专利名称：双调蛋白作为保护剂在急性肝损伤中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于应用于治疗肝疾病、且特别是例如急性肝衰竭(ALF)的急性肝损伤的医药部门的生物技术领域。
更具体地，本发明基于使用双调蛋白(AR)为这类疾病提供了的新的治疗。
本发明现有技术发展水平急性肝损伤是极其严重的病症，可以将其表述为继发于由肝细胞死亡所致功能性肝物质损失的急性肝衰竭(ALF)。ALF不是如所指的疾病，而是严重性与肝细胞损失程度成比例的综合征。该病症是剧烈的，并且具有伴多器官影响的并发症，所述并发症包括脑病、脑水肿、脓毒症、呼吸和肾衰竭、肠出血和心血管萎陷(Sanyal，A.J.，Stravitz，R.T.The liver.第16章，445-496页.Zakim及Boyer编，Saunders.Philadelphia.2003)。
尽管ALF不是特别常见，但相关死亡率为40至95％(Sanyal，A.J.，Stravitz，R.T.The liver.第16章，445-496页.Zakim及Boyer编，Saunders.Philadelphia.2003；以及Galun，E.，Axelrod，J.H.Biochim.Biophys.Acta.1592345-358.2002(下文将其标识为(15))。
ALF的病因学是多样的，具有地理可变性(geographicalvariability)；为了确定预后并实施治疗，其正确定义是重要的。
在可以导致ALF的试剂中，应当提到肝炎病毒、某些药物和毒素、代谢紊乱、某些急性缺血情况、以及肝实质大部切除(Sanyal，A.J.出处同上；Galun，E.出处同上)。
ALF的成功消退依赖于抑制肝细胞损伤的可能性和损伤实质的再生。现有临床实践中可利用的大部分治疗方法试图减轻ALF的多器官表现；然而，没有一种治疗策略能够减少坏死和细胞凋亡、或促进肝细胞再生-肝移植最终成为治愈患者的唯一可能的备选方案(Sanyal，A.J.出处同上；Galun，E.出处同上)。
已知在继发于肝部分切除术(PH)或中毒性、病毒性、缺血性或免疫起因的损伤的肝组织损失后的肝中，细胞保护和再生机制得到激活((1)Michalopoulos，G.K.，DeFrances，M.C.1997.Liverregeneration.Science 27660-66.(2)Fausto，N.2000.Liverregeneration.J.Hepatol.32(suppl 1)19-31.(3)Taub，R.A.2003.Hepatic regeneration.InThe Liver.D.Zakim，J.L.Boyer，Saunders，Philadelphia.U.S.A.31-48)。不同的实验途径已经帮助详细说明了在严重肝损伤后有助于保持肝功能并恢复功能性肝物质的根本机制((4)Koniaris，L.G.，McKillop，I.H.，Schwartz，S.I.，Zimmers，T.A.2003.Liver regeneration.J.Am.Coll.Surg.197634-659)。这种复杂反应是在以一系列协调步骤进展的过程背景下由细胞因子、辅有丝分裂原和生长因子网络介导的((2)，(3)，(5)Kosai，K.，Matsumoto，K.，Nagata，S.，Tsujimoto，Y.，Nakamura，T.1998.Abrogation of Fas-induced fulminant hepaticfailure in mice by hepatocyte growth factor.Biochem.Biophys.Res.Commun.244683-690.(6).Ethier，C.，Raymond，V-A.，Musallam，L.，Houle，R.和Bilodeau，M.2003.Antiapoptotic effect of EGF onmouse hepatocytes associated with downregulation of proapoptoticBid protein.Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.285G298-G308.(7).Kanda，D.，Takagi，H.，Toyoda，M.，Horiguchi，N.，Nakajima，H.，Otsuka，T.，Mori，M.2002.Transforming growth factorαprotects against Fas-mediated liver apoptosis in mice.FEBS Lett.51911-15)。认为在动物模型中对于损伤或切除的再生应答至关重要的许多细胞因子和生长因子在人体内也于肝再生过程中表达，从而提示物种中的基本机制的保持(4)。
已经在实验水平显示，对动物(大鼠和小鼠)施用某些生长因子和细胞因子能针对ALF进行保护，从而避免了细胞死亡并刺激肝实质再生。这类因子包括肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子α(TGF-α)和表皮生长因子(EGF)。(Kosai，K.，Matsumoto，K.Nagata，S.，Tsujimoto，Y.，Nalamura，T.Biochem.Biohys.Res.Commun.244683-690.1998，下文表示为(5)；Kand，D.，Takagi，H.，Toyoda，M.，Horiguchi，N.，Nakajima，H.，Otsuka，T.，Mori，M.FEBS Lett.519-11-15.2002；以及Ethier，C.，Raymond，V.A.，Musallam，L.，Houle，R.，Bilodeau，M.Am.J.Physiol.285G298-G308.2003)。在细胞因子中，应当提到白细胞介素6(IL-6)和向心素-1(CT-1)。(Kovalovich，K.，DeAngelis，R.A.，Li，W.，Durth，E.E，Ciliberto，G.，Taub，R.Hepatology 31149-159.2000，下文表示为(26)；以及Bustos，M.，Beraza，N.，Lasarte，J.J.，Baixeras，E.，Alzuguren，P.，Bordet，T.，Prieto，J.Gastroenterology125192-201.2003，下文表示为(43))。肝再生是实质切除或损伤后以恢复肝物质为目的的独特反应。存活和增殖信号通过以协调方式运作的细胞因子和生长因子的复杂网络传递。然而，尽管过去几十年中进行了透彻研究，但尚未充分阐明在肝损伤的生理学适应反应中涉及的分子和机制。
发明人最近观察到Wilms氏肿瘤抑制基因WT1在肝细胞损伤患者的肝以及在用四氯化碳(CCl4)处理的大鼠肝中被诱导((8)Berasain，C.，Herrero，J.I.，García-Trevijano，E.R.，Avila，M.A.，Esteban，J.I.，Mato，J.M.和Prieto，J.2003.Expression of Wilms’tumor suppressor in the cirrhotic liverrelationship to HNF4 levelsand hepatocellular function.Hepatology 38148-157)。WT1基因编码具有锌指的转录因子，该转录因子可以调节与生长和分化相关的一类基因的表达((9)Scharnhorst，V.，Van der Eb，A.J，和Jochemsen，A.G.WT1 proteinsfunctions in growth and differentiation.2001.Gene 273141-161)。
双调蛋白(AR)是由WT1直接诱导的主要生理学靶之一((10)Lee，S.B.，Huang，K.，Palmer，R.，Truong，V.B.，Herzlinger，D.，Kolquist，K.A.，Wong，J.，Paulding，C.，Yoon，S.K.，Gerald，W.，Oliner，J.D.，和Haber，D.A.1999.The Wilms’tumor suppressorWT1 encodes a transcriptional activator of amphiregulin.Cell 98663-673)。AR是属于EGF家族的多肽生长因子及EGF受体(EGF-R)配体，最初从用佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(phorbol12-myristate 13-acetate)处理的MCF-7人乳腺腺癌细胞条件培养基分离获得((11)Shoyab，M.，McDonald，V.L.，Bradley，G.和Todaro，G.J.1988.Amphiregulina bifunctional growth-modulatingglycoprotein produced by the phorbol 12-myristate 13-acetate-treatedhuman breast adenocarcinoma cell line MCF-7.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.856528-6532)。通过与EGF和TGFα相同的方法，将AR作为跨膜前体合成，该前体经过蛋白水解加工以产生成熟的分泌形式((12)Lee，D.C.，Sunnarborg，S.W.，Hinkle，C.L.，Myers，T.J.，Stevenson，M.Y.，Russell，W.E，Castner，B.J.，Gerhart，M.J.，Paxton，R.J.，Black，R.A.，Chang，A.和Jackson，L.F.2003.TACE/ADAM17 processing of EGF-R ligands indicates a role as aphysiological convertase.Ann.N.Y.Acad.Sci.99522-38)。AR的表达是组织特异的。在人中，它更显著见于卵巢和胎盘，而在肝中不可检测((13)Plowman，G.D.，Green，J.M.，McDonald，V.L.，Neubauer，M.G.，Disteche，C.M.，Todaro，G.J.和Shoyab，M.1990.Amphiregulin gene encodes a novel epidermal growth factor-relatedprotein with tumor-inhibitory activity.Mol.Cell Biol.101969-1981)。
AR具有双功能特性，刺激多种正常细胞增殖并抑制许多肿瘤细胞系((10)，(13)和(14)Kato，M.，Inazu，T.，Kawai，Y.，Masamura，K.，Yoshida，M.，Tanaka，N.，Miyamoto，K.和Miyamori，I.Amphiregulin is a potent mitogen for the vascular smooth musclecell line，A75.2003.Biochem.Biophys.Res.Commun.3011109-1115)。
US-5115096专利描述了双调蛋白的物理化学特征及其对上皮起源的癌细胞的抗增殖作用，及其在创伤治疗和癌症的诊断及治疗中的用途。其中提到肝中双调蛋白产生的水平明确降低，由此推导其显然“发挥一些功能性作用”。
专利US-5980885描述了包括使用AR和成纤维细胞生长因子在哺乳动物神经元组织中诱导前身细胞增殖的方法。
专利US-6204359描述了由角质形成细胞产生的AR新形式在创伤和癌症治疗中的用途。
专利申请US-20011051358描述了来自EEGF(细胞外/表皮生长因子)的多肽的获得及除其他应用外其在肝病症治疗中的用途。该申请也提到与肝再生有关的治疗的可能性。然而，仅将AR作为技术发展水平已知的产物提及，这是想来由本文件中所述发明所超越的。
专利申请WO-0145697描述了抑制AR表达的调节剂及其在人皮肤治疗中的用途。
最后，专利申请WO-02102319描述了编码BGS-8多肽、其片段和同源物的多核苷酸，所述BGS-8多肽、其片段和同源物除其他应用外用于治疗和预防影响肝的肝病症及增殖状态。同样指出，因为“与EGF蛋白质家族成员例如bFGF、PDGF、AR、β-cellulin、crypto-和TGF-α的高度同源性”，所以预期BGS-8多肽与属于该家族的蛋白质至少共有某些生物学活性。
技术发展水平对于ALF治疗的新的备选方案提出需求。因此，需要为ALF寻找基于生长因子或细胞因子应用的更有效的治疗，该治疗的施用可以在ALF中提供肝保护。
发明描述基于上述技术发展水平，发明人意外地发现，外部施用的AR在例如可以导致(或已经导致)急性肝衰竭(ALF)的急性肝损伤中可以用作保护剂。
因此，本发明的目的是双调蛋白在制备急性肝损伤治疗药物中的用途。
本发明的另一个目的是其中施用所述因子的药物在增强肝组织抗急性肝损伤的原发内源性保护反应中的用途。
本发明的另一个目的是双调蛋白在制备药物中的用途，施用所述药物以促进急性肝损伤中肝实质细胞中的DNA合成。
本发明的另一个目的是AR在制备药物中的用途，施用所述药物以预防急性肝损伤中肝实质细胞的死亡。
另一个目的是AR在制备药物中的用途，所述药物刺激任何病因的急性肝损伤后残余肝实质的再生。
本发明的另一个目的是AR在制备药物中的用途，所述药物可用于刺激肝部分切除术后的肝再生。
本发明的另一个目的是AR在制备药物中的用途，所述药物可以在活体(in vivo)或来自尸体的移植的肝患者受体中用作肝保护(hepatoprotective)药物和肝细胞再生刺激物。
双调蛋白因此可通过施用于需要这类治疗的患者而用于治疗急性肝损伤。因此，双调蛋白可以用于急性肝损伤治疗方法中，所述方法包括向需要这类治疗的患者施用有效量的AR。在这类用途背景中，可以在(例如)向患者施用AR的治疗方法中使用该药物，以实现*增强肝组织抗急性肝损伤的原发内源性保护反应；和/或*促进急性肝损伤期间肝细胞中的DNA合成；和/或*预防急性肝损伤期间肝细胞死亡；和/或*刺激急性肝损伤后残余肝实质再生；和/或*增强肝组织抗肝损伤的原发内源性保护反应，和/或促进肝细胞DNA合成，和/或*预防急性肝损伤患者肝组织中的肝细胞死亡，和/或*刺激任何病因的急性肝损伤后残余肝实质的再生；和/或*刺激肝部分切除术后的肝再生；和/或*刺激活体或来自尸体的肝移植患者受体的肝细胞再生。
发明人已惊讶地发现，施用AR能够在肝损伤期间诱导肝细胞存活。因此，已经证明AR起促有丝分裂和增殖因子的作用。发明人已证实，AR能够直接作用于分离的肝细胞，从而促进其增殖并抑制细胞凋亡。这些作用似乎由EGF-R和细胞外调节的激酶1/2(ERK1/2)、信号-3转导蛋白和转录激活物(STAT-3)、c-jun N-末端激酶(JNK)和Akt的活化介导。另外，AR在分离的肝细胞中诱导TGFα和CT-1两种存活介质(survival mediator)的表达。
同样，发明人已经能够证实，向用特异性活化Fas配体受体的抗体Jo2、或用CCl4造成急性肝损伤这两个临床相关肝损伤模型((4)，(15)Galun，E.，和Axelrod，J.H.2002.The role of cytokines in liverfailure and regenerationpotential new molecular therapies.Biochim.Biophys.Acta.1592345-358)的小鼠体内施用AR，对肝组织提供明显的保护并抑制细胞凋亡。因此，发明人的发现揭示了AR在肝中的新功能，该功能反映其在严重肝损伤或损害的情况下降低肝细胞损伤的治疗性效用。
上述注释反映了双调蛋白在与人类急性肝损伤具有相关性的肝细胞损伤模型中的肝保护性质及其促有丝分裂作用。
可以将AR作为注射剂通过肠胃外途径施用，且优选通过静脉内途径，尽管还可以皮下或肌内施用AR。
可以通过将AR与缓冲剂、稳定剂、防腐剂、加溶剂、增强剂(tonicagent)和/或悬浮剂混合而常规获得肠胃外施用形式。为了避免对AR分子中发现的二硫键的作用，制剂不应包含能够修饰(还原)这些二硫键的成分。使用已知技术将该组合物灭菌，并为施用包装为注射剂。
可能的缓冲剂包含以有机磷酸酯为基础的盐。
加溶剂的实例为用聚氧乙烯固化的蓖麻油、聚山梨醇酯80、烟酰胺和聚乙二醇(macrogol)。
可以使用亚硫酸钠或偏亚硫酸钠(metasodium sulfite)作为稳定剂，且使用山梨酸、甲酚、对甲酚等作为防腐剂。作为优选的施用形式，可注射组合物可以是溶液、乳剂或无菌分散体(dispersion)。通过与一种或多种赋形剂一起在注射用水中的AR溶解、乳化或分散来制备所述可注射制剂。
在可以形成用于皮下施用的可注射制剂的部分的赋形剂中，依赖于具有或不具有缓冲潜能的组织中的注射，并依赖于一种或多种活性物质在生理pH的稳定性，可以提到缓冲剂。在缓冲剂中，可以提到调节溶液，例如柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸-乙酸钠、以及碳酸氢钠-碳酸钠等。
其他任选的赋形剂是灭菌剂以避免致热原和/或污染物的存在。
通过皮下途径施用的药物组合物的其他任选成分是一种或多种液体载体试剂，例如水、烃、醇、多元醇、醚、植物油、羊毛脂和甲酮(methyketone)等。
可以设计静脉内或腹膜内注射制剂以允许以一剂或几剂施用每天0.5至1.8mg/kg患者体重，例如每天0.85至1.55mg/kg患者体重，且更具体为每天1至1.5mg/kg患者体重。
附图简述
图1AAR基因在人和实验性肝硬变中的表达，其在来自对照(n＝26)和肝硬变患者(Child-Pugh A肝硬变，n＝7，Child-Pugh B+C肝硬变，n＝22)的肝样品中通过实时聚合酶链反应(RT-PCR)确定。
图1BAR基因在对照大鼠肝和由CCl4诱导的肝硬变肝中的表达，其通过RT-PCR确定(每组n＝6只动物)。
图2AAR基因在对照小鼠和用Jo2抗体或CCl4诱导急性肝损伤后的肝中的表达。实施上述处理后5小时通过RT-PCR评价AR的表达。
图2BAR在用Jo2抗体或CCl4诱导的急性肝损伤中的表达，并通过蛋白质印迹评价。分别在用Jo2和CCl4处理12和24小时后获得肝组织样品。以亲和纯化的和生物素化的抗-AR抗体进行分析。箭标尖端指示AR的不同形式，并显示每组三个代表性样品。用对作为上样对照的肌动蛋白特异的抗体与膜杂交。显示代表性图像。
图3A用AR处理预防由CCl4诱导的急性肝损伤。显示了用CCl4处理的小鼠中的肝组织学和血清转氨酶水平(H&E染色，最初放大倍率X200)。施用CCl4后24小时收集血清和肝组织样品。将值表达为一式三份实施三个实验的平均值±SEM。
图3BAR处理对用Jo2处理的小鼠中肝组织学和血清转氨酶的作用(H&E染色，最初放大倍率X200)。施用Jo2后12小时收集血清和肝组织样品。将值表达为一式三份实施三个实验的平均值±SEM。星号表示与仅Jo2相比P＜0.01。
图3CAR处理对小鼠肝中于Jo2注射后12小时测量的胱天蛋白酶-3活性的作用。将值表达为一式三份实施三个实验的平均值±SEM，且星号表示与仅Jo2相比P＜0.01。
图3DAR处理对对照小鼠-C-肝和Jo2注射后12小时所获肝提取物中活性胱天蛋白酶-3p17亚基和Bcl-xL蛋白质水平的作用。用对作为上样对照的肌动蛋白特异的抗体与膜杂交。显示代表性图像。
图4AAR对原代培养物中小鼠肝细胞的抗细胞凋亡作用。在浓度增加的AR的存在下，通过放线菌素D和Jo2处理诱导细胞凋亡。通过测量释放到细胞质中的单核小体(mononucleosome)和寡核小体(oligonucleosome)的特异性富集而评价细胞凋亡(富集因数EF)。关于在对照肝细胞-C-中获得的那些值将值标准化。将值表达为一式三份实施三个实验的平均值±SEM，且星号表示与Jo2相比P＜0.05。
图4B左图AR(20nM)对用放线菌素D和Jo2处理的培养的小鼠肝细胞中胱天蛋白酶-3活性的作用。将值表达为一式三份实施三个实验的平均值±SEM，且星号表示与用放线菌素D和Jo2处理的细胞相比P＜0.05。右图与左图所述相同的样品中活性胱天蛋白酶-3p17亚基和Bcl-xL蛋白质的蛋白质印迹分析。
图4C培养的小鼠肝细胞中由AR活化抗细胞凋亡信号传导途径。在添加AR(20nM)后不同时间通过蛋白质印迹评价小鼠肝细胞提取物中的Akt、ERK1/2和STAT3磷酸化状态。显示以一式两份实施的三个实验的代表性图像。
图4D在EGF-R抑制剂PD153035(1μM)、MEK1抑制剂PD98059(10μM)或PI-3K抑制剂LY-294002(20μM)的存在下，AR(20nM)对培养的小鼠肝细胞中由放线菌素D和Jo-2诱导的细胞凋亡的作用。将值表达为一式三份实施三个实验的平均值±SEM，且星号表示与Jo2相比P＜0.05。
图5A、5B肝部分切除术(PH)后在大鼠肝(图5A)和小鼠肝(图5B)中的AR基因表达。于PH后不同时间通过实时PCR在残余肝实质中分析编码AR的mRNA的水平。将值表达为三个不同动物的平均值±SEM。实心圆圈对应于肝切除的动物，空心圆圈对应于经受假手术的动物。
图6A培养的大鼠肝细胞中由AR刺激DNA合成。用浓度增加的AR处理肝细胞，并通过确定[3H]胸苷掺合测量DNA合成。显示了TGFβ(8ng/ml)对由AR诱导的DNA合成的作用。将值表达为一式四份实施三个实验的平均值±SEM。一个星号表示与对照相比P＜0.05，且两个星号表示与对照相比P＜0.01。
图6B培养的大鼠肝细胞中由AR刺激EGF-R酪氨酸残基磷酸化。通过蛋白质印迹检测酪氨酸磷酸化的EGF-R和总EGF-R。显示一式两份实施三个实验的代表性图像。
图6C培养的大鼠肝细胞中由AR活化与细胞增殖相关的信号传导途径。在添加AR后不同时间使用特异性抗体通过蛋白质印迹评价大鼠肝细胞提取物中的Akt、ERK1/2和JNK磷酸化状态。显示以一式两份实施的三个实验的代表性图像。
图6D在EGF-R抑制剂PD153035(1μM)、MEK1抑制剂PD98059(10μM)、PI-3K抑制剂LY-294002(20μM)、JNK抑制剂SP600125(20μM)、或p38MAPK抑制剂SB202190(25μM)的存在下，AR(100nM)对大鼠肝细胞中DNA合成的作用。星号表示与仅AR相比P＜0.05。将值表达为一式三份实施三个实验的平均值±SEM。
图7A在用IL-1β(2ng/ml)处理的培养的大鼠肝细胞(实心条)中AR基因于不同时间段期间的表达。通过实时PCR确定AR基因表达。星号表示与对照(空心条)相比P＜0.05。将值表达为一式三份实施三个实验的平均值±SEM。
图7B在用PGE2(10μM)处理的培养的大鼠肝细胞(实心条)中AR基因在不同时间段期间的表达。通过实时PCR确定AR基因表达。星号表示与对照(空心条)相比P＜0.05。将值表达为一式三份实施三个实验的平均值±SEM。
图7C通过RT-PCR作为培养持续时间的函数对大鼠肝细胞中AR基线基因表达的分析。显示代表性图像。
图7D在用编码四种WT1同工型的pCB6质粒的等摩尔混合物、或用等量gutless载体pCB6转染后24小时的培养的大鼠肝细胞中的AR基因表达。通过实时PCR确定AR基因表达。
图8A、8BTGFα(图8A)和CT-1(图8B)基因在用AR处理的肝细胞中于不同时间段期间的表达。将值表达为一式三份实施三个实验的平均值±SEM，并且表达为与对应于各时间点的对照相比的数字倍数增加。星号表示与对照相比P＜0.05。
图9EGF-R、AR、TGFα、EGF和HB-EGF配体基因在对照小鼠-C-肝和用Jo2抗体处理的小鼠肝中的表达。通过RT-PCR确定这些基因的表达。星号表示与对照相比P＜0.01。将值表达为一式三份实施三个实验的平均值±SEM。
试验AR基因表达在肝硬变的人肝中的得到检测，并且在实验性肝损伤中和肝部分切除术后被迅速诱导。由发明人进行的实验以及所获结果的详尽分析显示如下，所述结果为本发明中预期的AR用途提供了科学基础和支持。
慢性和急性肝损伤中诱导的AR基因表达发明人已经显示，在几乎所有肝硬变的人肝测试样品和由CCl4在大鼠中诱导的肝硬变中，转录因子WT1的表达得到诱导(8)。AR是WT1主要转录靶的事实(10)引导发明人检查所述生长因子在肝硬变患者肝中的表达。尽管实时PCR分析(RTi-PCR)在健康人肝中得到几乎不能检测的AR表达水平，但在大约75％的肝硬变患者中观察到高水平的编码AR的mRNA(图1A)。最有重要意义的事实是，AR基因表达水平与对照肝和肝硬变个体中WT1基因表达水平直接相关(r＝0.752，P＜0.001)。与人的数据相符，在大鼠中施用CCl4(图1B)和胆道结扎(未显示)后诱导的实验性肝硬变中，AR表达也增加。
为了确定AR是否能够形成对侵害的部分快速肝反应，在实施单次腹膜内注射CCl4(1μl/g)后、或注射Jo2抗体(4μg/小鼠)后，评价小鼠肝中编码AR的mRNA和蛋白质的水平。图2A显示，编码AR的mRNA的水平在处理开始之后5小时被强烈诱导。用分别施用抗体Jo2或CCl4后12和24小时获得的肝样品实施蛋白质印迹。使用经过亲和纯化并且生物素化的抗-AR抗体，检测到仅存在于经过处理的小鼠肝中的一组蛋白质(图2B)。约50、43、28和19kDa的四个条带与上皮细胞中所述的AR的不同形式一致((22)Brown，C.L.，Meise，K.S.，Plowman，G.D.，Coffey，R.J.，Dempsey，P.J.1998.Cell surface ectodomain cleavage of human amphiregulinprecursor is sensitive to a metalloprotease inhibitor.J.Biol.Chem.27317258-17268)。对应于50和28kDa的条带可能代表锚定到膜上的AR形式，而对应于43和19kDa的条带可能是经过蛋白水解加工的AR的可溶形式(22)。
通过施用AR在小鼠中减弱由CCl4或Fas激活诱导的急性肝损伤为了确定AR是否可以限制肝损伤的程度，发明人已经检查了在继发于用CCl4或抗体Jo2处理后经受急性肝损伤的小鼠中施用AR的作用。CCl4诱导由于细胞、溶酶体和线粒体膜透性改变的肝坏死和细胞凋亡((23)Berger，M.L.，Bhatt，H.，Combes，B.，Estabrook，R.1986.CCl4-induced toxicity in isolated hepatocytesthe importanceof direct solvent injury.Hepatology 636-45.(24)Kovalovich，K.，Li，W.，DeAngelis，R.，Greenbaum，L.E.，Ciliberto，G.，和Taub，R.2001.Interleukin-6 protects against Fas-mediated death byestablishing a critical level of anti-apoptotic hepatic proteins FLIP，Bcl-2，and Bcl-xL.J.Biol.Chem.27626605-26613.(25)Shi，J.，Aisaki，K.，Ikawa，Y.，Wake，K.1998.Evidence of hepatocyteapoptosis in rat liver after the administration of carbon tetrachloride.Am.J.Pathol.153515-525.(26)Kovalovich，K.，DeAngelis，R.A.，Li，W.，Furth，E.E.，Ciliberto，G.，Taub，R.2000.Increasedtoxin-induced liver injury and fibrosis in interleukin-6-deficient mice.Hepatology 31149-159.(27)Czaja，M.J.，Xu，J.，Alt，E.1995.Prevention of carbon tetrachloride-induced rat liver injury by solubletumor necrosis factor receptor.Gastroenterology 1081849-1854)。AST和ALT两者的血清水平在注射CCl4后24小时均略有升高，然而，这种升高在用AR处理的小鼠中明显减弱(图3A)。与此吻合的是，在用AR处理的小鼠中组织学损伤程度降低(图3A)。
血清AST和ALT水平在注射Jo2后12小时显著升高(图3B)。用AR处理强烈抑制了血清转氨酶升高，而且组织病理学分析证实，施用AR几乎完全避免了肝损伤(图3B)。细胞凋亡细胞死亡是由Fas介导的肝损伤中的主要决定因素((5)-(7)，(28)Ogasawara，J.，Watanabe-Fukunaga，R.，Adachi，M.，Matsuzawa，A.，Kasugai，T.，Kitamura，Y.，Itoh，N.，Suda，T.，Nagata，S.1993.Lethal effectof the anti-Fas antibody in mice.Nature 364806-809.(29)Nagata，S.1997.Apoptosis by death factor.Cell 88355-365)。为了证实AR针对由Fas介导的肝损伤的肝保护作用来自抗细胞凋亡活性，发明人测量了小鼠肝提取物中胱天蛋白酶-3的蛋白水解活化及其活性。他们发现，用抗体Jo2处理的小鼠中所检测到的胱天蛋白酶-3活性的诱导通过施用AR而受到强烈抑制(图3C)。使用特异性识别活性胱天蛋白酶-3p17亚基的抗体，发现通过用AR处理避免了胱天蛋白酶-3的破裂-由此提示AR介导的对由Fas诱导的细胞凋亡途径的特异性阻断(图3D)。Bcl-2家族的蛋白质抑制由多种刺激物诱导的细胞凋亡，包括Fas介导的细胞凋亡((30)Shimizu，S.，Eguchi，Y.，Kosaka，H.，Kamiike，W.，Matsuda，H.，Tsujimoto，Y.1995.Prevention of hypoxia-induced cell death by Bcl-2 and Bcl-xL.Nature374811-813.(31)Stoll，S.W.，Benedict，M.，Mitra，R.，Hiniker，A.，Elder，J.T.， ，G.1998.EGF receptor signaling inhibitskeratinocyte apoptosisevidence for mediation by Bcl-xL.Oncogene161493-1499.(32)Lacronique，V.，Mignon，A.，Fabre，M.，Viollet，B.，Rouquet，N.，Molina，T.，Porteu，A.，Henrion，A.，Bouscary，D.，Varlet，P.，Joulin，V.，Kahn，A.1996.Bcl-2 protectsfrom lethal hepatic apoptosis induced by an anti-Fas antibody in mice.Nat.Med.280-86)。注射Jo2抗体后6小时通过蛋白质印迹评价Bcl-xL蛋白质的表达。与仅用抗体Jo2处理的小鼠相比，在用AR和抗体Jo2处理的小鼠肝中，Bcl-xL蛋白质的水平更高(图3D)。
AR对原代培养物中肝细胞的直接抗细胞凋亡作用为了确定AR的体内抗细胞凋亡作用是否能由AR对肝实质细胞的直接作用介导，发明人使用了原代培养物中的小鼠肝细胞。已经报导，暴露于Jo-2抗体的肝细胞在放线菌素D的存在下有效地经受细胞凋亡((5)，(6)，(33)Ni，R.，Tomita，Y.，Matsuda，K.，Ichiara，A.，Ishimura，K.，Ogasawara，J.，Nagata，S.1994.Fas-mediated apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes.Exp.Cell Res.215332-337)。在添加放线菌素D和Jo2抗体前3小时期间，用不同浓度的AR预处理肝细胞。18小时后进行细胞凋亡及相关分子事件的测量。如图4A中所见，AR以剂量依赖性的方式保护肝细胞免于细胞凋亡，因此说明AR在预防由Fas介导的肝细胞凋亡中的直接细胞保护作用。AR介导的细胞保护活性也见于由其他试剂诱导的细胞凋亡，所述试剂例如TNFα加半乳糖胺、冈田酸和转化生长因子β(TGFβ)(数据未显示)。基于AR的抗细胞凋亡作用，发明人发现，由Jo2抗体诱导的胱天蛋白酶-3的蛋白质水解和活化被AR显著抑制(图4B)。他们同样发现，在用Jo2处理的小鼠肝细胞中，抗细胞凋亡蛋白质Bcl-xL由AR处理诱导(图4B)。为了鉴定AR抗细胞凋亡信号传导机制，因为PI-3K/Akt和ERK1/2途径是细胞存活的一般介质而对其进行研究((4)，(6))。用AR处理的培养的小鼠肝细胞显示Akt和ERK1/2磷酸化增加(图4C)。在针对由Fas诱导的肝损伤的保护中涉及的关键信号传导分子是STAT3((34)Shen，Y.，Devgan，G.，Darnell，J.E.，Bromberg，J.F.2001.Constitutively activated Stat3 protects fibroblasts from serumwithdrawal and UV-induced apoptosis and antagonizes theproapoptotic effects of activated Stat1.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.981543-1548.(35)Haga，S.，Terui，K.，Zhang，H.Q.，Enosawa，S.，Ogawa，W.，Inoue，H.，Okuyama，T.，Takeda，K.，Akira，S.，Ogino，T.，等人，2003.Stat3 protects against Fas-induced liverinjury by redox-dependent and-independent mechanisms.J.Clin.Invest.112989-998]。发现AR刺激STAT3的磷酸化(图4C)。
AR活化EGF-R似乎是介导该生长因子对Fas诱导的细胞死亡的抗细胞凋亡作用所必需的。当小鼠肝细胞在添加AR前用EGF-R抑制剂PD153035预处理1小时、而AR提供的保护丧失的时候，这一点便变得明显(图4D)。为了避免细胞凋亡，也证明了AR激活在EGF-R下运转的PI-3K/Akt途径是必需的。PI-3K抑制剂LY294002对由AR所提供的保护的显著抑制作用也显示了这一点(图4D)。然而，MEK1抑制剂PD98059并不干扰AR的抗细胞凋亡作用(图4D)。
AR在肝部分切除术后肝中的表达本发明也检查了三分之二肝部分切除术后小鼠和大鼠肝中的AR表达((1)，(4))。如图5A中可见的，PH前在大鼠肝中不能检测到AR mRNA，尽管在手术后半小时检测到其出现，并且在6小时后达到峰值，随后15至24小时之间表达逐渐降低。有趣的是，在经受假手术(SH)的大鼠中，AR基因的表达在6至15小时后得到瞬时诱导(图5A)。小鼠肝中AR基因的表达也在PH后得到迅速诱导。发现编码AR的mRNA的水平在PH后0.5小时升高，在24和48小时之间达到峰值，并在此后降低(图5B)。AR基因的表达在经受假手术的小鼠中也被诱导，尽管动力学大大快于在大鼠中。在评价的最短时间点(0.5小时)，经受假手术的小鼠表现出与肝切除的动物类似的编码AR的mRNA水平。然而，干预后1小时，与经受切除术的动物相比，经受假手术的小鼠中编码AR的mRNA水平显著降低，而且这种情况在该研究的整个剩余部分持续(图5B)。
在分离的肝细胞中AR介导的DNA合成诱导发明人一旦表明了AR基因的表达在肝损伤和PH中被迅速诱导、且AR可以对肝实质起到保护作用，他们便试图证明AR对于肝细胞也可以具有促有丝分裂行为。
如图6A中可见的，AR在原代培养物中对分离的肝细胞起到纯促分裂原的作用，从而以剂量依赖性的方式刺激[3H]胸苷向DNA中的掺合。AR对DNA合成的作用由TGFβ消除，TGFβ是牵涉在肝再生反应生理性终止中的生长因子(1)。
AR是EGF-R配体，EGF-R配体是在成年动物中由肝细胞大量表达的受体((36)Salomon，D.S.，Brandt，R.，Ciardiello，F.，Normanno，N.1995.Epidermal growth factor-related peptides andtheir receptors in human malignancies.Crit.Rev.Oncol.Hematol.19183-232.(37)Carver，R.S.，Stevenson，M.C.，Scheving，L.A.，和Russell，W.E.2002 Diverse expression of ErbB receptor proteinsduring rat liver development and regeneration.Gastroenterology1232017-2027)。发明人在培养的大鼠肝细胞中检查了AR的细胞内信号传导。用AR处理分离的大鼠肝细胞诱导了EGF-R的快速和瞬时磷酸化(图6B)。对作为肝细胞对生长因子的促有丝分裂应答的主要信号级联放大的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3K)途径进行分析((38)Band，C.J.，Mounier，C.，Posner，B.1999.Epidermal growth factor and insulin-induceddeoxyribonucleic acid synthesis in primary rat hepatocytes isphosphatidylinositol 3-kinase dependent and dissociated fromprotooncogene induction.Endocrinology 1405625-5634.(39)Coutant，A.，Rescan，C.，Gilot，D.，Loyer，P.，Guguen-Guillouzo，C.，Baffet，G.2002.PI3K-FRAP/mTOR pathway is critical forhepatocyte proliferation whereas MEK/ERK supports bothproliferation and survival.Hepatology 361079-1088)。更近地，已显示，c-Jun-N-末端激酶(JNK)的活化显著地有助于PH后的肝细胞增殖((40)Schwabe，R.F.，Bradham，C.A.，Uehara，T.，Hatano，E.，Bennett，B.L.，Schoonhoven，R.，Brenner，D.A.2003.c-Jun-N-Terminal kinase drives cyclin D1 expression and proliferationduring liver regeneration.Hepatology 37824-832)。正如在小鼠肝细胞所观察到的，用AR处理分离的大鼠肝细胞迅速地诱导ERK1/2和Akt的磷酸化(图6C)。另外，发明人观察到应答AR处理的JNK磷酸化(图6C)。
为了评价肝细胞增殖中的AR信号传导，发明人测量了在这些信号传导途径抑制剂存在下用AR处理的大鼠肝细胞中[3H]胸苷向DNA中的掺合。如图6D中可见的，EGF-R酪氨酸激酶活性抑制剂PD153035完全防止了由AR刺激的DNA合成。对于PI-3K抑制剂LY294002观察到类似的抑制程度，而MEK1抑制剂PD98059和JNK抑制剂SP600125将AR的作用降低70％(图6D)。然而，用p38-MAPK抑制剂SB202190处理，对由AR刺激的DNA合成没有表现明显作用(图6D)。
分离的肝细胞中的AR基因表达发明人已经显示，AR在肝组织损伤和再生的不同情况下的肝中得到表达。为了鉴定负责AR诱导的机制，分离了大鼠肝实质细胞，并且在不同条件下检查AR基因表达。首先，评价了例如IL-1β、IL-6、TNFα、HGF和前列腺素E2(PGE2)这些牵涉在肝炎症和再生过程中的不同因子的作用((1)-(4)，(41)Rudnick，D.A.，Perlmutter，D.H.，和Muglia，L.J.2001.Prostaglandins are required for CREBactivation and cellular proliferation during liver regeneration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.988885-8890)。在评价的细胞因子和生长因子中，IL-1β是所发现的刺激AR基因表达的唯一分子(图7A)。基于较早期在结肠癌细胞中的观察((42)Shao，J.，Lee，S.B.，Guo，H.，Evers，M.，和Sheng，H.2003.Prostaglandin E2stimulates thegrowth of colon cancer cells via induction of amphiregulin.CancerRes.635218-5223)，发现用PGE2处理大鼠肝细胞引起AR基因表达的快速诱导(图7B)。已经假定，PGE2介导的AR基因表达的刺激由cAMP/蛋白激酶A(PKA)途径诱导，其作用于AR启动子中的cAMP反应元件(CRE)(42)。与该机制一致，发明人发现cAMP诱导物毛喉萜在分离的肝细胞中启动AR基因的表达(数据未显示)。用不同的氧化应激诱导物(例如过氧化氢和甲萘醌)处理肝细胞，没有表现出对AR基因表达的作用(数据未显示)。
同样可见AR基因表达在培养的肝细胞中得到诱导，而且该作用的大小随着培养时间而增加(图7C)。AR是WT1转录因子的真正靶(10)。发明人已发现，通过实时PCR确定，用编码四种WT1同工型质粒的等摩尔混合物转染肝细胞，引起编码AR的mRNA水平增高。尽管这些数据显示WT1可以在分离的肝细胞中控制AR基因的表达，但在培养的肝细胞中AR的诱导先于WT1的诱导(数据未显示)-从而说明以前鉴定的因子IL-1β和PGE2可能负责AR基因表达在培养的肝细胞中的快速起始诱导。
AR在分离的肝细胞中诱导肝保护和再生介质的表达为了在更深的层次研究作为AR的肝保护作用基础的机制，发明人评价了这种生长因子对于TGFα和向心素-1(CT-1)的表达的作用，TGFα和向心素-1是牵涉在对肝损伤和PH的内源性应答中的关键分子((7)，(43)Bustos，M.，Beraza，N.，Lasarte，J-J.，Baixeras，E.，Alzuguren，P.，Bordet，T.，Prieto，J.2003.Protectionagainst liver damage by cardiotrophin-1a hepatocyte survival factorup-regulated in the regenerating liver in rats.Gastroenterology 125192-201.(44)Webber，E.M.，Fitzgerald，M.J.，Brown，P.I.，Bartlett，M.H.，Fausto，N.1993.Transforming growth factor-αexpressionduring liver regeneration after partial hepatectomy and toxicinjury，and potential interactions between transforming growthfactor-αand hepatocyte growth factor.Hepatology 181422-1431)。分离的大鼠肝细胞的AR处理增加了编码TGFα和CT-1的mRNA的水平(图8A和B)。这些应答强调了AR作为肝营养因子(hepatotrophic factor)的适当性(relevance)。
EGF-R配体在Fas介导的急性肝损伤中的表达除了AR之外，EGF-R可以由包括肝素结合EGF型生长因子(HB-EGF)及EGF和TGFα的配体家族活化((36)，(45)Holbro，T.，Hynes，N.E.2004.ErbB receptorsdirecting key signalingnetworks throughout life.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.44195-217)。为了更深入地评价这些EGF-R配体对于急性肝损伤后快速肝保护和再生反应的相对贡献，发明人检查了它们在用Jo2抗体处理的小鼠中的基因表达特征。如图9所示，通过实时PCR检测对照小鼠肝中的EGF、TGFα和HB-EGF表达，所述对照小鼠肝早先表现出编码AR的mRNA的不可检测的表达水平。施用Jo2抗体后五小时，对应于EGF、TGFα和HB-EGF的mRNA水平显著降低，同时观察到AR基因表达的可评价的诱导。这些发现总体说明，AR是在急性肝损伤早期期间唯一检测到的在小鼠肝中诱导的EGF-R配体。
综上所述，已表明AR基因表达在不同肝损伤模型中得到快速并且一致的诱导，而且外源性施用AR提供了显著的肝保护。
上面的观察清楚并且明确地全面说明，可以将AR视为肝再生这个复杂过程中的一个新的活性参与者。因此，AR可能为处理由急性肝损伤引起的病理状态、尤其强调例如ALF这种严重的状态提供了巨大的治疗潜力。
本发明的实施方案另外通过下列实施例进一步说明本发明，与上述附图组合，所述实施例显示了用于开发本发明的实验方法学。应当理解，本领域技术人员将理解，可以在本发明范围内进行修改和变化。
实施例患者从两组受试者获得肝组织样品(a)对照(n＝26；19名男性；平均年龄50.8岁，18-73岁)，具有最小肝改变。作为消化道肿瘤外科手术的结果(16例)或由于肝功能测试参数的微小改变实施经皮肤的肝活组织检查(10例)而获得组织样品；以及(b)肝硬变(n＝29；24名男性；平均年龄56岁，36-77岁)，8例归因于丙型肝炎病毒(HCV)感染，13例酒精中毒，3例乙型肝炎病毒(HBV)感染，3例自身免疫性肝炎，一例色素沉着病，以及另一例隐原性肝炎。在10名肝硬变患者中出现相关的肝细胞癌(HCC)。该研究由HumanResearch Review Committee of the University of Navarra，Spain许可，并遵照赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)原则。
动物模型遵照University of Navarra关于实验动物使用指导方针进行实验。如别处所述((16)Castilla-Cortazar，I.，Garcia，M.，Muguerza，B.，Quiroga，J.，Perez，R.，Santidrian，S.，Prieto，J.1997.Hepatoprotective effects of insulin-like growth factor I in rats withcarbon tetrachloride-induced cirrhosis.Gastroenterology 1131682-1691)用CCl4在雄性Wistar大鼠中诱导肝硬变。根据Higgins和Andersen的方法((17)Higgins，G.M.，Andersen，R.M.1931.Experimental pathology of liverrestoration of liver of the white ratfollowing partial surgical removal.Arch.Pathol.12186-202.(18)Latasa，M.U.，Bonkaba，A.，García-Trevijano，E.R.，Torres，L.，Rodríguez，J.L.，Caballería，J.，Lu，S.C.，López-Rodas，G.，Franco，L.，Mato，J.M.等人，2001.Hepatocyte growth factor induces MAT2Aexpression and histone acetylation in rat hepatocytes.Role in liverregeneration.FASEB J.10.1096/fj.00-0556fje.(19)Chen，L.，Zeng，Y.，Yang，H.，Lee，T.D.，French，S.W.，Corrales，F.J.，García-Trevijano，E.R.，Avila，M.A.，Mato，J.M.，和Lu，S.C.2004.Impaired liver regeneration in mice lacking methionineadenosyltransferase 1A.FASEB J.18914-916)对雄性Wister大鼠(150g)和雄性C57/BL6小鼠(20g)实施三分之二的PH或假手术。镇静后，在假手术的动物中将肝暴露，然后送回腹腔。通过单次腹膜内注射CCl4(溶于橄榄油中的1μl/g体重)(Sigma，St.Louis，MO，美国)或Jo2单克隆抗体(溶于盐溶液中的4μg/小鼠)(BDPharMingen，San Diego，CA，美国)在雄性C57/BL6小鼠(20g)中诱导急性肝损伤(每种条件和时间点n＝3-5)((5)，(20)Martínez-Chantar，M.L.，Corrales，F.J.，Martínez-Cruz，A.，García-Trevijano，E.R.，Huang，Z.Z.，Chen，L.X.，Kanel，G.，Avila，M.A.，Mato，J.M.，Lu，S.C.2002.Spontaneous oxidative stressand liver tumors in mice lacking methionine adenosyltrahsferase 1A.FASEB J.10.1096/fj.02-0078fje)。对照接受等体积的橄榄油或盐溶液。在指出的情况中，小鼠在Jo2抗体之前6和0.5小时及之后3小时，或CCl4之前0.5小时及之后12小时接受人重组AR(9.5μg/小鼠)(Sigma)的腹膜内注射。在所示时间点，使小鼠经过血液取样，且如别处所述((16)和(21)Lasarte，J.J.，Sarobe，P.，Boya，P.，Casares，N.，Arribillaga，L.，López-Díaz of Cerio，A.，Gorraiz，M.，Borrás-Cuesta，F.，Prieto，J.2003.A recombinant adenovirusencoding hepatitis C virus core and E1 proteins protects mice againstcytokine-induced liver damage.Hepatology 37461-470)对血清分析丙氨酸和天冬氨酸转氨酶(ALT和AST)。将小鼠通过颈脱位法处死，并将肝迅速冷冻于液氮中、或固定于福尔马林中并包埋在石蜡中用于用苏木精和曙红(H&E)染色。
大鼠和小鼠肝细胞的分离、培养和处理如别处所述((18)，(20))通过灌注胶原酶(Gibco-BRL，Paisley，英国)从雄性Wistar大鼠(150g)和C57/BL6小鼠(20g)分离肝细胞。将细胞(每孔5×105个细胞)接种到用胶原(I型胶原，Collaborative Biomedical，Bedford，MA，美国)包被的6孔板上。将培养物维持在补加了10％胎牛血清(FCS)、非必需氨基酸、2mM谷氨酰胺和抗生素(均由Gibco-BRL供应)的MEM培养基中。温育2小时后，去除培养基，并将细胞在含有5％FCS的相同培养基中再次培养。可适用时，用Roche(Mannheim，德国)的IL-1β或TNFα、Calbiochem(San Diego，CA，美国)的HGF或毛喉萜、RD Systems(Wiesbaden-Nordenstadt，德国)的IL6、或Alexis QBiogene(Carlsbad，CA，美国)的PGE2处理肝细胞。
如别处所述(5)，通过用0.5μg/ml的Jo2抗体和0.05μg/ml的放线菌素D处理，在培养的小鼠肝细胞中诱导细胞凋亡。可适用时，在添加Jo2抗体和放线菌素D之前6小时用AR处理肝细胞。使用Cell Death Detection Assay(Roche)，通过确定可溶性组蛋白-DNA复合体来评价细胞凋亡。按照厂商说明书实施ELISA测试以确定细胞死亡。以对应于处理的细胞和对照细胞的样品的吸收值之间的比率计算释放到细胞质中的单核小体和寡核小体的特异性富集(富集因数，EF)。也在MEK1抑制剂PD98059、PI-3K抑制剂LY-294002、以及EGF-R酪氨酸激酶活性抑制剂PD153035(均由Calbiochem供应)存在下评价AR对由Fas介导的细胞凋亡的影响。
DNA合成的评价对于DNA合成，将大鼠肝细胞以3×104个细胞/孔的密度铺平板到用处于补加了10％FCS的MEM培养基中的胶原包被的96孔板中。铺平板后五小时，更换培养基，并将细胞在无血清存在下维持另外20小时。用AR处理30小时后测定DNA合成。添加AR后22小时施加[3H]胸苷脉冲(1μCi/孔)(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，美国)。收获细胞，并以闪烁计数器确定胸苷掺合。在MEK1抑制剂PD98059、PI-3K抑制剂LY-294002、p38 MAPK抑制剂SB202190、JNK抑制剂SP600125、以及EGF-R酪氨酸激酶活性抑制剂PD153035(均由Calbiochem供应)存在下评价AR对DNA合成的作用。
大鼠肝细胞的瞬时转染在分离后24小时使用TfxTM-50试剂(Promega，Madison，WI，美国)根据厂商说明书转染原代培养物中的大鼠肝细胞。用编码WT1四种同工型的pCB6质粒(以存在或不存在外显子5和KTS为特征)的等摩尔混合物、或者用等量的gutless pCB6载体转染细胞，所述载体由Jochemsen博士(Leiden University Medical Center，Leiden，荷兰)惠赠。使用区别同工型的特异性引物通过RT-PCR分析监控四种WT1同工型的等摩尔混合物的转染功效。
RNA分离及基因表达分析使用TRI试剂(Sigma)提取总RNA。在反转录之前用DNA酶I(Gibco-BRL)处理2μg RNA，其中在RNase OUT(Gibco-BRL)存在下使用M-MLV酶(Gibco-BRL)用于反转录。使用各cDNA制剂的1/10用于各PCR反应。将PCR产物在2％琼脂糖凝胶中进行电泳，随后用溴化乙锭染色，并使用Molecular Analyst软件(Bio-Rad，Hercules，CA，美国)定量。将数据关于β-肌动蛋白基因表达水平标准化。该研究仅包括那些具有与β-肌动蛋白扩增相当的mRNA扩增的样品。所有引物均经过设计以区别基因组DNA和cDNA之间的扩增，而且所有产物均经过测序以确认特异性。使用的引物如下描述于表I中
表I
使用iCycler(BioRad)和iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)实施实时PCR。为了监控PCR终产物的特异性，通过融合曲线和电泳分析后者。将各转录物的量表示为与参照基因(β-肌动蛋白)表达相比的n-倍差异(2ΔCt，其中ΔCt表示靶基因和对照基因之间阈值循环中的差异)。
胱天蛋白酶-3活性的测量使用胱天蛋白酶-3/CPP32比色测定试剂盒(Bio Vision，PaloAlto，CA，美国)测定小鼠肝细胞和肝组织裂解物中的胱天蛋白酶-3活性。将培养物中的细胞(每条件5×105)在相应处理后直接在随试剂盒提供的裂解缓冲液中裂解。使用Dounce匀浆器在裂解缓冲液中将肝组织匀浆，随后于15000rpm离心10分钟。按照厂商说明书将细胞裂解物和肝匀浆物的上清液(溶于50μl中的200μg)用于胱天蛋白酶-3活性的测量。
蛋白质印迹如别处所述将来自肝样品和分离的肝细胞的匀浆物进行蛋白质印迹分析((19，(20))。使用的抗体为特异性靶向鼠AR的亲和纯化和生物素化的多克隆抗体(BAF989)(RD Systems)；活性胱天蛋白酶-3p17亚基(9664S)、磷酸化的Akt(Ser473)(9271S)和磷酸化的STAT3(Tyr705)(9131S)的特异性抗体(Cell Signaling，Beverly，MA，美国)；ERK1/2(06-182)、磷酸化的EGF-R(Tyr1173)(05-483)和STAT3(06-596)(Upstate Biotechnology，Charlottesville，VA，美国)。所有其它抗体均来自Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz，CA，美国)BclxL(sc8392)、Bc12(sc7382)、EGF-R(sc-03)、磷酸化的ERK1/2(Tyr204)(sc7383)、Akt(sc5298)、JNK(sc571)以及磷酸化的JNK(Thr183/Tyr185)(sc6254)。
统计学分析使用独立斯氏t-检验和方差分析(ANOVA)将表现正态分布的数据进行组间比较。使用Kruskal-Wallis和Mann-Whitney检验比较非正态分布的数据。通过Spearman或Pearson相关系数评价相关性。认为P＜0.05的值是显著的。将数据表示为平均值±SEM、或者表示为中位值和四分位数的间距。
序列表<110>PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA，S.L.
<120>双调蛋白作为保护剂在急性肝损伤中的用途<130>Proyecto de Biomedicina CIMA<140>
<141>
<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>17<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1agcctcgcct ttgccga 17<210>2<211>17<212>DNA<213>小鼠<400>2actgcgcttc ttgccgc 17<210>3<211>17<212>DNA<213>大鼠<400>3caacctcctt gcagctc 17<210>4<211>22<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)
<400>4catgctgtga gttttcatgg ac 22<210>5<211>20<212>DNA<213>小鼠或大鼠<400>5ctgctggtct taggctcagg 20<210>6<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>6gtctggaaga ccaccagact g21<210>7<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>7ccctggatcc tattactgca c21<210>8<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>8atgaagctgc tgccgtcggt g21<210>9<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>9gcccagattc ccacactcag 20<210>10
<211>25<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>10cgtttctcac tggtctcaga tgccg25<210>11<211>15<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>11ctggtgcctg gggcg 15<210>12<211>17<212>DNA<213>小鼠<400>12catgacgccc tggtgtc 17<210>13<211>15<212>DNA<213>大鼠<400>13ctggtgccta gggcg 15<210>14<211>20<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>14ctgtcgctct tgatactcgg 20<210>15<211>21<212>DNA<213>小鼠或大鼠
<400>15ccaggttctc gatgtatctg c21<210>16<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>16agccgctcgg acaccggtag c21<210>17<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>17gaaagcaatc acattcccag g21<210>18<211>24<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>18tggatgcagt agtccttgta tttc 24<210>19<211>17<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>19aggacagcca gggccac 17<210>20<211>21<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>20ggaatcagat gaacttagga g2权利要求
1.双调蛋白的用途，其特征在于所述双调蛋白用于制备治疗急性肝损伤的药物。
2.根据权利要求1的双调蛋白的用途，其特征在于该药物可用于增强肝组织对急性肝损伤的原发内源性保护反应。
3.根据权利要求1的双调蛋白的用途，其特征在于该药物可用于促进肝细胞中的DNA合成。
4.根据权利要求1的双调蛋白的用途，其特征在于该药物可用于预防急性肝损伤患者肝组织中的肝细胞死亡。
5.根据权利要求1的双调蛋白的用途，其特征在于该药物可用于刺激任何病因的急性肝损伤后残余肝实质的再生。
6.根据权利要求1的双调蛋白的用途，其特征在于该药物可用作任何病因的急性肝损伤患者的肝保护药物。
7.根据权利要求1的双调蛋白的用途，其特征在于该药物可用于刺激肝部分切除术后的肝再生。
8.根据权利要求1的双调蛋白的用途，其特征在于该药物可在活体或尸体肝移植患者受体中用作肝保护药物和肝细胞再生刺激物。
全文摘要
本发明涉及双调蛋白在药物生产中的用途，所述药物可以用于治疗急性肝损伤，并且为了例如促进肝组织中抗急性肝损伤的原发内源性保护反应、促进肝细胞DNA合成、预防急性肝损伤患者肝组织中肝细胞死亡、刺激任何病因的急性肝损伤后残余肝实质的再生以及刺激肝部分切除术后肝再生而施用所述药物。根据本发明，将双调蛋白作为肝保护药物施用于任何病因的急性肝损伤患者，和/或作为肝保护药物和肝细胞再生刺激物施用于来自活供体或尸体供体的肝移植受体。
文档编号C07K14/485GK101031585SQ200580031448
公开日2007年9月5日 申请日期2005年6月21日 优先权日2004年7月20日
发明者M·A·阿威拉扎拉戈扎, E·鲁茨贾西阿－特雷威贾诺, C·贝拉萨因－拉萨特, J·普里托瓦尔图纳 申请人:西马生物医学计划公司