克隆抗体多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烃基，将相关抗原与在待免疫的物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的，例如匙孔虫戚血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和，并将溶液皮内注射于多个部位，由此将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中肽或偶联物初始量的1/5-1/10对动物进行强化。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行强化直到滴度达到稳定。优选的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行强化。偶联物还可在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
(ii)单克隆抗体单克隆抗体是由一群基本上同质的抗体获得的，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了在生产单克隆抗体的过程中可能产生的变体外，这种变体通常以很少量存在。由此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征，即不是分立的或多克隆的抗体的混合物。
例如，单克隆抗体可以通过最初由Kohler et al.，Nature 256495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(美国专利4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，《Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》，59-103，Academic Press，1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止缺乏HGPRT的细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持选择的抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的骨髓瘤细胞。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠源骨髓瘤系，诸如可从Salk Institute CellDistribution Center(San Diege，California，USA)购得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的衍生系，以及可从American Type Culture Collection(Rockville，Maryland，USA)购得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.1333001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications，51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson et al.，Anal.Biochem.107220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并使用标准方法进行培养(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，59-103，AcademicPress，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。
可通过常规免疫球蛋白纯化流程，诸如例如蛋白A-SEPHAROSETM交联琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于通过常规流程分离并测序(例如使用能够特异性结合编码鼠源抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到宿主细胞中，诸如不另外产生免疫球蛋白蛋白质的大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.5256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.130151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可从使用McCafferty et al.，Nature 348552-554(1990)所述技术构建的噬菌体抗体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson etal.，Nature 352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠源和人源抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marks et al.，Bio/Technology 10779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids Res.212265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人源抗体。由此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替换方法。
还可以修饰DNA，例如通过替代即用人重链和轻链恒定区的编码序列代替同源鼠源序列(美国专利4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851(1984))，或通过共价接合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。
通常，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定区，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变区，产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点以及对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
(iii)人源化抗体本领域已经描述了用于将非人抗体人源化的方法。优选的是，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法进行(Jones et al.，Nature 321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science 2391534-1536(1988))，通过用高变区序列替代相应的人抗体序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中本质上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。
用于制备人源化抗体的人可变区的选择，包括轻链和重链，对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体可变区序列对已知的人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims et al.，J.Immunol.1512296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链可变区亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.1512623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力以及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所需抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。通常，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
(iv)人抗体作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immuno.733(1993)；及美国专利5,591,669、5,589,369和5,545,807。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty et al.，Nature 348552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因全集生成人抗体和抗体片段。根据这种技术，将抗体V区基因克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因的读码框中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。由此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行；有关综述参见例如Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology 3564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson et al.，Nature 352624-628(1991)从衍生自免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。可本质上依照Marks et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)或Griffith et al.，EMBO J.12725-734(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集，并分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利5,565,332和5,573,905。
还可通过体外激活B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)来生成人抗体。
(v)抗体片段已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24107-117(1992)和Brennan et al.，Science 22981(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段，并通过化学方法偶联形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology 10163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 1993/16185及美国专利5,571,894和美国专利5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如美国专利5,641,870中描述的抗体。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)双特异性抗体双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合CD20抗原的两种不同表位。其它此类抗体可结合CD20且还结合第二种B细胞表面标志。或者，抗CD20结合臂可与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，使得细胞防御机制聚焦于B细胞。双特异性抗体还可用于将胞毒剂定位于B细胞。这些抗体拥有CD20结合臂以及结合胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生成基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein et al.，Nature 305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，且产物产量低。WO 1993/08829及Traunecker et al.，EMBO J.103655-3659(1991)中公开了类似的流程。
根据一种不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。优选的是，在至少一种融合物中具有包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个载体。
在本方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将所需双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO1994/04690。关于生成双特异性抗体的其它细节参见例如Suresh et al.，Methods in Enzymology 121210(1986)。
根据美国专利5,731,168中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，将从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分CH3抗体恒定区。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)，和用于治疗HIV感染(WO 1991/00360、WO 1992/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利4,676,980。
文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.，Science 22981(1985)描述了通过蛋白水解切割完整抗体生成F(ab′)2片段的方法。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al.，J.Immunol.148(5)1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原，形成单体，然后重新氧化，形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448 (1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替换机制。该片段包含通过接头相连的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL区与另一个片段上的互补VL和VH区配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber etal.，J.Immunol.1525368(1994)。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al.，J.Immunol.14760(1991)。
IV.抗体的偶联物和其它修饰任选将本文方法中所使用的或制品中所包含的抗体与胞毒剂偶联。例如，可将CD20抗体与WO 2004/032828中描述的药物偶联。
上文已经描述了可用于生成此类抗体-胞毒剂偶联物的化疗剂。
本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素形成的偶联物，诸如加利车霉素、美登素(美国专利5,208,020)、单端孢菌毒素和CC1065。在本发明的一个实施方案中，将抗体与一个和多个美登素分子偶联(例如每个抗体分子偶联约1个至约10个美登素分子)。例如可将美登素转变为May-SS-Me，后者可还原为May-SH3并与经修饰抗体反应(Chari et al.，Cancer Research 52127-131(1992))以产生美登木素生物碱-抗体偶联物。
或者，将抗体与一个或多个加利车霉素分子偶联。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1(Hinman et al.，Cancer Research 533336-3342(1993)和Lode et al.，Cancer Research 582925-2928(1998))。
可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin protein)、美洲商陆(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(neomycin)和单端孢菌毒素(tricothecenes)。还可参见例如1993年10月28日出版的WO1993/21232。
本发明还设想了与具有核酸水解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)偶联的抗体。
有多种放射性同位素可用于生成放射性偶联抗体。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和胞毒剂的偶联物，诸如3-(2-吡啶基二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二酰亚胺酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 2381098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO1994/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari et al.，Cancer Research 52127-131(1992))。
或者，可例如通过重组技术或肽合成法来制备包含抗体和胞毒剂的融合蛋白。
在另一个实施方案中，可以将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联，用于肿瘤的预定位，其中对受试者施用抗体-受体偶联物，随后使用清除剂从循环中除去未结合的偶联物，然后施用与胞毒剂(例如放射性核苷)偶联的“配体”(例如亲合素)。
还可将本发明的抗体与前体药物活化酶偶联，后者将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO 1981/01145)转变为活性抗癌药。参见例如WO1988/07378和美国专利4,975,278。
此类偶联物的酶成分包括能够以这样一种方式作用于前体药物从而将其转变为更具活性的细胞毒性形式的任何酶。
可用于本发明方法的酶包括但不限于可将含磷酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的芳基硫酸酯酶；可将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)；可转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；可将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割酶类，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可将β-内酰胺衍生的药物转变为游离药物的β-内酰胺酶；及可将在其氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作“抗体酶”，将本发明的前体药物转变为游离活性药物(参见例如Massey，Nature 328457-458(1987))。可如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物，用于将抗体酶投递至肿瘤细胞群。
可通过本领域众所周知的技术将本发明的酶与抗体共价结合，诸如使用上文讨论的异双功能交联剂。或者，可使用本领域众所周知的重组DNA技术构建包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明抗体的至少抗原结合区的融合蛋白(参见例如Neuberger et al.，Nature 312604-608(1984))。
本文还设想了抗体的其它修饰。例如，可将抗体与多种非蛋白质性质聚合物中的一种连接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。与一个和多个PEG分子连接的抗体片段，诸如Fab’是本发明尤其优选的实施方案。
本文公开的抗体还可配制成脂质体。可通过本领域已知的方法制备包含抗体的脂质体，诸如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774030(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545；及1 997年10月23日出版的WO 1997/38731中所述。美国专利5,013,556中公开了具有延长的循环时间的脂质体。
可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，产生具有所需直径的脂质体。可如Martin et al.，J.Biol.Chem.257286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon et al.，J.NationalCancer Inst.81(19)1484(1989)。
设想了本文所述蛋白质或肽抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适当的核苷酸改变引入抗体核酸或通过肽合成法来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列中的残基删除和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有所需特性，可进行删除、插入和替代的任何组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可能改变抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称作“丙氨酸扫描突变”，如Cunningham and Wells，Science 2441081-1085(1989)所述。这里，鉴定了一个或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代显示功能敏感性的氨基酸位置。由此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析在指定位点处的突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机突变，并对所表达的抗体变体筛选所需活性。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端的融合，长度范围从一个残基到包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括在抗体的N-或C-末端融合酶或提高抗体血清半衰期的多肽。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替换。最感兴趣在抗体中进行替代诱变的位点包括高变区，但也考虑了FR改变。保守替代在表1中显示为“优选替代”。如果此类替代导致生物学活性的改变，那么可以引入表1中称为“例示替代”的更实质性改变，或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选产物。
表1
对抗体生物学特性的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger，在《Biochemistry》中，第2版，73-75，Worth Publishers，New York，1975)(1)非极性的Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)(2)不带电荷的、极性的Gly(G)、Ser(s)、Thr(T)、Cys(c)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)(3)酸性的Asp(D)、Glu(E)(4)碱性的Lys(K)、Arg(R)、His(H)或者，根据共同的侧链特性，可将天然存在残基如下分组(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性、亲水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的Asp、Glu；(4)碱性的His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基Gly、Pro；(6)芳香族的Tro、Tyr、Phe。
非保守替代将需要用这些类别之一中的一个成员交换另一个类别的。
任何不涉及保持抗体正确构象的半胱氨酸残基也可替代，通常用丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。
特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法是使用噬菌体展示进行的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化样式。此类改变包括删除在抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。
多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。由此，多肽中这些三肽序列其中任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上文描述的三肽序列而便利的完成(用于N-连接的糖基化位点)。这种改变还可通过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。
在抗体包含Fc区时，可改变附着其上的碳水化合物。例如，US2003/0157108(Presta，L.)中描述了具有成熟碳水化合物结构的抗体，所述结构缺乏附着于抗体Fc区的岩藻糖。还可参见US 2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co.，Ltd.)。WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)和美国专利6,602,684(Umana等人)中提到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中具有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 1997/30087(Patel等人)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体。关于具有附着于其Fc区的更改碳水化合物的抗体还可参见WO 1998/58964(Raju，S.)和WO 1999/22764(Raju，S.)。
本文中的优选糖基化变体包含Fc区，其中附着于Fc区的碳水化合物结构缺乏岩藻糖。此类变体具有改进的ADCC功能。任选的是，Fc区还包含进一步改进ADCC的一个或多个氨基酸替代，例如Fc区位置298、333和/或334处的替代(Eu残基编号)。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体的出版物的例子包括US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；Okazakiet al.，J.Mol.Biol.3361239-1249(2004)；及Yamane-Ohnuki et al.，Biotech.Bioeng.87614(2004)。生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.，Arch.Biochem.Biophys.249533-545(1986)；US 2003/0157108，Presta，L；及WO 2004/056312，Adams et al.，尤其是实施例11)和敲除细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖转移酶基因，FUT8，敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki et al.，Biotech.Bioeng.87614(2004))。
编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体形式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
可能希望在效应物功能方面修饰本发明的抗体，例如增强抗体的ADCC和/或CDC。这可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和ADCC。参见Caron et al.，J.Exp.Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.1482918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff et al.，Cancer Research 532560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，并因此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson et al.，Anti-Cancer DrugDesign 3219-230(1989)。
WO 2000/42072(Presta，L.)描述了在存在人效应细胞时具有改进的ADCC功能的抗体，其中抗体在其Fc区中包含氨基酸替代。优选的是，具有改进的ADCC的抗体在Fc区的位置298、333和/或334包含替代。优选的是，改变的Fc区是在一个、两个或三个这些位置处包含替代或由其组成的人IgG1 Fc区。
WO 1999/51642和美国专利6,194,551、6,242,195、6,528,624和6,538,124(Idusogie等人)中描述了具有改变的C1q结合和/和CDC的抗体。这些抗体在其Fc区的氨基酸位置270、322、326、327、329、313、333和/或334其中一个或多个处包含氨基酸替代。
为了提高抗体的血清半衰期，可如例如美国专利5,739,277中所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区中负责提高IgG分子体内血清半衰期的表位。WO 2000/42072(Presta，L.)中也描述了在其Fc区中具有替代且具有提高的血清半衰期的抗体。
还设想了具有三个或更多(优选四个)功能性抗原结合位点的改造抗体(US 2002/0004587 A1，Miller等人)。
V.药用配制剂制备依照本发明使用的抗体的治疗用配制剂，即将具有所需纯化程度的抗体与任选的制药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980)，以冻干配制剂或水溶液的形式贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，还包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
例示性抗CD20抗体配制剂描述于WO 1998/56418。该出版物描述了液体多剂量配制剂，其中含有40mg/mL rituximab，25mM醋酸盐，150mM海藻糖，0.9％苯甲醇，0.02％POLYSORBATETM20乳化剂，pH5.0，它在2-8℃具有最少2年的保存期。另一种感兴趣的抗CD20配制剂在9.0mg/mL氯化钠，7.35mg/mL二水合柠檬酸钠，0.7mg/mL POLYSORBATETM80乳化剂，和注射用无菌水，pH6.5中包含10mg/mL rituximab。
适于皮下施用的冻干配制剂描述于例如美国专利6,267,958(Andya等人)。此类冻干配制剂可用合适的稀释剂重建成高蛋白质浓度，且重建后的配制剂可皮下施用于本文中待治疗的哺乳动物。
还设想了结晶形式的抗体。参见例如US 2002/0136719A1(Shenoy等人)。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物(第二药物)，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。例如，可能还希望在配制剂中提供胞毒剂，例如米托蒽醌(NOVANTRONE)、甲氨喋呤、环磷酰胺、苯丁酸氮芥或硫唑嘌呤；化疗剂；免疫抑制剂；细胞因子；细胞因子拮抗剂或抗体；生长因子；激素，例如睾酮或激素代替疗法；整联蛋白；整联蛋白拮抗剂或抗体，例如LFA-1抗体，诸如可从Genentech购得的efalizumab/RAPTIVE或α4整联蛋白抗体，诸如可从Biogen购得的natalizumab/ANTEGREN或上文所述其它的；干扰素类药物，诸如IFN-β-1a(REBIF和AVONEX)或IFN-β-1b(BETASERON)；寡肽，诸如醋酸格拉默(COPAXONE)；静脉内免疫球蛋白(丙种球蛋白)；淋巴细胞消减性药物，例如米托蒽醌、环磷酰胺、CAMPATHTM抗体、抗CD4或克拉屈滨；非淋巴细胞消减性免疫抑制性药物，例如MMF或环孢菌素；“抑制素”类降低胆固醇的药物；雌二醇；治疗狼疮继发的或相关的症状(例如痉挛、失禁、疼痛、疲劳)的药物；TNF抑制剂；DMARD；NSAID；皮质类固醇，例如甲泼尼龙、泼尼松、地塞米松或糖皮质激素；左旋甲状腺素；环孢菌素A；促生长素抑制素类似物；抗代谢物；其它B细胞表面标志拮抗剂/抗体；等。此类其它药剂(本文中称为第二药物，其中第一药物是CD20抗体)的类型和有效量取决于例如配制剂中存在的抗体的量、所治疗狼疮的类型、及受试者的临床参数。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物传递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980。
可制备持续释放配制剂。持续释放配制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。
VI.制品在本发明的另一个实施方案中，提供了装有可用于治疗上文所述狼疮的物质的制品。优选的是，该制品包含(a)装有包含结合B细胞表面标志的抗体(如CD20抗体)和制药学可接受载体或稀释剂的组合物的容器；及(b)附有在受试者中治疗狼疮的说明书的包装插页，其中所述说明书指出对受试者施用一定量的抗体以有效提供约0.5至4克的初次抗体暴露，随后是约0.5至4克的第二次抗体暴露，其中第二次暴露是直到距初次暴露约16至54周时才提供的，且每次抗体暴露是以单剂或者两个或三个分开剂量的抗体提供给受试者的。
所述包装插页贴在所述容器上或与其相关。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。所述容器可以用各种材料诸如玻璃或塑料制成。该容器装有有效治疗狼疮的组合物，且可具有无菌存取口(例如该容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管)。所述组合物中的至少一种活性剂是抗体。所述标签或包装插页表明该组合物用于在符合治疗条件的受试者中治疗狼疮，所述治疗遵循关于所提供的抗体和任何其它药物的剂量给药数量和间隔的具体指示。该制品还可包含第二容器，其中装有制药学可接受的稀释缓冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。该制品还可包含第二或第三容器，其中装有第二药物，其中所述CD20抗体是第一药物，此时该产品还包含包装插页上关于用所述第二药物治疗受试者的说明书。例示性的第二药物包括化疗剂、免疫抑制剂、抗疟药、胞毒剂、整联蛋白拮抗剂、细胞因子拮抗剂或激素。优选的第二药物是化疗剂、抗疟药或免疫抑制剂，最优选羟氯喹、氯喹、奎纳克林、环磷酰胺、泼尼松、霉酚酸吗乙酯、甲氨喋呤、硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤。更具体的说，如果狼疮是SLE，那么所述第二药物优选是皮质类固醇，诸如泼尼松(连同任选的甲氨喋呤、羟氯喹、氯喹、奎纳克林、MMF或硫唑嘌呤，有或无6-巯基嘌呤)；而如果狼疮是狼疮肾炎，那么所述第二药物优选是皮质类固醇，诸如泼尼松，以及MMF或环磷酰胺。所述制品还可包含商业和使用者立场上所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
下面的非限制性实施例阐明了本发明的更多细节。将说明书中所有引用的公开内容明确引入本文作为参考。
实施例实施例1在ISN/RPS 2003 III型或IV型狼疮肾炎患者中使用rituximab的功效和安全性的研究此项研究评估了在活动性ISN/RPS 2003III型或IV型狼疮肾炎患者中将rituximab(MABTHERA/RITUXAN)添加到霉酚酸吗乙酯(MMF)和皮质类固醇中较之只使用MMF加皮质类固醇而言在功效和安全性方面的优越性。伴随着静脉内和口服皮质类固醇，在第1天和第15天以两个初始剂量施用rituximab(1000mg×2)，随后是6个月时的1g×2。将此实验摄生法(将rituximab添加到MMF+皮质类固醇中)与安慰剂(将安慰剂添加到MMF+皮质类固醇中)进行比较。此基于rituximab的摄生法挑战了当前护理标准，消除了患者对CYTOXAN环磷酰胺(CYC)及其已知毒性的暴露，并证实了改进的净临床获益。在整个52周的研究阶段对患者监测肾和肾外的疾病活性、疾病的发作和安全性事件。此试验的主要功效终点在52周。安全性跟踪需要直至最后一剂rituximab之后12个月或B细胞恢复，无论哪项发生在后。
主要目的是测定达到完全或部分肾响应的患者的比例。
完全的肾响应定义为1.正常的肌酸酐，或者肌酸酐正常化至基线(±0.2mg/dL)，如果基线肌酸酐低于正常范围的话。
2.不活跃的尿沉积(证据是每个高倍视野(HPF)中红血球(RBC)少于10个及缺乏红细胞脱落物)。
3.尿蛋白与肌酸酐的比率＜0.5。
部分肾响应定义为1.估算肾小球滤过率(GFR)是稳定的(±10％筛选值)或改善的(依照肾病饮食修正(MDRD)方程式计算)。
2.尿沉积没有自基线恶化。
3.如果基线尿蛋白与肌酸酐的比率≤3.5，那么观察到蛋白尿下降至尿蛋白与肌酸酐的比率＜1.0；或者如果基线尿蛋白与肌酸酐的比率＞3.5，那么观察到蛋白尿下降≥50％达到低于尿蛋白与肌酸酐的比率为3.5的水平。
受试者自愿参与可长达14天的筛选期以决定是否符合条件。筛选后，还未接受MMF的受试者将以分开剂量(每天3次)以1500mg/天开始接受MMF。根据耐受性，所有受试者将逐步增加剂量(titrate)至在第4周达到分开剂量(每天3次)3g/天的目标剂量。如果剂量必须降低，则容许降幅250-500mg的降低。随机性的，受试者在继续或开始接受MMF后将开始每天一次静脉内1000mg甲泼尼龙，持续两天，然后在第三天开始患者将开始口服0.75mg/kg/天泼尼松，到第16周逐渐减少至每天10-15mg。在第1和第15天以及第168和182天，受试者将接受rituximab或安慰剂，在第15、168和1 82天在输注前30-60分钟给予静脉内施用100mg甲泼尼龙。发生肾功能恶化的受试者可根据调查员的判断退出并进行治疗。这些受试者将计作治疗失败，但密切监测安全性跟踪。
如果满足以下所有三个标准，则认为受试者符合参与此项研究的条件。即，他们●已诊断患有ISN/RPS III型或IV型狼疮肾炎，证据是在筛选的12个月内进行的肾脏活组织切片检查显示少于50％的肾小球有硬化。
●正在发病，证据是蛋白尿，尿蛋白与肌酸酐的比率＞1.0，并且或是在筛选的3个月内肾脏的活组织切片显示出ISN/RPS 2003 III型或IV型狼疮肾炎或是活跃的尿沉积且RBC/HPF＞10或存在红细胞脱落物。
●在筛选前12周内估算GFR≥30ml/min(根据MDRD方程式计算)。
在基线、在每个疗程的rituximab/安慰剂结束时、以及之后整个试验过程中每4周评估B细胞计数(CD19)。所有B细胞计数均在发起人安排的中心实验室进行。在78周结束时，接受安慰剂rituximab或活性rituximab但显示出B细胞恢复的受试者将完成整个研究的参与。接受rituximab但未显示出B细胞恢复的受试者将追踪直至B细胞恢复，定义为基线或正常的下限(无论哪项更低)。
52周后，受试者可能符合输注rituximab的条件。52周后接受一剂rituximab的所有受试者将在他们最后一剂rituximab后观察12个月或直至B细胞恢复(无论哪项更迟)。
据预测和预期，较之对照而言，在上文所述方案中对受试者施用rituximab或人源化2H7将改善狼疮肾炎的一种或多种征候、症状或其它指标。还预期，如果受试者病情正在发作，无论给予或不给予泼尼松和/或其它免疫抑制剂，在用CD20抗体进行初次治疗后12个月和18个月之间再次给予另外2克剂量的CD20抗体，或是全部一次给药，或是在大约14-16天里以1克的量分配，将有效的继续初始治疗的响应或者诱发另外的完全/部分响应。由此，CD20抗体将最初在大约2周的时间内施用，然后是大约6个月时的另一次治疗，然后是距初次治疗(从给予任一剂的时间算起)大约1年至1年半时进行另一次可能的治疗，预期会成功。这种反复治疗方案预期可成功的用于治疗增殖性狼疮肾炎。
实施例2在中度至重度系统性红斑狼疮患者中评估rituximab的功效和安全性的研究此项研究在加入II/III期试验时患有活动性SLE但未患肾小球肾炎的受试者中评估与安慰剂相比，将rituximab(MABTHERA/RITUXAN)添加到泼尼松和另一种免疫抑制剂(MMF、甲氨喋呤(MTX)、硫唑嘌呤(AZA)或6-巯基嘌呤(6-MP))中的功效和安全性。表现出一项新的BILAG A标准或两项新的BILAG B标准定义的严重狼疮发作的受试者可能是有资格的，并且将根据他们的BILAG得分和预研究泼尼松剂量而接受0.5mg/kg/天、0.75mg/kg/天或1.0mg/kg/天的初始口服泼尼松摄生法，持续7天的时间。然后受试者随机接受rituximab或安慰剂，并且在第16天时将开始接受泼尼松，在10周内逐渐减少到泼尼松剂量小于10mg/天。受试者将根据耐受性继续逐步减少他们的皮质类固醇剂量至目标剂量≤5mg/天。在研究的整个52周内对受试者监测疾病活性、其它免疫抑制剂的应用、疾病的发作、泼尼松的应用及安全性事件。该试验的主要功效终点在52周。安全性跟踪需要直至最后一剂rituximab之后12个月或B细胞恢复，无论哪项发生在后。
此项研究的主要目的是在患有中度至重度系统性红斑狼疮(SLE)的受试者中评估与安慰剂相比rituximab在达到并维持主要临床应答(MCR)或部分临床应答(PCR)中的功效，依照BILAG评估法进行评估。临床应答通过以下三个相互排斥的范畴进行分组●达到MCR的受试者。
●未达到MCR但达到PCR的受试者。
●未达到MCR或PCR的受试者(即无临床应答(NCR))。
MCR、PCR和NCR定义如下●MCR受试者在24周时达到BILAG C得分或更好，并直至52周维持此应答而未形成发作(具有BILAG A或B得分的一个或多个新范围)。
●PCR受试者在24周时达到BILAG C得分或更好，并连续16周维持此应答且未形成发作(具有BILAG B得分的一个或多个新范围)，或者在24周时达到具有BILAG B得分的某一范围的最大值，并直至52周维持此应答且未形成发作(具有BILAG B或新的BILAGA得分的一个或多个新范围)。
●NCR从第1天至第24周发生严重发作(具有BILAG A得分的一个新范围或具有BILAG B得分的两个新范围)的所有受试者或不符合上述MCR或PCR定义的任何受试者。
此项研究(比较rituximab和安慰剂)的次要目的或功效成果测量是评估以下方面●rituximab降低整体SLE疾病活性的能力，在52周内用BILAG评估法通过经时间调整的曲线下面积减去基线(AUCMB)得分进行测量。
●rituximab诱发MCR(不包括PCR)或PCR(包括MCR)的能力，通过例如在52周时达到MCR(不包括PCR)的受试者比例和达到PCR(包括MCR)的受试者比例进行测量。
●rituximab的安全性和可耐受性。
●rituximab治疗的受试者在第24周达到BILAG C得分或更好的能力，通过例如第24周在所有范围内达到BILAG C得分或更好的受试者比例进行测量。
●rituximab将形成中等或严重发作的时间拖延超过52周的能力。
●rituximab改善生活质量的能力，根据第52周自基线的SLE扩大健康调查(Expanded Health Survey)体格检查功能得分进行测量(具有对狼疮特异的附加要素的SF-36指标)。
●接受rituximab的受试者中皮质类固醇的剩余，例如根据从第24至52周每天用少于10mg泼尼松达到MCR的受试者的比例进行测量。
●在患有SLE的受试者中rituximab的药动学。
受试者自愿参与持续可长达7天的筛选期以决定其是否符合条件。受试者必须存在通过ACR标准和一个新的BILAG范畴“A”或两个新的BILAG范畴“B”标准确定的活动性狼疮但尽管在背景免疫抑制剂上也未显示出活动性肾小球肾炎。筛选时，受试者最初根据起始BILAG得分和预筛选皮质类固醇剂量以口服泼尼松0.5mg/kg/天、0.75mg/kg/天或1.0mg/kg/天处理7天。在52周的治疗和观察期内，合格的受试者以2∶1的比例随机接受静脉内rituximab 1000mg 2次(第1、15天)加上逐渐减少的泼尼松，或者静脉内rituximab安慰剂等效物加上逐渐减少的泼尼松。在第1天进行首次rituximab/安慰剂输注，在第15天进行第二次输注。预定的泼尼松逐渐减少开始于研究的第16天且在10周内患者轻微减少泼尼松至10mg/天p.o.，随后根据耐受程度在52周继续缩减到小于5mg/天。研究人员接受过如何正确施用rituximab的培训。受试者可住院观察，特别是首次输注时，这由调查员决定。rituximab必须在密切监督下施用，而且必须有立即可用的完整复苏设备。所有受试者将在第24周和26周再次服用rituximab或安慰剂。此外，在进行每次研究药物(rituximab或安慰剂)输注前30-60分钟，受试者将静脉内接受100mg solumedrol(甲强龙制剂)。
在整个研究过程中，所有受试者均被指示继续筛选时提供的基线免疫抑制性药物治疗(例如MMF、AZA/6-MP、MTX)和继续他们的抗疟疾药物治疗(如果指出了)，以及他们的基线非皮质类固醇SLE药物治疗，除非治疗调查员有所指示，否则不作改变。NSAID将允许治疗症状轻微的疾病。逐渐减少免疫抑制性药物的要求必须提前与医疗监督员讨论。下表列举了试验过程中预期使用的抗疟药和剂量范围，如果它们被指出的话。
如果调查员临床判断适合，发生方案确定的中度至重度SLE发作(治疗失败)的受试者可接受额外口服皮质类固醇的治疗。根据疾病的严重程度，这些受试者可再次用泼尼松(0.5-1.0mg/kg)进行治疗。如果由于肠胃问题暂时不能口服皮质类固醇，则可允许静脉内施用同等剂量的皮质类固醇。发生对皮质类固醇无响应的发作的受试者是那些在增加皮质类固醇治疗2周后他们的BILAG A或B症状无改善的受试者。如果受试者和调查员希望，他们将符合条件参加开放标记扩充试验(open-label extension trial)的补救治疗。如果伴随药物治疗的开始发生在第二种研究药物摄生法之前(6个月时)，则开始新的免疫抑制剂或任何其它新SLE药物治疗的受试者将进入试验的安全性跟踪期，并且将不再接受更多的研究药物。
每月对患者进行评估达12个月。在整个治疗/观察期中，在基线时、在每个rituximab/安慰剂输注疗程结束时、及随后每隔4周评估B细胞计数。所有B细胞计数都在中心实验室进行，且医师对B细胞计数不知情。在第78周结束时，接受rituximab安慰剂或rituximab并由B细胞恢复至基线或正常下限(无论哪项更低)确定而证实B细胞恢复的受试者将完成研究参与。接受rituximab但在78周时未证实B细胞恢复的受试者将观察直至B细胞恢复。
据预测和预期，较之对照而言，在上文所述方案中对受试者施用rituximab或人源化2H7将改善SLE的一种或多种征候、症状或其它指标。还预期，如果受试者病情正在发作，无论给予或不给予泼尼松和/或其它免疫抑制剂，在用CD20抗体进行初次治疗后12个月和18个月之间再次给予另外2克剂量的CD20抗体，或是全部一次给药，或是在大约14-16天里以1克的量分配，将有效的继续初始治疗的响应或者诱发另外的完全/部分响应。由此，CD20抗体将最初在大约2周的时间内施用，然后是大约6个月时的另一次治疗，之后是距初次治疗(从给予任一剂的时间算起)大约1年至1年半时进行另一次可能的治疗。这种反复治疗方案预期可成功的用于治疗SLE。
实施例3可用于本文的人源化2H7变体可用于本文目的的是包含一个、两个、三个、四个、五个或六个下列CDR序列的人源化2H7抗体CDR L1序列RASSSVSYXH，其中X是M或L(SEQ ID NO18)，例如SEQID NO4(图1A)，CDR L2序列SEQ ID NO5(图1A)，CDR L3序列QQWXFNPPT，其中X是S或A(SEQ ID NO19)，例如SEQID NO6(图1A)，CDR H1序列SEQ ID NO10(图1B)，CDR H2序列AIYPGNGXTSYNQKFKG，其中X是D或A(SEQ ID NO20)，例如SEQ ID NO11(图1B)，及CDR H3序列VVYYSXXYWYFDV，其中位置6的X是N、A、Y、W或D，而位置7的X是S或R(SEQ ID NO21)，例如SEQ ID NO12(图1B)。
上述CDR序列通常存在于人源轻链和重链可变区框架序列内，诸如主要是人轻链κ亚类I(VκI)的人共有FR残基，和主要是人重链亚类III(VHIII)的人共有FR残基。还可参见WO 2004/056312(Lowman等人)。
重链可变区可连接人IgG链恒定区，其中所述区可以是例如IgG1或IgG3，包括天然序列和非天然序列恒定区。
在一个优选的实施方案中，此类抗体包含SEQ ID NO8的重链可变区序列(v16，如图1B所示)，任选还包含SEQ ID NO2的轻链可变区序列(v16，如图1A所示)，它任选在重链可变区的位置56、100和/或100a处包含一个或多个氨基酸替代，如D56A、N100A或N100Y、和/或S100aR，及在轻链可变区的位置32和/或92处包含一个或多个氨基酸替代，如M32L和/或S92A。优选的是，所述抗体是包含SEQ ID NO13或16的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO14、15、17或22的重链氨基酸序列的完整抗体。
一种优选的人源化2H7抗体是ocrelizumab(Genentech，Inc.)。
本文中的抗体还可在Fc区中包含至少一个改进ADCC活性的氨基酸替代，诸如在位置298、333和334处的氨基酸替代，优选S298A、E333A和K334A，使用重链残基的Eu编号。还可参见美国专利6,737,056(Presta，L.)。
任何这些抗体可在Fc区中包含至少一个改进FcRn结合或血清半衰期的替代，例如在重链位置434处的替代，诸如N434W。还可参见美国专利6,737,056(Presta，L.)。
任何这些抗体还可在Fc区中包含至少一个提高CDC活性的氨基酸替代，例如在位置326处包含至少一个替代，优选K326A或K326W。还可参见美国专利6,528,624(Idusogie等人)。
有些优选的人源化2H7变体是那些包含SEQ ID NO2的轻链可变区和SEQ ID NO8的重链可变区的抗体，包括那些在Fc区(如果存在的话)中具有或没有替代的抗体，和那些包含在SEQ ID NO8中具有改变N100A；或是D56A及N100A；或是D56A、N100Y及S100aR的重链可变区和在SEQID NO2中具有改变M32L；或是S92A；或是M32L及S92A的轻链可变区的抗体。
2H7.v16重链可变区中的M34已经鉴定为抗体稳定性的潜在来源，且是替代的另一个潜在候选位置。
在本发明的一些各种优选实施方案的总结中，基于2H7.v16的变体的可变区包含v16的氨基酸序列，除了下表所示氨基酸替代的位置。除非另有说明，2H7变体将具有与v16相同的轻链。
表2例示性人源化2H7抗体变体
一种优选的人源化2H7包含2H7.v16轻链可变区序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO2)；和2H7.v16重链可变区序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO8)。
若人源化2H7.v16抗体是完整抗体，则它可包含轻链氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO13)；和重链氨基酸序列SEQ ID NO14或EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO15)。
另一种优选的人源化2H7抗体包含2H7.v511轻链可变区序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO23)；和2H7.v511重链可变区序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO24)。
参见图5和6，它们分别对比了人源化2H7.v511和人源化2H7.v16的成熟轻链和重链。
若人源化2H7.v31抗体是完整抗体，则它可包含轻链氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO13)；和重链氨基酸序列SEQ ID NO15或EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO22)。
本文中优选的一个实施方案是其中抗体是包含SEQ ID NO2和8中的可变区序列的人源化2H7。本文中另一个优选的实施方案是其中抗体是包含SEQ ID NO23和24中的可变区序列的人源化2H7。
权利要求
1.在受试者中治疗狼疮的方法，包括对受试者施用有效量的CD20抗体，以提供约0.5至4克的初次抗体暴露，随后是约0.5至4克的第二次抗体暴露，其中所述第二次暴露是直到距初次暴露约16至54周时才提供的，且每次抗体暴露是以单剂或者分两或三剂向受试者提供抗体。
2.权利要求1的方法，其中所述第二次暴露是直到距初次暴露约20至30周时才提供的。
3.权利要求1或2的方法，其中所述第二次暴露是直到距初次暴露约46至54周时才提供的。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述初次和第二次抗体暴露是各自以约1.5至3.5克的量提供的。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述初次和第二次抗体暴露是各自以约1.5至2.5克的量提供的。
6.权利要求1-5任一项的方法，还包括对受试者施用有效量的所述CD20抗体，以提供约0.5至4克的第三次抗体暴露，其中第三次暴露是直到距初次暴露约46至60周时才提供的，且第三次抗体暴露是以单剂或者分两或三剂向受试者提供抗体。
7.权利要求6的方法，其中所述第三次抗体暴露是以约1.5至3.5克的量提供的。
8.权利要求6或7的方法，其中所述第三次抗体暴露是以约1.5至2.5克的量提供的。
9.权利要求6-8任一项的方法，其中所述第三次暴露是直到距初次暴露约46至55周时才提供的。
10.权利要求6-9任一项的方法，其中直到距初次暴露至少约70-75周时没有提供再次的抗体暴露。
11.权利要求10的方法，其中直到距初次暴露约74至80周时没有提供再次抗体暴露。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中一次或多次抗体暴露是以单剂的抗体提供给受试者的。
13.权利要求12的方法，其中每次抗体暴露都是以单剂的抗体提供给受试者的。
14.权利要求1-11任一项的方法，其中一次或多次抗体暴露是作为分开剂量的抗体提供给受试者的。
15.权利要求14的方法，其中每次抗体暴露都是作为分开剂量的抗体提供的。
16.权利要求14或15的方法，其中所述分开剂量包括第一剂和第二剂。
17.权利要求14或15的方法，其中所述分开剂量包括第一剂、第二剂和第三剂。
18.权利要求15-17任一项的方法，其中所述第二剂或第三剂是在距施用前一剂约1至20天时施用的。
19.权利要求15-18任一项的方法，其中所述第二剂或第三剂是在距施用前一剂约6至16天时施用的。
20.权利要求15-19任一项的方法，其中所述第二剂或第三剂是在距施用前一剂约14至16天时施用的。
21.权利要求15-20任一项的方法，其中所述分开剂量是在总共约1天至4周的时间内施用的。
22.权利要求21的方法，其中所述分开剂量是在总共约1天至25天的时间内施用的。
23.权利要求15-22任一项的方法，其中所述分开剂量是以约每周一次施用的，即第二剂在距第一剂约一周时施用而任何第三剂在距第二剂大约一周时施用。
24.权利要求15-23任一项的方法，其中每剂分开剂量的抗体是约0.5至1.5克。
25.权利要求15-24任一项的方法，其中每剂分开剂量的抗体是约0.75至1.3克。
26.权利要求1-25任一项的方法，其中对受试者施行4至20次抗体暴露。
27.权利要求1-26任一项的方法，其中伴随着抗体暴露施用有效量的第二药物，其中所述CD20抗体是第一药物。
28.权利要求27的方法，其中所述第二药物是伴随着初次抗体暴露施用的。
29.权利要求27或28的方法，其中所述第二药物是伴随着初次和第二次抗体暴露施用的。
30.权利要求27-29任一项的方法，其中所述第二药物是伴随着所有暴露施用的。
31.权利要求27-30任一项的方法，其中所述第二药物是化疗剂、免疫抑制剂、抗疟药、胞毒剂、整联蛋白拮抗剂、细胞因子拮抗剂或激素。
32.权利要求27-31任一项的方法，其中所述第二药物是免疫抑制剂、抗疟药或化疗剂。
33.权利要求32的方法，其中所述免疫抑制剂、抗疟药或化疗剂是伴随着初次暴露施用的。
34.权利要求33的方法，其中施用皮质类固醇、甲氨喋呤、环磷酰胺、羟氯喹、氯喹、奎纳克林、硫唑嘌呤、霉酚酸吗乙酯或6-巯基嘌呤。
35.权利要求32-34任一项的方法，其中所述免疫抑制剂、抗疟药或化疗剂在第二次暴露时不施用，或者以低于初次暴露时的用量施用。
36.权利要求1-35任一项的方法，其中所述狼疮是狼疮肾炎。
37.权利要求36的方法，其中施用约2克所述CD20抗体作为初次暴露。
38.权利要求36或37的方法，其中先施用约1克所述CD20抗体，随后在约两周内施用另一次约1克所述抗体作为初次暴露。
39.权利要求36-38任一项的方法，其中所述第二次暴露距初次暴露约6个月且以约2克的量施用。
40.权利要求36-39任一项的方法，其中所述第二次暴露距初次暴露约6个月且先施用约1克所述抗体，随后在约两周内施用另一次约1克所述抗体。
41.权利要求36-40任一项的方法，其中施用皮质类固醇。
42.权利要求41的方法，其中所述皮质类固醇是甲泼尼龙或泼尼松或二者。
43.权利要求36-42任一项的方法，其中施用霉酚酸吗乙酯。
44.权利要求36-43任一项的方法，其中在距初次暴露约1年至18个月时进行对所述CD20抗体的第三次暴露。
45.权利要求1-35任一项的方法，其中所述狼疮是系统性红斑狼疮。
46.权利要求45的方法，其中施用约2克所述CD20抗体作为初次暴露。
47.权利要求45或46的方法，其中先施用约1克所述CD20抗体，随后在约两周内施用另一次约1克所述抗体作为初次暴露。
48.权利要求45-47任一项的方法，其中所述第二次暴露距初次暴露约6个月且以约2克的量施用。
49.权利要求45-48任一项的方法，其中所述第二次暴露距初次暴露约6个月且先施用约1克所述抗体，随后在约两周内施用另一次约1克所述抗体。
50.权利要求45-49任一项的方法，其中在初次暴露之前或同时施用泼尼松。
51.权利要求50的方法，其中第二次暴露时施用的泼尼松量低于初次暴露时的用量，或者其中第二次暴露时不施用泼尼松，或者其中第二次暴露时以低于初次暴露时的用量施用泼尼松但在第三次或更后面的暴露中不施用。
52.权利要求50或51的方法，其中还施用羟氯喹、氯喹、奎纳克林、甲氨喋呤、霉酚酸吗乙酯、硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤。
53.权利要求45-52任一项的方法，其中在距初次暴露约1年至18个月时进行对所述CD20抗体的第三次暴露。
54.权利要求1-53任一项的方法，其中所述受试者先前从未用CD20抗体治疗过。
55.权利要求1-54任一项的方法，其中所述抗体是裸抗体。
56.权利要求1-54任一项的方法，其中所述抗体与另一分子偶联。
57.权利要求56的方法，其中所述另一分子是胞毒剂。
58.权利要求1-57任一项的方法，其中所述抗体是静脉内施用的。
59.权利要求58的方法，其中每次抗体暴露的所述抗体是静脉内施用的。
60.权利要求1-57任一项的方法，其中所述抗体是皮下施用的。
61.权利要求60的方法，其中每次抗体暴露的所述抗体是皮下施用的。
62.权利要求1-26、36-40、44-49和53-61任一项的方法，其中未对受试者施用所述CD20抗体以外的其它药物以治疗狼疮。
63.权利要求1-62任一项的方法，其中所述抗体是rituximab。
64.权利要求1-62任一项的方法，其中所述抗体是包含SEQ ID NO2和8中可变区序列的人源化2H7。
65.权利要求1-62任一项的方法，其中所述抗体是包含SEQ ID NO23和24中可变区序列的人源化2H7。
66.权利要求1-65任一项的方法，其中所述受试者具有水平提高的渗透性CD20细胞、抗核抗体(ANA)、抗双链DNA(dsDNA)抗体、抗Sm抗体、抗核核蛋白抗体、抗磷脂抗体、抗核糖体P抗体、抗Ro/SS-A抗体、抗Ro抗体或抗La抗体，或者两种或多种此类细胞或抗体的组合。
67.制品，其包括(a)装有CD20抗体的容器；和(b)附有关于在受试者中治疗狼疮的说明书的包装插页，其中所述说明书指出对受试者施用一定量的抗体，它有效提供约0.5至4克的初次抗体暴露，随后是约0.5至4克的第二次抗体暴露，其中第二次暴露是直到距初次暴露约16至54周时才提供的，且每次抗体暴露是以单剂或者分两或三剂向受试者提供抗体。
68.权利要求67的制品，还包括装有第二药物的容器，其中所述CD20抗体是第一药物，且还包括包装插页上关于用所述第二药物治疗受试者的说明书。
69.权利要求68的制品，其中所述第二药物是化疗剂、免疫抑制剂、抗疟药、胞毒剂、整联蛋白拮抗剂、细胞因子拮抗剂或激素。
70.权利要求68或69的制品，其中所述第二药物是化疗剂、抗疟药或免疫抑制剂。
71.权利要求68-70任一项的制品，其中所述第二药物是甲泼尼龙、泼尼松、霉酚酸吗乙酯、甲氨喋呤、羟氯喹、氯喹、奎纳克林、硫唑嘌呤或6-巯基嘌呤。
全文摘要
本发明提供了在符合治疗条件的受试者中治疗狼疮的方法及用于该方法的制品，所述方法包括对受试者施用有效量的结合B细胞表面标志的抗体，以在某些剂量给药摄生法中提供对所述抗体的初次暴露和后续暴露。
文档编号C07K16/18GK1993142SQ200580026541
公开日2007年7月4日 申请日期2005年6月2日 优先权日2004年6月4日
发明者保罗·G·布龙塔 申请人:健泰科生物技术公司