专利名称:用于分析物电化学检测的介体修饰的氧化还原生物分子的制作方法
技术领域:
本申请总体涉及一种生物传感器。
背景技术:
氧化还原生物分子经历可逆还原和氧化并且将电子有效地转移到自然电子受体中。它们通常包含介导并参与氧化和还原过程的活性位点辅基或辅因子。通常,辅基是基于二核苷酸,例如黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。氧化还原生物分子使底物氧化并从底物得到电子,然后通过辅基的可逆氧化还原反应将电子转移到电子受体。
生物传感器能够提供对样品中分析物测定的灵敏、快速并且低成本的检验。生物传感器主要包含识别靶分析物的氧化还原生物分子和将识别事件转换成可测量信号的传感器。在一种方式中,生物传感器通过“中断”电子流向自然生物受体而运行。通过含有与生物分子接近的电极的电路,电子流作为电流或电压被检测。因此电子在氧化还原生物分子的活性位点辅基和电极表面之间的转移是生物传感器有效运行的一个重要因素。
通常可以观察到电子从氧化还原生物分子向生物传感器的电极表面转移的效率低于自然电子受体的高效率的还原。一些科研团体已经研究了通过氧化还原介体的共价结合来修饰氧化还原生物分子,但是发现电子转移速率常数比酶及它们的自然电子受体之间的电子转移速率常数低的多。
发明内容
根据本发明,申请人已经成功设计出生物传感器检测样品中分析物的新方法。该新方法是基于合成新的氧化还原介体的基础上,所述介体在各种试验条件下可以失去或获得电子。已经确信这种氧化还原介体起到电子中转基团的作用,该中转基团能够使得非扩散介导(non-diffusion-mediated)的电子从其它氧化还原分子例如氧化还原酶转移。
在一些实施方案中,本发明提供了具有对应于式(I)结构的过渡金属化合物
其中M是能够与氮形成配位键的金属元素。R和R′可以是在它们的氮原子上与M配位的含氮有机部分,L可以是一种包含有机胺的连接配体,该有机胺具有约3至约20个非氢原子、脂族氨基和为M提供金属-氮配位键的含氮部分。Z可以是卤素原子,而m可以是+1、+2、+3、+4、+5或+6。X是与m平衡的阴离子或阴离子的组合。
在其它一些实施方案中,本发明还提供了制备具有上述对应于式I结构的过渡金属化合物的方法。所述方法将式II的前体化合物与连接配体接触,经过配体交换反应形成式I的过渡金属化合物。
其中Z、M、R、R′、X和m与上述一样。
在进一步的实施方案中,本发明提供了一种电化学标签,包含与式I的过渡金属化合物结合的氧化还原生物分子,其中Z、M、R、R′、X和m与上述一样。在优选实施方案中,M是锇并且L是3-氨丙基咪唑。优选过渡金属化合物共价结合到氧化还原生物分子上,该生物分子优选包含葡萄糖氧化酶。
在另外一些实施方案中,本发明还提供制备上述电化学标签的方法。所述方法包括将氧化还原生物分子结合到式I的过渡金属化合物,其中Z、M、R、R′、X和m与上述一样。在优选实施方案中,Z是氯,L是3-氨丙基咪唑,通过葡萄糖氧化酶羧酸酯与L中存在的脂族伯氨基之间形成酰胺键,过渡金属化合物与葡萄糖氧化酶共价结合。
本发明进一步提供应用上述电化学标签来电化学检测样品中分析物的方法。在一些实施方案中,包含分析物和电化学标签的电化学活性氧化还原配合物在电极的表面形成,其中电化学标签包括键合到式I的过渡金属化合物上的氧化还原生物分子,其中Z,M,R,R′,X和m与上述一样。对本发明的使用、功能或组成没有限定的情况下,电子在经过氧化还原循环的电化学标签到电极之间的传送往返能够被检测到,并且指示样品中分析物是否存在。被检测的分析物可以是例如核酸或蛋白质。在优选实施方案中,分析物是对应于p53基因的序列,所述p53基因是一种与各种癌症相关的基因。在其它实施方案中,被检测的分析物也可以是氧化还原生物分子的氧化底物。
在进一步的实施方案中,本发明还涉及包含上述电化学标签的药盒,以及使用所述电化学标签进行分析物的电化学检测的生物传感器。
本领域技术人员可以理解,以下叙述的附图仅仅作为示例性目的。附图并不是以任何方式限定本公开的范围的目的。
图1图示了被PBS缓冲剂中的丝网印刷碳电极上吸附的Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的葡萄糖氧化酶(GOx)的循环伏安法的数据。(a)为存在EDC/NHS偶合试剂的数据,(b)表示不存在EDC/NHS偶合试剂的数据。扫描速率100mV/s。
图2图示了(a)GOx(b)Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl和(c)由Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的GOx的UV-Vis光谱。
图3图示了丝网印刷碳电极上吸附的Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的GOx的测量电流响应。(a)表示存在EDC/NHS偶合试剂,(b)表示不存在EDC/NHS偶合试剂。平衡电压030V,葡萄糖浓度40mM。
图4图示了用Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的酶作为电化学标签的DNA分析(mRNA中的p53基因,20pg/μl)的电流响应。(a)具有与p53基因互补的捕获探针,(b)具有与p53基因非互补的捕获探针,条件与图3中所述的相同。
具体实施例方式
根据本发明,申请人已经设计了用于检测样品中分析物的新型生物传感器及方法。本发明基于新的氧化还原介体的合成,所述介体可以在各种试验条件下失去或得到电子。在不遵循具体理论的情况下,可以确信该氧化还原介体作为电子中转基团使得非扩散介导的电子能够从其它氧化还原分子例如氧化还原酶转移。
在一些实施方案中,本发明提供过渡金属化合物,该化合物可以作为氧化还原介体,并且具有对应于上述式I的结构,其中M是可以与氮形成配位键的金属元素。用作M的合适金属可以是例如锇(Os)、钌(Ru、锌(Zn)、铁(Fe)、铑(Rh)、铼(Re)、铂(Pt)、钪(Sc)、钛(Ti)、钒(V)、镉(Cd)、镁(Mg)、铜(Cu)、钴(Co)、钯(pd)、铬(Cr)、锰(Mn)、镍(Ni)、钼(Mo)、钨(W)、铱(Ir)及其混合物。在优选实施方案中,金属元素M是过渡金属锇(Os)。
R和R′可以相同和不同,并且与M在它们的氮原子上配位。R、R′或二者可以是例如2,2′-联吡啶;由一个或多个取代基取代的2,2′-联吡定,其中所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和由一个或多个C1-C4烷基取代的苯基;1,10-菲咯啉基(phenanthrolinyl)和由一个或多个取代基取代的1,10-菲咯啉基,其中所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和由一个或多个C1-C4烷基取代的苯基。优选R和R′中至少一个是2,2’-联吡啶。
L是连接配体。在一些实施方案中,L是具有3-20个非氢原子的有机胺,包括含旨族氨基,并且还包含为提供M提供金属氮配位键的含氮部分。在优选实施方案中,含氮部分是含有至少一个氮原子的杂环。非限制性例子包括咪唑、苯并咪唑、吡咯、吡唑、三唑、苯并三唑、吡啶、哒嗪、吡嗪、嘧啶和三嗪。杂环上的氮原子之一与金属M形成配位键。优选的含氮部分是咪唑。当含氮部分是杂环时,脂族氨基优选固定到环连接的烷基上。烷基可以是直链或支链并且通常含有1至约20个碳原子。优选2~12个和更优选3~6个碳原子。优选的连接配体L是3-氨丙基咪唑。
Z是卤素原子。在优选实施方案中,Z是氯或溴,更优选为氯。上标m可以是+1、+2、+3、+4、+5或+6,根据金属M的氧化态而定。在优选实施方案中,例如当金属是+4氧化态的锇时,Z是氯和m为+3。X是与阳离子的形式电荷m相平衡的阴离子或阴离子的组合。例如,X可以非限制性的是氯化物、溴化物、碘化物、氟化物、四氟硼酸盐、高氯酸盐、硝酸盐、硫酸盐、碳酸盐或亚硫酸盐。
在其它实施方案中,配位基团R和R’中至少一个、优选二者是2,2′-联吡啶或1,10-菲咯啉基,二者都可以任选被取代。当联吡啶或菲咯啉基被取代时,取代基优选选自C1-C4烷基、苯基和进一步被C1-C4烷基、尤其是C1-C2烷基取代的苯基。取代的联吡啶和菲咯啉基配位基团可以是单取代、双取代和更多取代。在一些实施方案中,可以使用双取代的配位基团。非限制性例子包括4,4′-双取代-2,2′-联吡啶、5,5′-双取代-2,2′-联吡啶、1,10-菲咯啉基、4,7-双取代-1,10-菲咯啉基和5,6-双取代-1,10-菲咯啉基。
当R和R′中只有一个是联吡啶或菲咯啉基或任选上述取代基团之一时,另一个优选选自含有两个能够与金属M形成配位键的氮原子的脂族配体。非限制性例子包括1,3-丙二胺、1,4-丁二胺和二者的衍生物,其中所述衍生物是基于1,3-丙二胺和1,4-丁二胺骨架,所述骨架任选由烷基、芳基或不干扰氮与金属M配位健合或配合物的电化学活性的其它基团取代。
在优选实施方案中,过渡金属化合物具有以下特征中的一个或多个合适的氧化还原电势,以用作本发明生物传感器中电子穿梭,所述电势通常是生物分子的辅基的电势和生物传感器电极电势之间的中间介质;与电极快速交换电子的能力,将电子快速转移至酶或从酶中快速接收电子的能力,使得存在酶或其它电化学活性氧化还原配合物催化剂时促进底物的电氧化或电还原动力学。
在优选实施方案中,过渡金属化合物包含具有下列结构的+3形式电荷的阳离子 本发明还提供制备可以作为氧化还原介体的过渡金属化合物的方法,所述过渡金属化合物具有对应于上述式I的结构。在方法的优选实施方案中,过渡金属化合物通过上述通式Ⅱ的前体化合物与连接配体进行配体交换而形成。这里所述的过渡金属化合物包含有助于与金属形成稳定配合物并且在配体交换条件下能够被连接配体取代的填充(filler)配体Z。优选的连接配体包含为金属提供金属-氮配位键的含氮部分。在优选实施方案中,金属为锇,Z是氯和连接配体是3-氨丙基咪唑。
在另一实施方案中过渡金属化合物被用作氧化还原介体,作为电化学标签的一部分。当过渡金属化合物通过连接配体附着到氧化还原生物分子上时就获得了电化学标签。在一些实施方案中,过渡金属化合物共价结合到氧化还原生物分子的氨基酸,形成电化学标签。优选过渡金属化合物附着到氧化还原生物分子的氨基酸残基,所述残基相对邻近氧化还原生物分子的活性位辅基。在优选实施方案中,过渡金属化合物在天冬氨酸酯和谷氨酸酯残基处与葡萄糖氧化酶连接。计算机制图分析显示至少两个谷氨酸酯和八个天冬氨酸酯残基距离160千道尔顿葡萄糖氧化酶同型二聚体内的FAD/FADH辅基的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)N5原子在至少16埃之内。
在优选实施方案中,本发明提供了一种含有氧化还原介体和氧化还原生物分子例如氧化迟原酶的电化学标签,所述介体是通式I的过渡金属化合物。在特别优选的实施方案中,过渡金层化合物的金层是锇并且连接配体是3-氨丙基咪唑。在优选实施方案中,电化学标签包含氧化还原介体,所述介体是共价结合葡萄糖氧化酶的式I的过渡金属化合物。
在其它实施方案中,本发明提供将过渡金属化合物共价结合到氧化还原生物分子上形成电化学标签的方法。在优选实施方案中,使用例如本领域技术人员已知的盐酸1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟磺基琥珀酰亚胺(NHS),过渡金属化合物通过碳二亚胺偶合结合氧化还原生物分子。不被理论所束缚,通过活化羧基或磷酸盐形成O-脲衍生物,碳二亚胺促进了羧酸或磷酸盐和胺之间的酰胺键的形成。这种衍生物能够容易地与亲核试剂反应。可以用所述试剂由醇基团生成醚键和由酸和醇或酚生成酯键以及由酸和胺生成肽键。碳二亚胺通常用于作为水常性衍生物EDC或作为有机可溶性衍生物N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)的肽的合成。在EDC存在下,NHS通常用于帮助碳二亚胺偶合。反应可以包括中间活性酯(羧基和N-羟基琥珀酰亚胺的缩合物)的形成,所述活性酯进一步与胺官能团反应生成最终酰胺键。
在一些实施方案中,本发明还提供使用电化学标签来电化学测定样品中分析物的方法。没有限定本发明的机理、功能或使用情况下,可以确信所述方法利用从电化学标签到本发明的生物传感器的有效电子转移。本发明的方法可以用来测定宽范围样品的多种分析物。
在非限定性实施例中,包含电化学标签的电化学活性氧化还原配合物在固体载体例如电极的表面上生成,并且检测电子转移。在一个实施方案中,通过探针吸引或与分析物结合而在表面上形成配合物,其中探针固定在电极表面或能够与电极表面结合。分析物与探针的结合取决于被检测的分析物(“靶”)。例如,当分析物是核酸时,合适的探针是包含与分析物的特定序列互补的单链区的核酸。待检测的分析物可以包含核酸,其可以是单链或双链,依照说明,或含有双链和单链序列部分。当分析物仅包含双链核酸,应当理解在分析物与互补探针杂交之前需要链分离。分析物可以是DNA(基因组或cDNA)、RNA或杂种,其中核酸含有脱氧核苷酸和核苷酸的任意组合和碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、次黄苷、黄嘌呤(xathanine)和次黄嘌呤等的任意组合。当待检测的分析物包含抗原时,合适的探针是特定识别抗原的抗体。作为替代方案,当靶分析物是抗体时,探针可以包含被抗体识别的抗原。在非限定性例子中,分析物与探针的结合可以是通过杂交、退火、电荷-电荷相互作用、憎水相互作用或共价键合。一般,探针可以包含例如寡核苷酸包括DNA、mRNA、rRNA、tRNA、肽核酸(PNAs)、表达序列标签(ESTs)、抗原、抗体、配体或受体。
利用本领域技术人员熟知的多种识别对(pair)来完成电化学标签和分析物之间的相互作用。在非限制性例子中,识别对由生物素和抗生物素蛋包组成。为了使用识别对,所述对的各个部分共价结合到分析物和电化学标签上。所述对的两个部分的特定相互作用产生了待形成的配合物,其包含所述两种化学物和共价结合的识别对。
因而,在一个实施方案中,通过电极表面上的固定探针与识别对的第一部分标记的分析物和识别对的第二部分标记的电化学标签的相互作用,配合物在电极表面形成。标记的成分在溶液中与氧化还原生物分子的氧化底物结合在一起,并且所述溶液与电极接触。通过金属化合物与如上所述氧化还原生物分子共价结合,电极在适当的电势下运行以有效接收来自氧化底物的电子。如上所述,探针和分析物此特定结合或杂交,由于探针固定在电极表面上,电极上的分析物的杂交导致将电化学标签与电极接近,在此产生电子转移。
在优选实施方案中,所述方法用于遗传诊断。例如寡核苷酸探针可以用于测定靶分析物序列,例如p53基因,该基因是一种与各种癌症相关的基因。其它非限定性例子包括非息肉病结肠癌基因、BRCAl乳癌基因、使得患者的症状前筛选容易的显示高危害性Alzheimer病的ApoE4基因、囊性纤维化基因突变、或本领域熟知的其它任何基因。
在一个优选实施方案中,使用包含共价结合过渡金属化合物的抗生物素蛋白共轭的葡萄糖氧化酶的电化学标签,利用从大鼠肝脏中提取的mRNA来实施靶p53基因的直接电流检测。利用本领域已知的技术,通过将mRNA转化为cRNA来任选进一步配制mRNA,然后用生物素标记cRNA。在电极表面上形成电化学活性氧化还原配合物,在此探针结合电极,分析物通过核酸杂交与探针结合,电化学标签通过涉及抗生物素蛋白和生物素的识别对连接来与分析物结合。与在其它地方解释的一样,那些本领域技术人员将会认识到,并不限于使用生物素/抗生物素蛋白识别对,存在多种根据本发明可以使用的识别对。因而在靶分析物杂交后电化学标签被带到电极表面上。在底物(在这种情况下为葡萄糖)存在下,包含氧化迟原生物分子(在这种情况下为葡萄糖氧化酶)的电化学标签促进了底物的氧化并且电子通过与氧化还原生物分子骨架结合的过渡金属化合物穿梭到电极表面。分析物的测定或检测通过检测在电化学活性氧化还原配合物与电极之间的电子迁移来确定。当穿梭的电子被电极获得时就会检测到电流。
在另一实施方案中,待检测的分析物也是氧化还原生物分子的氧化底物。在非限定性例子中,电化学标签的氧化还原生物分子组分包含葡萄糖氧化酶并且分析物是葡萄糖。氧化底物的存在被检测作为电极上的电子转移活性(检测电流或电压),,其中应用本领域已知的技术将电化学标签固定或形成在电极表面。在非限定性例子中,电极的表面被识别对的第一部分标记,而电化学标签被笫二部分标记。被标记的组分可以在溶液中与含有待检测分析物(在这种情况下,例如是葡萄糖)的样品结合,其也是氧化还原生物分子的氧化底物。识别对的各部分的彼此结合导致将电化学标签邻近电极,在此发生电子转移。包含葡萄糖氧化酶的电化学标签促进样品中存在的任何葡萄糖的氧化,并且电子通过与葡萄糖氧化酶骨架结合的过渡金属化合物穿梭到电极表面。葡萄糖的测定或检测通过测定电化学标签和电极之间的电子转移而确定。当穿梭电子被电极获得时就会检测到电流。
在优选实施方案中,探针结合到金电极上。然而,本领域的技术人员知道探针可以通过本领域已知的多种技术固定到电极上。例如识别对可以用来将探针连接到电极上。在这方面,探针可以被改性以包含识测对的第一部分,而电极表面涂覆第二部分,上述识别对与用于将分析物结合到电化学标签上的识别对不同。在其它实施例中,本发明的探针可以共价结合到薄膜氧化表面上。采用文献程序,可以利用本领域技术人员已知的多种技术将探针固定到相据本发明使用的电极表面上。
在其它一些实施方案中,可以使用本发明的配合物来实现病毒或细菌的检测。在该实施方案中,探针被设计用来检测来自多种细菌或病毒的靶序列。这里公开的方法允许直接筛选临床样品以检测,例如HIV核酸序列。另外,作为评价抗病毒治疗的功效的改进方法,其允许直接监测患者体内的循环病毒。同样,与白血病、HTLV-I和HTLV-II相关的病毒可以用这种方法检测。细菌感染例如肺结核也可以被检测。
在其它实施方案中,核酸被用作例如水或食品样品筛选中毒性细菌的探针。例如可以处理样品以细胞溶解细菌释放其核酸,然后设定探针来识别细菌菌珠,包括但不限于病原菌珠,例如沙门氏菌属、弯曲杆菌属(Campylobacter)、霍乱孤茵,大肠杆菌肠毒性菌株和军团病菌。同样,生物治疗策略(bioremediationstrategy)可以使用本发明的组合物进行评估。
在其它实施方案中,探针可以用在法医上,其中DNA指纹识别被用来使犯罪现场分析物例如DNA与取自受害人和嫌疑人的样品进行匹配分析。
分析物的来源可以包括例如人类、动物、植物或环境。
在其它实施方案中,本发明还涉及包含电化学标签的药盒。所述药盒还可以包含能够识别和与待检测分析物结合的探针,例如如上描述的那些。
在其它一些实施方案中,本发明进一步涉及利用上述电化学标签的生物传感器。该生物传感器可以包含仪器或在系统中使用,该系统包括检测和测量由一种或多种电化学标签产生的信号的必须部件。仪器可以包含包括与电源和检测器结合的生物传感器阵列的集成电路。这种集成电路对本领域技术人员来说是公知的。含有生物传感器阵列的系统可以另外包括用于测量电压施加到工作电极后的电化学信号的装置。可以用程序处理器来完成施加电压和测量电化学信号。待检测的信号可以通过例如脉冲电流测定法、间歇脉冲电流测定法或微分脉冲电流测定法测量。作为替代方案,生物传感器可以包含单工作电极和单参考电极。不论是阵列还是单工作电极,生物传感器都可以任选包括一个或多个反电极。
这里描述的方法和仪器采用本领域技术人员公知的化验室技术并且可以在化验室手册中找到,例如Sambrook,J.,et al,Molecular CloningA LaboratoryManual,3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2001;Specter,D.L.et al.,CellsA Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1998;and Harlow,E.,UsingAntibodiesA Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,1999。
这里使用的标题(例如“技术领域”和“发明内容”)仅仅作为本发明公开内论题的概要组织并不是有意限定本发明的公开内容或其任何方面。特别是,“技术领域”中公开的主题可以包括本发明范围内的技术状况,并且不可以构成时现有技术的叙述。在“发明内容”中公开的主题并不是详尽的或完全公开本发明的整个范围或其任何实施方案。
此处参考的引文并不构成承认那些参考的引文是现有技术或与本文公开的发明的可专利性有任何相关。在说明书中所有引用的参考文件在此通过参考全文结合。
说明书和特定实施例以及本发明的启示性实施方案仅用于说明性目的而不是限定本发明的范围。而且,具有声明特征的大量实施方案的叙述并不排斥其它具有附加特征的实施方案或其它结合了声明特征的不同组合的实施方案。提供的特定实施例用于示例性说明如何制备、使用和应用本发明组合物和方法的目的,除非另外明确声明,特定实施例并不代表本发明给出的实施方案已经、或没有被制备或测试。
用于本文中时,措词“优选的”和“优选地”是指在一定情况下提供了特定优点的本发明的实施方案。然而,在相同或其它情况下,其它实施方案也可以被优选。此外,一个或多个优选实施方案的叙述并不意味着其它实施方案不能使用而且不排斥本发明范围内的其它实施方案。
用于本文中时,描词“包括”及其变化是非限定性的,例如对列表中项目的叙述并不意味着排除也可用于本发明的材料、组合物、装置和方法中的其它类似项目。
用于本文中时,术语“测定”或“检测”将被用于表示分析物的定性和定量测定或检测。在此,例如以下定义的方法和系统用于测定或检测液体介质中的分析物,这就意味着表示测定在介质中分析物的存在以及任选其浓度。
用于本文中时,术语“分析物”是指液体样品中被测定的因子(agent)。分析物可以是或不是氧化还原生物分子的底物。
用于本文中时,术语“氧化还原生物分子”是指天然或其它改性或设计的生物分子,其具有固有的电子转移能力,例如促进一种底物或一组底物氧化或还原的酶。一些氧化还原生物分子利用辅基,例如黄素或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。辅基是氧化还原分子的非蛋白质成分,其与氧化还原生物分子结合使其能够促进氧化或还原。不存在辅基的最简单氧化还原生物分子是利用在两个半胱氨酸残基之间可逆性形成二硫键的那些,如在硫氧还蛋白中。很多利用铁或铜离子能够以在两种不同的氧化还原状态存在的能力。
用于本文中时,术语“底物”或“氧化底物”是指与氧化还原生物分子活性位结合并且经历例如氧化或还原反应的分子。
用于本文中时,术语“氧化还原介体”是指用来在氧化还原生物分子和电极之间传送电子的分子。
用于本文中时,术语“电化学标签”是指与氧化还原介体共价结合的氧化还原生物分子。
用于本文中时,术语“电化学活性氧化还原配合物”是指在含有电化学标签的电极表面上形成的配合物。
用于本文中时,术语“生物传感器”是指含有用于检测或测量由于电子移动产生的信号的必须部件的仪器或系统,其中所述电子移动在氧化还原反应(例如电流检测)中产生。术语“生物传感器”包括用于检测物质浓度和甚至不直接利用生物系统的生物学相关的其它参数的装置。
实施例以下实施例是示例性的,并不起到限定本发明范围的目的。
实施例1该实施例举例说明了氧化还原介体Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl的合成。
Os(bpy)2Cl是用例如在Lay,P. A.et al.,1986,Inorg.Synth.,24291-296中描述的方法由K2OsCl6(99%,Stem Chemicals)合成。Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl合成如下向6.0毫升新鲜蒸镏的乙二醇中的Os(bpy)2Cl2(0.10mmol)的溶液中一次性加入3-氨丙基咪唑(0.12mmol),得到的混合物回流90-120分钟。3-氨丙基咪唑购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。配位体交换反应的完成由循环伏安法监测。然后在快速搅拌下将紫色反应混合物缓慢主入200ml乙醚。使用细烧结漏斗通过抽吸过滤来收集沉淀物。粗产品用醚洗涤,溶解在3.0-5.0毫升乙醇中并再次从醚中沉淀。通过从乙醇中结晶进一步净化沉淀物,得到的纯产物,产率为75%。
在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,产物在具有0.19V的E1/2的金电极上显示出一对可逆氧化还原波。为了确保完成配位体交换,需要稍微过量的3-氨丙基咪唑(10-20%)。
使用循环伏安法监测反应的过程。纯化的产物由质谱分析和电化学表征。其与以下结构相一致 实施例2
该实施例示例说明了通过与氧化还原介体偶合对氧化还原生物分子葡萄糖氧化酶(GOx)进行的改性。
葡萄糖氧化酶抗生物素蛋白D共轭物(GOx-A)(131单位/ng固体)购自Vector Laboratories(San Diego,CA)。葡萄糖氧化酶(GOx,EC 1.1.3.4,typeX-S,来自黑曲霉,213单位/mg固体)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。盐酸1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和透析药盒(MWCO 10,000)来自Pierce。
通过GOx羧酸盐和脂族伯胺基团之间形成酰胺键,利用EDC/NHS作为偶合剂GOx被Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl共价改性,其中所述旨族伯胺基团存在于氧化还原介体(例如过渡金属化合物)上。
向4.5毫升含有1.0mM Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl和1.0μM抗生物素蛋白共轭的葡萄糖氧化酶(GOx-A)的DI水中加入盐酸1-乙基-3-(3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),产生4.0mMEDC和1.6mM sulfo-NHS的最终浓度。然后通过PBS缓冲剂离析纯化溶液24小时。在对照试验中,在不加入偶合剂的情况下将相同量的GOx-A与Os配合物混合。
实施例3该实施例示例说明了由过渡金属化合物Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl共价结合改性的GOx的电化学标签是电化学活性的。
利用与低电流组件(CH仪器,Austin,TX)结合的CH仪器型号660A的电化学工作站来进行电化学试验。三电极系统由2毫米直径金工作电极、微型Ag/AgCl参比电极(Cypress Systems,Lawrence,KS)和铂丝对电极组成。电势参照Ag/AgCl参考电极。电化学标签的循环伏安法(CV)表现出一对良好界定的中心位于0.19V的伏安法电流峰植,显示出电化学活性。为了证明酶确实被共价改性,与Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl的简单静电结合相反,根据实施例2进行对照试验,但是不存在EDC和NHS耦合试剂。对照试验产生生物活性酶但透析后不具有可检测介体,表明介体并没有共价结合到GOx上(图1中的曲线b)。
实施例4该实施例使用UV-vis吸收光谱说明了由Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的GOx的特性。
图2中图示了原料和改性的GOx的UV-vis吸收光谱。Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl的UV-vis光谱与Os(bpy)2化合物相似。其由于配体内(IL)σ→σ*(bpy)跃迁而在UV区显示出强烈带和由于自旋允许9Os(dπ)→bpy(π*)金属-到-配体电荷-迁移(MLCT)跃迁而在可见光区域(400-600nm)内通过宽带。而且,改性的GOx的光谱是来自GOx和Os(bpy)2Cl(3-氨丙基咪唑)配合物的吸收光谱的复合。Os(bpy)2Cl(3-氨丙基咪唑)和GOx的简单叠加产生了与活性GOx相似的光谱,证实了活性GOx的形成。
实施例5该实施例使用UV-vis吸收光谱说明了由Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的GOx的生物活性。
为了测定酶在共价改性后是否仍具有生物活性,将一滴改性酶溶液滴到丝网卬刷碳电极上。吸附5~10分针后,利用PBS缓冲剂彻底冲洗电极。在PBS中存在40mM葡萄糖溶液下,通过在0.3伏下测量电流来监测催化电流。固定的电活性酶的伏安法结果显示GOx保留了其对于葡萄糖氧化的催化活性(图3)。存在最佳可溶介体的情况下,其催化电流在相同浓度下与天然GOx相当或更好。伏安法结果进一步证明,与GOx共价结合的Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl可以促进酶的FAD中心直接还原而不需要溶液中的任何附加介体。同样,用Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的GOx-抗生物素蛋白共轭物显示出与活性GOx类似的电化学特性。
实施例6该实施例示例说明了由Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl改性的GOx作为电化学标签在核酸检测中的应用。
电化学活性GOx-A被用作核酸的直接电流法检测中的电化学标签。图4显示了由大鼠肝脏中提取的mRNA(20pg/μl)中的p53基因检测的定型电流曲线(mRNA被转化成cDNA,其随后被维生物素标记)。核酸制备、捕集探针的固定和测量基本上如在Xie,H.et al.,2004,Nucleic Acids Research,32el 5中所描述。当互补探针被固定到电极表面时,在靶基因杂交后酶被引到电极表面,因为GOx-A的抗生物素蛋白部分结合到靶的生物素部分。在葡萄糖存在下,酶促进了葡萄糖的氧化。电子随后通过与GOx-A骨架结合的Os(bpy)2(3-氨丙基咪唑)Cl向电极表面穿梭并被电极获得。在电极表面具有非互补捕集探针对照试验中,靶p53基因没有与捕集探针杂交,因而酶不能够结合到表面上。被检测的微小电流主要是由于酶的非特异性结合。表1给出了三次重复试验的结果。
表1p53分析的电流测量响应(3次重复)
在不背离本发明范围的情况下,可以对以上方法和组合物进行各种改变,包含在以上说明的所有内容是作为说明目的而不是限定性的。本发明的说明和实施例并不用于表示本发明教导所给出的实施方案已经或没有实施。
权利要求
1.一种具有下式的过渡金属化合物 其中M是能够与氮形成配位键的金属元素;R和R′是在氮原子上与M配位的含氮有机部分,其中R和R′独立地选自2,2′-联吡啶;由一个或多个取代基取代的2,2′-联吡啶,其中所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和由一个或多个C1-C4烷基取代的苯基;1,10-菲咯啉基;和由一个或多个取代基取代的1,10-菲咯啉基,其中所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和被一个或多个C1-C4烷基取代苯基;L是包含有机胺的连接配体,所述有机胺具有约3~约20个非氢原子、脂族氨基和为M提供金属-氮配位键的含氮部分;Z是卤素原子;m是+1、+2、+3、+4、+5或+6;X是与m平衡的阴离子或阴离子的组合。
2.如权利要求1所述的化合物,其中M选自锇、钌、锌、铁、铑、铼、铂、钪、钛、钒、镉、镁、铜、钴、钯、铬、锰、镍、钼、钨和铱或它们的混合物。
3.如权利要求2所述的化合物,其中M是锇。
4.如权利要求1所述的化合物,其中连接配体包含3-氨丙基咪唑。
5.如权利要求1所述的化合物,其中Z是氯或溴。
6.如权利要求1所述的化合物,其中R和R′独立地选自2,2′-联吡啶、4,4′-甲基-2,2′-联吡啶、4,4′-乙基-2,2′-联吡啶、4,4′-苯基-2,2′-联吡啶、5,5′-甲基-2,2′-联吡啶、5,5′-乙基-2,2′-联吡啶和5,5′-苯基-2,2′-联吡啶。
7.如权利要求6所述的化合物,其中M选自锇、钌、锌、铁、铑、铼、铂、钪、钛、钒、镉、镁、铜、钴、钯、铬、锰、镍、钼、钨和铱或它们的混合物。
8.如权利要求7所述的化合物,其中M是锇。
9.如权利要求6所述的化合物,其中连接配体包含3-氨丙基咪唑。
10.如权利要求6所述的化合物,其中Z是氯或溴。
11.如权利要求1所述的化合物,其中R和R′中至少一个为2,2′-联吡啶,M是锇,Z是氯和连接配体包含3-氨丙基咪唑。
12.如权利要求1所述的化合物,包含下式
13.一种制备过渡金属化合物的方法,所述方法包括将具有下式的前体化合物与连接配体接触以形成权利要求1的过渡金属化合物, 其中Z、M、R、R′、X和m如权利要求1中所限定。
14.如权利要求13所述的方法,其中M选自锇、钌、锌、铁、铑、铼、铂、钪、钛、钒、镉、镁、铜、钴、钯、铬、锰、镍、钼、钨和铱或它们的混合物。
15.如权利要求14所述的方法,其中M是锇。
16.如权利要求13所述的方法,其中连接配体包含3-氨丙基咪唑。
17.如权利要求13所述的方法,其中Z是氯或溴。
18.如权利要求13所述的方法,其中R和R′独立地选自2,2′-联吡啶、4,4′-甲基-2,2′-联吡啶、4,4′-乙基-2,2′-联吡啶、4,4′-苯基-2,2′-联吡啶、5,5′-甲基-2,2′-联吡啶、5,5′-乙基-2,2′-联吡啶和5,5′-苯基-2,2′-联吡啶。
19.如权利要求18所述的方法,其中M选自锇、钌、锌、铁、铑、铼、铂、钪、钛、钒、镉、镁、铜、钴、钯、铬、锰、镍、钼、钨和铱或它们的混合物。
20.如权利要求19所述的方法,其中M是锇。
21.如权利要求18所述的方法,其中连接配体包含3-氨丙基咪唑。
22.如权利要求18所述的方法,其中Z是氯或溴。
23.如权利要求13所述的方法,其中R和R′中至少一个为2,2′-联吡啶,M是锇,Z是氯和连接配体包含3-氨丙基咪唑。
24.如权利要求13所述的方法,其中前体化合物是具有下式的化合物 其中R和R′为2,2′-联吡啶并且在它们的氮原子上与Os配位,Z是氯,m是+3,X是与m平衡的阴离子或阴离子的组合,连接配体是3-氨丙基咪唑,过渡金属化合物是具有下式的化合物
25.一种电化学标签,包含与具有下式的过渡金属化合物结合的氧化还原生物分子 其中M是能够与氮形成配位键的金属元素;R和R′是在氮原子上与M配位的含氮有机部分,其中R和R′独立地选自2,2′-联吡啶;由一个或多个取代基取代的2,2′-联吡啶,其中所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和由一个或多个C1-C4烷基取代的苯基;1,10-菲咯啉基;和由一个或多个取代基取代的1,10-菲咯啉基,其中所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和被一个或多个C1-C4烷基取代苯基;L是包含有机胺的连接配体,所述有机胺具有约3~约20个非氢原子、脂族氨基和为M提供金属-氮配位键的含氨部分;Z是卤素原子;m是+1、+2、+3、+4、+5或+6;X是与m平衡的阴离子或阴离子的组合。
26.如权利要求25所述的电化学标签,其中M选自锇、钌、锌、铁、铑、铼、铂、钪、钛、钒、镉、镁、铜、钴、钯、铬、锰、镍、钼、钨和铱或它们的混合物。
27.如权利要求26所述的电化学标签,其中M是锇。
28.如权利要求25所述的电化学标签,其中氧化还原生物分子包含氧化还原酶。
29.如权利要求28所述的电化学标签,其中氧化还原酶包含葡萄糖氧化酶。
30.如权利要求25所述的电化学标签,其中连接配体包含3-氨丙基咪唑。
31.如权利要求25所述的电化学标签,其中Z是氯或溴。
32.如权利要求25所述的电化学标签,R和R′独立地选自2,2′-联吡啶、4,4′-甲基-2,2′-联吡啶、4,4′-乙基-2,2′-联吡啶、4,4′-苯基-2,2′-联吡啶、5,5′-甲基-2,2′-联吡啶、5,5′-乙基2,2′-联吡啶和5,5′-苯基-2,2′-联吡啶。
33.如权利要求32所述的电化学标签,其中M选自锇、钌、锌、铁、铑、铼、铂、钪、钛、钒、镉、镁、铜、钴、钯、铬、锰、镍、钼、钨和铱或它们的混合物。
34.如权利要求33所述的电化学标签,其中M是锇。
35.如权利要求32所述的电化学标签,其中氧化还原生物分子包含氧化还原酶
36.如权利要求35所述的电化学标签,其中氧化还原酶包含葡萄糖氧化酶。
37.如权利要求32所述的电化学标签,其中连接配体包含3-氨丙基咪唑。
38.如权利要求32所述的电化学标签,其中Z是氯或溴。
39.如权利要求25所述的电化学标签,其中R和R′中至少一个为2,2′-联吡啶,M是锇,Z是氯以及连接配体包含3-氨丙基咪唑。
40.如权利要求39所述的电化学标签,其中氧化原生物分子包含氧化还原酶
41.如权利要求40所述的电化学标签,其中氧化还原酶包含葡萄糖氧化酶。
42.如权利要求25所述的电化学标签,包含与具有下式的过渡金属化合物结合的氧化还原生物分子
43.如权利要求42所述的电化学标签,其中氧化还原生物分子包含氧化还原酶。
44.如权利要求43所述的电化学标签,其中氧化还原酶包含葡萄糖氧化酶。
45.一种制备权利要求25所述的电化学标签的方法,所述方法包括将氧化还原生物分子与具有下式的过渡金属化物结合 其中M是能够与氮形成配位键的金属元素;R和R′是在氮原子上与M配位的含氮有机部分,其中R和R′独立地选自2,2′-联吡啶;由一个或多个取代基取代的2,2′-联吡啶,其中所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和由一个或多个C1-C4烷基取代的苯基;1,10-菲咯啉基;和由一个或多个取代基取代的1,10-菲咯啉基,其中所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和被一个或多个C1-C4烷基取代苯基;L是包含有机胺的连接配体,所述有机胺具有约3~约20个非氢原子、脂族氨基和为M提供金属-氮配位键的含氮部分;Z是卤素原子;m是+1、+2、+3、+4、+5或+6;X是与m平衡的阴离子或阴离子的组合。
46.如权利要求45所述的方法,其中M选自锇、钌、锌、铁、铑、铼、铂、钪、钛、钒、镉、镁、铜、钴、钯、铬、锰、镍、钼、钨和铱或它们的混合物。
47.如权利要求46所述的方法,其中M是锇。
48.如权利要求45所述的方法,其中氧化还原生物分子包含氧化还原酶。
49.如权利要求48所述的方法,其中氧化还原酶包含葡萄糖氧化酶。
50.如权利要求45所述的方法,其中氧化还原生物分子通过酰胺键与过渡金属化合物结合。
51.如权利要求45所述的方法,其中连接配体包含3-氨丙基咪唑。
52.如权利要求45所述的方法,其中Z是氯或溴。
53.如权利要45所述的方法,其中R和R′独立地选自2,2′-联吡啶、4,4′-甲基-2,2′-联吡啶、4,4′-乙基-2,2′-联吡啶、4,4′-苯基-2,2′-联吡啶、5,5′-甲基-2,2′-联吡啶、5,5′-乙基-2,2′-联吡啶和5,5′-苯基-2,2′-联吡啶。
54.如权利要求53所述的方法,其中M选自锇、钌、锌、铁、铑、铼、铂、钪、钛、钒、镉、镁、铜、钴、钯、铬、锰、镍、钼、钨和铱或它们的混合物。
55.如权利要求54所述的方法,其中M是锇。
56.如权利要求53所述的方法,其中氧化还原生物分子包含氧化还原酶。
57.如权利要求56所述的方法,其中氧化还原酶包含葡萄糖氧化酶。
58.如权利要求53所述的方法,其中氧化还原生物分子通过酰胺键与过渡金属化合物结合。
59.如权利要求53所述的方法,其中连接配体包含3-氨丙基咪唑。
60.如权利要求53所述的方法,其中Z是氯或溴。
61.如权利要求45所述的方法,其中R和R′中至少一个为2,2′-联吡啶,M是锇,Z是氯以及连接配体包含3-氨丙基咪唑。
62.如权利要求61所述的方法,其中氧化还原生物分子包含氧化还原酶。
63.如权利要求62所述的方法,其中氧化还原酶包含葡萄糖氧化酶。
64.如权利要求61所述的方法,其中氧化还原生物分子通过酰胺键与过渡金属化合物结合。
65.如权利要求45所述的方法,所述方法包括将氧化还原生物分子与具有下式的过渡金属化合物结合
66.如权利要求65所述的方法,其中氧化还原生物分子包含氧化还原酶。
67.如权利要求66所述的方法,其中氧化还原酶包含葡萄糖氧化酶。
68.如权利要求66所述的方法,其中氧化还原生物分子通过酰胺键与过渡金属化合物结合。
69.一种用于检测样品中分析物的方法,所述方法包括在电极表面形成包含分析物和电化学标签的电化学活性氧化还原配合物;和在电极检测电子转移,其中所述电化学标签包含与具有以式的过渡金属化合物结合的氧化还原生物分子 其中M是能够与氨形成配位键的金属元素;R和R′是在氮原子上与M配位的含氮有机部分,其中R和R′独立地选自2,2′-联吡啶;由一个或多个取代基取代的2,2′-联吡啶,其中所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和由一个或多个C1-C4烷基取代的苯基;1,10-菲咯啉基;和由一个或多个取代基取代的1,10-菲咯啉基,其中所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和被一个或多个C1-C4烷基取代苯基;L是包含有机胺的连接配体,所述有机胺具有约3~约20个非氢原子、脂族氨基和为M提供金属-氮配位键的含氮部分;Z是卤素原子;m是+1、+2、+3、+4、+5或+6;X是与m平衡的阴离子或阴离子的组合。
70.如权利要求69所述的方法,其中M选自锇、钌、锌、铁、铑、铼、铂、钪、钛、钒、镉、镁、铜、钴、钯、铬、锰、镍、钼、钨和铱或它们的混合物。
71.如权利要求70所述的方法,其中M是锇。
72.如权利要求69所述的方法,其中分析物是氧化还原生物分子的氧化底物。
73.如权利要求69所述的方法,其中氧化还原生物分子包含氧化还原酶。
74.如权利要求73所述的方法,其中氧化还原酶包含葡萄糖氧化酶。
75.如权利要求69所述的方法,其中连接配体包含3-氨丙基咪唑。
76.如权利要求69所述的方法,其中Z是氯或溴。
77.如权利要求69所述的方法,其中所述方法还包括将探针固定到电极表面上;用识别对的第一部分标记分析物;用识别对的第二部分标记电化学标签;和将被标记的成分与氧化还原生物分子的氧化底物在与电极接触的溶液中结合,其中探针和分析物彼此特异性结合或杂交。
78.如权利要求77所述的方法,其中识别对包含生物素和抗生物素蛋白。
79.如权利要求77所述的方法,其中分析物包含核酸。
80.如权利要求69所述的方法,其中所述方法还包括用识别对的第一部分标记电极表面;用识别对的第二部分标记电化学标签;和将被标记的成分与氧化还原生物分子的氧化底物在与电极接触的溶液中结合,其中所述电化学标签结合所述电极表面。
81.如权利要求80所述的方法,其中识别对包含生物素和抗生物素蛋白。
82.如权利要求80所述的方法,其中分析物包含氧化还原生物分子的底物。
83.如权利要求69所述的方法,其中过渡金属化合物包含有下式的+3阳离子
84.如权利要求83所述的方法,其中氧化还原生物分子包含氧化还原酶。
85.如权利要求83所述的方法,其中氧化还原酶包含葡萄糖氧化酶。
全文摘要
用于电化学检测分析物的组合物和方法,所述组合物包含式(I)过渡金属化合物,其中M是一种能够与氮形成配位键的金属元素;R和R′在它们的氮原子上与M配位;L是一种连接配体;Z是氯或溴,而m可以是1~6;X是平衡电荷m的阴离子或阴离子的组合。还提供了电化学标签和检测方法。
文档编号C07F17/00GK101027314SQ200580029087
公开日2007年8月29日 申请日期2005年7月18日 优先权日2004年7月28日
发明者谢虹, 高志强 申请人:新加坡科技研究局