专利名称：使用电催化嵌入剂测定核酸的制作方法
技术领域：
本申请一般地涉及用电催化嵌入剂(intercalator)检测核酸的生物传感器。
背景技术：
基于核酸的生物传感器具有从基因分型到分子诊断范围的潜在应用。基于荧光的技术提供高密度核酸阵列用于分析特异性核酸序列和基因表达。虽然被广泛应用，但是这些阵列需要标记靶核酸样品。因此，已经建议将电化学传导法用于核酸杂交事件的超灵敏检测。使用电化学技术代替荧光可以允许检测器更简易更小。选择性地并灵敏性地直接检测核酸的能力已经成为电化学研究的重要目标。
发明内容
因此，本发明人成功地设计了用于检测样品中核酸的生物传感器的新策略。这种策略基于用于超灵敏核酸检测的新的核酸嵌入剂的合成和分析应用。
在多种实施方案中，本发明提供式I的核心化合物L1-D-L2(I)其中D是二价环状基团。L1和L2各自独立地是连接基团，所述连接基团包含具有约3到约20个非氢原子的有机胺、脂肪族氨基和含氮部分。
在进一步的实施方案中，本发明还提供包含式I的核心化合物的电催化嵌入剂，所述式I的核心化合物与式II的过渡金属化合物相结合
其中M是可以与氮形成配位键的金属元素。R和R’是在其氮原子上与M配位的含氮有机部分。Z是卤素原子和m是+1、+2、+3、+4、+5或+6。X是平衡m的阴离子或阴离子组合。在一个优选的实施方案中，金属元素是钌。
在多种进一步的实施方案中，本发明还提供用于制备上述电催化嵌入剂的方法。所述方法包括使式I的核心化合物与式II的过渡金属化合物相接触以在核心化合物和过渡金属化合物之间形成金属-氮配位键。
本发明还提供利用上述电催化嵌入剂进行核酸电催化检测的方法。在多个实施方案中，所述电催化嵌入剂与包含靶核酸的复合物相接触以将所述电催化嵌入剂嵌入该复合物中。
在进一步的实施方案中，本发明还涉及包含电催化嵌入剂的试剂盒，以及利用这种电催化嵌入剂进行核酸电催化检测的生物传感器。
技术人员应当理解下述附图仅仅是为了举例说明的目的。所述附图不希望以任何方式限制本发明教导的范围。
图1举例说明PIND在CDCl3中的质子核磁共振(1H NMR)谱(300MHz)。
图2举例说明用电喷雾离子化模式对PIND进行质谱检测。
图3举例说明Ru(bpy)2Cl2(迹线1)、PIND在乙二醇中回流30分钟后的Ru(bpy)2Cl2(迹线2)、和纯化的PIND-Ru(迹线3)的循环伏安图，其中(迹线3)的支持电介质是PBS并且电势扫描速率是100mV/s。
图4举例说明纯化的PIND-Ru在PBS中的循环伏安图，其中从伏安图最内部到最外部的电势扫描速率是100(迹线1)、200(迹线2)、300(迹线3)、400(迹线4)和500(迹线5)mV/s。
图5举例说明(A)作为0(迹线1)、25(迹线2)、50(迹线3)和100(迹线4)μM的增加浓度的鲑精DNA(碱基对)的函数，25μMPIND-Ru的紫外-可见光谱；(B)PIND-Ru对包含序列5′-AATTT-CCCCC-AAATT的发夹寡核苷酸的荧光嵌入剂置换滴定曲线。
图6举例说明(A)200nM聚(T)40(迹线1)、和分别与其互补CP包被电极杂交的200nM聚(AT)20(迹线2)、聚(AG)20(迹线3)和聚(G)40(迹线4)的循环伏安图；(B)p53核酸杂交的生物传感器在PBS中的第一(迹线1)和第五(迹线2)电势循环，其中电势扫描速率是100mV/s。
具体实施例方式
根据本发明，申请人已发现新的电催化嵌入剂，其插入核酸的碱基对之间并在加电化学势差之后催化核苷酸的氧化。本发明的嵌入剂包含有助于嵌入剂电催化性质的多种部分。申请人已经发现本发明的电催化嵌入剂选择性掺入双链核酸中并且高效电催化作用提供灵敏的非标记测定或检测靶核酸的通用平台。
例如，穿线型(threading)嵌入剂是一组与双链核酸可逆性相互作用的重要化合物。穿线型嵌入剂具有共同的结构特征，例如，存在平面多芳香体系，其结合插入双链DNA的碱基对之间。不受任何具体理论约束，在本发明的电催化嵌入剂嵌入双链核酸中之后，在电极处检测到电子流，其中所述电催化嵌入剂氧化核苷酸并且电子从核苷酸转移到生物传感器/电极。不限制本发明的应用、功能或组合物，所述电催化嵌入剂在电化学势差现象后氧化核苷酸。在催化循环中，嵌入剂被电极氧化，其能从核苷酸移除电子而形成自由基阳离子，所述自由基阳离子脱质子并经历进一步反应。因此该反应是催化性的并通过一系列反应消耗核酸，这些反应直接从核酸移除电子并将它们转移到电极，产生可检测的电流。
在一个实施方案中，本发明提供具有对应于式(I)的结构的核心化合物L1-D-L2(I)式(I)中，D代表可具有一个或多个取代基的二价环状基团。该二价环状基团优选包含平面环状基团。二价环状基团的非限定性实例包括在其两个氮原子上具有两个键合位点的萘二酰亚胺基、在2-和6-位或1-和5-位(优选2-和6-位)具有两个键合位点的蒽基、以与蒽基中相同方式具有两个键合位点的蒽醌基、在2-和6-位具有两个键合位点的芴基、在2-和6-位具有两个键合位点的亚联苯基、在2-和7-位具有两个键合位点的菲(phenantholene)基、和在2-和7-位具有两个键合位点的芘基。优选的环状基团是在其两个氮原子上具有两个键合位点的萘二酰亚胺基。二价环状基团的取代基的非限定性实例包括卤原子(例如氯(Cl)或溴(Br)，或具有1到6个碳原子的烷基如甲基、乙基或正丙基)。
在一个优选实施方案中，D是核酸嵌入剂。嵌入剂是可以在双链核酸例如DNA/DNA或DNA/RNA杂合体的碱基对之间滑动的分子。优选地，所述嵌入剂包含萘二酰亚胺基。在一个优选实施方案中，所述嵌入剂包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
上述的式(I)中，L1和L2各自独立地是连接基团，所述连接基团包含具有约3到约20个非氢原子的有机胺、脂肪族氨基，还包含可提供金属-氮配位键的含氮部分。在一个优选实施方案中，含氮部分是含有至少一个氮原子的杂环。适宜的含氮部分的非限定性实例包括咪唑、苯并咪唑、吡咯、吡唑、三唑、苯并三唑、吡啶、哒嗪、吡嗪、嘧啶和三嗪。所述杂环的一个氮可以与金属形成配位键。优选的含氮部分是咪唑。当含氮部分是杂环时，所述脂肪族氨基优选在附着至所述环的烷基上。所述烷基可以是直链或支链的并通常含有约1到约20个碳原子，优选约2到约12个碳原子，更优选约3到约6个碳原子。优选的连接基是3-氨基丙基咪唑。
在另一个实施方案中，具有对应于上述式(I)的结构的化合物是电催化嵌入剂的一部分。在一个优选实施方案中，所述电催化嵌入剂包含键合到式(II)的过渡金属化合物的式(I)的化合物 其中M是与氮形成配位键的金属元素。R和R’是在其氮原子上与M配位的含氮有机部分。Z是卤原子和m是+1、+2、+3、+4、+5或+6。X是平衡m的阴离子或阴离子组合。
式II中，适于用作M的金属元素包括，例如钌(Ru)、锇(Os)、锌(Zn)、铁(Fe)、铑(Rh)、铼(Re)、铂(Pt)、钪(Sc)、钛(Ti)、钒(V)、镉(Cd)、镁(Mg)、铜(Cu)、钴(Co)、钯(Pd)、铬(Cr)、锰(Mn)、镍(Ni)、钼(Mo)、钨(W)、铱(Ir)及其混合物。在一个优选的实施方案中，金属元素M是过渡金属钌(Ru)。
式II的R和R’可以相同或不同，并且在其氮原子上与金属元素配位。R、R’或两者同时可以是例如2，2’-联吡啶基；用一或多个取代基取代的2，2’-联吡啶基，所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和用一或多个C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基和用一或多个取代基取代的1，10-菲咯啉基，所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和用一或多个C1-C4烷基取代的苯基。优选地，R和R’中至少一个是2，2’-联吡啶基。
在另一个实施方案中，R和R’中至少一个并优选都是2，2’-联吡啶基或1，10-菲咯啉基，其中任一个任选地可以被取代。当联吡啶基或菲咯啉基被取代时，取代基优选地选自C1至C4烷基、苯基和进一步用C1-C4烷基取代的苯基，更优选C1-C2烷基。取代的联吡啶基或菲咯啉基配基可以是单取代的、二取代的或更高取代的。在多个实施方案中，可以使用二取代的配基，包括例如4，4’-二取代-2，2’-联吡啶基、5，5’-二取代-2，2’-联吡啶基、1，10-菲咯啉基、4，7-二取代-1，10-菲咯啉基和5，6-二取代-1，10-菲咯啉基。
当R和R’中仅一个是联吡啶基或菲咯啉基、或者以上讨论的任选取代基团之一时，另一个优选地选自含有两个能与金属M形成配位键的氮原子的脂肪族配基。非限定性实例包括1，3-丙二胺、1，4-丁二胺及其衍生物，其中所述衍生物基于1，3-丙二胺或1，4-丁二胺骨架，所述骨架任选地用烷基、芳基或其它基团取代，这些基团不干扰氮元素与金属M的配位键合或者不干扰所述配合物的电化学活性。
式II中，Z是卤原子。在一个优选的实施方案中，Z是氯或溴，并且更优选氯。上标m是+1、+2、+3、+4、+5或+6，取决于M的氧化态。在一个优选的实施方案中，例如，当M是+4氧化态的钌时，Z是氯并且m是+3。X是平衡所述阳离子的形式电荷m的阴离子或阴离子组合。例如，X可以是，但不限于，氯、溴、碘、氟、四氟硼酸、高氯酸、硝酸、硫酸、碳酸或亚硫酸。
在一个优选的实施方案中，本发明的电催化嵌入剂包含键合到式(II)化合物的式(I)化合物，其中D是1，4，5，8-萘四羧酸二酐，L1和L2各自是3-氨基丙基咪唑，M是钌，R和R’各自是2，2’-联吡啶基，并且Z是氯。更优选地本发明的电催化嵌入剂包含式
本发明还提供制备上述电催化嵌入剂的方法。在本发明的一种优选方法中，通过通式(I)的核心化合物与通式(II)的过渡金属化合物之间的配基交换来制备所述电催化嵌入剂。本文描述的过渡金属化合物包含填充配基Z，在配基交换条件下，所述填充配基Z帮助形成与金属的稳定配合物并且可被所述连接基置换。优选的连接基包含提供与金属的金属-氮配位键的含氮部分。在一个优选的实施方案中，金属是钌，Z是氯，并且连接基是3-氨基丙基咪唑。
本发明的电催化嵌入剂可以用于检测样品中的靶核酸。在非限定性实例中，在固相载体如电极的表面形成包含核酸和电催化嵌入剂的配合物并检测电子转移。根据本发明，电催化嵌入剂插入到包含与互补探针分子杂交的靶核酸的双链核酸的碱基对之间。不限制本发明的机理、功能或应用，这些方法利用核苷酸的电化学氧化。在插入双链核酸中并在适当的电化学势差时，所述电催化嵌入剂可以氧化核苷酸，优选鸟嘌呤。不受特定的理论约束，在催化循环中，嵌入剂被电极氧化，其能从核苷酸移除电子以形成自由基阳离子，所述自由基阳离子脱质子并经历进一步反应。该反应是催化性的并通过一系列反应导致核酸的消耗，所述反应直接从核酸移除电子并将它们转移到电极，从而产生可检测的电流。
在一个实施方案中，通过靶核酸与探针杂交，其中所述探针或被固定在电极表面或能结合到电极表面，在所述电极表面形成包含靶核酸和电催化嵌入剂的配合物。适宜的探针可以包含核酸，所述核酸包含与靶核酸的特定序列互补的单链区。待检测的靶核酸可以包含核酸，如所指出，其可以是单链或双链核酸，或含有双链或单链序列的部分。如果靶核酸仅包含双链核酸，应当理解在靶核酸与互补探针杂交之前需要变性。
靶核酸可以是DNA(或基因组或eDNA)、RNA或杂合体，其中核酸含有脱氧核糖-和核糖-核苷酸的任意组合和碱基的任意组合，包括例如，尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷(inosine)、黄嘌呤(xathanine)、次黄嘌呤(hypoxathanine)等等。靶核酸与探针例如可以通过杂交结合。
通常，探针可以包含，例如，寡核苷酸，包括DNA、mRNA、rRNA、tRNA、肽核酸(PNAs)或表达序列标签(ESTs)。可以从DNA或其片段得到探针，可以通过从活体提取、限制酶切割、电泳分离和热处理或碱处理变性得到所述DNA或其片段。所述探针也可以化学合成。还可以用替代性碱基合成所述探针，所述替代性碱基取代探针链中的鸟嘌呤(即，如鸟嘌呤一样，与核酸双链中胞嘧啶的亲和力大于与其它碱基的亲和力的碱基)，但在合适反应条件下不被所述电催化嵌入剂氧化。替代性碱基的实例是肌苷(inosine)和7-去氮杂-鸟嘌呤。
适于制备所述探针的碱基可选自天然或非天然或“合成”核苷酸碱基。天然核苷酸碱基可以是，例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶。探针还可以从非天然或“合成”核苷酸碱基制备，例如7-去氮杂-鸟嘌呤、8-氧-鸟嘌呤、6-巯基鸟嘌呤、4-乙酰胞苷、5-(羧基羟乙基)尿苷、2’-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨基-甲基-2-硫代尿苷(thioridine)、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氢尿苷、2’-O-甲基假尿苷、β，D-半乳糖Q核苷(queosine)、2’-O-甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷(thioridine)、β，D-甘露糖Q核苷(queosine)、5-甲氧羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)N-甲基氨基甲酰)苏氨酸、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸、wybutoxosine、假尿苷、Q核苷(queosine)、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖嘌呤-6-基)氨基甲酰)苏氨酸、2’-O-甲基-5-甲基尿苷、2’-O-甲基尿苷、wybutosine和3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷。可以利用任意寡核苷酸骨架，包括DNA、RNA、修饰糖如碳环、和含有2’取代例如氟和甲氧基的糖。所述寡核苷酸可以是这样的寡核苷酸，其中至少一个或全部核苷酸间桥连磷酸残基是修饰磷酸酯，如甲基膦酸酯、甲基硫代膦酸酯、吗啉代磷酸酯(phosphoromorpholidates)、哌嗪代磷酸酯(phosphoropiperazidates)和氨基磷酸酯(例如，每隔一个核苷酸间桥连磷酸酯残基可以是所述修饰残基)。所述寡核苷酸可以是“肽核酸”如P.Nielsen et al.，Science 254，1497-1500(1991)中描述，其内容通过引用并入本文。唯一的要求是寡核苷酸探针应该具有这种序列，其至少一部分能结合到DNA样品序列的已知部分上。在一些应用中，可能需要将靶核酸样品与许多具有不同碱基序列的寡核苷酸探针相接触(例如，样品中有两种或多种靶核酸，或者在“三明治”测试中单一靶核酸杂交到两个或多个探针上)探针分子可以固定在电极上。在一个优选的实施方案中，探针附着在金电极上。然而，本领域技术人员应当理解可以通过许多本领域公知的技术将探针固定在电极上。使用文献方法，有多种技术可以应用并且是本领域技术人员已知的，用于将探针固定在根据本发明使用的电极表面上。
在非限定性实例中，可以将巯基附着到探针分子例如寡核苷酸或多聚核苷酸的5’-或3’-末端(优选5’-末端)，并且附着的巯基与电极的金原子配位。M.Maeda et al.，Chem.Lett.，1805-1806(1994)和A.Connolly，Nucleic Acids Res.，13，4484(1985)描述了将巯基结合至DNA的方法，其内容通过引用并入本文。在所述固定方法中，将具有巯基末端的探针分子滴到金电极上，然后使之在低温放置几小时以后期望的探针分子就被固定在电极上。
在另一个非限定性实例中，例如使用玻璃碳电极，电极被高锰酸钾氧化而在电极表面产生羧基。在具有羧基的表面上滴加含巯基末端的探针分子，使得形成酰胺键以将探针分子固定在玻璃碳电极的表面上。K.M.Millan et al.，Analytical Chemistry，65，2317-2323(1993)中描述了这种方法的细节，其内容通过引用并入本文。
还可以使用识别对将探针结合到电极上。在此方面，探针可以被修饰以包含识别对的第一成员而电极表面包被第二成员。因此，通过识别对的第一和第二成员的相互作用可以在电极表面形成包含探针/靶核酸杂合体的双链核酸。识别对及其对多种分子的附着是本领域中已知的。在非限定性实例中，识别对由生物素和亲合素组成。
可以在添加嵌入剂之前或嵌入剂存在下进行靶核酸与探针的杂交，优选使用嵌入剂的浓度是几nM到几mM。可以通过本领域技术人员已知的任意合适的方式使靶核酸样品与探针相接触。例如，靶样品可以溶解在溶液中，并通过在允许杂交的条件下将探针溶解在含有靶样品的溶液中来与探针相接触。适宜的条件是本领域技术人员公知的并且包括多种盐浓度条件。作为替代，可以将靶样品溶解在溶液中，而探针固定在在固相载体上，由此通过将具有固定于其上的寡核苷酸探针的固相载体浸在含有靶样品的溶液中，而可以使得靶样品与探针相接触。通过向电极施加电势并检测电流来测定靶核酸与探针的杂交。
本发明的电催化嵌入剂还可以用于检测与探针分子部分地互补的靶核酸片段样品。这种片段样品通常称为“错配片段”。通过比较可能错配的靶核酸片段的检测中得到的峰电流强度与完全互补的靶核酸片段(即完全匹配的片段)的检测中得到的相应峰电流强度，可进行错配片段的检测。
可以根据本领域技术人员已知的任意合适方法检测包括氧化和还原的催化循环。检测与氧化和还原反应相关的电信号允许确定是否存在杂交的探针/靶核酸。可以通过任意适宜的方法进行反应速率测量的步骤。例如，通过比较作为扫描速率、探针浓度、靶浓度、介质、缓冲剂、温度和/或电化学方法的函数的电流来测定相对反应速率。
可以根据本领域技术人员已知的任意适宜的方法检测氧化-还原反应速率。典型地，通过检测与发生氧化-还原反应相关的电信号来检测氧化-还原反应速率。例如，可以通过提供与检测电极电子通讯的合适设备来检测与氧化和还原反应相关的电信号。合适的设备可以检测所产生的电信号，从而提供杂交的探针/靶核酸与电催化嵌入剂反应的氧化-还原反应速率的测量。所述电信号可以具有任意电化学方法的特征，包括循环伏安法、常规脉冲伏安法、计时电流法和方波伏安法，其中循环伏安法是目前优选的形式。
在优选的实施方案中，所述方法用于遗传诊断。例如，寡核苷酸探针可以用于测定靶分析物序列，例如与多种癌症相关的p53基因。另一些非限定性实例包括非息肉性结肠癌基因、BRCAl乳癌基因、ApoE4基因(该基因指示阿尔茨海默病的较大风险，允许容易的症状前筛查患者)、囊性纤维化基因的突变或本领域公知的任意其它基因。
在多个另外的实施方案中，可以用本发明的电催化嵌入剂进行病毒和细菌检测。在该实施方案中，设计探针以检测来自多种细菌和病毒的靶序列。本文公开的方法允许直接筛选临床样品以检测例如HIV核酸序列。此外，作为一种改进的评价抗病毒治疗疗效的方法，这允许直接监测患者内的循环中的病毒。相似地，以此方式可以检测白血病相关病毒、HTLV-I和HTLV-II。还可以检测细菌感染例如结核。
在另一些实施方案中，在例如水和食物样品筛选中有毒细菌的探针。例如，可以处理样品以裂解细菌使得细菌释放其核酸，然后设计探针来识别菌株，包括但不限于致病菌株，如沙门氏菌、弯曲杆菌、霍乱弧菌、大肠杆菌的肠毒性株和军团病细菌。相似地，可以用本发明组合物评价生物治疗策略。
在另一些实施方案中，所述探针可以用于法医学，其中DNA指纹分析用于匹配犯罪现场的靶核酸如DNA来对比从受害者和嫌疑者取得的样品。
靶核酸的来源可以包括例如人、动物、植物或环境。
在另一些实施方案中，本发明还涉及包含电催化嵌入剂的试剂盒。所述试剂盒还可以包含探针，例如本文描述的那些，其可以识别并结合待检测的靶核酸。
在很多另一些实施方案中，本发明还涉及使用本文所述电催化嵌入剂的生物传感器。所述生物传感器可包含一种设备或用于系统中，所述设备或系统包括必要的组件，用于检测和测量一或多种电催化嵌入剂产生的信号。设备可包含包括生物传感器阵列的集成电路，并与电源和检测器相组合。这种集成电路是本领域技术人员已知的。包括所述生物传感器阵列的系统还可以包括在施加跨工作电极的电势之后测量电化学信号的装置。
本文描述的方法和设备使用技术人员公知的实验技术，并可以在实验手册中发现，例如Sambrook，J.，et al，Molecular CloningALaboratory Manual，3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001；Spector，D.L.et al，CellsALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1998；和Harlow，E.，Using AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1999。
本文描述的方法和设备使用技术人员公知的实验技术，并可以在实验手册中发现，例如Sambrook，J.，et al，Molecular CloningALaboratory Manual，3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001；Spector，D.L.et al，CellsALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1998；和Harlow，E.，Using AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1999。
本文使用的标题(例如“背景技术”和“发明内容”)仅仅是为了大致组织本发明公开内的主题，而不是为了限制本发明的公开内容或其任何方面。具体而言，“背景技术”中公开的主题可以包括本发明范围内的技术方面但并不构成现有技术。“发明内容”中公开的主题并不是本发明全部范围或其任意实施方案的穷尽的或全部公开。
本文的参考引用不等于承认那些参考是现有技术或与本文公开的发明的专利性有任何相关性。因此说明书中引用的所有参考以其全部内容经引用并入本文。
说明书和具体实施例，尽管展示了本发明的实施方案，但是仅是为了举例说明的目的，而不是为了限制本发明的范围。然而，具有所列特征的多种实施方案的叙述不是为了排除具有另外特征的其它实施方案、或合并所列特征的不同组合的其它实施方案。具体实施例是为了举例说明如何制备、使用和实施本发明的组合物和方法的目的而提供的；除非另外明确指出，它们不是意图代表已经或未曾实施或测试本发明的所给实施方案。
本文所用的单词“优选”是指在某些情况下提供某些利益的本发明的实施方案。然而，在相同的或另外的情况下，另外的实施方案也可以是优选的。而且，提到一个或多个优选的实施方案并不意味着另外的实施方案不可用，并且没有意图将另外的实施方案排除在本发明范围以外。
本文所用的单词“包括”及其变体意思是非限定性的，例如列表中提到的项目并不排除可以其它类似的项目也可用于本发明的材料、组合物、设备和方法中。
以下描述中，术语“测定”或“检测”将用于表示定性和定量地测定或检测样品中核酸。例如，当以下定义的方法和系统用于测定或检测介质中核酸时，这意味着表示确定介质中核酸的存在和任选地其浓度。因此，短语“确定是否存在”意思包括定性测定和定量测定是否存在所检测事件(例如，DNA杂交、RNA杂交、检测靶核酸等)。
本文所用的术语“嵌入剂”是指能插入和/或堆叠在核酸碱基对之间的平面芳香或杂芳基结构。
本文所用的术语“穿线型(threading)嵌入剂”是指具有取代基或侧链的嵌入剂。
本文所用的术语“电催化嵌入剂”是指可以被电极氧化并且在电化学势差现象之后可以氧化核苷酸的嵌入剂。
本文所用的术语“核酸”是指任意核酸，包括DNA和RNA。本发明的核酸典型地是多聚核苷酸；也就是说，是通过3’，5’磷酸二酯键共价连接的单个核苷酸的聚合物。尽管本发明的方法和设备在本文中有时用DNA来解释，但是这是为了清楚的目的，并且应当理解，本发明的方法和设备可以用于其它核酸例如RNA。
本文所用的术语“互补核酸”是指特异性结合另一个核酸而形成杂交核酸的任意核酸，包括寡核苷酸探针。
本文所用的术语“杂交”是指相互结合的至少两个核酸链，其可以是或不是全部碱基配对。
本文所用的术语“变性”是指一种过程，通过所述过程寡核苷酸双链不再通过氢键碱基配对而是被分成单链分子。变性方法是本领域技术人员公知的并包括热变性和碱变性。
本文所用的术语“电极”是指传导电流进出导电介质的电导体。两个电极，阳极和阴极，分别接受和发射电子。电极通常用于描述导体。在本发明中，电极还可以是很多分离可寻址的电极组成的微阵列，或是超微电极。
本文所用的术语“核苷”是指连接戊糖如核糖、脱氧核糖或其衍生物或类似物的含氮杂环碱基。术语“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，包含含氮杂环碱基、戊糖和一或多个磷酸酯或其它骨架形成基团；它是寡核苷酸的单体单元。核苷酸单元可以包括常见碱基如鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、或其衍生物。戊糖可以是脱氧核糖、核糖或由此取代的基团。
本文所用的术语“核苷酸类似物”、“修饰碱基”、“碱基类似物”或“修饰核苷酸”是指功能与其天然对应物相似但是结构已被改变的部分。
本文所用的术语“寡核苷酸”或“核苷酸序列”是指从天然杂环碱基和呋喃戊糖等价基团通过磷酸二酯键或其它骨架形成基团连接、并以特定序列形成的多个相连的核苷酸单元。
本文所用的术语“寡核苷酸类似物”或“修饰寡核苷酸”是指功能与天然寡核苷酸相似但具有非天然部分的组合物。寡核苷酸类似物或修饰寡核苷酸可以具有改变的糖部分、改变的碱基、同时具有改变的糖和碱基或者改变的糖间连接，这些已知用于本领域中。
本文所用的术语“生物传感器”是指包含检测或测量在氧化或还原反应中所产生电子迁移而产生的信号的必要组件的设备或系统。术语“生物传感器”包括用于测定物质浓度和生物学感兴趣的其它参数的设备，即使并不直接利用生物学系统。
实施例以下实施例是为了举例说明而不是为了限制本发明的范围。
实施例1该实施例举例说明电催化嵌入剂的合成(用Ru(bpy)2Cl2接枝的N，N’-双[1(3-丙基)-咪唑]-1，4，5，8-萘二酰亚胺(PIND)(“PIND-Ru”))。
PIND-Ru的合成如下所述
按1，4，5，8-萘四羧酸二酐(ND)合成的一般步骤制备PIND。将0.30g1，4，5，8-萘四羧酸二酐缓慢加入到3.0ml 3-氨丙基咪唑(AI)和3.0ml四氢呋喃的磁力搅拌的混合物中。控制添加速率使得很少结渣。回流反应混合物24h，然后冷却至室温。接下来，将该反应分散在10ml丙酮/水(3/1)混合物中，然后倒入500ml快速搅拌的无水醚中沉淀所述化合物。通过精细烧结漏斗抽滤来收集沉淀，并用乙醇简单洗涤。从氯仿/乙醇(1/1体积)中结晶进行纯化并在真空和40℃过夜干燥得到0.46g黄色结晶(收率85％)。
通过一步配基交换反应合成PIND-Ru。向Ru(bpy)2Cl2(0.52mmol)在8.0ml新鲜蒸馏的乙二醇溶液中在10分钟时间以小份添加PIND(0.25mmol)，回流所得混合物30到40分钟。通过循环伏安法监测配基交换反应的完成。然后将紫色反应混合物缓慢倒入100ml快速搅拌的KCl饱和的乙醇中。通过精细烧结漏斗抽滤来收集沉淀，并用乙醇简单洗涤。粗产物用PBS洗涤，溶解在3.0-5.0ml乙醇中并再次从KCl饱和的乙醇中沉淀。通过乙醇重结晶进一步纯化沉淀得到78％收率的纯产物。该产物在PBS中在E1/2为0.63V的金电极上显示单对可逆氧化还原波。为了保证在PIND的两个咪唑末端的彻底的双配基交换，需要稍过量的Ru(bpy)2(10-15％)。
用Finnigan/MAT LCQ质谱仪(ThermoFinnigan，San Jose，CA)进行质谱试验。除非另外指出，所有谱图在室温下记录。
质子核磁共振(1H NMR)谱(300MHz CDCl3)δ8.76(4H)，7.54(2H)，7.26(2H)，4.27(4H)，4.12(4H)，2.31(4H)和1.83 9(2H)(图1)。
使用电喷雾离子化质谱(ESI-MS)对PIND进行的质谱试验显示在m/z 483.3和242.3的主峰，对应于PIND+H+，(和(PIND+2H+)/2(图2)，其与期望化合物的分子量具有良好一致性。由于在ESI-MS谱中没有观察到单接枝的PIND，因此我们可以排除任何不完全接枝的PIND。
实施例2该实施例举例说明电活性PIND-Ru嵌入剂的形成和使用循环伏安法的其电化学性质。
在乙二醇中回流期间，每5分钟进行循环伏安试验。图3显示在开始30分钟得到的两个典型的伏安图。由图3中迹线1可见，向Ru(bpy)2Cl2中添加PIND之前，获得中心在0.40V的一对可逆伏安峰，对应公知的Ru(bpy)2Cl2的氧化还原过程。添加PIND时，一对新的伏安峰出现在0.63V，显示PIND-Ru的形成(图3，迹线2)。两个电子转移过程都被清楚地分辨并且具有可逆过程的所有特征，除了稍大的峰-峰电势分离，这主要是由于反应介质的较高iR降。0.63V的伏安峰强度随反应时间逐渐增加。同时，0.40V的峰逐渐变小。回流30到40分钟后，两个氧化还原对都达到稳态。0.40V的小伏安峰指示过量的Ru(bpy)2Cl2。分离并纯化后，如此纯化的PIND-Ru的伏安试验仅显示一对伏安峰，意味着纯化过程是非常有效的(图3，迹线3)。
如图3中迹线3举例说明，PIND-Ru如预期准确地表现溶液中高度可逆的氧化还原对。在0.0和+0.90V之间多次重复电势循环后观察到的变化很小，显示PIND-Ru在溶液中的良好稳定性。低扫描速率下，＜500mV/s，记录了典型的扩散控制的伏安图，正如预期表现理想能斯特行为的单电子交换系统峰电流与电势扫描速率的平方根成比例，峰-峰电势分离非常接近于59mV的理论值并且不依赖于电势扫描速率(图4)。这些结果明确了所有钌氧化还原中心都允许到达电极表面并且进行可逆的非均匀电子转移。
实施例3该实施例举例说明通过PIND-Ru的UV-可见分光光度法测定的PIND-Ru和ds-DNA的相互作用。
研究了在增加量的鲑精DNA存在下，通过PIND-Ru的UV-可见分光光度法测定PIND-Ru和ds-DNA的相互作用模式(图5A)。在Agilent 8453UV-可见分光光度计上记录UV-可见光谱。在UV-可见光谱中，当穿线型嵌入剂的稠环平面芳香体系自身插入到ds-DNA的碱基对之间时，嵌入结合的信号有减色效应并红移。如图5A所示，以DNA碱基对/PIND-Ru比4.0向ds-DNA添加PIND-Ru导致366和387nm处ND吸收带降低40％并红移2-nm。之前观察到具有脂肪族叔胺侧链的萘二酰亚胺(ND)具有类似现象。在DNA碱基对/PIND-Ru比大于4.0时，ND吸收带减色效应达到稳态，并且观察到恒定的减色效应，显示通过优先嵌入ND发生PIND-Ru和ds-DNA的结合。
使用与Boger建议相似的短发夹寡核苷酸，通过竞争试验估计嵌入的稳定性。PIND-Ru的荧光变化对比等价物的分析提供了滴定曲线，从中确定化学计量为1∶1(图5B)。发现通过竞争试验测定的稳定性常数是3.0×107，对应于与ND相比增强约75-倍。稳定性常数增强的似乎合理的解释将是ND基团嵌入ds-DNA后，PIND-Ru中两个阳离子Ru(bpy)2Cl基团与ds-DNA每侧的磷酸形成离子对，使得ND更紧紧地固定在ds-DNA的碱基对之间。
实施例4
该实施例举例说明PIND-Ru在DNA生物传感器中应用。
之前Xie et al.，Anal.Chem.761611-1617(2004)、Xie et.al.Nucelic Acids Res.32，el5(2004)、Xie et al.Anal Chem.764023-4029(2004)和Gao et al.Synth.Met.755-10(1995)中描述了金电极的制备和预处理，所有内容通过引用并入本文。简而言之，捕获探针(CP)吸附之前，将金电极在氧等离子体中暴露5到10分钟，然后立即在无水乙醇中浸20分钟以还原氧化物层。通过将金电极在100μg/ml CP的PBS溶液中浸16到24小时吸附CP单层。吸附之后，用PBS充分漂洗电极并在PBS中浸泡20分钟，再次漂洗，并用空气流吹干。根据steel建议的程序，使用阳离子氧化还原探针进行电化学评价，发现CP的表面密度在1.13-1.30×10-11mol/cm2之间。为了使非-DNA相关的PIND-Ru吸收最小化并提高CP单层的质量和稳定性，将CP-包被的金电极在2.0mg/ml 1-巯基十二烷(MD)的乙醇溶液中浸没4到6小时。漂洗掉未反应的MD分子，将电极在搅拌的乙醇中浸没10分钟来洗涤该电极，随后用乙醇和水彻底漂洗。所述电极经空气干燥后备用。
分三步进行靶DNA的杂交及其电化学检测。首先，将2.5μl份的含有靶DNA的杂交溶液均匀铺展在电极上，并且将该电极在水饱和环境的室中在60℃(低于盐调节熔链温度27℃的低严谨度)维持30分钟。然后在60℃用空白杂交溶液彻底漂洗，并与5.0μl份在杂交溶液中的100μg/ml PIND-Ru在35℃下一起孵育10分钟。PIND-Ru通过穿线型嵌入附着到杂交的靶DNA上。所述电极经空气冷却并在室温下放置10分钟之后，用含10％乙醇的NaCl-饱和磷酸缓冲液(pH7.4)彻底漂洗。伏安法测量电催化氧化电流。低DNA浓度下，每次检测后进行平滑处理以消除随机噪音和电磁干扰。
使用配备低电流模块的CH Instruments model 660A电化学工作站(CH Instruments，Austin，TX)进行电化学试验。该三电极系统由3.0mm-直径的金工作电极、无渗漏-微型Ag/AgCl参比电极(CypressSystems，Lawrence，KS)和铂丝计数电极组成。为了避免样品小滴铺展到3.0-mm直径的工作区以外，将CP固定后在金电极施加图案化的疏水膜。参照Ag/AgCl电极，记录该工作中所有电势。
在第一个杂交试验中，分别将5.0μL份在TE中的200nM聚(AT)20、聚(AG)20和聚(G)40与其对应的互补CP-包被电极杂交。为了对比，用5.0μL份的200nM聚(T)40处理相同组的电极。经杂交，寡核苷酸选择性结合到其互补CP上并固定在电极表面。用杂交缓冲液彻底漂洗，将所有的非杂交相关的寡核苷酸洗掉。在随后与5.0μl份的在杂交溶液中的100μg/ml PIND-Ru一起孵育期间PIND-Ru被带到电极表面。发现用含10％乙醇的NaCl-饱和磷酸缓冲液(pH7.4)进行彻底冲洗除去大多数非-DNA相关的PIND-Ru吸收。
图6A显示杂交后电极的循环伏安图。对于非互补的聚(T)40，杂交后在PIND-Ru氧化还原电势(0.63V)观察到一对小伏安峰(图6A迹线1)，这主要是由于PIND-Ru与电极表面CP的纯静电相互作用。对于互补性聚(AT)20、聚(AG)20和聚(G)40，观察到氧化还原电势的轻微正向迁移并且峰电流大大增加100倍(图6A迹线2、3和4)。与200nM聚(AT)20杂交后观察到的电流0.30μA，因此来自1.3pmol活性和嵌入的PIND-Ru。该数值代表包含在测试小滴内的＜0.50％的PIND-Ru。将1.2×10-11mol/cm2(估计值的中范围)作为表面CP覆盖率并且假设最大PIND-Ru/碱基比率为1/4，则1.3pmol靶DNA被杂交。因此，13％靶DNA和15％的表面结合CP被实际上杂交，这与文献中发现的那些相当。有趣地是，当聚(AG)20和聚(G)40与其对应的互补CP包被的电极杂交时，观察到阳极电流显著增加而阴极电流稍微降低(图6A迹线3和4)。并且随鸟嘌呤含量增加，增加几乎接近线性，显示寡核苷酸中的鸟嘌呤被嵌入的PIND-Ru在0.63V催化氧化。这些结果证明PIND-Ru与ds-DNA选择性相互作用并且PIND-Ru-ds-DNA加合物具有非常慢的解离速率以及高效电催化鸟嘌呤氧化，这为开发超敏DNA生物传感器铺平了道路。
接下来，以mRNA中的全长肿瘤蛋白p53(TP53)基因作为我们的靶基因，评价了PIND-Ru作为电活性指示剂用于直接检测mRNA中癌症易感基因。杂交之前，在70℃将mRNA混合物变性10分钟。具有与TP53互补序列的寡核苷酸被固定在电极表面并作为CP。经过53℃杂交30分钟，混合物中TP53mRNA选择性结合到电极表面。用杂交缓冲液进行彻底漂洗，洗掉所有非-杂交相关的mRNA。
由图6B可见，施加PIND-Ru后电极的典型循环伏安图，在阳极法中观察到相当高的峰电流，显示较多量的电子参与氧化过程，最可能由于捕获的长TP53mRNA分子向电极表面提供了非常大量的鸟氨酸。在接下来的电势循环期间峰电流显著下降，并且在0到0.90V之间5个循环后得到稳态伏安图(图5B迹线2)。对慢扫描速率≤10mV/s下氧化或还原电流峰进行积分，对于电活性Ru2+/Ru3+位点得到3.8pmol的表面覆盖。PIND-Ru总量，1.9×10-11摩尔/cm2，相当于32％的CP被杂交并完全嵌入。为了更好地理解杂交效率和PIND-Ru负载水平，对杂交后以及PIND-Ru嵌入后的TP53进行一系列石英晶体微量天平(QCM)测量。表1总结了该结果
表1.与1.0μg mRNA中TP53杂交后、以及PIND-Ru嵌入后，CP包被的石英晶体振荡器的QCM数据。
如表1所示，约40飞摩尔TP53被杂交。该数值代表约1.6％的表面结合的CP被实际杂交，这比文献中报道的那些短寡核苷酸(20-50聚体)低得多。杂交效率随分析基因长度的增加显著降低，这并不令人惊奇。此外，QCM试验显示TP53的每11到14个碱基嵌入一个PIND-Ru，提示一些PIND-Ru分子嵌入到TP53的二级结构中，这进一步提高该方法的灵敏度。发现PIND-Ru负载密度在1.5-2.2×10-11摩尔/em2范围内，这与在伏安试验中得到的具有良好一致性。
使用从TP53的mRNA转录的纯化的cDNA，并在使用前用TE缓冲液稀释成不同浓度，确立TP53基因定量的动态范围。对于对照试验，在电极准备时使用非互补性CP。发现随cDNA浓度从2.5到350pM，电流呈线性增加，检测限是1.5pM，对应0.60ng/ml。考虑到样品体积，使用建议的方法能成功地检测到甚至少到7.5阿托摩尔的TP53cDNA。对比先前的直接核酸氧化分析的结果，通过使用本发明的催化性穿线型嵌入剂方案，基因组核酸分析的灵敏度大大提高。非标记电化学方法用于直接检测核酸的吸引力在于来自真实世界样品的基因表现出高灵敏度，所述真实世界样品包含许多氧化还原活性单元(鸟嘌呤和嵌入的PIND-Ru)。本文描述的PIND-Ru催化体系的优点是鸟嘌呤和PIND-Ru都在低至0.63V的电势被氧化，此时存在的背景电流很小。而且，具有越多鸟嘌呤的基因给出越敏感的信号。两者的组合实现了皮摩尔检测限并且动态范围达到350pM。由于不脱离本教导的范围对上述方法和组合物可以进行多种改变，其意思是以上描述中包含的所有材料应解释为举例说明而非限制性含义。除非明确声明叙述已经进行的活动(即使用过去时态)，举例说明和实施例不应理解为代表本教导给定的实施方案已经或未曾实施。
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权利要求
1.下式的化合物L1-D-L2其中D是二价环状基团；和L1和L2各自独立地是连接基团，所述连接基团包含具有约3到约20个非氢原子的有机胺、脂肪族氨基和含氮部分。
2.权利要求1的化合物，其中所述二价环状基团包含可以嵌入双链核酸中的部分。
3.权利要求2的化合物，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
4.权利要求1的化合物，其中所述含氮部分提供金属-氮配位键。
5.权利要求1的化合物，其中所述有机胺是3-氨丙基咪唑。
6.包含下式的化合物
7.包含下式的核心化合物的电催化嵌入剂L1-D-L2其中D是二价环状基团；和L1和L2各自独立地是连接基团，所述连接基团包含具有约3到约20个非氢原子的有机胺、脂肪族氨基和含氮部分，所述核心化合物键合到下式的过渡金属化合物上 其中M是可以与氮形成配位键的金属元素；R和R’是在其氮原子处与M配位的含氮有机部分，其中R和R’独立地选自2，2’-联吡啶基；用一个或多个取代基取代的2，2’-联吡啶基，所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和用一个或多个C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基和用一个或多个取代基取代的1，10-菲咯啉基，所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和用一个或多个C1-C4烷基取代的苯基；Z是卤原子；m是+1、+2、+3、+4、+5或+6；和X是平衡m的阴离子或阴离子组合。
8.权利要求7的电催化嵌入剂，其中所述核心化合物通过金属-氮配位键键合到所述过渡金属化合物上。
9.权利要求8的电催化嵌入剂，其中M选自钌、锇、锌、铁、铑、铼、铂、钪、钛、钒、镉、镁、铜、钴、钯、铬、锰、镍、钼、钨、和铱、或其混合物。
10.权利要求8的电催化嵌入剂，其中M是钌。
11.权利要求7的电催化嵌入剂，其中所述有机胺包含3-氨丙基咪唑。
12.权利要求8的电催化嵌入剂，其中Z是氯或溴。
13.权利要求8的电催化嵌入剂，其中所述二价环状基团包含可以嵌入双链核酸中的部分。
14.权利要求13的电催化嵌入剂，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
15.权利要求8的电催化嵌入剂，其中R和R’独立地选自2，2’-联吡啶基、4，4’-甲基-2，2’-联吡啶基、4，4’-乙基-2，2’-联吡啶基、4，4’-苯基-2，2’-联吡啶基、5，5’-甲基-2，2’-联吡啶基、5，5’-乙基-2，2’-联吡啶基和5，5’-苯基-2，2’-联吡啶基。
16.权利要求15的电催化嵌入剂，其中M选自钌、锇、锌、铁、铑、铼、铂、钪、钛、钒、镉、镁、铜、钴、钯、铬、锰、镍、钼、钨、和铱、或其混合物。
17.权利要求16的电催化嵌入剂，其中M是钌。
18.权利要求15的电催化嵌入剂，其中所述有机胺包含3-氨丙基咪唑。
19.权利要求15的电催化嵌入剂，其中Z是氯或溴。
20.权利要求15的电催化嵌入剂，其中所述二价环状基团包含可以嵌入双链核酸中的部分。
21.权利要求20的电催化嵌入剂，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
22.权利要求7的电催化嵌入剂，其中I是1，4，5，8-萘四羧酸二酐，所述有机胺是3-氨丙基咪唑，R和R’中至少一个是2，2’-联吡啶基，M是钌，和Z是氯。
23.包含下式的电催化嵌入剂
24.一种制备电催化嵌入剂的方法，所述方法包括使下式的核心化合物L1-D-L2其中D是二价环状基团；和L1和L2各自独立地是连接基团，所述连接基团包含具有约3到约20个非氢原子的有机胺、脂肪族氨基和含氮部分，与下式的过渡金属化合物相接触 其中M是可以与氮形成配位键的金属元素；R和R’是在其氮原子上与M配位的含氮有机部分，其中R和R’独立地选自2，2’-联吡啶基；用一个或多个取代基取代的2，2’-联吡啶基，所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和用一个或多个C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基和用一个或多个取代基取代的1，10-菲咯啉基，所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和用一个或多个C1-C4烷基取代的苯基；Z是卤原子；m是+1、+2、+3、+4、+5或+6；和X是平衡m的阴离子或阴离子组合，以在所述核心化合物和过渡金属化合物之间形成金属-氮配位键。
25.权利要求24的方法，其中M选自钌、锇、锌、铁、铑、铼、铂、钪、钛、钒、镉、镁、铜、钴、钯、铬、锰、镍、钼、钨、和铱、或其混合物。
26.权利要求25的方法，其中M是钌。
27.权利要求24的方法，其中所述有机胺包含3-氨丙基咪唑。
28.权利要求24的方法，其中Z是氯或溴。
29.权利要求24的方法，其中所述二价环状基团包含可以嵌入双链核酸中的部分。
30.权利要求29的方法，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
31.权利要求24的方法，其中R和R’独立地选自2，2’-联吡啶基、4，4’-甲基-2，2’-联吡啶基、4，4’-乙基-2，2’-联吡啶基、4，4’-苯基-2，2’-联吡啶基、5，5’-甲基-2，2’-联吡啶基、5，5’-乙基-2，2’-联吡啶基和5，5’-苯基-2，2’-联吡啶基。
32.权利要求31的方法，其中M选自钌、锇、锌、铁、铑、铼、铂、钪、钛、钒、镉、镁、铜、钴、钯、铬、锰、镍、钼、钨、和铱、或其混合物。
33.权利要求32的方法，其中M是钌。
34.权利要求31的方法，其中所述有机胺包含3-氨丙基咪唑。
35.权利要求31的方法，其中Z是氯或溴。
36.权利要求31的方法，其中所述二价环状基团包含可以嵌入双链核酸中的部分。
37.权利要求36的方法，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
38.权利要求24的方法，其中I是1，4，5，8-萘四羧酸二酐，所述有机胺是3-氨丙基咪唑，R和R’中至少一个是2，2’-联吡啶基，M是钌，和Z是氯。
39.一种检测核酸的方法，所述方法包括在水性介质中使包含下式核心化合物的电催化嵌入剂L1-D-L2其中D是二价环状基团；和L1和L2各自独立地是连接基团，所述连接基团包含具有约3到约20个非氢原子的有机胺、脂肪族氨基和含氮部分，所述核心化合物键合至下式的过渡金属化合物 其中M是可以与氮形成配位键的金属元素；R和R’是在其氮原子上与M配位的含氮有机部分，其中R和R’独立地选自2，2’-联吡啶基；用一个或多个取代基取代的2，2’-联吡啶基，所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和用一个或多个C1-C4烷基取代的苯基；1，10-菲咯啉基和用一个或多个取代基取代的1，10-菲咯啉基，所述取代基选自C1-C4烷基、苯基和用一个或多个C1-C4烷基取代的苯基；Z是卤原子；m是+1、+2、+3、+4、+5或+6；和X是平衡m的阴离子或阴离子组合，与包含所述核酸的复合物相结合以将所述电催化嵌入剂嵌入所述复合物中；和检测电流，其中所述电催化嵌入剂氧化核苷酸。
40.权利要求39的方法，其中所述核苷酸是鸟嘌呤。
41.权利要求39的方法，其中M选自钌、锇、锌、铁、铑、铼、铂、钪、钛、钒、镉、镁、铜、钴、钯、铬、锰、镍、钼、钨、和铱、或其混合物。
42.权利要求41的方法，其中M是钌。
43.权利要求39的方法，其中所述有机胺包含3-氨丙基咪唑。
44.权利要求39的方法，其中Z是氯或溴。
45.权利要求39的方法，其中所述二价环状基团包含可以嵌入双链核酸中的部分。
46.权利要求45的方法，其中所述部分包含1，4，5，8-萘四羧酸二酐。
47.权利要求39的方法，其中所述方法还包括将探针固定在所述电极上；和提供溶液中所述核酸与电极相接触，其中所述探针和核酸互相杂交。
48.权利要求39的方法，其中所述方法还包括将识别对的第一成员固定在所述电极上；用所述识别对的第二成员标记探针；组合溶液中所述标记探针与所述电极相接触，其中所述探针和核酸杂交形成结合到电极表面的复合物。
49.权利要求39的方法，其中所述电催化嵌入剂是包含下式的化合物
全文摘要
本发明公开了电化学检测核酸的组合物和方法。所述组合物包含与双链核酸结合并氧化核酸的电催化嵌入剂。检测样品中核酸的方法包括形成被电催化嵌入剂结合的双链核酸，其中嵌入剂在电极表面催化核酸的氧化。
文档编号C07F15/00GK101068813SQ200580033568
公开日2007年11月7日 申请日期2005年7月19日 优先权日2004年9月2日
发明者谢虹, 高志强, 谢芳 申请人:新加坡科技研究局