蛋白质分离的方法

专利名称：：蛋白质分离的方法
技术领域：
：本发明涉及从生物源分离蛋白质的方法。更具体而言，本发明涉及从血液中分离蛋白质的方法。
背景技术：
：血浆是自然界最有价值的原材料之一，并且从血浆中纯化的蛋白质是全世界许多个体的生命和健康所必需的。这其中的大部分蛋白质由Cohn冷乙醇沉淀分级分离法生产。该方法由哈佛大学的EdwinCohn博士在20世纪40年代早期开发。Cohn发现可根据不同条件(pH、离子强度、蛋白质浓度、温度和乙醇浓度)下蛋白质的沉淀特征分离血浆中的蛋白质。通过改变这些参数，不同蛋白质以分步方式沉淀出来。Colm技术已用于血浆工业数十年，但是该方法在纯度和效率方面存在一些局限性。尽管该方法可生产一定品质的产品，但是在步骤的灵活性和所生产产品的纯度上存在局限性。商业上最为常见的依然使用该方法生产的蛋白质包括白蛋白、免疫球蛋白、抗凝血酶III、凝血酶和血纤蛋白原。生产血浆产品的一类技术进步包括层析的使用，该层析分离血浆中的蛋白质是基于液体(流动相)渗透过含固定相的封闭柱时，蛋白质分子选择性吸附到固定固体表面(固相)。根据吸附或相互作用的效率，不同蛋白质的运动被不同程度地延緩，这使其能从柱底实现分离并收集。层析本质上是较传统的Cohn冷乙醇法更为温和的分离蛋白质的手段，Cohn冷乙醇法使得蛋白质暴露在高浓度乙醇中的时间更长。这就会使蛋白质变性并产生所不需要的聚集物，这转而对接受这些产品的患者有着不利治疗后果。相反，层析分级分离可有效除去杂质，而不影响到蛋白质的天然结构。与Cohn冷乙醇分级分离法中所涉及的反复大规模沉淀相比，层析是一种更直接的分离方法，它能提高每升血浆所生产的蛋白质的量。迄今为止已被采用的层析法在使产率最优化同时维持或提高必要的纯度水平方面仍具有挑战性。仍然需要有效且高性价比的层析技术，该层析技术以相对于现有方法以更高的纯度和产量选择性洗脱血浆组分。20世纪60年代早期，人们注意到低温孵育血浆时，可观察到有沉淀物形成。已证实该沉淀物含有因子VIII、VonWillebrand因子和许多其它血浆蛋白质。最初该冷沉淀物被用于治疗A型血友病患者，但是需要提高患者对该产品的耐受性，可采用纯度更高形式的因子VIII。冷该方法效率不高，并且尽管已进行多种尝试通过直接使用血浆而非冷沉淀物提高因子VIII的回收，但是这其中很少有尝试在商业上获得成功。因子IX用于治疗B型血友病患者，它从上清液I——完善的Cohn血浆分级分离法的副流分一一中分离出。在基本所有的现有制备方法中，上清液I中的因子IX通常采用亲合层析步骤使用肝素琼脂糖凝胶(HeparinSepharose)进一步纯化，但是由于整个方法是以Cohn分经分离为基础，所以在制备效率上依然存在着显著的局限性。在这种情况下，仍需要从含有因子VIII和/或因子IX的混合物中分离因子VIII和/或因子IX的更为有效的方法。
发明内容根据第一方面，本发明提供了一种从含有蛋白质的溶液中分离所述蛋白质的方法，所述溶液选自粗制血浆、血清、来源于血浆的冷上清液、分级分离的人血浆、来源于血浆的冷沉淀物和重组肉汤(recombinantbroth),所述方法包括(i)提供具有下式的固体分离介质M-S-L其中M为基质骨架，S为任选的间隔臂，L是配体巯基烟酸；(ii)将所述固体分离介质与所述溶液相接触，这样至少一种所述蛋白质可逆地结合到所述固体分离介质上；(iii)进行至少一步洗脱以从该固体分离介质上选择性洗脱至少一种蛋白质流分。下列特征涉及本发明的第一方面。在一个实施方案中，蛋白质为哺乳动物源的或人源的。间隔臂s可来源于含有环氧基的化合物(如丁二醇二环氧甘油醚(butanedioldiglycidylether)或表氯醇)或其它合适的本领i戈已知的用于共价连接配体的偶联剂。基质骨架M可为树脂，由此该固体分离介质为与配体起作用的树脂。另外，该树脂可为配体可与其连接的任何树脂。更进一步，该树脂可为适于诸如流化床吸附和膨胀床吸附的非填充床吸附的高密度树脂，例如以6°/。或4%琼脂糖为基础的高度交联微球样琼脂糖衍生物、琼脂糖-碳化鵠凝聚物、琼脂糖不锈钢凝聚物、琼脂糖-石英凝聚物、多孔陶瓷微球、多孔氧化锆微球、控孔玻璃制成的微球以及其孔中含有有机聚合物的多孔无机材料复合孩i球。在一个实施方案中，该配体可为2-巯基烟酸(2-mercaptonicotinicacid)。由于蛋白质与配体的结合是可逆的，该蛋白质可在下述合适的洗脱条件下与固体分离介质中分离。固体分离介质可包含高密度树脂，该树脂平均颗粒大小介于约10微米至约150微米之间，微球密度介于约1.5g/mi至15g/ml之间，或者，平均颗粒大小介于约IO微米至约120微米之间，微球密度介于约2.0g/ml至15g/ml之间，或者，平均颗粒大小介于约15微米至约100微米之间，微球密度介于约2.3g/ml至15g/ml之间，或者，平均颗粒大小介于约15微米至约80微米之间，微球密度介于约3g/ml至15g/ml之间。通过第一方面的方法分离的蛋白质可选自例如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的免疫球蛋白，转铁蛋白(Tf),血纤蛋白原或其衍生物，血浆蛋白酶抑制剂例如抗凝血酶如抗凝血酶III，血液促凝固蛋白(bloodpro-coagulationprotein)，血'液抗凝固蛋白，细胞因子，生长因子，白蛋白或其衍生物，溶血栓剂，抗血管发生蛋白，胰岛素或其衍生物，a-l-蛋白酶抑制剂或其衍生物例如a-l-抗胰蛋白酶，a-2-抗纤溶酶或其衍生物，C-l酯酶抑制剂，载脂蛋白，HDL,纤连蛋白或其衍生物，糖蛋白I，纤溶酶原，纤溶酶，纤溶酶原激活物，纤溶酶原抑制剂，尿激酶或其衍生物，链激酶或其衍生物，间-a-胰蛋白酶抑制剂，a-2-巨球蛋白，淀粉状蛋白，血清类黏蛋白，铁蛋白，前白蛋白，GC-球蛋白，血凝乳酶(haemopexin)和补体C3。蛋白质流分可含有一种蛋白质。或者，蛋白质流分可含有多种蛋白质。该方法可包括1至50、1至30、1至20、I至IO、l至5步洗脱，1至3步或一步洗脱。在一个实施方案中，各种洗脱液可具有介于约4.0至约9.0之间的pH。或者，各种洗脱液可具有介于约4.0至8.5之间的pH。或者，各种洗脱液可具有介于约4.0至约8.0之间的pH。另外，各种洗脱液可具有介于约5.0至约8.0之间的pH。另外，各种洗脱液可具有介于约4.5至8.0之间的pH。另外，各种洗脱液可具有介于约5.5至约8.0之间的pH。更进一步，各种洗脱液可具有介于约6.0至8.0之间的pH。各种洗脱液可具有介于约0.00005西门子/厘米(S/cm)至约10.0S/cm之间的离子强度。或者，各种洗脱液可具有介于约0.0005S/cm至约10.0S/cm之间的离子强度。或者，各种洗脱液可具有介于约0.0001S/cm至约6.0S/cm之间的离子强度。另外，各种洗脱液可具有介于约0.001S/cm至约5.5S/cm之间的离子强度。更进一步，各种洗脱液可具有介于约0.001S/cm至约5.0S/cm之间的离子强度。又进一步，各种洗崩L液可具有介于约0.005S/cm至约5.0S/cm之间的离子强度。再进一步，各种洗脱液可具有介于约0.01S/cm至约4.0S/cm之间的离子强度。各种洗脱液可具有上述范围内的pH和离子强度值的任意组合。第一种洗脱液、第二种洗脱液或第三种洗脱液可具有介于约4.0至约9.0之间的pH，并具有介于约0.00005S/cm至约10.0S/cm之间的离子强度。第一种洗脱液可具有介于约4.0至约8.0之间的pH，并具有介于约0.00005S/cm至约0.1S/cm之间的离子强度。另外，第一种洗脱液可具有介于约4.5至约6.5之间的pH，并具有介于约0.00005S/cm至约0.075S/cm之间的离子强度。另外，第一种洗脱液可具有介于约5.0至约6.0之间的pH,并具有介于约0.001S/cm至约0.05S/cm之间的离子强度。第二种洗脱液可具有介于约5.0至约7.0之间的pH，并具有介于约0.0001S/cm至约0.1S/cm之间的离子强度。或者，第二种洗脱液可具有介于约5.5至约6.5之间的pH,并具有介于约0.0001S/cm至约0.075S/cm之间的离子强度。另外，第二种洗脱液可具有介于约5.5至约6.5之间的pH，并具有介于约0.001S/cm至约0.05S/cm之间的离子强度。第三种洗脱液可具有介于约5.0至约9.0之间的pH,并具有介于约0.0001S/cm至约4.0S/cm之间的离子强度。或者，第三种洗脱液可具有介于约6.0至约8.0之间的pH，并具有介于约0.01S/cm至约3.0S/cm之间的离子强度。另外，第三种洗脱液可具有介于约6.0至约8.0之间的pH，并具有介于约0.05S/cm至约2.0S/cm之间的离子强度。第一种洗脱液可为不会引起蛋白质的生物学功能丧失的洗脱液，例如脱矿质水或一种或多种无才几强酸的无才几盐水溶液，所述盐例如盐酸盐、疏酸盐和硝酸盐，如氯化钠、氯化钾、氯化铵、硫酸钠、辟u酸钾和硫酸铵。或者，第一种洗脱液可为含有无机酸盐和/或有机酸盐的緩冲水溶液，该无机酸盐和/或有机酸盐不会引起蛋白质的生物学功能丧失，例如含有柠檬酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲酸盐、丙酸盐、磷酸盐或硼酸盐的緩冲液。第二种洗脱液可为含有无机酸盐和/或有机酸盐的緩冲水溶液，该无机酸盐和/或有机酸盐不会引起蛋白质的生物学功能丧失，例如含有柠檬酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲酸盐、丙酸盐、磷酸盐或硼酸盐的緩沖液。在一个实施方案中，第二洗脱液含有具有非芳香族、芳香族或杂芳族疏水部分的带负电的分子(例如中链至长链烷基羧酸和烷基磺酸)和带负电的洗涤剂(例如十二烷基硫酸钠和脱氧胆酸钠)。例如，第二种洗脱液可包含一种或多种选自下列的酸的盐己酸、庚酸、辛酸、壬酸(perlagonicacid)和癸酸、十一酸、十二酸、十三酸、十四酸和十五烷酸，以及其不饱和书f生物和烷基取^U汙生物。或者，第二种洗脱液可包含一种或多种选自下列的酸的盐己磺酸、辛磺酸、癸磺酸、十二磺酸，己烷硫酸盐、辛烷硫酸盐、癸烷硫酸盐和十二烷疏酸盐。第三种洗脱液可为含有无机酸盐和/或有机酸盐的緩冲水溶液，该无机酸盐和/或有机酸盐不会引起蛋白质的生物学活性丧失，例如含有柠檬酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲酸盐、丙酸盐、磷酸盐或硼酸盐的緩冲液。或者第三种洗脱液可含有疏液性(lyotrophobicity)相对较高的无才几盐或有才几盐，例如辟^酸铵、AH酸钠、硫酸钾、磷酸铵、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾。第一方面的方法可包括用第四种洗脱液洗脱固体分离介质以选择性洗脱第四蛋白质流分。第^洗脱液可具有介于约5.0至约9.0之间的pH，并具有介于约0.01S/cm至约2S/cm之间的离子强度。或者，第四种洗脱液可具有介于约6.0至约8.0之间的pH,并具有介于约0.01S/cm至约1.0S/cm之间的离子强度。另外，第四种洗脱液可具有介于约6.0至约8.0之间的pH，并具有介于约0.05S/cm至约1.0S/cm之间的离子强度。第四种洗脱液可为含有与待分离蛋白质相容的无机酸盐和/或有机酸盐的緩冲水溶液，例如含有柠檬酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、曱酸盐、丙酸盐、磷酸盐或硼酸盐的緩冲液。第四种洗脱液还可含有一种或多种无机酸特別是无机强酸的无才几盐的水溶液，该盐不会引起蛋白质的生物学功能的丧失，例如盐酸盐、石克酸盐和贿酸盐，如氯化钠、氯化钾、氯化铵、碌b酸钠、；危酸钾、辟u酸铵。第一蛋白质流分可包含一种或多种下列选自白蛋白、血清类黏蛋白、前白蛋白、a-l-蛋白酶抑制剂(a-l-PI)、转铁蛋白和血纤蛋白原的蛋白质。第二蛋白质流分可包含一种或多种下列选自抗凝血酶例如抗凝血酶III、白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白和血纤蛋白原的蛋白质。第三蛋白质流分可包含一种或多种下列选自免疫球蛋白例如IgA、IgD、IgE、IgG和/或IgM、转铁蛋白和血纤蛋白原的蛋白质。第四蛋白质流分可包含一种或多种下列选自转铁蛋白、a-2-巨球蛋白、例如IgM的免疫球蛋白和血纤蛋白原的蛋白质。根据第二方面，本发明提供了一种从含有因子VIII和/或因子IX的溶液中分离因子VIII和/或因子IX的方法，所述溶液选自粗制血浆、血清、来源于血浆的冷上清液、分级分离的人血浆、来源于血浆的冷沉淀物和重组肉汤，所述方法包括(i)提供具有下式的固体分离介质<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中M为基质骨架、S为任选的间隔臂，L为配体苯二甲胺；(ii)将所述固体分离介质与所述溶液相接触，这样至少因子VIII和/或因子IX将可逆地结合到所述固体分离介质上；(iH)进行第一步洗脱以从该固体分离介质上洗脱未结合蛋白质；(iv)进行第二步洗脱以从该固体分离介质上洗脱因子VIII和/或因子IX。M可为适于诸如流化床吸附和膨胀床吸附的非填充床吸附的高密度树脂，例如以6%或4%琼脂糖为基础的高度交联微球样琼脂糖衍生物、琼脂糖-碳化鴒凝聚物、琼脂糖不锈钢凝聚物、琼脂糖-石英凝聚物、多孔陶乾微球、多孔氧化锆微球、控孔玻璃制成的微球以及其孔中含有有机聚合物的多孔无机材料复合微球。该高密度树脂具有介于约IO微米至约300微米、或约15微米至约150孩i米之间的平均颗粒大小和介于约1.1g/ml至15g/ml、或约1.5g/ml至15g/ml之间的微球密度，或者具有介于约10微米至约120微米之间的平均颗粒大小和介于约2.0g/ml至15g/ml之间的微球密度，或者具有介于约15微米至约IOO微米之间的平均颗粒大小和介于约2.3g/ml至15g/ml之间的微球密度，或者具有介于约15微米至约80微米之间的平均粒径和介于约3g/ml至15g/ml之间的微球密度。间隔臂S可来源于含有环氧基的化合物(如丁二醇二环氧甘油醚或表氯醇)或其它合适的本领域已知的用于共价连接配体的偶联剂。在一个实施方案中，L可为间苯二甲胺。或者L可为对苯二曱胺。L还可为邻二曱胺。未结合蛋白质可选自但不限于IgG、IgA、IgM、IgD或IgE，转铁蛋白(Tf),血纤蛋白原或其衍生物，血浆蛋白酶抑制剂例如抗凝血酶如抗凝血酶III，血液促凝固蛋白，血液抗凝固蛋白，细胞因子，生长因子，白蛋白或其衍生物，溶血栓剂，抗血管发生蛋白，胰岛素或其衍生物，a-l-蛋白酶抑制剂或其衍生物例如a-l-抗胰蛋白酶，a-2-抗纤溶酶或其^"生物，C-l酯酶抑制剂，载脂蛋白，HDL，纤连蛋白或其书亍生物，P-2-糖蛋白I，纤溶酶原，纤溶酶，纤溶酶原激活物，纤溶酶原抑制剂，尿激酶或其衍生物，链激酶或其衍生物，间-a-胰蛋白酶抑制剂，a-2-巨球蛋白，淀粉状蛋白，血清类黏蛋白，铁蛋白，前白蛋白，GC-球蛋白，血凝乳酶和补体C3。洗脱步骤中所-使用洗脱液可具有介于约5.0至约9.0之间的pH。该洗脱液可具有介于约0.0001S/cm至约10.0S/cm之间的传导性。该洗脱液可具有介于约6.0至约9.0之间的pH,并具有介于约0.03S/cm至约0.2S/cm之间的传导性。洗脱液可具有大约相同的pH而在离子强度上有所不同。例如，各种洗脱液可包含不同緩冲体系，和/或任选地包含其它盐，例如盐酸盐、硫酸盐和硝酸盐，如氯化钠、氯化钾、氯化铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵。各种洗脱液可具有上述范围内的pH和离子强度值的任意组合。该洗脱液可含有含无机酸盐或有机酸盐的緩冲水溶液，该无才几酸盐和/或有机酸盐不会引起因子VIII和/或因子IX的生物学功能丧失，例如含有柠檬酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲酸盐、丙酸盐、磷酸盐或硼酸盐的缓冲液。该洗脱液还可含有一种或多种无机强酸的无机盐的水溶液，该盐不会引起蛋白质的生物学功能丟失，例如盐酸盐、硫酸盐和硝酸盐，如氯化钠、氯化钾、氯化铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵。第一种洗脱液和第二种洗脱液可具有介于约6.0至约8.0之间的pH,并具有介于约0.0001S/cm至约1.0S/cm之间的离子强度。或者，第一种洗脱液可具有介于约5.5至约6.0之间的pH,并具有介于约0.0001S/cm至约0.01S/cm之间的离子强度。另外，第一种洗脱液可具有介于约5.5至约6.0之间的pH，并具有介于约0.0001S/cm至约0.05S/cm之间的离子强度。另外，第一种洗脱液可具有介于约6.0至约6.5之间的pH,并具有介于约0.001S/cm至约0.1S/cm之间的离子强度。第二种洗脱液可具有介于约6.0至约8.0之间的pH,并具有介于约0.0001S/cm至约0.1S/cm之间的离子强度。或者，第二种洗脱液可具有介于约6.0至约8.0之间的pH,并具有介于约0.0001S/cm至约0.5S/cm之间的离子强度。另外，第二种洗脱液可具有介于约7.0至约9.0之间的pH，并具有介于约0.001S/cm至约1S/cm之间的离子强度。通过控制在上面段落中所描述的洗脱液的pH和传导性，该方法可用于从含有因子VIII和因子IX以及其它物质的溶液中分离作为混合物的因子VIII和因子IX。或者，在溶液仅含有因子VIII时(例如溶液为来源于血浆的冷沉淀物或其中仅因子VIII表达的重组肉汤时)，通过控制上面段落中所描述的洗脱液的pH和传导性，本方法可用于仅分离因子VIII。在溶液仅含因子IX时(例如溶液为来源于血浆的冷上清液或其中仅因子IX表达的重组肉汤时)，通过控制上面段落中所描述的洗脱液的pH和传导性，本方法可用于仅分离因子IX。图1示出根据本发明的方法，示出分离的蛋白质流分的进一步纯化。图2示出使用根据本发明的一个实施方案的方法的产品回收率。图3示出根据本发明的第一方面的一个实施方案的SDS-PAGE分析。图4示出从本发明的第一方面的一个实施方案获得的流分的单向放射免疫扩散分析。图5示出本发明的一个实施方案，其中本发明的第一方面和第二方面被连续使用以分离某些蛋白质流分。图6示出因子VIII吸附的所得流分的SDS-PAGE分析。泳道1示出粗制血浆，泳道2示出流出物(run-through)流分，泳道3示出因子VIII/因子IX的洗脱。将因子VIII/因子IX洗脱物相对于洗脱体积进行稀释以便与所使用血浆直接比较，即可目视估计产率。图7示出从第一方面的蛋白质分离方法获得的蛋白质流分的SDS-PAGE分析，其中所使用原材料(含有所述蛋白质的溶液)为从第二方面的方法获得的流出物流分。泳道l示出人血浆，泳道2示出流出物流分(a-l-PI)，泳道3示出洗脱2(白蛋白)，泳道4示出洗脱3(IgG)，泳道5示出洗脱4(血纤蛋白原)。图8示出从第一方面的蛋白质分离方法获得的流分的单向放射免疫扩散分析，其中所使用原材料(含有所迷蛋白质的溶液)为第二方面的方法获得的流出物流分。流分1至4分别代表流出物流分、洗脱2、洗脱3和洗脱4。图8A示出白蛋白的定量，图8B示出IgG的定量。图8A和8B的上两行示出粗制血浆100-20%的标准曲线(两次测定)。A和B的下两4亍示出如下物质l:流出物流分；2:洗脱2;3r洗脱3;4:洗脱4。定义下面是一些有助于理解本发明的描述的定义。在本说明书的上下文中，术语"包含"意味着"主要包括但不必为仅仅包括"。另外，单词"包含"的变化形式例如"包括"和"含有"具有相应的有所变化的含义。在本发明的上下文中，术语"洗脱步骤"、"洗脱"或"进行洗脱"可互换使用，旨在指获得包含一种或多种可能已结合或未结合且随后与固体分离介质分离的蛋白质的蛋白质流分的步骤。在本说明书的上下文中，术语"洗涤步骤"旨在指用液体冲洗固体分离介质的步骤，此步骤基本不会将任何蛋白质从固体分离介质上释放。在本说明书的上下文中，术语"平衡步骤"旨在指这么一个步骤，其中4吏充足的溶液流过固体分离介质，这样流出液(outgoingsolution)的反荷离子浓度、传导性和pH大约与流入液(incomingsolution)的相同。在本说明书的上下文中，术语"重组肉汤"指由进行过遗传操纵的细胞体外表达的可溶性蛋白质。重组肉汤中由这些被#:纵的细胞表达的蛋白质包括凝固途径蛋白质例如因子VII、因子VIII、因子IX或因子XIII,免疫球蛋白例如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE，转铁蛋白(Tf)，血纤蛋白原或其衍生物，血浆蛋白酶抑制剂例如抗凝血酶如抗凝血酶III,al-蛋白酶抑制剂，血液促凝固蛋白，血液抗凝固蛋白，细胞因子，生长因子，白蛋白或其衍生物，溶血栓剂，抗血管发生蛋白，胰岛素或其衍生物，a-l-蛋白酶抑制剂或其衍生物例如a-l-抗胰蛋白酶，a-2-抗纤溶酶或其衍生物，C-l酯酶抑制剂，载脂蛋白，HDL，纤连蛋白或其衍生物，P-2-糖蛋白I，纤溶酶原，纤溶酶，纤溶酶原激活物，纤溶酶原抑制剂，尿激酶或其书f生物，链激酶或其f斤生物，间-a-月爽蛋白酶抑制剂，a-2-巨球蛋白，淀粉状蛋白，血清类黏蛋白，铁蛋白，前白蛋白，GC-球蛋白，血凝乳酶和补体C3。在本说明书的上下文中，术语"血浆，，指血液的液体部分，是一种含有90%以上水的复合溶液。血浆的主要溶质为一组异质性蛋白质。其它血浆成分包括脂肪物质(脂质)、无机电解质、葡萄糖、氨基酸、维生素、激素和代谢废物。在本说明书的上下文中，术语"血清，，指在血凝过程中除去了血纤蛋白原的血浆。在本说明书的上下文中，术语"冷上清液"和"冷沉淀物"应该根据下列描述来理解冷上清液是在除去冷沉淀物之后由血浆制得的溶液。冷沉淀物由通过将血浆暴露于rc至io'c之间温度由血浆沉淀得到的蛋白质组成。在本说明书的上下文中，术语"分级分离的人血浆，，应理解为指代血浆的任何组分或组分的混合物，它们来源于进行例如沉淀、过滤、层析等分离处理的血浆。在本说明书的上下文中，术语"流出物"应理解为指代从本发明的第二方面获得的蛋白质流分，包含将血浆溶液上柱时获得的洗脱物，该洗脱物已与从第一步洗脱中获得的洗脱物相混合。具体实施例方式蛋白质分离本发明的第一方面涉及从生物溶液中分离蛋白质的方法。更具体而言，本发明涉及从人血浆、来源于人血浆的冷上清液、分级分离的人血浆、来源于人血浆、人血清或重组肉汤的冷沉淀物中分离人蛋白质的方法。含有蛋白质的溶液在与所述固体分离介质相接触之前可用另一种合适的液体稀释。例如，血浆可由脱矿质水或与待分离蛋白质相容的一种或多种无机强酸的无机盐的水溶液稀释，所述盐例如盐酸盐、辟L酸盐和硝酸盐，如氯化钠、氯化钾、氯化铵、好u酸钠、；克酸钾、》危酸铵。含有蛋白质的溶液可用另一种合适的液体以从约1000:1至约1:1000的比例稀释。例如，稀释比例可为约1000:1，约750:1，约500:1,约250:1，约100:1，约50:1，约25:1，约10:1，约7.5:1，约5:1，约3:1，约2.5:1,约2:1，约1:1，约1:2，约1:2.5，约1:3，约1:5，约1:7.5，约1:10，约1:25，约1:50，约1:100，约1:250，约1:500,约1:750，或约1:1000。含有蛋白质的溶液的pH可在将液体与固体分离介质接触之前调节。或者，pH可在含蛋白质的溶液与固体分离介质接触之后调节。可升高pH或者也可降低pH。或者，可使pH保持不变。可将pH调为约3.0到约6.0之间的pH,或者，可将pH调节为约4.5到约6.0之间的pH。例如，可将pH调节为约pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0。pH可使用合适的酸调节，所述酸例如盐酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、琥珀酸、醋酸等。pH可使用合适的碱调节，所述碱例如碳酸盐、碳酸氢盐、氨、氢氧化物等。pH可用合适的緩冲体系调节。緩沖体系为本领域的技术人员熟知，包括例如拧檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐、曱酸盐、琥珀酸盐、MES、ADA、1，3-双((三羟曱基)曱基氨基)丙烷(bis-trispropane)、PIPES、ACES、咪唑、MOPS、TES、HEPES、HEPPS、TRICINE、盐酸甘氨酰胺、TRIS、BICINE、甘氨酰甘氨酸、硼酸、CHES、CAPS。许多緩冲体系可商购，可从例如SigmaChemical公司获得。本领域的技术人员能根据所需pH确定合适的緩冲体系。洗脱液可在pH上有所不同。洗脱步骤可包括用pH逐渐升高或pH逐渐降低的洗脱液处理固体分离介质。洗脱液可具有大约相同的pH，但是在离子强度上可有所不同。例如，各个洗脱液可包含不同的緩冲体系，和/或任选包含其它盐，例如盐酸盐、硫酸盐和硝酸盐，如氯化钠、氯化钾、氯化铵、硫酸钠、硫酸钾、^危酸铵。所洗脱的每种蛋白质的产率可为原材料中的蛋白质的量的至少50%，或至少60%，或至少70%,或至少80%,或至少90%。洗脱步骤可在0。C至4(TC之间的温度下进行。例如，温度可为约5°C，约1(TC，约15。C，约20。C，约25"C，约30。C,约35"C或约40°C。第一方面的方法可任选包括一步或多步洗涤。洗涤步骤可在第一方面的方法的任何阶段进行，例如在固体分离介质与含有蛋白质的'溶液相接触之前，在固体分离介质与含有蛋白质的溶液相接触之后，或在每步洗脱之间。可用不会引起蛋白质的生物学功能丧失的任何溶液例如水、盐水或缓冲溶液例如柠檬酸盐緩冲液进行洗涤步骤。洗涤步骤可在用第二种洗脱液洗脱固体分离介质之后进行。洗涤緩冲液可包含疏液性相对较高的无4几盐或有才几盐，例如碌u酸铵、石克酸钠、硫酸钾、磷酸铵、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾。洗涤《差沖液的离子强度可为至少0.001S/cm，或至少0.01S/cm，或至少0.1S/cm或进一步至少1.0S/cm。第一方面的方法还可包括一步或多步平衡。平衡步骤可在将固体分离介质与所述含有蛋白质的溶液接触之前进行。平衡步骤可包含用水或合适的緩冲溶液处理所述固体分离介质以调节固体分离介质的pH和离子强度。用于平衡步骤的溶液可为脱矿质水或与待分离蛋白质相容的一种或多种无机强酸的无机盐的水溶液，所述盐例如盐酸盐、硫酸盐和硝酸盐，如氯化钠、氯化钾、氯化铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵。或者，平衡緩冲液可为含有与待分离蛋白质相容的无机酸盐和/或有机酸盐的緩沖水溶液，例如含柠檬酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、曱酸盐、丙酸盐、磷酸盐或硼酸盐的缓冲液。平衡步骤可在约l(TC至40。C之间的温度下进行。例如，温度可为约10。C，约15。C，约20。C，约25。C，约30。C或约40。C。含有蛋白质的溶液的pH可与用于在将所述固体分离介质与含有蛋白质的所述溶液相接触之前平衡固体分离介质的》爰冲溶液的pH相同。含有蛋白质的溶液的pH可与用于在将所述固体分离介质与含有蛋白质的所述溶液相接触之前平衡固体分离介质的緩冲溶液的pH不同。第一方面的方法还可包括一步或多步再生。再生步骤包括用能将残留物质从固体分离介质中除去的合适试剂处理固体分离介质。再生步骤可在第一步洗脱完成之后任何时间进行。合适的再生试剂包括碱例如氢氧化物溶液如氳氧化钠或氢氧化钾、过酸溶液或过氧化氢溶液、含有活性氯的溶液如次氯酸盐溶液、变性剂如盐酸胍、有^L溶剂如乙醇。根据第一方面的方法，可将固体分离介质装入合适的层析柱装置中。该方法可在填充床柱中以填充床模式进行。或者，该方法可在膨胀床吸附(EBA)柱中以膨胀床模式进行。在第一方面的上下文中，实际上所有的人血浆蛋白质都会被吸附到单根柱中的固体分离介质上。然后本申请所描述的连续洗脱步骤可用于选择性洗脱富集特定蛋白质的洗脱蛋白质流分。EBA柱为本领域所熟知，并且合适的柱装置和设备，包括将液体导入膨胀床柱的方法，可从瑞典的GEHealthcare购得，或者已在WO99/65586、WO01/85329和WO92/00799中得以描述，它们的全部内容通过交叉引用纳入本申请。第一方面的一个实施方案包括选择EBA柱以及将合适量的固体分离介质装入柱中。所使用的固体分离介质的量取决于将要使用的含有蛋白质的溶液的量以及该蛋白质溶液中的蛋白质浓度。蛋白质溶液为人血浆或冷沉淀血浆时，一般1升固体分离介质用于每0.5到1.5升血浆。若蛋白质溶液为重组发酵肉汤时，一升固体分离介质可用于l升发酵肉汤，最高达1000L发酵肉汤。可在柱底确证流通(flowthrough)直到固体分离介质被流化。合适的柱线性流速包括范围在0.5至20cm/min或约5cm/min至15cm/min之间的流速。然后固体分离介质可使用合适溶液(例如水、电解质水溶液或i爰冲溶液)平衡，此后可将例如血浆、血清、冷上清液、溶解的冷沉淀物或重组肉汤溶液引入柱底。溶液被负栽到固体分离介质上后，可任选进行另外的洗涤步骤。然后可进行洗脱步骤以选择性洗脱富集特定蛋白质的蛋白质流分。每步各自的洗脱在适合选择性洗脱包含一种或多种蛋白质的蛋白质流分的条件下进行。例如，通过改变用于各个洗脱步骤中的洗脱液的pH和/或离子强度，可洗脱不同蛋白质。可使用合适的缓沖液将洗脱液调节为具有合适的pH和离子强度。离子强度还可使用盐调节。连续洗脱步骤可包括用pH逐渐升高的洗脱液处理固体分离介质。或者连续洗脱步骤可包括用pH逐渐降低的洗脱液处理固体分离介质。，根据第一方面的另一实施方案涉及建立含有与2-巯基烟酸起作用的琼脂糖-碳化鴒凝聚微球的EBA柱。琼脂糖-碳化鵠微球大小分布介于40-120微米之间，平均直径为70微米。微球的密度为2.9g/ml。平衡步骤使用pH约为4.5的柠檬酸盐緩冲液进行，紧随其后的是用pH约为5.0的柠檬酸盐緩冲液进一步平衡的步骤。然后将已由2份水稀释并用HCl调pH为5.0的人血浆以每升固体分离介质1.5升稀释血浆的比例应用于该柱。然后用下列緩冲溶、液洗脱该柱洗脱1.10mM柠檬酸钠，pH5.0洗脱2.5g/升辛酸钠和HCl，pH6.0洗脱3.1M柠檬酸钠，pH8.0洗脱4.20mM柠檬酸钠和0.1M氯化钠，pH8.0然后固体分离介质用1MNaOH再生。所有操作的流速为7.5cm/分钟，所使用的每一种溶液的量在表2给出。所4吏用洗脱液的体积一般取决于i午多相关因素，例如(i)加样、洗涤、洗脱、再生和平衡过程中所使用的流速；(ii)所洗脱产品流分的数目；(iii)每步所使用洗脱液的选择，由于洗脱液的选择影响各个流分的产量和纯度；(iv)各个流分之间的最佳间隔，它也对所获得产品的产量和纯度有影响；(v)固体分离介质的床高，由于固体分离介质的床高降低时通常所消耗的洗涤体积和洗脱体积减小。表2示出上述实施方案中每步的最佳溶液体积。参照图3，从上面的实施方案可见蛋白质a-l蛋白酶抑制剂、白蛋白、IgG和血纤蛋白原可^皮有效分离。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*cv是柱体积下表3示出由SRI测定得到的相对于所使用粗制血浆的蛋白质产率。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>为了测定洗脱液流分1至4中各种蛋白质的相对产量进行单向放射免疫扩散(SRI)。图4示出白蛋白、IgG、ct-l-蛋白酶抑制剂和凝血因子I的SRI分析。上述方法可以平稳、可重现以及不复杂的方式进行。发现所有最终的洗脱物为澄清液体，任何一种蛋白质均无显著变性/沉淀的迹象。SDS-PAGE和上述SRI的柱后测试未见洗脱产品的破坏、聚集或免疫反应性发生改变的迹象。本领域的技术人员应知道第一方面以及第二方面的方法可通过测量从柱中排出的液体的紫外吸光度监测。蛋白质和其它UV吸收物质的存在可在进行本发明的方法的过程中检出并定量，并且可正确收集不同蛋白质流分。同样，对pH、传导性和折射率的连续监测可用于记录和控制本发明的方法。因子VIII和/或因子IX的分离含有所述因子VIII和/或因子IX的溶液一般为粗制未稀释的血浆，可将它与固体分离介质直接接触。或者，粗制血浆可在与所述固体分离介质接触前用另一种合适的液体稀释。例如，血浆可用脱矿质水或与因子VIII和/或因子IX相容的一种或多种无机强酸的无机盐的水溶液稀释，所述盐例如盐酸盐、硫酸盐和硝酸盐，例如氯化钠、氯化钾、氯化铵、碌u酸钠、硫酸钾、好b酸铵。含有因子VIII和/或因子IX的溶液可用另一种合适的液体以从约1000:1到1:1000的比例稀释。例如，稀释比例可为约1000:1，约750:1,约500:1,约250:1,约100:1，约50:1，约25:1,约10:1，约7.5:1，约约3:1,约2.5:1，约2:1,约1:1，约1:2,约1:2.5，约1:3，约1:5，约1:7.5,约1:10，约1:25,约1:50，约1:100,约1:250，约1:500,约1:750或约1:1000。含有因子VIII和/或因子IX的溶液的pH可在与固体分离介质接触之前调节。或者，pH可在含因子vni和/或因子ix的溶液与固体分离介质接触之后调节。可升高pH或者也可降低pH。或者，可4吏pH保持不变。可将pH调至约5.0至约9.0之间。例如，可将pH调为约5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0的pH。可4吏用合适的酸调节pH，所述酸例如盐酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、琥珀酸、醋酸等。pH可使用合适的碱调节，所述碱如碳酸盐、碳酸氢盐、氨、氢氧化物等。pH可用合适的緩冲体系调节。緩沖体系为本领域的技术人员熟知，包括例如柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、MES、ADA、1，3-双((三羟甲基)曱基氨基)丙烷、PIPES、ACES、咪唑、MOPS、TES、HEPES、HEPPS、TRICINE、盐酸甘氨酰胺、TRIS、BICINE、甘氨酰甘氨酸、硼酸、CHES、CAPS。许多緩沖体系可商购，可从例如SigmaChemical公司获得。本领域的技术人员能根据所需pH确定合适的緩冲体系。该方法可任选包括一步或多步洗涤。洗涤步骤可在固体分离介质与含有因子VIII和/或因子IX的溶液接触之前进行，或者在固体分离介质与含有因子VIII和/或因子IX的溶液接触之后进行。可用不会引起因子VIII和/或因子IX的生物学功能丧失的任何溶液例如水、盐水或緩冲溶液例如柠檬酸盐緩冲液进行洗涤步骤。或者，洗涤緩冲液可包含疏液性相对较高的无机盐或有机盐，例如疏酸铵、硫酸钠、硫酸钾、磷酸铵、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾。洗涤緩冲液可具有介于约5.0至约9.0之间的pH。洗涤緩冲液的pH可为5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8或9.0。洗涤緩冲液可具有介于约0.1mS/cm至约100mS/cm之间的传导性。或者，洗涤》爰冲液可具有介于约0.1mS/cm到约40mS/cm之间的传导性。洗涤緩冲液还可包含不会引起蛋白质生物学功能丧失的一种或多种无机强酸的无机盐的水溶液，所述盐例如盐酸盐、硫酸盐和硝酸盐，例如氯化钠、氯化钾、氯化铵、碌u酸钠、碌b酸钾、；琉酸铵。该方法还可包括一步或多步平衡。平衡步骤可在将固体分离介质与含有因子VIII和/或因子IX的溶液接触之前进行。平衡步骤可包含用水或合适的缓沖溶液处理所述固体分离介质以调节固体分离介质的pH和离子强度。用于平衡步骤的溶液可为脱矿质水或与因子VIII和/或因子IX相容的一种或多种无机强酸的无机盐的水溶液，所述盐例如盐酸盐、；危酸盐和硝酸盐，例如氯化钠、氯化钾、氯化铵、辟b酸钠、發u酸钾、硫酸铵。或者，平衡緩沖液可为含有与因子VIII和/或因子IX相容的无机酸盐和/或有机酸盐的緩沖水溶液，例如含柠檬酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲酸盐、丙酸盐、磷酸盐或硼酸盐的緩沖液。平衡步骤可约2"C至约28'C之间的温度下进行。例如，温度可为约2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28。C。含有因子VIII和/或因子IX的溶液的pH与用于在将所述固体分离介质与含有因子VIII和/或因子IX的所述溶液相接触之前平衡固体分离介质的緩冲溶液的pH相同。含有因子VIII和/或因子IX的溶液的pH可与用于在将所述固体分离介质与含有因子VIII和/或因子IX的所述溶液相接触之前平衡固体分离介质的緩冲溶液的pH不同。本方法还可包括一步或多步再生。再生步骤包括用能将残留物质从固体分离介质中除去的合适试剂处理固体分离介质。再生步骤可在用洗脱液洗脱所述固体分离介质以洗脱因子VIII和/或因子IX之后进4亍。合适的再生试剂包括碱，例如氢氧化物溶液如氢氧化钠或氬IU匕钾、过酸溶液或过氧化氲溶液、含有活性氯的溶液如次氯酸盐溶液、变性剂如盐酸胍、有才几溶剂如乙醇。该方法可在填充床柱中以填充床模式进行。或者，该方法可在EBA柱中以膨胀床模式进行。如上所述，在一个实施方案中，该方法可用于从含有因子VIII和因子IX以及其它物质的溶液中分离作为混合物的因子VIII和因子IX。在该实施方案中，选用EBA柱，其中装入了足量的固体分离介质。所使用固体分离介质的量将取决于所要使用的含有因子VIII和因子IX的溶液的量，以及该溶液中因子VIII和因子IX的浓度。蛋白质溶液为人血浆或冷沉淀血浆时，一般1升固体分离介质用于每5到30升的血浆。若蛋白质溶液为重组发酵肉汤，一升固体分离介质可用于1升发酵肉汤，最高达1000L发酵肉汤。可在柱底确证流通直到固体分离介质3皮流化。合适的柱线性流速包括范围在0.5cm/min到40cm/min或约3cm/min至15cm/min之间的流速。然后平衡步骤可使用合适溶液(例如水、电解质水溶液或緩冲溶液)进行，此后可将含有因子VIII和因子IX的溶液例如粗制血浆引入柱底，含有因子VIII和因子IX的溶液由此与固体分离介质相接触。然后进行第一步洗脱以将未结合蛋白质从柱上洗脱。洗涤步骤可任选在第一步洗脱之后进行。然后进行第二步洗脱以将因子VIII和因子IX从固体分离介质上洗脱。本发明的第一方面和第二方面可以两步法连续使用，其中第一步涉及使用发明的第二方面，用于从含有说明书第4页所列出任何蛋白质的溶液中分离因子VIII或其与vonWillebrand因子的复合物和/或因子IX，其富集系数至少为10，第二步涉及使用发明的第一方面，用于将从第二方面的第一步获得的未结合蛋白分离为含有例如a-l-蛋白酶抑制剂、白蛋白、IgG、抗凝血酶III和血纤蛋白原的蛋白质的流分，其所有蛋白质产量均很高。第二方面的方法可与其它蛋白质分离方法连续使用。例如，第二方面的方法可用于从血浆溶液中分离因子VIII和/或因子IX，并将从流出物获得的流分中存在的残留蛋白质用作使用各种其它分级分离方法分离其它蛋白质的原材料，所述其它蛋白质例如白蛋白、血纤蛋白原、免疫球蛋白、a-l-蛋白酶抑制剂，所述其它分级分离方法分离例如沉淀、过滤、离子交换层析等。可将本发明方面的第一方面和第二方面的分离蛋白以合适形式如以粉末、溶液、液体形式等形成制剂。一些产品制剂的实例在表4中提供。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>分离蛋白质流分的其它纯化方法也可根据需要或恰当地用于本发明的方法中。这么一种方法可涉及包含一系列阴离子交换层析或疏水相互作用层析步骤。诸如此类的方法起着浓缩和进一步纯化从本发明的方法获得的蛋白质流分的作用。通过选择一步或多步系列层析的最佳固定介质和洗脱条件，从本发明的方法获得的所有蛋白质可结合到柱上。然后结合蛋白质可在不同的一组化学条件下从第二柱(secondarycolumn)上选择性洗脱，该化学条件可引起蛋白质显著浓缩并有可能被进一步纯化。其它层析技术例如亲和层析、金属螯合层析和凝胶过滤也可单独使用或组合使用。本发明的方法可任选包括病毒灭活步骤。例如，每种产品的病毒失说明书第20/32页活/清除步骤在表5中示出，其中每种产品可通过本发明的方法分离。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>现在本发明将就下列实施例仅通过举例详细描述。实施例旨在用于解释本发明，而不应该解释为限制通篇说明书中描述公开的普遍性。实施例实施例1a-l-蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III、血纤蛋白原、免疫球蛋白和白蛋白的分离步骤l.固体分离介质:与2-巯基烟酸起作用的琼脂糖-碳化钨微球。琼脂糖-碳化鴒微球大小分布介于40-120微米之间，平均直径为70微米。微球的密度为2.9g/ml(FastLineUFCNNSDWcat.No.:CS48,UpFrontChromatographyA/S，Copenhagen,Denmark.)。将微球装入EBA柱(FastLine100,UpFrontChromatographyA/S,Copenhagen,Denmark)(直径为10cm;床高设为50cm;设定床体积=3.926L)中。在温度为25°C时，用2.5柱体积(9.8L)40mM柠檬酸钠(pH4.5),然后用另一2.5柱体积(9.8L)40mM柠檬酸钠(pH5.0)，以7.5cm/min线性流速进行平衡。步骤2.2L解冻人血浆由4L水以1:2比例稀释，将含解冻人血浆的6升稀释血浆溶液上于该柱。稀释的血浆溶液在用于柱前其pH用1MHCll调为pH5.0,并且上样比为每升树脂1.5升稀释血浆溶液。步骤3.将稀释血浆溶液上样后,该柱用洗脱緩冲液l洗脱，该洗脱緩冲液含有4.2柱体积(16.49L)含10mM柠檬酸钠(pH5.0)的緩沖溶液。由此除去用于柱的稀释血浆溶液中存在的包括95%以上a-1-蛋白酶抑制剂在内的未结合蛋白质、脂质和其它物质。步骤4.步骤3后，该柱用2.9柱体积(11.39L)含5g/L辛酸钠/HCl的洗脱緩冲液2(pH6.0)洗脱。步骤4将白蛋白从柱上洗脱，其产量高于用于柱的稀释血浆溶液中存在的白蛋白的量的95%。该步骤还洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的60。/。抗凝血酶in。步骤5.如上面的步骤4所述柱洗脱之后，该柱用4.4柱体积(17.27L)含有1M柠檬酸钠(pH8.0)的洗脱^爰沖液3洗脱。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的95。/。以上免疫球蛋白。步骤6.如上面的步骤5所述柱洗脱之后，该柱用洗脱緩冲液4(pH8.0)洗脱，该洗脱緩冲液4含有2.1柱体积(8.24L)含0.1M氯化钠的20mM柠檬酸钠。步骤7.如步骤6所述柱洗脱之后，该柱用1柱体积(3.926L)1M氢氧化钠再生，并用2.5柱体积(9.8L)40mM柠檬酸钠(pH4.5)、再2.5柱体积(9.8L)40mM柠檬酸钠(pH5.0)再次平衡。实施例2a-l-蛋白酶抑制剂、白蛋白、免疫球蛋白和血纤蛋白原的分离，其中还包括洗涤步骤用于本实施例的固体分离介质与用于实施例1的固体分离介质相同。步骤1.在2rC温度下,用2.5柱体积(196.3mL)40mM柠檬酸钠(pH4.5)，以5.0cm/min的线性流速平衡EBA柱(FastLine20，UpFrontChromatographyA/S,CopenhagenDenmark)(直径为2cm;床高为25cm;i殳定床体积=78.5mL)。步骤2.39.3mL解冻人血浆由78.5mL水以1:2比例稀释，将含解冻人血浆的117.8mL稀释血浆溶液上于该柱。稀释血浆溶液在用于柱前其pH用1MHC1调为pH5.0,并且上样比为每升树脂1.5升血浆溶液。步骤3.将稀释血浆溶液上样后，该柱用3.3柱体积(259.2mL)含10mM柠檬酸钠(pH5.0)的洗脱緩冲液1洗脱。由此除去用于柱的稀释血浆溶液中存在的包括a-l-蛋白酶抑制剂在内的未结合蛋白质、脂质和其它物质。步骤4.上述步骤3后，该柱用2.6柱体积(204.2mL)含5g/L辛酸钠/HCl的洗脱緩冲液2(pH6.0)洗脱。步骤4洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的白蛋白。步骤4a.如上面的步骤4所述柱洗脱之后，该柱用1.0柱体积(78.5mL)1M柠檬酸钠(pH8.0)洗涤。步骤5.如上面的步骤4a所述柱洗涤之后，该柱用4.9柱体积(384.8mL)含有0.3M柠檬酸钠(pH8.0)的洗脱緩冲液3洗脱。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的免疫球蛋白。步骤6.如上面的步骤5所述柱洗脱之后，该柱用洗脱緩冲液4(pH8.0)洗脱，该洗脱緩沖液4含有2.6柱体积(204.2mL)含0.1M氯化钠的20mM柠檬酸钠。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的血纤蛋白原。步骤7.如步骤6所述柱洗脱之后，该柱用1柱体积(78.5mL)1M氢氧化钠再生，并用2.0柱体积(157mL)40mM柠檬酸钠(pH4.5)再次平衡。实施例3a-l-蛋白酶抑制剂、白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白和血纤蛋白原的分离用于本实施例的固体分离介质与用于实施例1的固体分离介质相同。步骤1.在21。C温度下，用2.5柱体积(196.3mL)40mM柠檬酸钠(pH5.0),以15.0cm/min的线性流速平衡EBA柱(FastLine20,UpFrontChromatographyA/S,CopenhagenDenmark)(直径为2cm;床高为25cm;设定床体积=78.5mL)。步骤2.39.3mL解冻人血浆由78.5mL水以1:2比例稀释，将含解冻人血浆的117.8mL稀释血浆溶液上于该柱。稀释血浆溶液在用于柱前其pH用1MHC1调为pH5.0，并且上样比为每升树脂1.5升血浆溶液。步骤3.将稀释血浆溶液上样后,该柱用含9.4柱体积(738.3mL)脱矿质水的洗脱緩冲液l洗脱。由此除去用于柱的稀释血浆溶液中存在的包括100%a-l-蛋白酶抑制剂、10%白蛋白、5%转纟失蛋白和10%凝血因子I在内的未结合蛋白质、脂质和其它物质。步骤4.上面的步骤3后，该柱用8.9柱体积(699mL)含5g/L辛酸钠/HCl的洗脱緩冲液2(pH6.0)洗脱。步骤4从柱上洗脱了白蛋白，其产量为用于柱的稀释血浆溶液中存在的白蛋白的量的90%。该步骤还洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的5。/。免疫球蛋白。步骤5.如上面的步骤4所述柱洗脱之后，该柱用9.0柱体积(706.8mL)含有0.3M柠檬酸钠(pH8.0)的洗脱緩冲液3洗脱。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的85。/。以上免疫球蛋白。该步骤还洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的95。/。转铁蛋白和30。/。血纤蛋白原。步骤6.如上面的步骤5所述柱洗脱之后，该柱用洗脱緩沖液4(pH8.0)洗脱，该洗脱緩沖液4含有5.0柱体积(392.7mL)含0.1M氯化钠的20mM柠檬酸钠。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的60%血纤蛋白原和10%免疫球蛋白。步骤7.如步骤6所述柱洗脱之后，该柱用1柱体积(78.5mL)lM氢氧化钠再生，并用2.0柱体积(157mL)40mM柠檬酸钠(pH5.0)再次平衡实施例4a-l-蛋白酶抑制剂、白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白和血纤蛋白原的分离用于本实施例的固体分离介质与用于实施例1的固体分离介质相同。步骤1.在21。C温度下，用2.5柱体积(196.3mL)40mM柠檬酸钠(pH5.0)，以5.0em/min的线性流速平衡EBA柱(FastLiae20，UpFrontChromatographyA/S，CopenhagenDenmark)(直径为2cm;床高为25cm;i殳定床体积=78.5mL)。步骤2.39.3mL解冻人血浆由78.5mL水以1:2比例稀释，将含解冻乂、血浆的117.8mL稀释血浆溶液上于该柱。稀释血浆溶液在用于柱前其pH用1MHC1调为pH5.0,并且上样比为每升树脂1.5升血浆溶液。步骤3.将稀释血浆溶液上样后，该柱用含6.8柱体积(533.8mL)脱矿质水的洗脱^爰冲液1洗脱。由此除去用于柱的稀释血浆溶液中存在的包括100%a-l-蛋白酶抑制剂、10%白蛋白、5%转4失蛋白和10%凝血因子I在内的未结合蛋白质、脂质和其它物质。步骤4.上面的步骤3所述柱洗涤之后，该柱用5.5柱体积(431.75mL)含5g/L辛酸钠/HCl的洗脱緩冲液2(pH6.0)洗脱。步骤4从柱上洗脱了白蛋白，其产量为用于柱的稀释血浆溶液中存在的白蛋白的量的90%。该步骤还洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的5%免疫球蛋白。步骤5.上面的步骤4之后，该柱用5.0柱体积(392.5mL)含有0.3M柠檬酸钠(pH8.0)的洗脱緩冲液3洗脱。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的85。/。以上免疫J求蛋白。该步骤还洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的95%转铁蛋白和30%血纤蛋白原。步骤6.如上面的步骤5所述柱洗脱之后，该柱用洗脱緩冲液4(pH8.0)洗脱，该洗脱緩冲液4含有3.1柱体积(243.35mL)含0.1M氯化钠的20mM柠檬酸钠。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的60%血纤蛋白原和10%免疫5求蛋白。步骤7.如步骤6所述柱洗脱之后，该柱用1柱体积(78.5mL)1M氢氧化钠再生，并用2.0柱体积(157mL)40mM柠檬酸钠(pH5.0)再次平衡。实施例5a-l-蛋白酶抑制剂、白蛋白、免疫球蛋白、血纤蛋白原和转铁蛋白的分离用于本实施例的固体分离介质与用于实施例1的固体分离介质相同。步骤1.在2rC温度下，用2,5柱体积(196.3mL)40mM柠檬酸钠(pH5.0)，以10.0cm/min的线性流速平衡EBA柱(FastLine20，UpFrontChromatographyA/S，CopenhagenDenmark)(直径为2cm;床高为25cm;i殳定床体积=78.5mL)。步骤2.39.3mL解冻人血浆由78.5mL水以1:2比例稀释，将含解冻人血浆的117.8mL稀释血浆溶液上于该柱。稀释血浆溶液在用于柱前其pH用1MHC1调为pH5.0，并且上样比为每升树脂1.5升血浆溶液。步骤3.将稀释血浆溶液上样后，该柱用含9.5柱体积(745.75mL)脱矿质水的洗脱緩冲液1洗脱。由此除去用于柱的稀释血浆溶液中存在的包括100%a-l-蛋白酶抑制剂、10%白蛋白、5%转《失蛋白和10%凝血因子I在内的未结合蛋白质、脂质和其它物质。200580026695.X说明书第25/32页步骤4.上面的步骤3之后，该柱用7.1柱体积(557.35mL)含5g/L辛酸钠/HCl的洗脱緩冲液2(pH6.0)洗脱。步骤4从柱上洗脱了白蛋白，其产量为用于柱的稀释血浆溶液中存在的白蛋白的量的90%。该步骤还洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的5。/。免疫球蛋白。步骤5.上面的步骤4之后，该柱用5.9柱体积(463.15mL)含有0.3M柠檬酸钠(pH8.0)的洗脱緩冲液3洗脱。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的85%以上免疫球蛋白。该步骤还洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的95。/。转铁蛋白和30。/。血纤蛋白原。步骤6.如上面的步骤5所述柱洗脱之后，该柱用洗脱緩冲液4(pH8.0)洗脱，该洗脱緩冲液4含有3.1柱体积(243.35mL)含0.1M氯化钠的20mM柠檬酸钠。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的60%血纤蛋白原和10%免疫5求蛋白。步骤7.如步骤6所述柱洗脱之后，该柱用1柱体积(78.5mL)lM氲氧化钠再生，并用2.0柱体积(157mL)40mM柠檬酸钠(pH5.0)再次平衡。实施例6a-l-蛋白酶抑制剂、白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白和血纤蛋白原的分离用于本实施例的固体分离介质与用于实施例1的固体分离介质相同。步骤l.在21。C温度下，用2,5柱体积(196.3mL)40mM柠檬酸钠(pH5.0),以20.0cm/min的线性流速平衡EBA柱(FastLine20，UpFrontChromatographyA/S,CopenhagenDenmark)(直径为2cm;床高为25cm;i史定床体积=78.5mL)。步骤2.39.3mL解冻人血浆由78.5mL水以1:2比例稀释，将解冻人血浆的117.8mL稀释血浆溶液上于该柱。稀释血浆溶液在用于柱前其pH用1MHC1调为pH5.0，并且上样比为每升树脂1.5升血浆溶液。步骤3.将稀释血浆溶液上样后，该柱用含12.6柱体积(989.1mL)脱矿质水的洗脱緩冲液1洗脱。由此除去用于柱的稀释血浆溶液中存在的包括100%a-l-蛋白酶抑制剂在内的未结合蛋白质、脂质和其它物质。应该注意的是，显著量的白蛋白在该步骤中也可以20cm/min的流速得以洗脱。步骤4.上面的步骤3之后，该柱用10.6柱体积(832.1mL)含5g/L辛酸钠/HCl的洗脱緩冲液2(pH6.0)洗脱。步骤4从柱上洗脱了白蛋白，其产量为用于柱的稀释血浆溶液中存在的白蛋白的量的卯％。该步骤还洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的5%免疫球蛋白。步骤5.上面的步骤4之后，该柱用6.9柱体积(541.65mL)含有0.3M柠檬酸钠(pH8.0)的洗脱緩冲液3洗脱。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的85%以上免疫球蛋白。该步骤还洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的95。/。转铁蛋白和30。/。血纤蛋白原。步骤6.如上面的步骤5所述柱洗脱之后，该柱用洗脱緩冲液4(pH8.0)洗脱，该洗脱緩冲液4含有6.8柱体积(533.8mL)含0.1M氯化钠的20mM柠檬酸钠。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的60%血纤蛋白原和10%免疫5求蛋白。步骤7.如步骤6所述柱洗脱之后，该柱用1柱体积(78.5mL)lM氢氧化钠再生，并用2.0柱体积(157mL)40mM柠檬酸钠(pH5.0)再次平衡。实施例7a-l-蛋白酶抑制剂、白蛋白和IgG的分离用于本实施例的固体分离介质与用于实施例1的固体分离介质相同。步骤1.在2rC温度下，用2.5柱体积(196.3mL)40mM柠檬酸钠(pH4,5),以5.0cm/min的线性流速平衡EBA柱(FastLine20,UpFrontChromatographyA/S，CopenhagenDenmark)(直径为2cm;床高为25cm;i殳定床体积=78.5mL)。步骤2.39.3mL解冻人血浆由78.5mL水以1:2比例稀释，将含解冻,、血浆的117.8mL稀释血浆溶液上于该柱。稀释血浆溶液在用于柱前其pH用1MHC1调为pH5.0，并且上样比为每升树脂1.5升血浆溶液。步骤3.将稀释血浆溶液上样后,该柱用3.3柱体积(259.2mL)含10mM柠檬酸钠(pH5.0)的洗脱l爰冲液l洗脱。由此除去用于柱的稀释血浆溶液中存在的包括a-l-蛋白酶抑制剂在内的未结合蛋白质、脂质和其它物质。步骤4.上面的步骤3所述柱洗涤之后,该柱用2.7柱体积(211.95mL)含5g/L辛酸钠/HCl的洗脱緩冲液2(pH6.0)洗脱。步骤4洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的白蛋白。步骤5.已删除。步骤6.如上面的步骤4所述柱洗脱之后，该柱用洗脱緩冲液4(pH8.0)洗脱，该洗脱緩沖液4含有3.8柱体积(298.3mL)含0.1M氯化钠的20mM柠檬酸钠。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的IgG。步骤7.如步骤6所述柱洗脱之后，该柱用1柱体积(78.5mL)1M氢氧化钠再生，并用2.0柱体积(157mL)40mM柠檬酸钠(pH4.5)再次平衡。实施例8a-l-蛋白酶抑制剂、白蛋白、免疫5求蛋白和血纤蛋白原的分离，其中还包括洗涤步骤用于本实施例的固体分离介质与用于实施例1的固体分离介质相同。步骤1.在21。C温度下，用2.5柱体积(392.5mL)40mM柠檬酸钠(pH4.5),以5.0cm/min的线性流速平衡EBA柱(FastLine20，UpFrontChromatographyA/S，CopenhagenDenmark)(直径为2cm;床高为25cm;i殳定床体积=78.5mL)。步骤2.39.3mL解冻人血浆由78.5mL水以1:2比例稀释，将含解冻/、血浆的117.8mL稀释血浆溶液上于该柱。稀释血浆溶液在用于柱前其pH用1MHC1调为pH5.0，并且上样比为每升树脂1.5升血浆溶液。步骤3.将稀释血浆溶液上样后，该柱用2.9柱体积(455.3mL)含10mM柠檬酸钠(pH5.0)的洗脱緩沖液l洗脱。由此除去用于柱的稀释血浆溶液中存在的包括a-l-蛋白酶抑制剂在内的未结合蛋白质、脂质和其它物质。步骤4.上面的步骤3之后，该柱用2.8柱体积(439.6mL)含5g/L辛酸钠/HCl的洗脱緩沖液2(pH6.0)洗脱。步骤4洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的白蛋白。步骤4a，如上面的步骤4所述柱洗脱之后，该柱用1.0柱体积(157mL)1M柠檬酸钠(pH8.0)洗涤。步骤5.如上面的步骤4a所述柱洗涤之后，该柱用4.5柱体积(706.5mL)含有0.3M柠檬酸钠(pH8.0)的洗脱緩沖液3洗脱。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的免疫球蛋白。歩骤6.如上面的步骤5所述柱洗脱之后，该柱用洗脱緩冲液4(pH8.0)洗脱，该洗脱緩冲液4含有1.9柱体积(298.3mL)含0.1M氯化钠的20mM柠檬酸钠。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的血纤蛋白原。步骤7.如步骤6所述柱洗脱之后，该柱用1柱体积(157mL)1M氢氧化钠再生，并用1.9柱体积(298.3mL)40mM柠檬酸钠(pH4.5)再次平衡。实施例9a-l-蛋白酶抑制剂、白蛋白、免疫球蛋白和血纤蛋白原的分离，其中还包括洗涤步骤用于本实施例的固体分离介质与用于实施例1的固体分离介质相同。步骤1.在21。C温度下，用2.5柱体积(392.5mL)40mM柠檬酸钠(pH4.5)，以10.0cm/min的线性流速平衡EBA柱(FastLine20，UpFrontChromatographyA/S，CopenhagenDenmark)(直径为2cm;床高为25cm;i殳定床体积=78.5mL)。步骤2.39.3mL解冻人血浆由78.5mL水以1:2比例稀释，将含解冻人血浆的117.8mL稀释血浆溶液上于该柱。稀释血浆溶液在用于柱前其pH用1MHC1调为pH5.0，并且上样比为每升树脂1.5升血浆溶液。步骤3.将稀释血浆溶液上样后,该柱用3.7柱体积(580.9mL)含10mM柠檬酸钠(pH5.0)的洗脱緩冲液l洗脱。由此除去用于柱的稀释血浆溶液中存在的包括a-l-蛋白酶抑制剂在内的未结合蛋白质、脂质和其它物质。步骤4.上面的步骤3之后，该柱用3.6柱体积(565.2mL)含5g/L辛酸钠/HCl的洗脱緩冲液2(pH6.0)洗脱。步骤4洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的白蛋白。步骤4a.如上面的步骤4所述柱洗脱之后,该柱用1.0柱体积(157mL)1M柠檬酸钠(pH8.0)洗涂。步骤5.如上面的步骤4a所述柱洗涤之后，该柱用5.4柱体积(847.8mL)含有0.3M柠檬酸钠(pH8.0)的洗脱緩沖液3洗脱。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的免疫球蛋白。步骤6.如上面的步骤5所述柱洗脱之后，该柱用洗脱緩冲液4(pH8.0)洗脱，该洗脱緩沖液4含有1.7柱体积(266.9mL)含0.1M氯化钠的20mM柠檬酸钠。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的血纤蛋白原。步骤7.如步骤6所述柱洗脱之后，该柱用1柱体积(157mL)1M氢氧化钠再生，并用2.6柱体积(408.2mL)40mM柠檬酸钠(pH4.5)再次平衡。分析测定上述实施例的所有产量通过比较单向》丈射免疫扩散确定(AgneteInglldin:HandbookofImmunoprecipitation-in-GelTechniques,ed.NilsH.Axelsen,ScandinavianJournalofImmunology,Suppl.No.10，Vol17，pp.41-57，1983)。实施例10从粗制血浆中分离因子VIII和因子IX步骤l.固体分离介质:基质骨架为琼脂糖-碳化鴒树脂，间隔物来源于环氧基，配体为对苯二曱胺或间苯二甲胺。将微球装入EBA柱(F;astLine10,UpFrontChromatographyA/S,Copenhagen,Denmark)(直径为1cm;床高设为25em;设定床体积=20mL)中。在温度为25°C时，用20mM柠檬酸钠(pH6.0),以5.0cm/min的线性流速进行平衡。步骤2(加样步骤).将300mL未稀释的粗制血浆上于该柱。血浆在用于柱前其pH用1MHC1调为pH6.0，并且上样比为每升树脂15升血浆。步骤3(洗脱1).将血浆上样后,该柱用9柱体积(180mL)含20mM柠檬酸钠的洗脱緩冲液l(pH6.0)洗脱。由此除去未结合蛋白质。步骤4.然后该柱用6.4柱体积(128mL)洗涤纟爰沖液洗涤，该洗涤緩冲液含有20mM柠檬酸钠+0.2M氯化钠，pH为6.0。步骤5(洗脱2).上面的步骤4之后，该柱用6.0柱体积(120mL)洗脱緩冲液2洗脱，该洗脱緩沖液含有20mM柠檬酸钠+1.0M氯化钠，pH为8.0。该步骤洗脱了用于柱的血浆中存在的45。/。以上的因子VIII活性。该步骤还洗脱了用于柱的血浆中存在的85。/。以上的因子IX活性。步骤6.步骤5所述柱洗脱之后，该柱用1柱体积(20mL)1M氢氧化钠再生，并用2.0柱体积(40mL)20mM柠檬酸钠(pH6.0)再次平衡。因子VIII活性的测定使用购自Coamatic(目录编号822585-63)的因子VIII活性试剂盒在粗制血浆和EBA蛋白质流分中测定相对因子VIII活性。使用未稀释的(100%活性)和稀释为初始活性的80%、60%、40%、20%和0%(空白)的粗制血浆制备标准曲线(未给出)。对来自柱的流出物、洗涤物和洗脱物(洗脱2)的流分进行了分析并通过参照标准曲线确定了洗脱物中的活性产率(参见表7)。从表7可见，在所使用的条件下固体分离介质结合和洗脱了45"/。的因子VIII活性。表7:因子VIII、流分体积和活性产率<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>因子IX抗原的测定通过使用商品抗体的因子IX夹心ELISA在粗制血浆和EBA蛋白质流分中测定相对因子IX抗原浓度。使用未稀释(100。/。)的和稀释为初始浓度的80%、60%、40%、20%和0%(空白)的粗制血浆制备标准曲线(未给出)。对来自柱的流出物、洗涤物和洗脱物(洗脱2)的流分进行了分析并通过参照标准曲线确定了洗脱物(洗脱2)中的抗原产率(参见表8)。从表8可见，在所使用的条件下固体分离介质结合和洗脱了85%因子IX抗原。表8:因子IX、流分体积和抗原产率<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>图8通过SDS-PAGE示出洗脱物(洗脱2)包含极少比例所4吏用蛋白质。当为了与粗制血浆直接比较而稀释时，仅可见IgG、白蛋白和其它蛋白的极微弱条带，这表明相对于FVIII/FIX流分这些蛋白质的丟失不显著。同样，为了与粗制血浆直接比较将流出物流分稀释，未观察到蛋白质的显著丢失。RID示出在流出物流分中a-l-PI和血纤蛋白原也被完全回收(未给出)。实施例11第二方面的方法与第一方面的方法的相容性为了确定先除去因子VIII和因子IX是否会对第一方面的分离方法产生负面影响，来自实施例10的流出物流分被用作第一方面的方法的原材料。步骤l，固体分离介质与2-巯基烟酸起作用的琼脂糖-碳化钨微球。琼脂糖-碳化鴒微球大小分布介于40-120微米之间，平均直径为70微米。农t球的密度为2.9g/ml(FastLineUFCNNSDWcat.No.:CS48，UpFrontChromatographyA/S，Copenhagen,Denmark,)。将微球装入EBA柱(FastLine20,UpFrontChromatographyA/S，Copenhagen,Denmark)(直径为2cm;床高设为50cm;设定床体积=157mL)。在25。C温度下，用2.5柱体积(392.5mL)40mM柠檬酸钠(pH4.5)，然后用另一2.5柱体积(392.5mL)40mM杼檬酸钠(pH5.0),以线性流速为7.5cm/min进行平衡。步骤2.来自实施例10所述柱的流出物被调节为1份粗制血浆+2份水，将该流出物上于该柱。稀释血浆溶液在用于柱前其pH用1MHCl调为pH5.0，并且上样比为每升树脂1.5升血浆。步骤3.将稀释血浆溶液上样后,该柱用3.3柱体积(518mL)含10eiM柠檬酸钠(pH5.0)的洗脱緩冲液l洗脱。由此除去用于柱的稀释血浆溶液中存在的包括a-l-蛋白酶抑制剂在内的未结合蛋白质、脂质和其它物质。步骤4.上面的步骤3之后，该柱用2.6柱体积(408mL)含5g/L辛酸钠/HCl的洗脱緩沖液2(pH6.0)洗脱。步骤4洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的白蛋白。步骤4a.如上面的步骤4所述柱洗脱之后，该柱用1.0柱体积(157mL)1M柠檬酸钠(pH8.0)洗涂。步骤5.上面的步骤4a所述柱洗涤之后，该柱用4.9柱体积(769mL)含有0.3M柠檬酸钠(pH7.4)的洗脱緩沖液3洗脱。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的免疫球蛋白。步骤6.如上面的步骤5所述柱洗脱之后，该柱用洗脱緩冲液4(pH7.4)洗脱，该洗脱緩冲液4含有2.6柱体积(408mL)含0.1M氯化钠的20mM柠檬酸钠。该步骤洗脱了用于柱的稀释血浆溶液中存在的血纤蛋白原。步骤7.步骤6所述柱洗脱之后，该柱用1柱体积(157mL)1M氢氧化钠再生，并用2.0柱体积(314mL)40mM柠檬酸钠(pH4.5)再次平衡。如图7所示，由缺失因子VIII/因子IX的血浆获得的定性条带形式与实施例4中获得的条带形式相同。每个流分获得的处理体积也与实施例4所描述的相同。图8A-B示出不同蛋白质流分中白蛋白和IgG的定量分析，并且正如所观察到的那样，实际上所有白蛋白在洗脱2中回收得到，并且实际上所有IgG在洗脱3中回收得到。白蛋白和IgG在其它流分中几乎枱r测不到。还发现a-l-蛋白酶抑制剂和血纤蛋白原与第一方面的方法所描述的^f亍为方式相同。这些结果表明对苯二曱胺或间苯二曱胺能以有效方式从未稀释血浆中选择性提取因子VIII和因子IX,并且不会显著降低其它血浆蛋白质的水平，其它血浆蛋白质可在随后的(一种或多种)方法如第一方面的方法中^皮分离。因子vin/因子ix的分离方法与第一方面的白蛋白/IgG/血纤蛋白原/a-1-蛋白酶抑制剂的分离方法相容。权利要求1.一种从含有蛋白质的溶液中分离所述蛋白质的方法，所述溶液选自粗制血浆、血清、来源于血浆的冷上清液、分级分离的人血浆、来源于血浆的冷沉淀物和重组肉汤，所述方法包括(i)提供具有下式的固体分离介质M-S-L其中M为基质骨架，S为任选的间隔臂，L是配体巯基烟酸；(ii)将所述固体分离介质与所述溶液相接触，这样至少一种所述蛋白质可逆地结合到所述固体分离介质上；(iii)进行至少一步洗脱以从该固体分离介质上选择性洗脱至少一种蛋白质流分。2.根据权利要求l的方法，其中该溶液为粗制血浆。3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中M为高密度树脂。4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中L为2-巯基烟酸。5.根据权利要求1至4任一项的方法，其中S为包含环氧基的化合物。6.根据权利要求1至5任一项的方法，其中该至少一种蛋白质流分包含选自下列的至少一种蛋白质免疫J求蛋白例如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE，转铁蛋白，血纤蛋白原或其衍生物，血浆蛋白酶抑制剂例如抗凝血酶如抗凝血酶III，血液促凝固蛋白，血液抗凝固蛋白，细胞因子，生长因子，白蛋白或其衍生物，溶血栓剂，抗血管发生蛋白，胰岛素或其衍生物，a-l-蛋白酶抑制剂或其书于生物例如a-l-抗月夷蛋白酶，a-2-抗纤溶酶或其衍生物，C-l酯酶抑制剂，载脂蛋白，HDL,纤连蛋白或其衍生物，P-2-糖蛋白I，纤溶酶原，纤溶酶，纤溶酶原激活物，纤溶酶原抑制剂，尿激酶或其衍生物，链激酶或其书f生物，间-a-胰蛋白酶抑制剂，a-2-巨球蛋白，淀粉状蛋白，血清类黏蛋白，铁蛋白，前白蛋白，GC-球蛋白，血凝乳酶和补体C3。7.根据权利要求6的方法，其中该至少一种蛋白质流分包含至少一种选择下列的蛋白质免疫球蛋白、转铁蛋白、血纤蛋白原或其衍生物、a-l-蛋白酶抑制剂和白蛋白，或其衍生物。8.根据权利要求1至7任一项的方法，其中含有所述蛋白质的该溶液具有介于约3.0至约6.0之间的pH。9.根据权利要求8的方法，其中含有所述蛋白质的该溶液具有介于约4.5至约6.0之间的pH。10.根据权利要求1至9任一项的方法，其中第一步洗脱包括用pH介于约4至约8之间、离子强度介于约0.00005S/cm至约0.1S/cm之间的溶液洗脱该固体分离介质以洗脱第一蛋白质流分。11.根据权利要求10的方法，其中该第一蛋白质流分包含至少一种选自a-l-蛋白酶抑制剂、白蛋白、血清类黏蛋白和前白蛋白的蛋白质。12.根据权利要求IO或权利要求11的方法，其中第二步洗脱包括用pH介于约5至约7之间、离子强度介于约0.0001S/cm至约0.1S/cm之间的溶液洗脱该固体分离介质以洗脱第二蛋白质流分。13.根据权利要求12的方法，其中该溶液还包含芳香族、非芳香族或杂芳族疏水化合物。14.根据权利要求13的方法，其中该非芳香族疏水化合物为烷基羧酸盐、磺酸盐或带负电的洗涤剂。15.根据权利要求12至14任一项的方法，其中该第二蛋白质流分包含至少一种选自白蛋白和免疫球蛋白的蛋白质。16.根据权利要求12至15任一项的方法，其中第三步洗脱包括用pH介于约5至约9之间、离子强度介于约0.001S/cm至约4S/cm之间的溶液洗脱该固体分离介质以洗脱第三蛋白质流分。17.根据权利要求16的方法，其中该第三蛋白质流分包含至少一种选自免疫球蛋白、转铁蛋白和血纤蛋白原的蛋白质。18.根据权利要求16或权利要求17的方法，其中第四步洗脱包括用pH介于约5至约9之间、离子强度介于约0.01S/cm至约2S/cm之间的溶液洗脱该固体分离介质以洗脱第四蛋白质流分。19.根据权利要求18的方法，其中该溶液还包括无机酸盐。20.才艮据权利要求18或权利要求19的方法，其中该第四蛋白质流分包含至少一种选自转铁蛋白、免疫球蛋白、血纤蛋白原和a-2-巨球蛋白的蛋白质。21.权利要求1至20任一项的方法，其中所述方法在膨胀床吸附柱中以膨胀床模式进行。22.权利要求1至20任一项的方法，其中所述方法在填充床柱中以填充床模式进行。23.—种从含有因子VIII和/或因子IX的溶液中分离因子VIII和/或因子IX的方法，所述溶液选自粗制血浆、血清、来源于血浆的冷上清液、分级分离的人血浆、来源于血浆的冷沉淀物和重组肉汤，所述方法包括(i)提供具有下式的固体分离介质M-S-L其中M为基质骨架、S为任选的间隔臂，L为配体苯二曱胺；(ii)将所述固体分离介质与所述溶液相接触，这样至少因子VIII和/或因子IX可逆地结合到所述固体分离介质上；(iii)进行第一步洗脱以从该固体分离介质上洗脱未结合蛋白质；(iv)进行第二步洗脱以从该固体分离介质上洗脱因子VIII和/或因子IX。24.根椐权利要求23的方法，其中含有因子VIII和因子IX的溶液为净且制血浆。25.根据权利要求23或权利要求24的方法，其中M为高密度树脂。26.根据权利要求23至25任一项的方法，其中S为含有环氧基的化合物。27.根据权利要求23至26任一项的方法，其中第一步洗脱包括用pH介于约5.5至约6.5之间、离子强度介于约0.001S/cm至约0.02S/cm之间的溶液洗脱固体分离介质以洗脱第一蛋白质流分。28.根据权利要求27的方法，其中第二步洗脱包括用pH介于约7至约9之间、离子强度介于约0.03S/cm至约0.2S/cm之间的溶液洗脱固体分离介质以洗脱第二蛋白质流分。29.根据权利要求27或权利要求28的方法，其中该溶液还包含无机酸盐。全文摘要一方面，本发明涉及一种从含有蛋白质的溶液中分离蛋白质的方法，其中所述溶液选自粗制血浆、血清、来源于血浆的冷上清液、分级分离的人血浆、来源于血浆的冷沉淀物和重组肉汤。本方法涉及提供具有式M-S-L的固体分离介质，其中M为基质骨架，S为任选的间隔臂，L是配体巯基烟酸；将所述固体分离介质与含有蛋白质的溶液相接触，这样至少一种所述蛋白将可逆地结合到所述固体分离介质。然后进行至少一步洗脱以从该固体分离介质上选择性洗脱至少一种蛋白质流分。另一方面，本发明涉及一种分离因子VIII和/或因子IX的方法。文档编号C07K14/755GK101111511SQ200580026695公开日2008年1月23日申请日期2005年6月6日优先权日2004年6月7日发明者A·利赫姆申请人:Avt血浆有限公司