关于血管性血友病因子的适体及其作为血栓形成疾病治疗剂的应用的制作方法

专利名称：：关于血管性血友病因子的适体及其作为血栓形成疾病治疗剂的应用的制作方法
技术领域：
：本发明主要涉及核酸领域，更尤其涉及能结合血管性血友病因子，在血栓形成性疾病和/或其他疾病的诊断和治疗过程中用作治疗剂的适体，在所述血栓形成性疾病和/或其他疾病中，血管性血友病因子调节的血小板凝聚牵连其中。本发明进一步涉及用于结、药肯fe纟吉4、血管'hi血友夕呙因子的适'*的才才4牛禾口方法。
背景技术：
：适体是核酸分子，通过不同于传统的沃森-克里克碱基配对的分子间相互作用对分子具有特异性结合亲和性。适体，如同通过噬菌体显示或单克隆抗体^支术("mAbs")产生的肽一样，能够特异结合选定的目标并调节靶分子的活性或结合相互作用，例如，通过结合的适体可以阻断其耙分子发挥功能性作用。通过从低聚核苷酸随才几序列库中进行体外选择过禾呈发现，得到的适体可以产生超过130种蛋白质，包括生长因子、转录因子、酶、免疫球蛋白和受体。典型的适体大小在10-15kDa(20-45个核苷酸)之间，以纳摩尔到次纳摩尔的亲合力与其耙分子结合，并区分密切相关的其它靶分子(例如，适体一般地不会结合同基因族的其他蛋白质)。一系列的抗体结构研究已经表明，适体能够使用同类的结合相互作用(例如，氢4建键合、静电互补、疏水性接触、空间排斥)，增强抗体-抗原复合物亲合性和专一性。适体在用作治疗剂和-诊断制剂过程中具有许多理想的特征，包括高特异性和亲合性、生物有效性和杰出的药代动力学性质。此外，它们可以提供比抗体及其他蛋白质生物体更优越的特殊的竟争优势，例如1)速度和控制。适体通过完全的体外过程生产，允许最初先导物，包括治疗剂先导物的快速生成。体外筛选过程严格控制了适体的特异性和亲合性，允许先导物，包括针对有毒的和非免疫原的靶分子的先导物的生成。2)毒性和免疫原性。作为一类物质，适体具有已经证明的治疗可接受的毒性和缺乏免疫原性。但是许多单克隆抗体的功效由于其自身与抗体的免疫反应而大大受到限制，得到关于适体的抗体是非常困难的，这很可能是因为适体不能由T-cells通过MHC(主要组织相容性复合体)产生，且免疫应答通常不识别核酸片段。3)给药。虽然目前最i人可的抗体治疗剂是通过l争脉输液多会药的(一般地为2-4小时)，但是适体可以通过皮下注射给药(在猴子体内进4亍研究证明，适体通过皮下给药的生物利用率〉80%(Tuckeretal，J.ChromatographyB.732:203-212，1999))。由于适体具有良好的可溶性(>150mg/ml)和相对较低的分子量(适体10-50kDa;抗体150kDa),周剂量的适体可能通过以小于0.5mL的体积注射给药。此外，适体较小的尺寸使它们能够渗入4元体或抗体片段不能渗入的构象限制区，展现了基于适体的治疗剖或预防剂一个另外的优势。4)可规模性和成本。适体治疗剂是化学合成的，因此容易根据目前的生产需要进行规才莫性放大。然而目前在放大生,中的难点限制了某些生物体的可用性，且大规模蛋白质生产制造厂的基建费用是巨大的，但是，单一大规模的低聚核苷酸合成器的产量可达到100kg/年，且其只需要相对中等成度的创办投资。目前目前用于适体合成的生产原津牛的成本以千克为单位估计为500美元/g，基本相当于高度优化的抗体的生产。在未来5年内工艺的持续改进可以预料原料成本将下降到<100美元/g。5)稳定性。适体治疗剂是化学稳定的。在暴露于例如热处理和变性剂等条件下之后，他们能够本能的恢复活性，在室温下，适体作为冻干^分末可以储存相当长的时间(>1年)。血4全形成性疾病在进行普通的，控制的止血过程中，血小板通常只黏附于受伤血管的内皮下膜处，并不与健康的血管相粘黏。血小板的黏附引发一系列的血小板活化过程，从而最终产生血栓起到止血作用。在血管创伤部位，血管性血友病因子("vWF")是血小板凝结作用的调节剂。vWF是一种大的多亚基，复合可溶性因子，主要由血管的内皮细胞产生。血管性血友病因子通过血管性血友病因子A3区域^和暴露月交原质的相互作用固定在流血的血管壁上。血小4反受体并唐蛋白Ib(下文中用GPIb表示)牙口固定的血管性血友病因子Al区域发生短暂的相互作用，促进血小板在血管创伤处的黏附与活化。参见E.G.Huizingaetal"Science,297，1176(2002)。因此，血管性血友病因子具有趋血栓阻塞性，在止血过程中对于促进血管创伤处的血栓形成起到重要的作用。相反的，通过相同的才几制，血管性血友病因子又于于包3舌血小^反凝聚和血栓形成的疾病，例如心血管疾病，也起着重要的作用。尽管目前抗血4全形成治疗剂是可以购得的，但在进一步治疗方面仍有许多未满足的需要。美国心脏协会估计，只在美国就有超过6千万人患有一种或更多种形式的心血管病，绝大部分患病人群4艮有可能患有动月永血^全病。参见S.P.JacksonandS.M.Schoenwaelder,NatureReviews,2,1-12(2003).目前通用的治疗剂有一种重要的问题，就是改进的功效降低了安全寸生。参见S.P.Jackson禾口S.M.Schoenwaelder,NatureReviews,2，1-12(2003).因此，在流血的副作用^皮最小化同时，通过防止血小板在血管系统处凝聚来治疗和防止血栓形成疾病是非常有益的。本发明提供了用于满足这些及其他需要的材料和方法。(SEEEX丁m)过程。图2是描述了不同聚乙二醇化策略的示意图，表示了标准单聚乙二醇化、多聚乙二醇化和通过聚乙二醇化进4亍的齐聚反应。图3是图表，列出了本发明试验所用的血管性血友病因子Al区域蛋白的氨基酸序列。图4是图表，列出了本发明试验所用的血管性血友病因子全长蛋白的氨基酸序列。图5是描述了ARC1029(序列号214)被提议的二级结构的示意图。图6是ARC1029(序列号214)与人vWF全长和兔vWFAl区域定点印记结合曲线的图表。图7是FACS数据图，表示了ARC1029(序列号214)抑制人vWF全长和兔vWFAl区域与冻干的人血小板的结合。图8是血小板凝聚分析仪曲线图，表示了随着时间变化，ARC1029(序列号214)对botrocetin诱导的血小板凝聚的抑制性。图9表示了ARC1029(序列号214)对botrocetin诱导的血小板凝聚的抑制性。图IO是描述序列号217被提议的二级结构的示意图，其中，C=fC，T=fU，N-任意核苷，但在配对区域满足Watson/Crick碱基配对原则，且X=可以被PEG间隔体替换的1到4个核苷或Nx-Nx-Nx-Nx。图11是描述vWFrRfYSELEXFAMILY#1中3个适体序列阵的示意图。图12是描述序列号218被4是议的二级结构的示意图。图13是描述序列号219被提议的二级结构的示意图。图14是描述vWFDNASELEX2FAMILY#1中26个适体的序列阵示意图，阵列顶端的黑线表示结合血管性血友病因子所需的3皮提i义的核心核酸结合序列。图15是描述序列号220被提议的二级结构的示意图。图15B是描述ARC1172(序列号222)二级结构的示意图，ARC1172的残基耐受2'-OMe取代。图16是表示核酸序列的图表，这些核酸序列包括ARC1029(序列号214),ARC1115(序列号221)，ARC1172(序列号222)和ARC1194(序列号223)到ARC1243(序列号272)的任意修饰。图17是表示核酸序列的图表，这些核酸序列包括ARC1172(序列号222),ARC1338(序列号273)到ARC1348(序列号283)和ARC1361(序歹'J号284)多JARC1381(序歹。号304)的^f壬意《奮饰。图表中的黑框表示一种缺失。在核苷指示剂(例如T或dA)之前的"s"表示在磷酸骨架5，到指示核苷之间的硫代磷酸取代。图18是表示核酸序列的图表，这些核酸序列包括ARC1172(序列号222)，ARC1524(序列号305)到ARC1535(序列号316),ARC1546(序列号317)和ARC1759(序列号318)的任意《奮饰。图表中的黑框表示一种缺失。图19是表示ARC1368(序歹'J号291)和ARC1534(序列号315)的二级结构的示意图。图20表示了在PFA-100试验中用ARC1368(序列号291)或ARC1525(序歹'J号306)处理人全血时的凝固时间，在这里，凝固时间是适体;农度的函凄t。图21表示了在PFA-100试-睑中用Integrilin,ReoProTM或ARC1368(序列号291)处理人全血时的封闭时间，在这里，封闭时间是药物浓度的函数。图22表示了在BIPA试-睑中，用Integrilin,ReoProTM或ARC1368(序列号291)处理的人PRP抑制性百分比，在这里，抑制性百分比是药物浓度的函数。图23表示了在AIPA试验中，用IntegrilinTM，ReoProTM或ARC1368(序列号291)处理的人PRP抑制性百分比，在这里，抑制性百分比是药物浓度的函凌t。图24表示了作为时间函数，在人血浆中4企测到的ARC1172(序列号222)或ARC1368(序列号291)全长序列百分比。图25表示了在给药ARC1368(序列号291)、ARC1779(序歹'J号320)或ARC1780(序列号321)之后，作为时间函数的灵长类动物须将适体浓度(使用Oligreen分析仪测定)。图26中的横轴表示从三只猕猴身上吸取试验用血的时间点，三个纵轴中最上面的一个表示了ARC1779(序列号320)的血浆浓度(以nM为单位)，三个纵轴中中间的一个表示了PFA-100闭合时间(以秒为单位)，三个纵轴最下面的一个表示了模版或皮肤的流血时间(以分钟为单位)。顶部、中部和下部的三个图分别表示了三只动物的血浆适体浓度、PFA-100闭合时间和皮肤流血时间的平均值。图27是一个图表，表示了对三只不同的猕猴给药ARC1779(序列号320)之后，在第1栏所示的不同时间点，以分钟为单位的皮肤流血时间(CBT)、BIPA原始数据和PFA闭合时间(秒)。图28表示了对猕猴给药ARC1779(序列号320)之后，在不同的时间点PFA-100闭合时间的平均l直。图29表示了在给药后不同时间点测定的用ARC1779(序列号320)处理的三只猕求吳的平均流血时间。图30是一个图表，将用ARC1779(序列号320)处理的猕猴平均流血时间(左纵轴)与PFA-100闭合时间相关联。图31描述了在猕猴电解产生的血栓模型中用来评估ARC1779(序列号320)的血液样品收集方案。图32描述了在电解产生的血栓模型中，治疗组3中的每只猕猴体内，作为时间函凄t的ARC1779(序列号320)的血浆浓度(纵轴)。图33表示了在猕猴电解产生的血栓模型中进行试验的每个治疗组的每只猕猴体内，封闭右颈动脉(阴影棒)或左颈动脉(实心棒表示)的时间。第1、8、9对棒形图表示了治疗组1(只给药介质)，第2、10、11、12和13对棒形图表示了治疗组2和4(给药ReoPro)。第3-7对棒形图表示了治疗组3(1000nM适体血浆;农度革巴向纟且)。第20、22、16和18只于才奉形图表示了治疗纟且7(750nM适体血浆浓度耙向组)。第19、21、23和24对棒形图表示了治疗组6(500nM适体血浆浓度耙向组)。第15和17对棒形图表示了治疗组5(300nM适体血浆浓度靶向组)。图34表示了在电创伤模型中，如纵轴所示时间点测定的不同猕猴治疗组中以分钟(横轴)为单位的皮肤流血时间。
发明内容本发明提供了用于治疗血纟全形成性病症的材料和方法，所述的血栓形成性病症包括血管性血友病因子调节的血小板凝聚。本发明提供了对血管性血友病因子靶分子具有特异性结合能力的适体。在某些实施方案中，血管性血友病因子靶分子是人的血管性血友病因子。在某些实施方案中，血管性血友病因子輩巴分子是一种人血管性血友病因子的变异体，这种人血管性血友病因子变异体表现出的生物功能与人血管性血友病因子功能相同。在某些实施方案中，血管性血友病因子耙分子或其变体的生物才几能是调节血小板凝聚。在某些实施方案中，人血管性血友病因子靶分子的变体基本上具有相同的结构，并且其结合本发明适体的能力基本上与人血管性血友病因子结合本发明适体的能力相同。在某些实施方案中，vWF靶分子是一种非人的血管性血友病因子。在某些实施方案中，本发明的适体结合血管性血友病因子靶分子或其变体，其中，所述变体包;fe—种氨基酸顺序，该氨基酸顺序与序列号7(图4)有至少75%、80%、90%或95%的同源性。在一个实施方案中，血管性血友病因子靶分子包括序列号7的氨基酸顺序。在文中，当比4交和调整最大值一致性时，两个或两个以上核酸或蛋白质序列之间的术语"序列同源性"或"％同源性"是指，通过使用下列序列之一进行比l支运算或通过目测;险查，两个或两个以上序列或子序列是相同的，或具有确定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸，在进行比l支运算时，一^:一个序列作为参比序列，待测待测序列与之相比较。当使用序列比较运算时，将待测序列和参比序列输入电脑中，如果必要的话子序列的坐标是指定的，且序列运算的程序参数也是指定的。然后，根据指定的程序参数，序列比较运算可以计算出待测序列(s)相对于参比序列的序列同源寸生百分比。可以通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的区域同源性算法，或通过Needleman&Wunsch,JMol.Biol.48:443(1970)的阵列同源性算法，或通过Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索法，或通过在计算机上执行这些算法(遗传学计算机集团生产的威斯康星遗传学禾呈序包中的禾呈序GAP,BESTFIT，FASTA，和TFASTA,575ScienceDr.,MadisonWis.),或通过目观'j检查(通常参见Ausubel,F-M.etalCurrentProtocolsinMolecularBiology,Greeneiil版协会和Wiley-interscience出版(1987))进行序列阵列最优4匕。适用于确定序列同源性百分比的算法的一个例子是在局部阵列基础搜索工具中使用的算法(下称"BLAST"),参见例如Altschuletal,JMol.Biol.215:403-410(1990)和Altschuletal,NucleicAcidsRes.,15:3389-3402(1997)。用于进行BLAST分析的l欠4牛可以从国家生物工程学信息中心(下称"NCBI")获得。佳:用软件确定序列同源性的默认参数也可以从NCBI中获得。例如，在文献McGinnisetal"NucleicAcidsRes.,32:W20-W25(2004)中描述的BLASTN(用于核苷酸序列)和BLASTP(用于氨基酸顺序)。在一种优选的实施方案中，通过使用Altschul等人的BLAST算法和McGinnis等人的默i人参lt确定同源性百分比，在这里可能被i人为是BLAST同源性百分比。在一个实施方案中，本发明的vWF适体包括一种电离常凄t,对于人血管性血友病因子或其变异体此电离常数大约是lOOnM或更少，优选50nM或更少，优选10nM或更少，优选5nM或更少，优选lnM或更少，更优选500pM或更少。电离常数可以通过定点印记试验确定，定点印记试驺"使用多点滴定，且满足实施例1中描述的等式y^max/(l+K/蛋白质))+yint。本发明还提供了一种能够与血管性血友病因子Al区域靶分子特异性结合的适体。在某些实施方案中，血管性血友病因子A1区域耙分子是人血管性血友病因子Al区域輩巴分子。在某些实施方案中，人血管性血友病因子Al区域乾分子是人血管性血友病因子Al区域的变异体，其生物功能本质上与人血管性血友病因子Al区域功能相同。在某些实施方案中，血管性血友病因子Al区域或其变异体的生物功能是结合血小板。在某些实施方案中，人血管性血友病因子区域靶分子变异体的结构与人血管性血友病因子Al区域的结构基本上相同，并且与人血管性血友病因子Al区i或具有基本上相同的结合所述适体的能力。在其他实施方案中，血管性血友病因子Al区域靶分子是非人类的血管性血友病因子Al领域靶分子，例如兔或非人灵长类动物的血管性血友病因子Al领域靶分子。在某些实施方案中，本发明的血管性血友病因子Al区域靶分子包括一种氨基酸顺序，此氨基酸顺序与选自由序列号4到6所组成的组的任何一个的序列有至少75%、80%、90%或95%的同源性。在一种优选的实施方案中，血管性血友病因子Al区域靶分子輩巴分子包括选自由序列号4到6所组成的组的任何一个的氨基酸顺序。在一个实施方案中，本发明关于人血管性血友病因子Al区Jt或或其变异体的vWF适体，包4舌大约100nM或更少，优选50nM或更少，优选10nM或更少，优选5nM或更少，优选lnM或更少，更优选500pM或更少的电离常数。在另一个实施方案中，本约100nM或更少，^尤选50nM或更少，优选10nM或更少，优选5nM或更少，优选lnM或更少，更优选500pM或更少的电离常数。电离常数可以通过使用多点滴定的定点印记试验确定，且满足下面实施例1所述等式y=(max/(l+K/蛋白质))+yint。在某些实施方案中，本发明提供了一种能够特异性结合血管性血友病因子全长靶分子的适体。在某些实施方案中，本发明提供了能够特异性结合血管性血友病因子全长靶分子和血管'l"生血友病因子Al区域靶分子的适体。在某些实施方案中，血管性血友病他的实施方案中，血管性血友病因子全长輩巴分子是一种非人血管性血友病因子靶分子或其变异体。在某些实施方案中，血管性血友病因子Al区域靶分子是一种非人血管性血友病因子Al区域靶分子或其变异体。在其他的实施方案中，血管性血友病因子A1区域耙分子是人血管性血友病因子Al区域乾分子或其变异体。在某些实施方案中，血管性血友病因子全长輩巴分子或Al区i或靶分子选自由兔、豚鼠、猴子、狗、羊、老鼠和小鼠的血管性血友病因子全长或Al区域耙分子所组成的组。在某些实施方案中，本发明适子Al区域革巴分子来自于不同的种类。本发明提供抗血管性血友病因子靶分子的适体，所述适体是核糖核酸或脱氧核糖核酸或核糖核酸和脱氧核糖核酸的混合。本发明的适体可以是单链核糖核酸或脱氧核糖核酸或核糖核酸和脱氧核*唐核酸的混合。在某些实施方案中，本发明的适体包"fe至少一个化学^f多饰。在某些实施方案中，核酸的化学修饰选自由糖位点的化学取代；^畴酸盐位点的化学取代；碱基位点的化学取代所组成的组。在其他的实施方案中，化学修饰选自由修饰核苷酸的结合、3'封端、与高分子量非免疫原性化合物的结合、与亲脂性化合物的结合和硫代磷酸进入磷酸盐骨架的结合所组成的组。在一种优选的实施方案中，非免疫原的高分子化合物是聚烯基二醇，更优选是聚乙二醇。在本发明的某些实施方案中，提供了一种能够特异性地与靶分子结合的适体，例如血管性血友病因子适体，其中，该适体包4舌一种具有不大于四个，不大于三个，不大于两个或不大于一个硫^磷酸骨架修饰，并且该适体对于靶分子具有结合亲合性，其中，此结合亲合性相对于具有相同核苷酸序列但是没有硫zR磷酸骨架修饰的第二适体有所增加。在某些实施方案中，靶分子是一种不具有已知的核酸结合功能，特别是不具有已知的结合对亥酸基本功能的蛋白质或肽。在某些实施方案中，本发明的适体调节任何一个选自由血管性血友病因子、血管性血友病因子Al区域靶分子和任一革巴分子的变异体所组成的组的成员的功能。在某些实施方案中，功能调节是血小板凝聚作用的调节。在某些实施方案中，本发明的适体抑制血管性血友病因子调节体内血小板凝聚作用。在其他的实施方案中，本发明的适体阻止任意一个选自由血管性血友病因子靶分子、血管性血友病因子Al区域靼分子和其变异体所组成的组的分子与血小板结合。在其他的实施方案中，本发明的适体阻止任意一个选自由血管性血友病因子革巴分子、血管性血友病因子Al区域靶分子和其变异体所组成的组的分子与血小板受体蛋白结合。在另外的实施方案中，本发明的适体阻止任意一个选自由血管性血友病因子靶分子、血管性血友病因子Al区域靶分子和其变异体所组成的组的分子与血小板受体蛋白GPIb结合。在某些实施方案中，本发明的适体阻止vWF因子调节的血小板凝聚作用，同时不会明显的增力o出血时间。在某些实施方案中；出jfe时间不显著的增加小于15分钟，优选小于IO分钟，更优选小于5分钟，并且在某些实施方案中，相对于未用本发明适体处理的患者的出血时间增加小于3分钟。在某些实施方案中，出血时间是由皮肤(或者才莫4反)的出血时间决定的。在某些实施方案中，本发明的适体对于血管性血友病因子靶分子、血管性血友病因子Al区域靶分子和其变异体具有基本上相同的结合能力，其中，适体选自序列号11到50,序列号54到94,序列号98到164，序列号165，序列号169,序列号172,序列号174，序列号177，序列号180，序列号183，序列号186,序列号189，序列号192,序列号198，序列号201，序列号205,序列号208,序列号212-214,ARC1115(序列号221)，ARC1172(序列号222)，ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269),ARC1338(序列号273)至'JARC1346(序歹寸号281),ARC1361(序歹'j号284)至，JARC1381(序列号304),ARC1524(序列号305)，ARC1526(序列号307)到ARC1535(序列号316),ARC1546(序列号317),ARC1635(序列号319),ARC1759(序列号318)，ARC1779(序列号320)到ARC1780(序列号321)和ARC1884(序列号322)到ARC1885(序列号323)。在其他的实施方案中，本发明的适体具有基本上相同的结构，且对于血管性血友病因子靶分子、血管性血友病因子Al区域靶分子和其变异体具有基本上相同的结合能力，其中适体选自由序列号11到50,序列号54到94,序列号98到164，序列号165,序列号169，序列号172,序列号174,序列号177,序列号180,序列号183,序列号186,序列号189，序列号192,序列号198,序列号201，序列号205，序列号208,序列号212-214，ARC1115(序列号221),ARC1172(序列号222),ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269),ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281),ARC1361(序歹'J号284)至'JARC1381(序歹'J号304),ARC1524、zjz一V"v/一,，丄*_丄、a"v/、yjz一Jy丄、i^^jwr、,一,—V"丄v,，ARC1546(序列号317),ARC1635(序列号319),ARC1759(序歹'J号318)，ARC1779(序列号320)到ARC1780(序列号321)和ARC1884(序列号322)到ARC1885(序列号323)所组成的组。在另外的实施方案中，本发明的适体选自由序列号11到50,序列号54到94,序列号98到164,序列号165，序列号169,序列号172，序列号174，序列号177，序列号180,序列号183,序列号186,序列号189，序列号192,序列号198,序列号201，序列号205,序列号208，序列号212-214，ARC1115(序列号221),ARC1172(序列号222),ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269),ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281),ARC1361(序列号284)到ARC1381(序列号304)，ARC1524(序列号305),ARC1526(序列号307)到ARC1535(序列号316),ARC1546(序列号317)，ARC1635(序列号319),ARC1759(序列号318),ARC1779(序列号320)到ARC1780(序列号321)和ARC1884(序列号322)到ARC1885(序列号323)所组成的组。在一种特歹未的实施方案中，本发明的适体包4舌的主要核酸序列为ARC1172(序列号222)或ARC1115(序列号221)或ARC1029(序列号214)或序列号220,且在6到9、20、22、24到27、30或32到33位点处不包括2'-0-Me取代的核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的适体包^舌核酸序列ARC1172(序列号222)或ARC1115(序列号221)或ARC1029(序列号214)或序列号220，并且在一个或一个以上^立点，在5个或5个以上位点，在10个或IO个以上位点，在15个或15个以上位点，或在20个或20个以上位点包括2'-0-Me取代的核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的适体包括核酸序列ARC1172(序列号222)或ARC1U5(序列号221)或ARC1029(序列号214)或序列号220，且在1到5位点、10至'J194立,泉、2K立,泉、234立；、、28》J294立,泉和34至'J4K立,泉包#舌2'-OMe耳又4戈的牙亥普酸:，其中，^f立点号石马vM^亥卧免,序列的5'末端开始编号。在本发明特殊的实施方案中，提供了一种适体，该适体包括一种选自由序列号95到97和序列号217到219所组成的组的核酸序列，其中，Y-C或T/U，1^A或G,N-任意核苷，在成对区域满足沃森克里克碱基配对头见则；且X=1到4。在另一种实施方案中，本发明的适体选自序歹'J号217禾口220,其中，Nx-Nx-Nx-Nx画，或N(wo)可以被PEG连接体取代。在另外的实施方案中，本发明的适体选自序歹'J号325-327,其中Y=C或T,R=A或G。在特殊的实施方案中，能够特异性结合血管性血友病因子的适体包4舌一种三元螺旋结合的二级结构部分，此部分与图L5所描述的序列号220具有一致的序列结构。在另一个特殊的实施方案中，具有三元螺;旋结构的适体包^舌与图19A所描述的(ARC1368(序列号291))—致的结构。然而在另一种实施方案中，具有三元螺-旋结构的适体与图19B所描述的(ARC1534(序列号315))—致的结构。在另外的实施方案中，能够特异性结合血管性血友病因子的适体包括茎-环-茎-环状二级结构部分，此部分具有与图IO描述的序列号217—致的序列结构。在其他的实施方案中，特异性结合血管性血友病因子的适体包括茎-环-环二级结构部分，该部分含有与图12描述的序列号218—致的序列结构。在其他的实施方案中，特异性结合血管性血友病因子的适体包括一种三元结合的二级结构部分，该部分有两个螺》走;J犬的茎和一个如图13所描述的序列19的茎-环结构。在某些实施方案中，本发明适体的二级结构部分可以通过4.1X反的RNAstructure.(参见，Mathews,D.H.;Disney,M.D.;Childs,J丄.；Schroeder,SJ.;Zuker，M.;和Turner,D.H.2004年在美国国家科学院学净艮101巻7287-7292页发表的名为"将化学修饰限制亏1入动态规划法则来预计RNA二级结构"的文献).预测。在优选地实施方案中，提供了能够特异性结合人血管性血友病因子革巴分子和非人血管性血友病因子革巴分子的适体。在一个实施方案中，提供了包括下列结构的适体或其盐H3C(OGH2CH2)n—0-6-N^^5'，其中n大约为454个环氧乙烷单位(PEG=20KDa)---是一种连^妄体，且该适体是本发明的抗-vWF适体《在一种特歹未的实施方案中，适体包4舌下列4亥酸序列或其片断mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-S-dTmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T(序列号291)。其中"s"是指硫代磷酸盐取代，"3T"是指反向脱氧胸腺嘧i定。在其他的实施方案中，适体包括下列核酸序列或其片断dGdGdCdGdTdGdCdAdGdTdGdCdCdTdTdCdG(1GdCdCdGdTdGdCdGdGdTdGdCdCdTdCdCdGdTdCdAdCdGdCdC-3T(序列号323),其中，"d"是指脱氧核苷，"3T"是指一种反向的脱氧胸腺嘧，定。在本发明此方面的某些实施方案中，连4妄体是烷基连4妄体。在特朱的实施方案中，烷基连接体包4舌2-12个连续的CH2基团。在特殊的优选实施方案中，烷基连接体包括3-6个连续的CHb基团。在一种特殊的实施方案中，本发明实体包括下列结构H3C(OCH2CH2)n—Q^C^vv^^—o尸、0—5'适体3'其中n大约为454个环氧乙烷单位(PEG=20KDa)且该适体核酸序列是本发明的抗-vWF适体。在一种特殊的实施方案中，适体包括下列核酸序列或其片断mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-S画dTmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T(序列号291)。其中"s"是指硫代磷酸盐取代，"3T，，是指反向脱氧胸腺嘧啶。在其他的实施方案中，适体包凌舌下列核酸序列或其片断dGdGdCdGdTdGdCdAdGdTdGdCdCdTdTdCdGdGdCdCdGdTdGdCdGdGdTdGdCdCdTdCdCdGdTdCdAdCdGdCdC-3T(序列号323)，其中，"d"是才旨脱氧核苷，"3T"是指一种反向的脱氧胸腺嘧啶。在另一种实施方案中，提供了本发明适体的盐。在一种特殊的实施方案中，才是供了如下的适体盐>^-(甲氧基-聚乙二醇)-6-氨基己基-(1->5')-2'-0]\^-鸟苷酸基-(3'->5')-2'-OMe-胞苦酸基-(3'画>5')醫2'-OMe-鸟*酸基-(3'->5，)-2'-01\^-尿苷酸基-(3，->5，)-2'-脱氧鸟苷酸基-(3，-〉5，)-2，-脱氧月包苷酸基-(3，->5，)-2'-脱氧腺普酸基-(3'->5')-2'-OMe-鸟苷酸基-(3'->5')-2'-OMe-尿普酸基_(3'->5')-2'-OMe-鸟普酸基-(3'画>5，)-2，-OMe-胞苷酸基-(3'-〉5，)-2'-OMe-胞普酸基-(3'-〉5')-2'-OMe-尿苷酸基_(3'->5，)-2'-OMe-尿苦酸基-(3'->5，)-2'-OMe-胞苷酸基-(3'—>5')-2'-OMe-鸟苷酸基-(3'->5')-2'-OMe-鸟普酸基-(3'->5')画2'國OMe-胞苷酸基画(3'画〉5')画2'-脱氧胞苷酸基-(3'-〉5')-2'-OMe-P-碌u代鸟苷酸基-(3'->5')-2'-脱氧胸腺苷酸基-(3'-〉5')-2'-OMe-鸟普酸基-(3'->5，)-2，-脱氧胞苷酸基-(3'-〉5')-2'-脱氧鸟苷酸基-(3，->5')-2'-脱氧鸟苷酸基-(3'-〉5')-2'-OMe-脱氧胸腺苦酸基-(3'-〉5')-2'-01^6-鸟苦酸基画(3'-〉5')-2'-OMe-胞苦酸-基-(3'->5')-2'國.脱氧月包普酸基-(3'-〉5')-2'-OMe-尿苷酸基-(3'-〉5')-2，-脱氧胞苷酸基-(3'-〉5')-2'-脱氧胞苷酸基-(3'->5')-2'-OMe-鸟苷酸基-(3'->5')-2'-OMe-尿苷酸基-(3，->5')-2'-脱氧胞苷酸基-(3'->5')-2'-OMe-腺苦酸基-(3'->5')-2'-OMe-胞苷酸基-(3'->5')-2'-OMe-鸟苦酸基-(3'-〉5')-2'-01^6-胞苷酸基-(3'->5')-(3'->3')-2'-脱氧胸腺嘧啶，40-钠盐，其中，甲氧基聚乙二醇包括分子量为为20KDa的分子。在另外的实施方案中，提供了一种药物组合物，该药物组合物包括々f壬一治疗有效量的本发明适体或其盐和药用可4妄受的载体或稀释剂。在一种特殊的实施方案中，本发明的药物组合物包4舌ARC1779。在一种更特朱的实施方案中，药物组合物包4舌具有下述结构的适体或其盐oO0其中，n是大约454个环氧乙烷单位(PEG=20KDa)，且该适体包4舌下列才亥酸序列或其片断mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-s-dTmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T(序列号291),其中，"m，，指2'-甲氧基取代，"d"指脱氧的核酸，"s"是指硫代磷酸盐取代，"3T"是指反向脱氧胸腺嘧啶。本发明提供了一种治疗、预防或改善由血管性血友病因子调节的疾病的方法，包纟舌对脊稚动物，优选哺乳动物，更优选人，给药本发明适体或药物组合物。在某些实施方案中，需要治疗、预防或改善的疾病选自原发性血小板减少症、血一全形成性紫斑症("TTP，，)、IIb型血管性血友病、例如周围动脉闭塞性疾病的周围动月永疾病、不稳、定型心会支痛、心绞痛、动月永血才全症、动脉硬j匕、心月几梗塞、急性冠乐:M宗合4iE、心房颤动、颈动月永狭窄、脑梗塞、脑血;f全、缺血性脑卒中和短暂性脑缺血发作。在某些实施方案中，在进4亍透析、CABG手术、冠心病介入治疗或心脏瓣膜置换术之前/期间/或之后，给药本发明的药物组合物。根据治疗、改善和/或预防的疾病不同，本发明适体的体内半衰期时间是变化的。例如，在某些实施方案中，根据治疗、改善和/或预防的疾病不同，需要緩慢进行适体给药，则本发明的适体具有相对较长的半衰期，例如，在人体内的半衰期超过5个小时。在其他的实施方案中，本发明的适体包括一种需要的功能性半衰期或作用持续时间。功能性半衰期或作用持续时间是适体药代动力学半衰期和药效活性二者共同的效果。在其他的实施方案中，本发明的适体包括一种需要的功能性半衰期或作用持续时间.功能性半衰期或作用持续时间是适体药代动力学半衰期和药效活性的函数。在某些实施方案中，抗-vW治疗剂适体所需的入功能性半衰期或作用持续时间对于适应症选择的PCI和ACS为1-5个小时。具有这种动力学的适体表现出一种两者间的平衡，这两者是(1)最小化总的适体服药量(从而实现比较长的半衰期)和(2)停止治疗之后(实现较短的半衰期)，允许血小板功能快速正常化。在某些实施方案中，血小板的快速正常化功能是非常重要的，因为这样可以使临床医师在病人进行治疗后不能稳定的情况下，有机会快速的介入治疗因此，在某些实施方案中，用于治疗方法的适体和/或本发明的药物组合物包括一种相对4豆的功能性半衰期，例如在人体内的功能性半衰期大约为l到5小时。在某些实施方案中，在人体内的功能性半衰期为至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时且不大于5小时。在某些实施方案中，功能性半衰期或作用持续时间大约与适体的分布半衰期T,/2相同。在某些实施方案中，包括较短的人体内功能性半衰期的本发明适体净皮用于一些方法和症且合物中，所述方法和症且合物用于治疗、改善或防止可能需要外科手术的疾病，例如急性冠状动^永综合症。在某些实施方案中，包括短的人体内功能性半衰期的本发明此方面的适体与PEG连4妄，例如5、10或20kDa的PEG。在某些实施方案中，包括短的人体内功能性半衰期的本发明此方面的适体是ARC1779。本发明还4是供了一种it断方法，包括将本发明的适体与有可能包括血管性血友病因子、血管性血友病因子Al区域或其变异体的组合物接触，检测其中有没有血管性血友病因子、血管性血友病因子Al区域或其变异体存在。在某些实施方案中，这种it断方法在体外^吏用，而在其他的实施方案中，这种i貪断方法在体内4吏用。本发明还提供了一种鉴别能够阻断体内的生物功能的适体的方法，包4舌a)制备一种单链核酸的候补混合物；b)将此候补混合物与全长蛋白质靶分子和全长蛋白质靶分子的一个区i或相接触；c)分离对全长蛋白质靶分子和全长蛋白质靶分子的一个区i或具有增加的亲合'l"生的4亥t复；和d)体外扩增亲合性增加的核酸，从而产生一种特异性靶分子蛋白质富集的适体混合物。在某些实施方案中，鉴别方法进一步包括e)将特异性靶分子蛋白质富集的适体混合物与全长靶分子蛋白质接触；f)分离对全长靶分子蛋白质具有增加的亲合性的核酸；和g)体外扩增亲合性增加的核酸，从而产生特异性靶分子富集的适体混合物；h)将此特异性靶分子富集的适体混合物与蛋白质目标^^页域4妄触；i)分离对蛋白质目标领域具有增加的亲合性的亲合性核酸；和j)体外扩增亲合性增加的核酸，从而产生特异性靶分子蛋白质富集的适体混合物。在某些实施方案中，鉴别方法进一步包括，选择能够体内阻断全长輩巴分子蛋白质生物功能的适体，同时，在其他的实施方案中，该方法进一步包括选择能够体内阻断靶分子蛋白质目标领域生物功能的适体。在本发明鉴别方法的某些实施方案中，全长革巴分子蛋白质来自于第一物种，蛋白质目标领域来自于第二物种。在本发明鉴别方法的进一步实施方案中，该方法进一步包括，选择能与第一和第二物种的蛋白质靶分子结合的适体，优选地，选择一种能够在第一和第二物种体内阻断靶分子蛋白质的生物功能的适体。在本发明鉴別方法的某些实施方案中，全长靶分子蛋白质靶向是血管性血友病因子。在本发明鉴别方法的某些实施方案中，全长靶分子蛋白质靶向是血管性血友病因子，其中，优选选择的适体能够阻断血管性血友病因子调节的血小板凝聚。在某些实施方案中，蛋白,质目才示4贞i或.是jfe管'f生血友病因子Al区域。4^发明还提供了一种通过本发明鉴別方法鉴别出的适体。在某些实施方案中，本发明还提供了一种能够特异性结合血管性血友病因子的适体，该适体包括的主要的核酸序列，与选自由序列号11到50,序列号54到94，序列号98到164,序列号165,序列号169,序列号172,序列号174,序列号177,序列号180，序列号183,序列号186,序列号189，序列号192,序列号198,序列号201,序列号205,序列号208,序列号212-214,ARC1115(序列号221)，ARC1172(序列号222),ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269)，ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281),ARC1361(序列号284)到ARC1381(序列号304)，ARC1524(序列号305),ARC1526(序列号307)到ARC1535(序列号316),ARC1546(序列号317),ARC1635(序列号319),ARC1759(序列号到ARC1885(序列号323)所组成的组的任意一种序列有至少80%的同源性，特别i也至少90%的同源性，更特别地至少95%的同源性。在某些实施方案中，本发明适体的°/。序列同源性是BLAST序列同源'hi。在另一种实施方案中，本发明的适体包4舌一种具有化学^务饰的核酸序列，包括的化学修饰与任何一个选自由序列号11到50，序列号54到94，序列号98到164,序列号165，序列号169,序列号172，序列号174，序列号177,序列号180,序列号183，序列号186，序列号189，序列号192,序列号198,序列号201,序列号205,序列号208,序列号212-214,ARC1115(序列号221),ARC1172(序列号222)，ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269),ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281),ARC1361(序列号284)到ARC1381(序列号304)，ARC1524(序列号305)，ARC1526(序列号307)到ARC1535(序列号316)，ARC1546(序列号317)，ARC1635(序列号319),ARC1759(序列号318)，ARC17795[]ARC1780(序歹'J号321)禾口ARC1884(序歹'J号322)至'JARC1885(序列号323)所组成的组的核酸序列有至少80%的同源性，特别;t也90%的同源性，更特别3也至少95%的同源性。在另一种实施方案中，本发明提供了一种适体，其通过结合血管性血友病因子輩巴分子调节血管性血友病因子功能，且优选在体内，该适体包括30个邻近的核苷酸序列，该序列与选自由序列号11到50,序列号54到94,序列号98到164,序列号165,序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180,序列号183,序列号186,序列号189,序列号192，序列号198,序列号201,序列号205，序列号208,序列号212-214,ARC1115(序列号221)，ARC1172(序列号222)，ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269),ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281>，ARC1361(序列号284)到ARC1381(序列号304),ARC1524(岸列号305),ARC1526(序列号307)到ARC1535(序列号316),ARC1546(序列号317),ARC1635(序列号319),ARC1759(序列号318),ARC1779到ARC1780(序列号321)和ARC1884(序歹'j号322)到ARC1885(序列号323)所组成的组的任意一种序列的30个邻近的核苷酸同源。在另一种实施方案中，本发明提供了一种适体，优选在体内通过结合血管性血友病因子輩巴分子调节血管性血友病因子功能，且该适体包^舌20个邻近的核苷酸序列，该序列与选自由序列号11到50,序列号54到94,序列号98到164,序列号165，序列号169,序列号172,序列号174,序列号177，序列号180，序列号183,序列号186,序列号189,序列号192，序列号198,序列号201,序列号205,序列号208,序列号212-214,ARC1115(序列号221),ARC1172(序列号222),ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269),ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281),ARC1361(序歹'J号284)到ARC1381(序歹'J号304)，ARC1524(序歹'J号305),ARC1526(序列号307)到ARC1535(序列号316),ARC1546(序列号317)，ARC1635(序列号319),ARC1759(序列号318),ARC1779到ARC1780(序列号321)和ARC1884(序列号322)到ARC1885(序列号323)所组成的组的任意一种序列独特区域的20个邻近的核苷酸同源。在另一种实施方案中，本发明提供了一种适体，优选在体内通过结合血管性血友病因子靶分子调节血管性血友病因子功能，且该适体包括8个邻近的核苦酸序列，该序列与选自由序列号11到50,序列号54到94,序列号98到164，序列号165,序列号169,序列号172,序列号174，序列号177,序列号180,序列号183，序列号186,序列号189，序列号192,序列号198,序列号201,序列号205,序列号208,序列号212-214,ARC1115(序列号221),ARC1172(序列号222),ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269),ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281),ARC1361(序列号284)到ARC1381(序列号304)，ARC1524(序列号305),ARC1526(序列号307)到ARC1535(序列号316),ARC1546(序列号317),ARC1635(序列号319),ARC1759(序列号318),ARC1779到ARC1780(序列号321)和ARC1884(序列号322)到ARC1885(序列号323)所组成的组的任意一种序列独特区域的8个邻近的核苷酸同源。在另一种实施方案中，本发明提供了一种适体，优选在体内通过结合血管性血友病因子靶分子调节血管性血友病因子功能，且该适体包括4个邻近的牙玄苷酸序列，该序列与选自由序列号11到50,序列号54到94，序列号98到164，序列号165，序列号169,序列号172，序列号174，序列号177,序列号180,序列号183，序列号186,序列号189，序列号192,序列号198,序列号201,序列号205,序列号208,序列号212-214，ARC1115(序列号221),ARC1172(序列号222),ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269)，ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281),ARC1361(序列号284)到ARC1381(序列号304),ARC1524(序列号305),ARC1526(序歹'J号307)到ARC1535(序列号316),ARC1546(序列号317)，ARC1635(序列号319),ARC1759(序列号318),ARC1779到ARC1780(序歹'J号321)和ARC1884(序列号322)到ARC1885(序列号323)戶斤纟且成的组的任意一种序列独特区i或的4个邻近的核苦S吏同源。具体实施方案以下的描述详细地阐明了本发明的一个或一个以上实施方案的细节。尽管与这里描述的相似或相同的任何材料和方法都可以用于本发明的实现或试验，但是在这里描述的，是优选的方法和材料。通过描述，本发明的其他特点、目的和优势变得清楚明了，除非文中另有指出，否则在说明书中的单数形式还包括复^t。除非另有定义，否则，这里使用的所有的科技术语与本发明所属领域普通4支术人员通常理解的意义相同。如果发生矛盾，则以本i兌明书的意思为准。SELEXtm方法产生适体的合适的方法是图1描述的名为"指数级富集的配体系统进化技术"("SELEXTM")。SELEXTM过程是一种用于体外核酸分子进化的方法，该方法对靶分子具有高度的特异性结合能力，并在一些文献中有所描述，例如1990年6月11日递交、目前》文弃的美国第07/536,428号专利申请，名为"核酸配位体"的美国专利第5,475,096号和名为"核酸配位体"的美国专利第5,270,163号(也参见W091/19813)。每个SELEXTM识别的核酸配位体，即每程的独特依据是，核酸具有足够形成多样的二维和三维结构的能力，且具有足够的化学多功能性，可被其单体利用作为几乎{壬<可化合物的配位体(即，形成特异性结合对)，无论此化合物是单链的还是聚合的。任意大小的分子或组合物可以作为輩巴分子。SELEX在起点依赖于一种包括随机序列的大的单链低聚核苷酸文库。低聚核苦酸可以是修饰或未修饰的DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。在某些实施例中，序列库包括100%随4几的or部分随机的低聚核苷酸。在其他的实施例中，序列库包括随机的或部分随机的低聚核苷酸，该随机的或部分随机的低聚核苦酸包含与随机序列结合的至少一个固定序列和/或保守序列。在其他的实施例中，序列库包4舌随4几的或部分随才几的低聚核苷酸，此随坤几的或部分随机的低聚核苷酸在其5'和/或3'端包含至少一个固定序列和/或保守序列，在5'和/或3'端可能包括一种被低聚核苦酸序列库中所有分子分享的序列。固定序列是用于预定目的的低聚核苷酸库中常见的序列从而促进克隆和/或测序所需低聚核普酸，其中常见序列例如下面会描述到的CpG部分、PCR引物杂交地点、RNA聚合酶启动基因序列(例如，T3、T4、T7和SP6)、限制酶古M立点或例如多聚&泉苷酸或多聚胸腺嗜，定区的均聚序列、^f崔化核心、亲和层析柱选择性结合位点及其他序列。保守序列是除了以前描述到的固定序列之外的序列，4皮i午多结合相同輩巴分子的适体分享。基因库的低聚核苦酸优选包4舌随机序列部分和有效扩增必须的固定序列。通常起始库的低聚核苷酸包括固定的5'和3，末端序列，所述末端序列侧面与30-50个随机核苷的内部区域连接。随才几核苦可以通过多种方式生产，包括^匕学合成和从随才几教附于l包内的核酸中进行大小筛选。在反复筛选/扩增过程之前或过程之中，4寺测核酸中的序列变异体也可以通过突变的方法引入或增加。低聚核苷酸的随机序列部分可以是任意长度的，包括核寿唐核苷和/或脱氧核糖核苷，还可以包括经过修饰的或非天然的核苦或核普类似物。参加例如美国专利第5,958,691号；美国专利第5，660,985号；美国专利第5,958,691号；美国专利第5,698,687号；美国专利第5,817,635号；美国专利第5，672，695号，和PCT公开文件WO92/07065。随才几^f氐聚核苷f复可由^粦酸内酯4建连4妄的核芬通过本领域内已知的固定相低聚核苷酸合成4支术合成。参见例如Froehleretal，Nucl.AcidRes.14:5399-5467(1986)和Froehleretal，Tet.Lett.27:5575-5578(1986)。随才/M氐聚核苷酸也可以〗吏用溶液相方法例:i口三酯合成的方法合成。参见例如Soodetal,Nucl.AcidRes.4:2557(1977)禾口Hiroseetal，Tet.Lett.,28:2449(1978)。典型的合成过程在自动DNA合成仪中进行，产生1014-1016个独立的分子，这些分子对于大多数SELEXTM实验来讲是足够的。在序列设计中足够大的随机序列区域增加了每个合成的分子有可能代表一种独特序列的可能性。4氐聚核苷酸的起始文库可以通过DNA合成4义自动化学合成。为了合成随机序列，在每个核酸添加步骤加入全部四种核香的混合物，允许核苷随机结合。如上所述，在一个实施方案中，随机j氐聚核苷酸包4舌全部的随才几序列；然而在其他的实施方案中，随才几低聚核苷酸包括非随4几或部分随才几的序列排列。部分随才几序列可以通过在每个添加步骤力。入不同比率的四种核芬产生。低聚核苷酸的起始文库可以是RNA也可以是DNA，或者是取代的DNA或RNA。在RNA文库被用作起始文库的情况下，jt匕RNA文库通常由合成的DNA文库产生，随才几PCR扩增，然后^f吏用T7RNA合成酶或修饰的T8RNA合成酶体外转录DNA文库，最后纯化转录的文库。随后，在有利于结合的条件下，将RNA或DNA文库与靶分子混合，逐级反复结合、分离和扩增，使用相同的筛选计划，从而实质上达到任意希望的结合亲和性和选择性标准。更具体的，以包含核酸起始序列库的混合物为开端，SELEXtm方法包括如下步骤(a)在适于结合的情况下将混合物与靶分子接触；(b)从对靶分子有结合特异性的核酸中分离未结合的核酸；(c)解离核酸-靶分子复合物；(d)扩增从核酸-靶分子混合物中解离的核酸，/人而产生一种配4立体富集的核酸混合物；和(e)在每个循环中重复结合、分离、解离和扩增步骤，从而产生对于革巴分子有高特异性、高亲和性的核酸配体。在筛选RNA适体的情况下，SELEXTM方法进一步包括(i)在扩增步骤(d)之前，反转录从核酸-草巴分子复合物上解离下来的核酸；和(ii)在此过程从新开始前，转录步骤(d)扩增的核酸。在包含大量可能的序列和结构的核酸混合物的内部，对于给定的靶分子有较大范围的结合亲和性。例如，包括20个随机排列核苷的核酸混合物，可产生4加个可能的候选排列。其中对把分子具有较高亲和性(较低的解离常数)的核酸最有可能与靶分子结合。分离、解离和扩增之后，可产生富集高结合亲和性候选排列的第二核酸混合物。附加的筛选过程逐渐簿选出最佳配体，直到所得核酸混合物主要由一种或少数几种序列组成。这些序列可以作为纯配体或适体而克隆、测序和分别测定结合亲和性。重复进行筛选和扩增循环直到获得所需目标。在最常见的情况下，重复循环过程继续筛选/扩增步骤直至结合强度没有明显改善时为止。当样品为大约IO"个不同的核酸种类时通常使用这种方法，当样品为大约1018个不同的核酸种类时，也可以使用这种方法。通常，核酸适体分子经过5-20轮筛选过程，在一个实施方案中，只在最初的筛选步骤中引入杂质，在整个复制过程的中没有杂质引入。在一个SELEXTM实施方案中，篩选过程是非常有岁丈的，能够分离对选择的靶分子有最强结合能力的核酸配体，因此，只需要一步筛选扩增步骤。在例如层析过程中，可能发生这种有效的筛选，在层析过程中，核酸与固定在层析柱上的靶分子的结合能力使层析柱能够有效地筛选分离具有最高亲和性的核酸配体。在许多情况下，并不一定必须进行重复的SELEXTM步骤直至确定出单一核酸配体。革巴分子特异性核酸配体溶液可能包4舌一力矣核酸结构或部分，该片亥酸结构或部分具有大量反义序列和大量进4亍耳又^或添加之后核酸配体对革巴分子的亲和性没有明显改变的序列。在完成之前停止SELEXTM过程，可以确定核酸配体溶液族多凄丈成员的序列。已知多凄t核酸存在初级、二级和三级结构。结构或部分大多数属于非沃森克里克型相互作用的结构或部分是指发夹环、相称的和不相称的凸泡、，支扭结及大量同类物结合体。大多数已知的情况表明，这种部分能在少于30个核苷的核酸序列中形成。因此，通常优选带有相邻随机片段的SELEX过程起始于包含大约20-50个核苦随机片段的核酸序列，在一些实施方案中，起始于包含大约30-40个核苦随机片段的核酸序列。在一个实施例中，5'-固定:随机:3'-固定的序列包括大约30-50个核苷的随机序列。核心SELEXTM方法经过》务饰可以实现多种特歹未的目的。例如，美国专利第5,707,796号描述的使用SELEXTM与凝胶电泳相结合的方法筛选具有特歹未结构特点的核酸分子，例如弯曲DNA。美国专利第5,763,177号描述了以SELEXTM为基础的方法，此方法可用于筛选包含光活性基团的核酸配体，此光活性基团具有结合或光交写关能力，能够光活化靶分子。美国专利第5，496,938号描述了完成SELEXTM过程之后，获得改进的核酸配体的方法。美国专利第5,705,337号描述了共价结合配体和靶分子的方法。SELEXTM也可以用于获得能够与靶分子上超过1个位点结合的核酸配体，还可以用于获得包括非核酸物质的核酸配体，所述非核酸物质能与草巴分子特定位点结合。SELEXTM提供了一种分离和鉴定核酸配体的方法，所述配体能结合4壬意可视j巴分子，包括「大的和小的生物分子，例如核酸结合蛋白和能够与核酸结合作为其生物活性部分的蛋白，以及辅因子和其他小分子。例如美国专利第5,580,737号公开的核酸序列，此核酸序列是通过SELEXtm鉴定的，能够高亲和性结合咖啡因及其相近的类似物茶碱。反-SELEXTM是一种用于改进核酸配体对革巴分子特异性的方法，通过去除对一个或一个以上非靶分子物质有交叉反应性的核酸配体起作用。反-SELEXTM包括以下步骤(a)制备核酸的候选混合物；(b)使候选混合物与靶分子相接触，其中相对于候补混合物，对耙分子具有增加的亲和性的核酸就有可能从候补混合物的其他成分中分离出来；(c)将具有增加的亲和性的核酸从候补混合物的其他成分中分离出来；(d)从靶分子上将具有增加的亲和性的核酸解离下来；(e)将具有增加的亲和性的核酸与一个或一个以上非靶分子物质相接触，从而除去对非靶分子物质具有特异亲和性的核酸配体；和(f)扩增只对耙分子具有特异亲和性的核酸，产生核酸混合物，该混合物富集了对耙分子具有相对4交高亲和性和结合特异性的核酸序列。如上所述，重复进行篩选和扩增的SELEXTM循环直到获得所需目标产物。在4吏用核酸作为治疗剂和疫苗时会遇到一个潜在的问题#尤是，磷酸二酯形式的低聚核苦酸在表现出所需作用之前，会被体液中胞内和胞外酶4艮快的降解，所述胞内和胞外酶例如核酸内切酶和核酸外切酶。因此，SELEXTM方法包括识别包含修饰核香酸的高亲合性核酸配体，所述fl"饰核普酸赋予配体改进的特征，例如改进的体内稳定性或改进的给药特征。这种^f奮饰的例子包4舌在糖和/或磷酸盐和/或碱基位点处的化学取代。SELEXTM-识别的包含^f奮饰核苷酸的核酸配体在一些文献中有所描述，例如美国专利第5,660,985号，该专利描述了包含核苷酸书f生物的低聚核苷酸，此核苷酸纟汙生物在2'核4唐位点、5嘧，定位点和8噤呤位点存在化学修饰；美国专利第5,756,703号描述了包含不同的2'-修饰嘧啶的低聚核苷酸；和美国专利第5,580,737号，该专利描述了包含一种或一种以上4务饰核苷酸的高特异性核酸配体，其中^f奮饰核苷酸净皮2，-氨基(2'-NH2)、2'-氟代(2'-F)和/或2'-OMe取代。本发明构思之内的核酸配体的修饰包括但不局限于，提供其4也的化学基团，为核酸配体的碱基或整个核酸配体引入额外的电荷、极性、疏水性、氲键作用、静电相互作用、和流变性。产生能抵抗核酸酶的低聚核苷酸的修饰还可以包括一种或一种以上核苷酸间连接键取代、改变的糖、改变的碱基或其结合。这些修饰包括但不局限于2'-位点的糖基修饰，5-位点的嘧咬修饰，8-位点的噤呤修饰，外环胺修饰，4-硫代尿噤呤取代，5-溴代或5-减代尿嘧啶取代，骨架修饰，-危代磷酸酯或磷酸烷基酯修饰，曱基化和罕见的^咸基对结合例如等基线异胞嘧咬衍生物和异胍衍生物。<奮饰还可以包括3'和5'修饰例如封端。在一个实施方案中，提供了低聚核苦酸，其中P(O)O基团被P(O)S("硫代")，P(S)S("二硫代")，P(0)NR2("酰胺化")，P(O)R，P(O)OR',CO或CH2("formacetal")或3'-氨基(-NH-CH2-CH2-),其中每个R或R'分别是H或取代的或未被取代的烷基。连接体基团可以与相邻的核苷酸通过-O-,-N-，或-S-连接体相连。不是所有的1氐聚核苷酸内的连接体都是一样的。在经过一种或多种疏原子取代的磷酸二酯键中，这里使用的术语硫代磷酸酯包括一种或多种非桥氧原子。在进一步实施方案中，低聚核普酸包括修饰的糖基团，例如一个或一个以上羟基被卣素、脂肪基取代或功能化为醚或胺。在一个实施方案中，2'-位点的呋喃残基被0-甲基、O-烷基、O-丙烯基、S-烷基、S-丙烯基或卣素基团取代。文献，例如Sproat,etal.,Nucl.AcidRes.19:733-738(1991);Gotten,etal,Nucl.AcidRes.19:2629-2635(1991);和Hobbs,etal,Biochemistry12:5138-5145(1973)描述了2'-修饰的糖的合成方法。其他的修饰是本领域内普通才支术人员已知的。这种修饰可能是预SELEXTM过程修饰或后SELEXTM过程修饰(先前识别的未修饰配体的修饰)，或者这种修饰可能通过SELEXTM过程引入。预-SELEXTM过程修饰或通过SELEXTM过程引入的修饰产生的核酸配体，该核S吏配体既具有对其SELEXTM耙分子的特异性也具有改进的稳定性，例如体内稳定性。核酸配体的后-SELEXTM过程^修饰可以产生改进的稳、定性，例如，体内稳定性，且对4亥酸配体的结合力没有不利影响。SELEXTM方法包括将所选择的低聚核苷酸与另外选择的低聚核苷酸和非低聚核苷酸功能单元相结合，如在美国专利第5,637,459号和美国专利第5,683,867号所描述的一样。SELEX方法进一步包括，在诊断剂或治疗剂复合物中，将选择的才j酸配体与亲脂性或非免疫原性高分子化合物结合，如美国专利第6,011,020号、美国专利第6，051，698和PCT/^开的WO98/18480中所描述的一样。这些专利和申请教导了将宽范围内的形式或其他性质，与低聚核苷酸的有效的扩增和复制性质的结合，以及与其他分子的理想性质的结合。核酸配体通过SELEXtm方法识别小的柔性肽的方法也进行了研究。小肽具有柔性结构，且通常以多重构象体平衡的形式存在于溶液中，因此起初认为，由于在与柔性肽结合时会有构象熵损失，所以适体的结合亲和性可能受到限制。然而，美国专利第5,648,214号论证了核酸配体在溶液中对小肽的识别可能性，其中识别了一种对P物质具有高亲合性的RNA核酸配体，所述P物质是一种具有11个氨基酸的肽。如这里所述，对靶分子具有特异性和结合亲合性的本发明适体一^:通过SELEXTM过程筛选。然后，作为SELEXTM过程的一部分，筛选的与耙分子结合的序列^t可才喿作的最小化，从而确定具有所需结合亲合性的最小序列。筛选的适体序列和/或最小化适体序列通过进行序列随机诱变或直接诱变进行可操作的优化从而增加结合亲合性，或作为选择，确定在序列中那个位点对于结合活性是必不可少的。例如，"摻杂重筛选"过程可能用来研究适体内部的序列要求。在掺杂重筛选过程中，对合成并且退化的序列库进行筛选，其中此序列库是才艮据单一序列i殳计的。野生型核普酸的退化水平通常在70%到85%之间变化。通常，按照4参杂重篩选过禾呈可以观察到中性突变，{旦有时序列变化可以改进序列亲合性。另外，可以对与修饰序列结合的序列进行筛选过程，从而3急定适体分子，抵抗在体内的退化过程。2M奮饰的SELEXtm为了^f吏适体适合于用作治疗剂，优选通过廉价的合成方法合成该适体，并使其在体内具有安全性和稳定性。由于对核酸酶的降解作用敏感，野生型RNA和DNA适体在体内一般不稳定。如果需要的话，可以通过在2'-位点结合修饰基团来极大地增加对核酸酶降解作用的耐受性。2'-氟代和2'-氨基基团已经成功地从随后筛选出的适体中引入低聚核苦酸文库。然而这些f资饰;恢大地增加了合成适体产物的成本，并且，在某些情况下可能引起安全性考虑，这是由于，修饰的核苷酸可能通过{奮饰{氐聚核苦酸的降解作用和随后的此核苷酸作为DNA合成底物的4吏用，再循环进入宿主DNA之内。如同在某些实施方案中所4是供的，包含2'-0-甲基("2'-OMe)核苦酸的适体能够克服多种缺陷。包含2，-OMe的低聚核苷酸是具有核酸酶-耐受性的，且其合成过程是廉价的。虽然2'-OMe核苷酸在生物系统中是普遍存在的，但在生理条件下，天然的聚合酶不将2'-OMeNTPs作为底物结合，因此无需考虑2'-OMe核苷酸进入宿主DNA之内再循环的安全性。例如，在2002年12月3日递交的美国临时专利申i青第60/430,761号、2003年7月15号递交的美国临时专利申请第60/487,474号、2003年11月4号递交的美国临时专利申请第60/517,039号、2003年12月3日递交的美国专利申请第諮29，581号、2004年6月21号递交的名为"2'-OMe取代的核酸体外筛选方法"的美国专利申请第10/873,856号和2005年6月30日递交的名为"用于生产包含全2'-修饰的核酸转录产物的改进的材;阵和方法"美国临时专利申请第60/696,295号中，描述了用于产生T-修饰的适体的SELEXtm方法，这里提到的每篇文献通过在jt匕引i正而全文并入本文。本发明包括一种能结合血管性血友病因子并调节其功能的适体，所述血管性血友病因子包含修饰的核苷酸(例如，在2'位点具有修饰的核苦酸)，从而产生比未修饰的低聚核苦酸更稳定的低聚核苷酸，对酶催化降解和化学降解以及热降解和物理降解稳定。虽然在个别的文献中存在过包含2'-OMe的适体的例子(参见，例如，Ruckmanetal.，J.Biol.Chem,1998273,20556-20567-695),但这些适体是通过体外筛选修饰转录产物文库而生产的，其中修饰的转录产物的C和U残基是2'-氟代(2'-F)的，A和G残基是2'-OH化的。一旦识别到功能性序列，就试验每个A和G残基对2'-OMe耳又代的耐受性，之后重合成适体，使其具有耐受2'-OMe取代的A和G残基都为2'-OMe残基。虽然平均有大约20%的例外，但大部分通过这种两步方式产生的适体A和G残基能够耐受2'-OMe残基耳又代。因此，4吏用这种方法产生的适体往往包含二到四个2'-OH残基，其结果是，合成方法的稳定性与合成成本达到一种综合平衡的状态。将修饰的核苷酸引入转录反应，以该反应产生淨皮稳定的^f氐聚核苷酸以用于低聚核苷酸文库，通过SELEXtm方法(和/或其任何变型及改进方法，包括本文中所描述的)从该文库中筛选和富集适体，本发明的方法就省去了对筛选的适体《氐聚核苷酸进4亍稳定化的必要(例如，通过4务饰的核苦酸的对低聚核普酸进行再合成)。在一个实施方案中，本发明提供了一种包括ATP，GTP,CTP,TTP,和UTP核苷2'-OH,2'-F3，2'-脱氧，和2'-OMe修饰结合体的适体。在其他的实施方案中，本发明提供了包括ATP,GTP,CTP,TTP,和UTP核苷2'-OH，2'-F,2'-脱氧，2'-OMe，2'-NH2,和2'-甲氧基乙基修饰结合体的适体。在其他的实施方案中，本发明提供了包括56种ATP，GTP,CTP,TTP和UTP核苦2'-OH、2'-F,2，-脱氧，2'-OMe,2'-NH2和2'-曱氧基乙基修饰结合体的适体。本发明某些实施方案中2'-修饰的适体是通过使用修饰的聚合酶产生的，例如，经过修饰的T7聚合酶，与野生型聚合酶相比，此修饰的T7聚合酶对在2'-位置具有大量呋喃糖取代的修饰核苷具有丰支高的结合速率。例如，639位的酪氨酸残基变为苯丙氨酸残基的单一突变体T7聚合酶(Y639)可以方便的使用2'脱氧，2'氨基-,和2'氟代-核苷三磷酸(NTPs)作为底物，在许多应用过程中广泛地用于修饰的RNAs合成。然而，据才艮道，此突变体T7聚合酶不能容易的使用(即，结合)具有大量2'取代物的NTPs,例如2'-OMe或2'-叠氮(N3)取代。为了结合具有大量2'取代物的NTPs，报道公开了一种T7聚合酶双突变体(Y639F/H784A),此T7聚合酶双突变体在具有Y639突变之外，其784位的组氨酸变为丙氨酸残基，在有限的情况下，此T7聚合酶双突变用于结合修饰的嘧啶NTPs。参见Padilla，R.andSousa,R.,NucleicAcidsRes.，2002，30(24):138。在有限的情况下，使用Y639F/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶来结合修饰的噪呤或嘧，定NTPs,例如，2，-OMeNTPs,但是用于转录的话，需要一种2'-OHGTP刺突。参见Burmeisteret.al.，ChemistryandBiology,2005,12:25-33。文献Padillaetah,NucleicAcidsResearch,2002,30:138报道了784位组氨酸^皮丙氨酸残基取^的单一突变T7聚合酶(H784)。在Y639F/H784A双突变和H784A单一突变T7聚合酶中，一个小氨基酸残基，例如丙氨酸的改变能够结合大量核苦底物，例如，2'-0-甲基耳又^C的核苷。参见Chelliserry,K.andEllington,A.D.，NatureBiotech,2004，9:1155-60。也才艮道了其他的T7聚合酶，这些聚合酶在T7RNA聚合酶活性位点具有突变，更易于结合大量2，-修饰的底物，例如，639位酪氨酸残基变为亮氨酸的T7聚合酶单一突变体(Y639L)。然而，这种突变在增力。底物特异性的同时;f主往牺牲了一部分结合活性，从而导致较低的转录产量。参见PadillaRandSousa，R.,NucleicAcidsRes.，1999,27(6):1561。总体而言，i现已发5见，在这里7>开的条件下，Y639单一突变体可以用于结合除了GTP之外所有2'-OMe取代的NTPs,Y639F/H784A，Y639F/H784A/K378R,Y639L/H784A，和Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶可以用于结合包括:GTP在内的所有2'-OMe取代的NTPs。当在这里7>开的条件下4吏用时，可期望的是H784A单一突变体具有和Y639F和Y639F/H784A相似的性质。2，-修饰的低聚核苦酸可以全部由修饰的核苷合成，或具有一种<奮饰核苦子集。所有的核芬都可以是被相同的修饰体修饰的。所有的核苷也可以是被不同的f^饰体》务饰的，例如，包含同一石威基的所有核苦可以含有一个类型的修饰，而含有其他碱基的核苦可以含有不同类型的^^饰。所有噤呤核苦可以含有一个类型的修_饰(或未修饰)，而所有嘧啶核苷含有其他的、不同类型的修饰(或未修饰)。这样，通过任意修饰的结合，包括例如核糖核苷(2'-OH)、脱氧核糖核苷(2，-脱氧)、2，-F和2，-OMe核苦的结合，可以产生转录产物或转录产物文库。包含2，-OMeU和C和2'-OHA和G的转录混合物被叫做"rRmY"混合物，从其中筛选的适体叫做"rRmY，，适体。包含脱氧A和G和2，-OMeU和C的转录混合物被叫做"dRmY，，混合物，从其中筛选的适体叫做"dRmY，，适体。包含2，-OMeA、U和C和2，-OHG的转录混合物被叫做"rGmH"混合物，从其中筛选的适体叫估文"rGmH"适体。交替包含2，-OMeA、C、U和G及2，-OMeA、U和C和2，-FG的转录混合物^皮叫做"交替混合物"，从其中筛选的适体叫做"交替混合物"适体。包含2，-OMeA、C、U和G且其中高达10%的G是核糖核酸的转录混合物被叫啦支"r/mGmH"混合物，从其中筛选的适体叫條"r/mGmH"适体。包含2，-OMeA、U和C和2，-FG的转录混合物-故叫做"fGmH，，混合物，从其中筛选的适体叫做"fGmH"适体。包含2'-OMeA、U和C和脱氧G的转录混合物被叫做"dGmH"混合物，从其中筛选的适体叫做"dGmH"适体。包含脱氧A和2，-OMeC、G和U的转录混合物净皮叫l故"dAmB，，混合物，从其中筛选的适体叫做"dAmB，，适体，包含所有2'-OH核苷的转录混合物叫^敗"rN"混合物，从其中筛选的适体叫做"rN"、"rRrY"或"RNA"适体。包含2，-OH三磷酸腺苷和三磷酸鸟苷及脱氧三磷酸月包苦和三磷酸胸苦的转录混合物叫^故rRdY混合物，/人其中筛选的适体叫做"rRdY"适体。"mRmY"适体是除了起始核苷为2'-氲氧化核苦之外，只包含2'-OMe核苷的适体。一种优选地实施方案包括2'-OH,2'-脱氧和2'-OMe核苷的任意结合。其他的实施方案包括2，-脱氧和2，-OMe核普的任意结合。另外的实施方案包括2，-脱氧和2，-OMe核苷的任意结合，其中嘧。定是2，-OMe1奮饰的(例如dRmY，mRmY或dGmH)。本发明适体中修饰核苷的引入可以在筛选过程之前完成(例如，预-SELEXTM修饰作用)。作为选择，经过预-SELEXTM修饰作用亏1入4务饰核苦的本发明适体可以被后-SELEXtm修飾过程进一步4,饰(即，预-SELEXTM修饰作用之后的后-SELEXTM修饰作用)。预-SELEXTM修饰作用产生的修饰核酸配体对SELEXtm耙分子具有特异性和改进的体内稳定性。后-SELEXTM修饰作用，即修饰作用(例如对具有预-SELEXT^f多饰作用引入核苷的前面鉴定的配体进行切^殳、消除、取代或附加核酸4务饰)可以进一步改善体内稳定性，且不会负面影响具有预-SELEXTM修饰作用引入核苦的核酸配体的结合能力。在聚合酶接受2，-修饰的NTPs的情况下，为了产生2'修饰的(例如2，-OMe)RNA转录产物，可以使用Y693F、Y693F/IC378R、Y693F/H784A、Y693F/H784A/K378R、Y693L/H784A、Y693L/H784A/K378RY639L或Y639L/K378R突变体T7RNA聚合酶。优选的聚合酶是Y639L/H784A突变体T7RNA聚合酶。另一种优选的聚合酶是Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶。其他的聚合酶，尤其是对大量2，-底物具有高耐受力的聚合酶也可以用于本发明。当在这里公开的条件下用于直接模版聚合时，Y639L/H784A或Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶可以用于引入所有2'-OMeNTPs，包括GTP,且其转录产量高于4吏用Y639F,Y639F/K378R,Y639F/H784A，Y639F/H784A/K378R,Y639L或Y639L/K378R突变体T7RNA聚合酶所能达到的转录产量。Y639L/H784A和Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA可以，但并不是必须与2'-OHGTP—起使用，从而达到高产量2，-修饰的低聚核苦酸，例如，包括2，-OMe修饰的低聚核苦酸。已经确定了一些对这里开的方法所使用的转录条件十分重要的因素。例如，当在DNA转录模版的5'末端引入一种引导序列时，可以观察到fl"饰转录产物的产量有所增加。此前导序列通常长度为6-15个冲亥苦，可以全部由噤P令组成，或者为噤呤或嘧^t冲亥苦的混合物。转录过程可以分为两个阶^::第一阶段是开始，在此阶l殳，将一种NTP加入到GTP(或其他取代的鸟噤呤)的3，-氢氧基末端，/人而产生一种双核普，随后，此双核苦延长大约10-12个核苷；第二阶段是延长，在此阶段，在第一阶段的基础上进行转录过程，加入大约10-12个核苦。已经发现，将少量2'-OHGTP加入包含过量2'-OMeGTP的转录混合物中，足以使聚合酶使用2，-OHGTP起始转录过程，但一旦转录过程进入延长阶段，由于2，-OMeGTP与2'-OHGTP的区别越来越不明显，相对2'-OHGTP来讲过量的2，-OMeGTP导致萍皮引入的主要是2，-OMeGTP。在将2，-OMe取代核苷引入转录过程中的其他重要因素是转录混合物中二价镁离子和二价锰离子的使用。已经发现，不同的氯化镁和氯化锰的结合浓度能够影响2，-O-甲基化转录产4勿的产量，最优化的氯化4美和氯化锰的浓度依赖于转录反应混合物中复合二^f介金属离子的NTPs的浓度。为了获得最高产量的最大2，-0-曱基化转录产物(即，所有的A、C和U以及大约90%的G是2'-OMe化的核苦)，当每种NTP的浓度为0.5mM时，优选大约5mM的氯化镁和1.5mM的氯化锰。当每种NTP的浓度为1.0mM时，优选大约6.5mM的氯化4美和2.0mM的氯化锰。当每种NTP的浓度为2.0mM时，优选大约9.5mM的氯化镁和3.0mM的氯化锰。在任意情况下，在这些浓度高达两倍的偏差范围内，仍能得到足够量的修饰转录产物。用GMP或鸟噤呤、或其他的非2'-OMe非三磷酸盐引发的转录过程是同样重要的。其作用源自聚合酶对起始核苦的特异性。作为结果，用这种方式产生的所有转录产物的5'-末端核苷可能都是2'-OHG。优选的GMP(或鸟噪呤)浓度是0.5mM,更优选1mM。此夕卜，已经发现在转录反应中，包括的PEG,优选PEG-8000对于修饰核苷的最佳化f1入是有帮助的。为了将2'画OMeATP(100%),UTP(100%),CTP(100%)和GTP(90%)("r/mGmH")最大的引入转录产物中，优选下列条件HEPES纟爰冲液200mM,DTT40mM,亚精胺2mM，PEG-800010%(w/v),TritonX-1000.01%(w/v),MgCl25mM(当每种2'國OMeNTP的浓度都是1.0mM时，MgCb为6.5mM),MnCl21.5mM(当每种2'-OMeNTP的浓度都是1.0mM时，MnCl2为2.0mM),2'-OMeNTP(每种)500[xM(更优选为1.0mM)，2'-OHGTP30^M，2'-OHGMP500jiM,pH值为7.5，Y639F/H784AT7RNA聚合酶200nM，无才几焦磷酸酶5units/ml,且全部为噤呤的前导序列长度至少为8个核苷。这里使用的一单位Y639F/H784A突变体T7RNA聚合酶(或《壬何其它在此杀又述的突变体T7RNA聚合酶)的定义是，在r/mGmH条件下，向转录产物中引入1nmole2'-OMeNTPs所需的酶的量。这里<吏用的一单位无才几焦^,酸酶的定义是，在25。C，pH为7.2的条件下，每分钟释i文l.O摩尔无才几正磷酸盐所需的酶的量。为了将2'-OMeATP,UTP和CTP("rGmH")最大的引入(100%)转录产物中，优选下列条件HEPES緩沖液200mM,DTT40mM,亚并奮胺2mM,PEG-800010%(w/v),TritonX-1000.01%(w/v),MgCl25mM(当每种2'-OMeNTP的浓度都是2.0mM时，MgCl2为9.5mM),MnCl21.5mM(当每种2'-OMeNTP的浓度都是2.0mM时，MnCl2为3.0mM),2'-OMeNTP(每种)500(更优选为2.0mM),pH值为7.5,Y639FT7RNA聚合酶200nM，无机焦磷酸酶5units/ml，且全部为噪呤的前导序列长度至少为8个核苷。为了将2'-OMeATP(100%),2'画OMeUTP(100%),2'-OMeCTP(100%)和2'-OMeGTP(100%)("mRmY")最大的引入寿争录产物中，优选下列条件HEPES緩冲液200mM,DTT40mM,亚精胺2mM,PEG-800010%(w/v),TritonX-1000.01%(w/v),MgCl28mM,MnCl22.5mM,2'-OMeNTP(每种)1.5mM,2'醒OHGMP1mM,pH值为7.5,Y639L/H784A/K378R突变体T7RNA聚合酶200nM,无机焦磷酸酶5units/ml，和一种在衍生的转录条件下增加转录产量的前导序列。在一个实施方案中，前导序列是全部为噤呤的前导序列。在另一个实施方案中，前导序列是噤呤和嘧啶的混合物。这里4吏用的一单位无才几焦z畴酸酶的定义是，在25。C,pH为7.2的条件下，每分钟释放l.O摩尔无才几正磷酸盐所需的酶的量。为了将2'-OMeUTP和CTP("rRmY")最大的引入(100%)转录产物中，优选下列条件HEPES緩冲液200mM,DTT40rnM，亚精胺2mM，PEG-800010%(w/v)，TritonX-1000.01%(w/v)，MgCl25mM(当每种2'-OMeNTP的浓度都是2.0mM时，MgCl2为9.5mM),MnCl21.5mM(当每种2'_OMeNTP的浓度都是2.0mM时，MnCl2为3.0mM),2'-OMeNTP(每种)500nM(更优选为2-0mM),pH值为7.5,Y639F/H784AT7RNA聚合酶200nM,无4几焦磷酸酶5units/ml,且全部为嘌呤的前导序列长度至少为8个核苦。为了将2'-OMe脱氧ATP和GTP及2'-OMeUTP和CTP("dRmY")最大的引入(100%)转录产物中，优选下列条件HEPES緩冲液200mM,DTT40mM，精胺2mM,亚精胺2mM,PEG-800010%(w/v),TritonX画1000.01%(w/v)，MgCl29.5mM，MnCl23.0mM,2'画OMeNTP(每种)2.0mM,pH值为7.5,Y639FT7RNA聚合酶200nM，无机焦磷酸酶5units/ml,且全部为噤呤的前导序列长度至少为8个核苷。为了将2'-OMeATP,UTP和CTP及2'-FGTP("fGmH")最大的引入(100%)转录产物中，优选下列条件HEPES緩冲液200mM,DTT40mM,亚精胺2mM,PEG-800010%(w/v)，TritonX-1000.01%(w/v)，MgCl29.5mM,MnCl23.0mM,2'-OMeNTP(每种)2.0mM,pH值为7.5，Y639FT7RNA聚合酶200nM,无机焦磷酸酶5units/ml,且全部为嘌P令的前导序列长度至少为8个核苷。为了将2'-OMe脱氧ATP及2'-OMeUTP，GTP和CTP("dAmB")最大的引入(100%)转录产物中，优选下列条件HEPES緩沖液200mM,DTT40mM，亚精胺2mM,PEG-800010%(w/v),TritonX-1000.01%(w/v),MgCl29.5mM,MnCl23.0mM,2'画OMeNTP(每种)2.0mM,pH值为7.5,Y639FT7RNA聚合酶200nM,无斗几焦石粦酸酶5units/ml,且全部为噤呤的前导序列长度至少为8个核苦。对于上述每种情况，(a)转录优选在大约20。C到大约5(TC,优选从大约30°C到45r更优选在大约37。C温度下进行至少两小时，和(b)使用50-300nM的双链DNA转录模板(在第一轮，使用200nM模板来增加多样性(对于dRmY转录过程使用300nM模丰反))，对于随后几轮，〗吏用大约50nM的双链DNA转录模板，在这里描述的条件下，进行1/10稀释的优化PCR反应。优选的DNA转录才莫板在下面有所描述(在全部是2'-OMe条件下进4亍ARC254和ARC256,在rRmY条件下进行ARC255转录)。序列号15'<^TCGATGCTAGTCGTAACQATCCNNNNNNNHNJJWNNNNNNNNNNNNNNNNNCGA0AAO3TllCTCTCCTClCCCTATAGTQAGTCGTATTAd'序列号25'"CATGCATCGCGACTGACTAGCaajNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTDCCTATAGTGAGTCGTATTA-3'序列号35'"CATCGATCGATCGATCOACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3'在本发明的rN转录条件下，转录反应混合物包括2'-OH三磷酸腺苷(ATP)、2'-OH三磷酸鸟苷(GTP)、2'-OH三磷酸胞普(CTP)和2'-OH三磷酸尿苷(UTP)。使用本发明rN转录混合物生产的修-饰的低聚核苷酸基本上包4舌全部的2'-OH腺嘌呤、2'-OH鸟噤呤、2'-OH胞嘧啶和2'-OH尿嘧啶。在rN转录作用的一种优选实施方案中，产生的修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中至少80%的腺嘌呤核苷是2'-OH腺噤呤，至少80%的鸟噤呤核苷是2'-OH鸟噪呤，至少80y。的胞嘧啶核苷是2'-OH胞嗜咬，至少80%的尿嘧，定核苷是2'-OH尿嘧p定。在rN转录作用的一种更优选的实施方案中，本发明产生的经修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，至少90%的腺噤呤核苷是2'-OH腺噪呤，至少90%的鸟嘌呤核苷是2'-OH鸟嘌呤，至少90%的胞嘧啶核苦是2'-OH胞嘧咬，至少90%的尿嘧啶核苷是2'-OH尿嘧啶。在rN转录作用的一种最优选的实施方案中，本发明产生的修饰低聚核香酸包括一种序列，在此序列中，100。/。的腺嘌呤核普是2'-OH腺嘌呤，100%的鸟嘌呤核苷是2'-OH鸟嘌呤，100%的胞嘧咬核普是2'-OH胞嘧啶，100%的尿嘧啶核苦是2'-OH尿嘧咬。在本发明rRmY转录条件下，转录反应混合物包括2'-OH三磷酸腺苦、2'-OH三磷酸鸟苷、2'-OH三磷酸胞苦和2'-OH三磷酸尿苷。使用本发明rRmY转录混合物生产的修饰的低聚核普酸基本上包4舌全部的2'-OH腺噪呤、2'-OH鸟嘌呤、2'-OMe胞嘧啶和2'-OMe尿嘧。定。在一种优选实施方案中，产生的f^饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中至少80%的腺噤呤核苦是2'-OH腺嘌呤，至少80。/。的鸟噪呤核苷是2'-OH鸟噤呤，至少80%的胞嘧啶核苷是2'-OMe胞嘧啶，至少80。/。的尿嘧啶核苷是2'-OMe尿嘧，定。在一种更优选的实施方案中，本发明产生的经f资饰的低聚核苷酸包4舌一种序列，在此序列中，至少90。/。的腺嘌呤核苷是2'-OH腺噤呤，至少90%的鸟。票呤核苦是2'-OH鸟噤呤，至少90%的胞嘧，定核苷是2'-OMeJ包嘧咬，至少90%的尿嗜咬核苦是2'-OMe尿嘧啶。在一种最优选的实施方案中，本发明产生的修饰低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，100。/。的腺噤呤核苦是2'-OH腺噪呤，100%的鸟噤呤核苷是2'-OH鸟"票呤，100%的胞嗜咬核苷是2'-OMe胞嘧咬，100%的尿嘧口定核苦是2'-OMe尿嘧啶。在本发明dRmY转录条件下，转录反应混合物包括2'-脱氧三磷酸腺苷、2'-脱氧三磷酸鸟苷、2'-0-曱基三磷酸胞苷和2'-0-曱基三磷酸尿苷。使用本发明dRmY转录混合物生产的修饰的低聚核苷酸基本上包括全部的2'-脱氧腺噤呤、2'-脱氧鸟噤呤、2'-0-曱基胞嘧啶和2'-0-曱基尿嘧啶。在一种优选实施方案中，产生的修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中至少80%的腺嘌呤核苦是2'-脱氧腺噤呤，至少80%的鸟噤呤核苦是2'-脱氧鸟嘌呤，至少80%的胞嘧啶核苷是2'-0-曱基胞嗜啶，至少80%的尿嘧咬核苷是2'-0-甲基尿嘧啶。在一种更优选的实施方案中，本发明产生的经修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，至少90%的腺噤呤核苷是2'-脱氧腺噤呤，至少90%的鸟噤呤核苷是2'-脱氧鸟噪呤，至少90%的胞嘧啶核苷是2'-0-曱基胞嘧啶，至少90%的尿嘧啶核苷是2'-0-甲基尿嘧啶。在一种最优选的实施方案中，本发明产生的i奮饰低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，100%的腺嘌呤核苷是2'-脱氧腺噤呤，100%的鸟嘌呤核苷是2'-脱氧鸟嘌呤，100%的胞嘧咬核苷是2'-0-甲基胞嘧啶，100%的尿嘧啶核苦是2'-0-甲基尿嘧咬。在本发明rGmH转录条件下，转录反应混合物包括2'-OH三磷酸鸟苷、2'-0-甲基三磷酸胞苷、2'-0-曱基三磷酸尿苷和2'-0-曱基三磷酸腺苷。使用本发明rGmH转录混合物生产的修饰的低聚核苦酸基本上包括全部的2'-OH鸟噤呤、2'-0-曱基胞嘧啶、2'-O-曱基尿嘧啶和2'-0-甲基腺嘌呤。在一种优选实施方案中，产生的》务饰的J氐聚核苦酸包4舌一种序列，在此序列中至少80%的鸟嘌^令核苷是2'-OH鸟嘌呤，至少80%的胞嘧咬核苷是2'-0-曱基胞嘧啶，至少80%的尿嘧啶核苷是2'-0-曱基尿嘧啶，至少80%的腺噤呤核苷是2'-0-甲基腺嘌呤。在一种更优选的实施方案中，本发明产生的经<多饰的低聚核苦酸包括一种序列，在此序列中，至少卯％的鸟噤呤核苷是2'-OH鸟噤呤，至少90%的胞嘧咬核苷是2'-0-甲基胞嘧啶，至少90%的尿嘧啶核苷是2'-0-曱基尿嘧咬，至少90%的腺噪呤核苷是2'-0-曱基腺嘌呤。在一种最优选的实施方案中，本发明产生的修饰低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，100%的鸟嘌呤核苷是2'-OH鸟噤呤，100%的胞嘧啶核苦是2'-0-甲基胞嘧啶，100%的尿嘧啶核苷是2'-0-甲基尿嘧啶，100%的腺噤呤核苷是2'-0-甲基腺噤呤。在本发明r/mGmH转录条件下，转录反应混合物包括2'-0-曱基三磷酸腺苷、2'-0-曱基三磷酸胞苷、2'-0-甲基三磷酸鸟苷、2'-0-曱基三磷酸尿苷和2'-OH三磷酸鸟苦。使用本发明r/mGmH转录混合物生产的修饰的低聚核苷酸基本上包括全部的2'-0甲基腺噤呤、2'-0-甲基胞嘧啶、2'-0-曱基鸟噤呤、2'-0-甲基尿嘧咬，其中，鸟嘌呤核苷至多包括大约10%的2'-OH鸟噤呤。在一种优选实施方案中，本发明r/mGmH产生的修饰的低聚核苦酸包括一种序列，'在此序列中至少80%的腺嘌呤核苷是2'-0-甲基腺噤呤，至少80%的胞嘧咬核苷是2'-0-曱基胞嗜啶，至少80%的鸟噤呤核苷是2'-0-曱基鸟嘌呤，至少80%的尿嘧啶核苷是2'-0-曱基尿嘧啶，且不超过10%的鸟嘌呤核苷是2'-OH鸟噪呤。在一种更优选的实施方案中，本发明产生的经修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，至少90%的腺噤呤核苷是2'-0-曱基腺噪呤，至少90%的胞嘧啶核苷是2'-0-曱基胞嘧啶，至少90。/。的鸟嘌呤核香是2'-OH鸟噤呤，至少90%的尿嘧啶核苦是2'-0-甲基尿嘧咬，且不超过10%的鸟嘌呤核苷是2'-OH鸟噤呤。在一种最优选的实施方案中，本发明产生的修饰低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，100%的腺嘌呤核苷是2'-0-甲基腺嘌呤，100%的胞嘧啶核普是2'-0-曱基胞嘧啶，90%的鸟嘌呤核苷是2'-0-曱基鸟噪呤，100%的尿嗜啶核苦是2'-0-曱基尿嘧啶，且不超过10%的鸟噤呤核苦是2'-OH鸟。票呤。在本发明mRmY转录条件下，转录反应混合物只包括2'-0-曱基三磷酸腺苷、2'-0-甲基三磷酸胞苷、2'-0-甲基三磷酸鸟苷和2'-0-甲基三磷酸尿苷。使用本发明mRmY转录混合物生产的修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，100%的腺嘌呤核苷是2'-0-甲基腺噤呤，100%的胞嘧啶核苦是2'-0-曱基胞嘧咬，100%的腺噪呤核苷是2'-0-曱基腺噤呤，100%的尿嗜咬核苦是2'-0-甲基尿嘧咬。在本发明fGmH转录条件下，转录反应混合物包括2'-0-甲基三磷酸腺苷、2'-0-甲基三磷酸尿苷、2'-0-曱基三磷酸胞苦和2'-F三磷酸鸟苷。使用本发明fGmH转录条件生产的修饰的低聚核苷酸基本上包括全部的2'-0画甲基腺噤呤、2'画0画曱基尿嗜咬、2'-0画甲基胞嘧啶和2'-F鸟噤呤。在一种优选实施方案中，产生的修饰的低聚核苷酸包4舌一种序列，在此序列中至少80%的腺嚯呤核苷是2'-0-Me腺噤呤，至少80%的尿嘧夂核普是2'-0-曱基尿嘧啶，至少80%的胞嘧啶核苷是2'-0-曱基胞嗜啶，至少80%的鸟噤呤核苷是2'-F鸟嘌呤。在一种更优选的实施方案中，本发明产生的经^奮饰的^f氐聚核苦酸包4舌一种序列，在此序列中，至少90%的腺嘌呤核苷是2，-0-Me腺噪呤，至少90%的尿嘧啶核苷是2'-0-甲基尿嘧啶，至少90%的胞嘧啶核苷是2'-0-甲基胞嘧咬，至少90%的鸟嘌呤核苷是2'-F鸟噤呤。在一种最优选的实施方案中，本发明产生的修饰低聚核苦酸包括一种序列，在此序列中，100%的腺嘌呤核苷是2'-0-Me腺噪呤，100%的尿嗜咬核苦是2'-0-曱基尿嘧啶，100%的胞嘧啶核苦是2，-0-甲基胞嘧啶，100。/。的鸟噤呤核苷是2'-F鸟噤呤。在本发明dAmB转录条件下，转录反应混合物包4舌2'-脱氧三磷酸腺苷、2'-0-曱基三磷酸胞苷、2'-0-曱基三磷酸鸟苷和2'-0-曱基三磷酸尿苦。使用本发明dAmB转录混合物生产的修饰的低聚核苷酸基本上包括全部的2'-脱氧腺噪呤、2'-0-甲基胞嘧啶、2，-0-曱基鸟嘌呤和2，-0-曱基尿嘧啶。在一种优选实施方案中，产生的<奮饰的<氐聚核苦酸包括一种序列，在此序列中至少80%的&复噤呤核苦是2'-脱氧腺嘌呤，至少80%的胞嘧咬核苷是2'-0-曱基胞嘧啶，至少80%的鸟嘌呤核苷是2'-0-甲基鸟噤呤，至少80%的尿嘧啶核苷是2'-0-曱基-尿嘧啶。在一种更优选的实施方案中，本发明产生的经修饰的低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，至少90%的腺噤呤核苷是2'-脱氧腺噤呤，至少90%的胞嘧咬核苦是2'-0-曱基胞嘧啶，至少卯％的鸟噤呤核普是2'-0-曱基鸟噤呤，至少90%的尿嘧咬核苦是2'-0-甲基-尿嘧"定。在一种最优选的实施方案中，本发明产生的修饰低聚核苷酸包括一种序列，在此序列中，100%的腺噤呤核苷是2'-脱氧腺嘌呤，100%的胞嗜啶核苷是2'-0-曱基月包嘧吱，100%的鸟嘌呤核苦是2'-0-曱基鸟噤呤，100%的尿嘧咬核苷是2'-0-甲基-尿嘧啶。在每种情况下，转录产物随后进入SELEXTM过程从而鉴定适体，和/或从而确定对给定的靶分子有特异性结合能力的保藏序列。所得序列已经经过部分稳定化过程，从后SELEXTM过程中除去这一过程从而得到优化的适体序列和高度稳定化的适体。2'-OMeSELEX过程的另一个优点是，所得序列可能含有序列所需的少量2'-OH核苷，也可能不含有。2'OH核酸残余物可以通过进行后SELEXTM《奮饰而除去。如下所述，在除了上述优化的条件之外的条件下，获得的全部引入2'耳又代核酸的转录产量比较低，但仍然有效。例如，上述砵争录条1牛的改变包^舌HEPES緩冲液浓度可以从0M变化到1M。本发明还预计到可以使用其他pKa值在5-10之间的緩冲试剂，包括，例如三-羟曱基-氨基曱烷。DTT浓度可以在0-400nM范围内。本发明的方法还提供了其他还原剂的使用，包括，例如，巯基乙醇。亚4青胺和/或精胺的浓度可以在0-20nM范围内。PEG-8000的浓度在0-50%(w/V)范围内。本发明的方法还提供了其他亲水性聚合物的使用，包括例如，其他分子量的PEG或其他的聚烯基二醇。TritonX-100的浓度在0-0.1。/o(w/v)范围内。本发明方法还提供了其他的非离子型去污剂的使用，包括例如，其他的去污剂包4舌其<也的TritonX去污剂。MgCl2的浓度在0.5mM到50mM范围内。MnCl2的浓度在0.15mM到15mM范围内。MgCl2和MnCl2必须以4笛述的范围存在，在优选地实施方案中，MgCl2:MnCl2存在的浓度比大约为10:3，优选的，该比率为大约3-5:1，更优选地，该比率为大约3-4:l。2'-OMeNTP的浓度(每种NTP)在5nM到5mM范围内。2'-OHGTP的浓度在0pM到300j^M范围内。2'-OHGMP的浓度在0到5mM范围内。pH值在6-9的范围内。本发明的方法可以在大多数能够结合小务饰核苦的聚合酶具有活性的pH范围内实现。另外，在转录,瓦应条件下，本发明的方法提供了螯合剂的任选使用，螯合剂包括，例如，EDTA,EGTA,和DTT。适体药物化学适体药物化学是一种适体改进^支术，在此才支术中能够化学合成一系列适体变异体。通过引入单一的取代基与母适体相区別，同时，变异体之间由于取代的位置不同而不同。随后，在这些变异体之间，变异体与母适体之间进行比较。其性质的改进具有非常重要的影响，这表明只需要引入一种单一取代基，就可以达到某种特殊的治疗剂标准。作为选择，从单一变异体系列获得的信息可以用来设计进一步的变异体系列，在此进一步的变异体系列中，同时引入了一种以上的取代基。在一个设计方案中，排列所有的单一取代基变异体，选择最上面的4种单一取代变异体，合成并分析这4种变异体的全部二倍(6)、三4咅(4)和4倍(1)结合体。在第二设计方案中，将最佳单一取代变异体作为新的母体，合成并分析包括这种最高排列单一取代突变体的所有可能的双取代变异体。也可以4吏用其他的方案，这些方案可以重复使用使取代基的数量逐步增加，同时，继续鉴定这些进一步改进的变异体。适体药物化学尤其可以用作研究将取代基局部引入，而不是整体引入的方法。由于适体是从转录过程产生的文库中制得的，在SELEXTM过程中任何取代基的引入都必须是整体引入。例如，如果需要将硫代磷酸4定引入核苷中，则只能在每个A(或每个G、C、T、U等等)位点都引入(整体取代)。只需要在某些A位点(或每个G、C、T、U等等)引入硫代磷酸键(局部取代)而其他的A位点不耐受此取^f戈的适体，不能通过这一过程方^f更的制得。适体药物化学过程可以利用多种取代基，这些取代基只受到作为固相合成试剂的生成能力和将其引入低聚体合成方案的能力的限制。此过程当然不仅限于核苷。适体药物化学方案可能包括能够引入空间位阻、疏水性、亲水性、亲脂性、疏油性、正电荷、负电荷、中性电荷、两性离子、极性、抗核酸酶能力、构象刚性、构象柔性、蛋白结合性质、聚集作用等等的取代基。适体药物化学方案可能包括碱基修饰、糖修饰或磷酸二酯键修饰。当考虑用于治疗剂适体领域可能会产生有益作用的取代基的种类时，引入的取代基需要属于下列类别的一种或一种以上(1)在体内已经存在的取代基，例如，2，-脱氧、2，-核、2，-0-曱基噤呤或嘧，定或5-曱基胞嘧，定。(2)取代基是已经批准的治疗剂的一部分，例如，硫>磷酸键连接的低聚核苷酸。(3)能够被水解或降解为上述两类中的一类的取代基，例如，甲基膦酸酯连接的^f氐聚核苦酸。本发明的vWF适体包括这里描述的通过适体药物化学制得的适体。血管性血友病因子特异性结合适体本发明的材料包括一系列长度在29到76核苷之间，能特异性结合血管性血友病因子的核酸适体。在一个实施方案中，本发明的材料包括一系列长度在29到76核苷之间，能特异性结合血管性血友病因子的核酸适体，此适体功能性调节，例如，阻断血管性血友病因子在体内和/或细胞基试验中的活性。这里描述了能够特异性结合和调节血管性血友病因子全长和/或血管性血友病因子Al区域的适体。这些适体提供了一种低毒性、安全和有效的方式来治疗和/或子页防心血管疾病或不适。在一个实施方案中，本发明的适体用作治疗和/或预防冠状动脉疾病的方法，其中冠状动脉疾病包括任意一种选自动脉血检症和急性冠状动脉综合症的疾病，例如不稳定心绞痛和心肌梗塞，众所周知，这些疾病的病因是血管性血友病因子调节的血小板凝聚，或者这些疾病与血小板凝聚作用相关。在特殊的实施方案中，本发明的适体用作治疗和/或预防冠状动脉疾病的方法，所述疾病包括选自动l^血栓症和急性冠状动脉综合症的疾病，例如不稳定心绞痛和心肌梗塞的任意一种疾病，总所周知，这些疾病的病因是血管性血友病因子调节的血小板凝聚，或者这些疾病与血小板凝聚作用相关，同时，血小板凝聚将流血的副作用减到最小。在另一个实施方案中，本发明的适体用作治疗和/或预防外周血管疾病的方法，所述外周血管疾病的病因是血管性血友病因子调节的血小板凝聚，或者这些疾病与血小板凝聚作用相关。在一种特殊的实施方案中，本发明的适体用作治疗和/或预防外周血管疾病的方法，总所周知，这些疾病的病因是血管性血友病因子调节的血小板凝聚，或者这些疾病与血小板凝聚作用相关，优选地，同时，血小板凝聚将流血的副作用减到最小。在另一个实施方案中，本发明的适体用作治疗和/或预防脑血管疾病的方法，所述疾病包括选自短暂性脑缺血发作、中风和和颈动脉狭窄的任意一种疾病，总所周知，这些疾病的病因是血管性血友病因子调节的血小板凝聚，或者这些疾病与血小板凝聚作用相关，优选地，同时，血小板凝聚将流血的副作用减到最小。进一步讲，在患者进4亍经皮冠心病介入治疗之前，其间和/或之后，本发明的适体对于在患者体内抑制血管性血友病因子调节的血小^反凝聚是有效的，所述经皮冠心病介入治疗包括血管成形术、血栓溶解剂治疗或冠状动脉架桥术。在患者进4亍冠状动脉架桥术之前、其间和/或之后，本发明的适体对于维持患者体内血管畅通也是有效的。本发明的适体对于治疗正在进4亍透牙斤的病人也是有效的。本发明的适体还可以有效抑制患者体内血管性血友病因子调节的血^全形成，优选地，同时将流血的副作用减到最少。被治疗的和/或被抑制的血栓可能与发炎反应有关。在一个实施方案中，用于治疗或it断过程的血管性血友病因子特异性结合适体选自序列号11到50,序列号54到94,序列号98到164,序列号165，序列号169，序列号172，序列号174，序列号177，序列号180，序列号183,序列号186，序列号189,序列号192,序列号198,序列号201,序列号205，序列号208,序列号212-214,ARC1115(序列号221)，ARC1172(序列号222),ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269),ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281),ARC1361(序列号284)到ARC1381(序列号304),ARC1524(序列号305),ARC1526(序列号307)到ARC1535(序列号316),ARC1546(序列号317),ARC1635,ARC1759(序列号318)，ARC1779(序列号320)到ARC1780和ARC1884(序列号322)到ARC1885(序列号323)由所组成的纽。在另一实施方案中，用于治疗或诊断过程的血管性血友病因子特异性结合适体包括:任意一种下述序列序列号23,序列号44，序列号49，序列号98-100，序列号106,序列号109，序列号114到115,序列号118,序列号127,序列号134，序列号164，序列号165,序列号169,序列号172,序列号174，序列号177，序列号180，序列号183,序列号186，序列号189，序列号192，序列号198,序列号201,序列号208，和序列号212到214.在有些实施方案中，用于治疗或诊断过程的血管性血友病因子特异性结合适体包括任意一种下述序歹'J:ARC1029(序列号214),ARC1115(序列号221)，ARC1172(序列号222),ARC1346(序列号281)，ARC1361(序列号284),ARC1368(序列号291),ARC1635(序列号319),ARC1759(序列号318),ARC1779(序列号320),ARC1780(序列号321),ARC1884(序列号322)到ARC1885(序列号323)。在下面的实施例1和2中，描述了本发明其他能够结合血管性血友病因子的适体。这些适体可能包括一些本文所述的修饰，例如，与亲脂性化合物或高分子化合物(例如，PEG)的结合；与修饰核苷的结合和磷酸盐骨架修饰(包括将硫代磷酸盐引入磷酸盐骨架中)。在本发明的一个实施方案中，提供了一种分离的、非天然产生的适体，该适体能够结合血管性血友病因子。在另一个实施方案中，本发明的适体调节血管性血友病因子的功能。在另一个实施方案中，本发明的适体抑制血管性血友病因子的功能，而在另一个实施方案中，适体刺;敫血管性血友病因子的功能。在本发明的另一个实施方案中，适体结合和/或调节血管性血友病因子变异体的功能。如此所述，血管性血友病因子变异体包括与血管性血友病因子具有基本上相同功能的变异体，优选包括基本上相同的结构，和在某些实施方案中，包括的序列与人血管性血友病因子的氨基酸序列具有至少70%的序列同源性、优选至少80°/。的序列同源性、更优选至少90%的序列同源性、更优选至少95°/。的序列同源性。在本发明的另一实施方案中，适体与包括序列号11到50,序列号54到94,序列号98到164,序列号165,序列号169,序列号172，序列号174,序列号177，序列号180，序列号183，序列号186,序列号189,序列号192,序列号198,序列号201,序列号205，序列号208,序列号212-214,ARC1115,ARC1172(序列号222)(序列号222),ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269)，ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281)，ARC1361(序列号284)到ARC1381(序列号304),ARC1524(序列号305)，ARC1526(序列号307)到ARC1535(序列号316),ARC1546(序列号317),ARC1635,ARC1759(序列号318),ARC1779(序列号320)到ARC1780(序列号321)和ARC1884(序列号322)到ARC1885(序列号323)中任意一个序列的适体具有完全相同的结合血管性血友病因子的能力。在本发明的另一实施方案中，适体与包括序列号ll到50,序列号54到94,序列号98到165,序列号169,序列号172,序列号174,序列号177,序列号180，序列号183,序列号186,序列号189，序列号192，序列号198，序列号201,序列号205，序列号208,序列号212-214,ARC1115，ARC1172(序列号222)(序列号222),ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269),ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281),ARC1361(序列号284)到ARC1381(序列号304),ARC1524(序列号305),ARC1526(序列号307)到ARC1535(序列号316)，ARC1546(序列号317〕，ARC1635,ARC1759(序列号318),ARC1779(序列号320)到ARC1780(序列号321)和ARC1884(序列号322)到ARC1885(序列号323)中4壬意一个序列的适体具有完全相同的结构和完全相同的结合血管性血友病因子的能力。在另一实施方案中，本发明的适体包括一种序列，该序列与序列号11到50,序列号54到94,序列号98到165,序列号169,序列号172,序列号174,序列号177,序列号180,序列号183,序列号186,序列号189,序列号192，序列号198，序列号201,序列号205,序列号208，序列号212-213,ARC1115，ARC1172(序列号222)(序列号222)，ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269),ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281),ARC1361(序列号284)到ARC1381(序列号304)，ARC1524(序列号305),ARC1526(序列号307)到ARC1535(序列号316),ARC1546(序列号317),ARC1635,ARC1759(序列号318),ARC1779(,序歹'J号320)到ARC1780(序歹'j号321)禾口ARC1884(,亭歹寸号322)到ARC1885(序列号323)中任意一个序列一致。在另一实施方案中，本发明的适体包括一种序列，该序列与和序列号11到50,序列号54到94,序列号98到164，序列号165,序列号169,序列号172,序列号174,序列号177,序列号180,序列号183，序列号186，序列号189，序列号192，序列号198，序列号201,序列号205,序列号208,序列号212-214,ARC1115,ARC1172(序列号222)(序列号222),ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269)，ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281),ARC1361(序列号284)到ARC1381(序列号304),ARC1524(序列号305)，ARC1526(序列号307)到ARC1535(序列号316),ARC1546(序列号317),ARC1635,ARC1759(序列号318)，ARC1779(序列号320)到ARC1780(序列号321)和ARC1884(序列号322)到ARC1885(序列号323)中任意一种一致的序列具有至少80%,优选至少90%，在某些实施方案中至少95%的同源性。在另一实施方案中，本发明的适体特异性地结合血管性血友病因子，且包括一种具有30今相邻核苷的序列，此序列与选自序列号11到50,序列号54到94，序列号98到164,序列号165,序列号169,序列号172，序列号174,序列号177,序列号180,序列号183,序列号186，序列号189，序列号192,序列号198,序列号201,序列号205，序列号208,序列号212-214,ARC1115,ARC1172(序列号222)(序列号222),ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269)，ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281)，ARC1361(序列号284)到ARC1381(序列号304)，ARC1524(序列号305),ARC1526(序列号307)到ARC1535(序列号316),ARC1546(序列号317)，ARC1635,ARC1759(序列号318),ARC1779(序列号320)到ARC1780(序列号321)和ARC1884(序列号322)到ARC1885(序列号323)中的4壬意一个序列中相邻的30个核苷具有同源型。在另一实施方案中，本发明的适体用作药物组合物中的活性成^f分。在其他的实施方案中，本发明适体或包括:本,发明适体的组合物纟皮用于治疗血纟全形成性疾病，例如心血管疾病，包括急性冠状动月永综合症；夕卜周动脉疾病；和脑血管病，包括中风。在某些实施方案中，本发明的适体或包括本发明适体的组合物被用于治疗、预防或改善选自原发性血小板减少症、血栓形成性紫斑症("TTP，，)、IIb型血管性血友病、假性血管性血友病，例如周围动脉闭塞性疾病的周围动脉疾病、不稳定型心绞痛、心绞痛、动月永血4全症、动月永石更化、心月几梗塞、急性冠脉综合征、心房颤动、颈动脉狭窄、脑梗塞、脑血栓、在臭血性脑卒中和短暂性脑缺血发作。在某些实施方案中，在进行透析、CABG手术、经皮冠心病介入治疗或心脏瓣膜置换术之前/期间/或之后，给药本发明的药物组合物。在某些实施方案中，本发明的适体治疗剂对于他们的孝巴分子具有较大的亲合性和特异性，同时，如果适体治疗剂在病人或患者身体内分解的话，能够降低非天然产生的核苷取代带来的有害的副作用。在某些实施方案中，包含本发明适体治疗剂的治疗剂组合物不含有，或含有很小数量的氟化核苷。法合成，所述方法包括固相低聚核苷酸合成技术(参见，例如Froehleretal,Nucl.AcidRes.14:5399-5467(1986)和Froehleretal,Tet.Lett.27:5575-5578(1986))和液才目方'法，侈'j^口三酉旨合成法(参见，例3口Soodetal,Nucl.AcidRes.4:2557(1977)和Hiroseetal,Tet.Lett,28:2449(1978)),这两种方法在本领域内，都是已知的。药物组合物本发明还包括包含能够结合血管性血友病因子的适体分子的药物组合物。在某些实施方案中，该组合物是与体内应用，且包括有效量的具有药理活性的本发明化合物单体或结合体，和药学上可4妄受的载体。该化合物如果具有毒性的话，则其在具有4艮低的毒性时尤其有岁爻。本发明组合物可以用于治疗或预防一种病4犬，例i口疾病或不适，本发明组合物还可以用于緩解患者体内这些疾病或不适的症状。例如，本发明组合物可以;陂用于治疗或预防与血小4反凝聚作用相关的病状。在某些实施方案中，^皮治疗、预防或改善的疾病选自原发性血小板减少症、血栓形成性紫斑症("TTP，，)、lib型血管性血友病、假性血管性血友病，例如周围动脉闭塞性疾病的周围动月永疾病、不稳、定型心绞痛、心绞痛、动月永血4全症、动月永石更化、心肌梗塞、急性冠脉综合征、心房颤动、颈动脉狭窄、脑梗塞、脑血松、缺血性脑卒中风和短暂性脑缺血发作。在某些实施方案中，在进行透析、CABG手术、经皮冠心病介入治疗或心脏瓣膜置换术之前/期间/或之后，给药本发明的药物组合物。本发明组合物是有用的，可以用于给药患有或倾向于患有由本发明适体特异性结合的靶分子引起的或与之相关的疾病或不适的患者。本发明组合物可以在治疗患病病人或患者的方法中使用。所述方法包4舌，将适体或包4舌适体的组合物给药病人或患者，该适体可以结合病^l大中包4舌的血管性血友病因子，因此，适体与革巴分子的结合改变了血管性血友病因子的生理功能，从而起到治疗病状的作用。患有病状的病人或患者，即可以用本发明所述方法治疗的病人或患者可以是哺乳动物，更优选是脊稚动物，或更优选是人。在实践过程中，给药一定量的适体或其药学上可接受的盐，使其足够发挥理想的生物活性，例如，干扰依赖于vWF的血小板凝聚。本发明的一个方面包4舌与其<也血纟全形成性疾病疗法相结4、的本发明适体组合物。本发明适体组合物可能包含，例如，一个以上适体，例如，抗-血才全形成适体和4元-vWF适体。在某些实施例中，包含一个以上适体的本发明适体组合物与其他有效的組合物，例如消炎剂、免疫抑制剂、抗病毒制剂等等相结合给药。总的来讲，可用于这种结合的已知治疗剂的常见有效剂量形式都是适用的。"结合治疗"(或"协同治疗")包括，给药本发明适体组合物和至少一种第二制剂，此第二制剂作为一种特异性治疗体通过这些治疗剂的协同作用起到了有益的效果。结合治疗的有益岁丈果包括但不限于，由于治疗剂结合得到了药代动力学或药效共同作用结果。这些治疗剂的结合给药通常在给定的时间段进行(4艮据所选择的结合方法，该时间-度通常是几分钟、几小时、几天或儿周)。"结合治疗"可以包括给药两种或两种以上治疗剂作为单独单药治疗方案的一部分，但通常不这么做。"结合治疗，，包括按照某种有序的方式给药这些治疗剂，即，其中的每种治疗剂在不同的时间给药，"结合治疗"还包括基本上同时给药这些治疗剂，或同时给药至少两种治疗剂。可以通过例如，给患者Ji良用舍有固定比例的各个治疗剂的单一胶嚢，或多个含有单一治疗剂的胶嚢，从而完成基本上同时给药过禾呈。通过任意合适的给药途径，可以使各个治疗剂的顺序给药或基本上同时给药发挥作用，其中，适合的给药途径包括，但不仅限于，局部途;f圣、口月良途才圣、静月永途径、月几肉途径、或通过粘膜组织直接吸收。这些治疗剂可以通过相同的途径或不同的途径绍^药。例如，选择结合体的第一治疗剂通过注射给药，而结合体的其他治疗剂通过局部方式给药。作为选择，例如，所有的治疗剂都可以局部给药或注射给药。除非另有说明，治疗剂给药的顺序不再详细的描述。"结合治疗"还包括给药上述治疗剂与其他生物活性成分的进一步结合体。该结合治疗剂进一步包括一种非药物治疗，这种非药物治疗可以在任意合适的时间内进行，直到治疗剂与非药物治疗结合的协同活性达到有益的效果。例如，在合适的情况下，当非药物治疗暂时^v治疗剂的给药过程中除去，可能除去几天或几周时，该治疗仍能达到有益的效果。本发明的治疗组合物或药物组合物通常包括有效量的治疗活性成分，这些活性成分溶解或分散在药学上可接受的介质中。药学上可接受的介质或载体包括任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗病毒剂或抗菌剂、等渗剂和延緩吸收试剂等等。在本领:域中，这些介质或试剂作为药物活性底物的应用是已知的。本发明治疗剂组合物还可以结合辅助活性成分。按照目前7>开的内容，药物组合物或药理组合物的制备方法对本领域4支术人员是已知的。一般地，这些组合物被制成液态的溶液或悬浮液作为血管注射剂；也可以制成固态形式，在注射之前，溶解于或悬浮于液体中；也可以制成片剂或其他固体制剂口服给药；也可以制成緩释胶嚢；也可以制成其他常用的制剂形式，包括滴眼剂、霜剂、洗液、药膏、吸入剂等等。在使用过程中，外科医生、内科医生或护工用例如盐水沖洗的方法获得的无菌配方用来治疗特殊部位是非常有效的。组合物还可以通过微装置、微粒或海绵体给药。在制剂中，治疗剂以一种与剂量处方相协调的方式给药，且给药量是具有药理活性的。制剂可以通过多种剂量形式给药。在优选的实施方案中，本发明的适体被制成上述可血管注射的溶剂，但也可以使用药物緩释胶嚢等等。在本文中，给药的活性成分的^:量和组合物的量依赖于^皮治疗的主体动物。需要给药的活性化合物精确的量依赖于使用者的判断，且对每个病人来i井都是不同的。通常使用的是分散活性化合物所需的最少量的组合物。合适给药的方案也是多种多样的，但可以表示为最初的化合物给药和结果控制和随后在进一步间隔中给予的进一步剂量控制。如下面实施例3所述，本发明抗-vWF适体的给药效果可以通过使用PFA-IOO血小板功能分析仪测定血小板凝聚作用进行控制，例如，测定botrocetin诱导的血小板凝聚("BIPA")和/或剪切力诱导的止血栓形成。举例来说，为了以片剂或胶嚢剂(例如一种明胶胶嚢)的形式口月l给药，药物活性成分可以与一种可口服的无毒的药学可4妄受惰性载体结合，其中所述多性载体例如乙醇、甘油、水等等。此外，在有需要或必要的时l美，混合物还可以引入合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂。合适的粘合剂包括淀粉；硅酸镁铝；淀粉糊；明胶；曱基纤维素；羧曱基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；天然糖例如葡萄净唐或P-乳津唐；玉米甜味剂；天然的和合成的树胶例如阿拉伯胶、黄芪胶或海藻酸钠；聚乙二醇；蜡等等。这些剂型可以使用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠、二氧化硅、滑石粉、石更脂酸、它的4美盐或钙盐和/或聚乙二醇等等。崩解剂包括，但不限于，淀粉、曱基纤维素、琼脂、斑脱土、黄原胶淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐、或泡腾混合物等等。稀释剂包括，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨并唐醇、纤维素和/或甘氨酸。注射剂组合物优选是水相等渗溶液或悬浮液，栓剂可以从脂肪族的乳化液或悬浮液中方便i也制得。组合物可以被灭菌且包含例如防腐剂、稳、定剂、湿润剂或乳化剂、溶体助剂、渗透压调节盐和/或緩冲液等添加剂。此外，还可能包含其它的有治疗〗介值的物质。组合物分别按照传统的混合、造粒或包衣方法制备，并且一般包含大约0.1%到75%,优选大约1%到50%的活性成分。本发明化合物还可以以延时释放和持续释放的片剂或胶嚢剂、药丸、；盼剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、悬浮剂、糖浆和乳剂的口月良剂量形式给药。液体，特别地注射剂组合物可以通过例如溶解、分散等等的方法制备。将活性化合物溶于或混合于药学纯溶剂中，从而形成血管注射剂溶液或悬浮液，所述药学纯溶剂例如水、生理盐水、水相葡萄并唐、甘油、乙醇等等。另外，也可以配制在注射之前适于溶入液体中的固体形式。本发明的化合物可以通过静脉注射(注射和输液)、腹腔内给药、皮下给药或肌肉注射的形式给药，所有的使用形式对药物领域普通4支术人员都是已知的。血管注射剂可以制成常用形式，如液体溶液或悬浮液o肠胃外的注射给药常被用于皮下注射、肌肉注射或静脉注射和输液。另外，按照美国专利第3，710，795号，一个肠胃外给药途径使用了緩释系统或持续释放系统，从而保证维持剂量在体内的恒定水平，该专利在这里通过引证并入本文。此夕卜，本发明优选的化合物可以通过适当的经鼻给药工具、吸入器的局部^f吏用以经鼻给药方式给药，或通过透皮吸收途径，使用本领域普通技术人员已知的透皮片剂给药。为了以透皮制剂的形式给药，在整个给药过程中，给药剂量当然是持续的，而不是间歇的。其他优选的局部制剂包括膏剂、软膏剂、洗液、气雾喷雾剂和凝月交剂，其中活性成分的浓度一般在0.01%到15%w/w或w/v范围内。对于固体组合物，可以使用赋形剂，包括医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸4美等等。上面定义的活性化合物，也可以^吏用例^o聚歸基二醇，比如丙二醇作为载体配制成栓剂。在某些实施方案中，栓剂可以从脂肪族的乳剂或悬浮液中方便地制得。本发明的化合物还可以以脂质体给药系统的形式给药，例如小单层脂质体、大单层脂质体和多层脂质体。脂质体可以由各种磷脂组成，包括胆固醇、十八胺或卵^畴脂。在某些实施方案中，如美国专利第5,262,564号所述，脂质成分层是用一种药物的水溶液水合而成的，形成一种包含药物的脂质层。例如，提供这里描述的适体分子，使用本领域已知的方法，可以构建该适体分子与亲脂性化合物或非免疫原性、高分子化合物的复合物。另外，脂质体能在其表面嵌合适体，用于内部靶向和传送细胞毒劑，从而调节细胞死亡。美国专利第6,011,020号提供了核酸相关的复合物的例子。本发明的化合物还可以与可溶性聚合物耦合，作为靼向药物载体。这种聚合体包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基-曱基丙烯酰胺-苯酚、聚羟基乙基天冬酰胺基苯酚(polyhydroxyethylaspanamidephenol)或用十六醜基耳又代的聚乙餘基氧化聚赖氨酸。此外，本发明的化合物可能与一类对实现药物控制释放有效的可生物降解聚合物耦合，例如，聚乳酸、聚s己内酯、多羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二羟基吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交联的或两性的水凝胶嵌段共聚物。如果需要的话，给药的药物组合物还可能包括少量的无毒辅助剂，例如湿润剂或乳化剂，pH緩冲剂及其他物质例如醋酸钠和油酸三乙醇胺酯。依照不同的因素，包括类型、种类、年龄、体重、性別和病人的医学状况；治疗疾病的严重禾呈度；给药途径；病人的肾和肝脏的功能；和使用的特定适体或其盐，选择适体使用的给药方案。普通的医生或兽医可以容易地确定和指定用于预防对抗或4中制疾病发展所需的有效量的药物。为了起到指定的作用，本发明的口服剂量在大约0.05mg/day到7500mg/day的范围内。组合物优选以刻痕片剂形式提供，该片剂包含0.5mg，1.0mg,2.5mg,5.0mg，10.0mg,15.0mg,25.0mg,50.0mg,100.0mg,250.0mg，500.0mg和1000.0mg的活')"生成分。输液剂量、经鼻给药剂量和透皮剂量在0.05mg/day到7500rag/day范围内。皮下注射静月永注射和腹腔内给药的剂量在0,05mg/day到3800mg/day范围内。本发明化合物可能以单一日剂量给药，或分二、三或四次每日定时给药每日的总剂量。本发明化合物的有效的血浆水平在0.002mg/mL到50mg/mL范围内。在本发明的剂量中，质量只涉及适体低聚核苦酸部分的分子量，不包括与PEG结合所获得的质量。适体治疗剂的药代动力学和生物分布调节量身定做所有以低聚核苷酸为基础的治疗剂，包括适体，使之与所需的药物应用相匹配，这一点是十分重要的。尽管直接抗胞外靶分子的适体不会遇到与胞内运输相关的困难(反义和RNAi治疗剂会遇到这种情况)，但是，这种适体仍然必须能够分布到目标器官和组织中，并通过理想的给药方案在体内(未修饰的)持续一段时间。因此，本发明提供了能够影响适体组合物药代动力学，特别是能够调和适体药代动力学的材料和方法。通过修饰部分(例如PEG聚合物)与适体的结合，和/或51入修饰核苦(例如2，-F或2，-O-曱基)来改变核算的化学组合物，可以实现对适体药代动力学的调和能力(即，调节能力)。^使用适体药代动力学的调和能力来改进现有的治疗剂应用，或作为选择，来开发新的治疗剂应月。例如，在某些治疗剂应用过禾呈中，例如，在抗肺瘤或急性疾病护理过程中，需要快速的药物清除或完全消失，这就需要缩短适体在循环过程中的保留时间。作为选择，在其他的治疗剂应用过程中，例如，需要在治疗剂进行系统循环的位置维持治疗剂，这#尤需要延长适体在循环过程中的J呆留时间。另外，使用适体药代动力学调和能力来修改患者体内适体治疗剂的生物分布。例如，在某些治疗剂应用过程中，需要努力改变适体治疗剂的生物分布来靶向特定的组织类型或确定的器官(或器官系统)。在这些应用过程中，适体治疗剂优选聚集在确定的组织或器官中。在其^也的治疗应用中，需要目标组织表现出一种月包内标记物或与给定的疾病、月包内损伤或其他不正常的病症相关的症状，从而使适体治疗剂优选地聚集在受伤组织中。例如，在2004年三月5日递交的，同时待审的名为"适体治疗剂的药代动力学和生物分布的控制调节"的美国临时专利申请第60/550790号中有所描述。-使用适体治疗剂的聚乙二醇化(例如，用20KDa的PEG聚合物进行聚乙二醇化)来靶向发炎的组织，因此，聚乙二醇化的适体治疗剂优选地聚集在发炎的组织中。为了确定适体治疗剂(例如适体结合物或具有改变的化学物质，如》务饰的核苷的适体)的药代动力学曲线和生物分布曲线，要控制多种参数。这些参数包括，例如，适体组合物的半衰期((tl/2)、血浆清除率(CL)、分布量(Vss)、浓度-时间曲线下面积(AUC)、观察到的最大血清或血浆浓度(Q^)和平均1呆持时间(MRT)。如这里^f吏用的，术语"AUC"是指适体给药后，随着时间变化绘制的适体治疗剂血浆浓度曲线下的面积。AUC值用于估算纟会定的适体治疗剂的生物利用率(即，适体给药后在^f盾环过程中给药的适体治疗剂的百分比)和/或总清除率(CL)(即，适体治疗剂从循环中除去的速率)。分布量与适体治疗剂的浓度和体内适体的量相关。Vss值越大，血浆外存在的适体越多(即溢出物越多)。本发明提供了某种材料和方法，这些材料和方法通过适体与调节部分的结合或将修饰核苦引入适体，以控制的方式调节稳定的适体组合物在体内的药代动力学和生物分布，其中所述调节部分例如，一种小分子、肽或聚合物末端基团。如在此所述，修饰间和组织分布的基本方面除了核酸酶的清除作用，低聚核苷酸治疗剂还受到肾脏过滤作用的消除。因此，除非阻止了过滤作用，抗核酸酶l氐聚核苷酸静乐K给药后的体内半衰期一般<10分钟。可以通过促进-充入组织的血液之外的快速分布，或通过在低聚核普酸有效大小基础上增加合适的分子量用于被肾小球切割来实现过滤作用的消除。小分子治疗剂与PEG聚合物(聚乙二醇化作用)的结合可以显著延长适体在循环内的保持时间，因此减少了给药频率，提高了对于血管靶分子的有效性。适体可以与多种l务饰部分结合，例如像PEG似的高分子量聚合物；肽，例如Tat(—种HIVTat蛋白的13个氨基酸片4爻(Vives,etal，(1997),J.Biol.Chem.272(25):16010-7)),Ant(果绳的触角足同源异型蛋白三螺旋结构衍生的一种16个氨基酸序列(Pietersz,etal，(2001),Vaccine19(11-12):1397-405))和Arg7(—种由聚精氨酸(Arg7)组成的短链带正电荷的渗入细胞型肽(Rothbard,etal,(2000):Nat.Med.6(11):1253-7;Rothbard,Jetal,(2002)，J.Med.Chem.45(17):3612-8))和小分子，例如亲脂性化合物，如胆固醇。在这里描述的不同的结合过程中，与PEG基团的结合使适体的体内性质具有最有意义的改变。例如，混有2'F和2'-OMe^f奮饰的适体治疗剂与20KDaPEG聚合物的复合作用妨碍了肾脏的过滤作用，并促进适体向健康的和发炎的组织分布。另夕卜，20KDa的PEG聚合物-适体聚合物也证明，适体的40KDaPEG聚合物在阻止肾脏过滤作用过程中一4羊有效。同时，聚乙二醇化的一个作用表现在适体的清除过程中，20KDa的部分可以在身体组织中暴露更长时间，也加速了适体到组织中的分布，尤其加速了在进行高速器官灌流时和发炎位点的分布。适体-20KDaPEG聚合物结合体指导适体分布到发炎位点，以便于聚乙二醇化的适体优选地聚集在发炎组织中。在某些情况下，20KDa的聚乙二醇化适体结合体能够进入细胞内部，例3口，肾细月包内部。<奮饰的核苷还可以用来调节适体的血浆清除率。例如，引入2'-F和2'-OMe的稳定化学体的未结合适体是这里产生的适体的典型，表现出高度的体内体外核酸酶稳定性，与未修饰的适体相比，该适体能够快速的从血浆中消失(即，快速的血浆清除率)，且能够快速的分布于组织，主要是肾脏中。PEG衍生的核酸如上所述，核酸的高分子量非免疫原性聚合物衍生物能够改变核酸的药代动力学性质和药理性质，4吏他们成为更有效的治疗剂。活性的有利改变包^"对核酸酶降解作用增加的纟氏抗力，降寸氐的肾脏过滤作用，减少暴露于免疫系统的时间和改变的治疗剂在体内的分布。本发明的适体组合物可以用聚烯基二醇(PAG)部分进行衍生。从2003年11月21号递交的美国专利申请第10/718,833号中可以发现PAG衍生核算的例子，该专利通过引证在此全部并入本文。本发明4吏用的典型的聚合物包括聚乙二醇(PEG)，也可i人作聚乙烯氧化物(PEO)和聚丙二醇(包括聚异丙二醇)。不同的氧化烯(例如，氧化乙稀盒氧化丙烯)的随才几共聚物或封闭共聚物可在多种申请中应用。聚烯基二醇，例如PEG最为常见的形式是一种直链聚合物，结尾处的末端基团是羟基基团HO-CH2CH20(CH2CH20)n-CH2CH2-OH。a-co-双羟基聚(乙二醇)这种聚合物也可以用HO-PEG-OH表示，其中已知符号-PEG-代表下面的结构单元-CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-，其中，n—4殳在45'J10,000》范围内。如图所示，PEG分子是双功能性分子，有时也叫l故"双羟基PEG"。PEG分子的末端部分是相对无反应性的羟基部分，-OH基团，该部分可纟皮活4b转变为功能性部分，使PEG或其它化合物附着于化合物的活性位点。这种活化的双羟基PEG在这里叫做双-活化的PEG。例如，通过用N-羟基琥珀酰亚胺中的琥珀酰亚胺活化酯部分取代相对无反应性的羟基部分-OH，从而功能化双羟基PEG的末端部分，使之作为活性碳酸酯用于与氨基部分进行筛选反应。在许多应用过程中，理想的情况是用一种基本上无反应性的部分封住PEG分子的一段，以致此PEG分子是单功能性(或单活化的)PEG分子。蛋白质治疗剂对于活化的PEG通常显示多重反应位点，对此蛋白质治疗剂来讲，双功能性活化的PEG会引起大规模的交联作用，产生缺乏功能性聚集物。为产生单活化PEG,将双羟基PEG分子的一个羟基部分用无反应性的甲氧基末端部分-OCH3取代。另一个未封端的PEG分子一般被转变为反应端部分，反应端部分能够被活化从而附着于平面或例如蛋白质分子的活性位点。PAG是一种聚合体，一般在水中和许多有机溶剂中具有溶解性、无毒性和无免疫原性。PAG的一个应用是将其共〗介附着在不可溶的聚合体分子上，从而产生PAG-分子可溶性"结合物"。例如，已经公布，不溶于水的药物紫杉醇在与PEG结合后，会变为水可溶物。Greenwald,etat，J.Org.Chem.，60:331-336(1995)。PAG结合物不^f义可以用于提高可溶性和稳、定性，而且可以用于延长分子的血液循环半衰期。本发明的多烷基化合物的大小一般在5kDa和80kDa之间，然而也能使用任意大小的化合物，这种选择取决于适体和应用过程。本发明其它的PAG化合物大小在10kDa和80kDa之间。本发明另外的PAG化合物大小在10kDa和60kDa之间。例如，一种PAG聚合体的大小可能至少为10,20,30,40,50,60，或80kDa。这些聚合体可以是直线型的，也可以是有支链的。与生物表达的蛋白治疗剂相反，核酸治疗剂一般是由活化的核苷单体化学合成的。PEG-核酸结合物可以通过相同的单体重复合成结合PEG来制备。例如，通过转变为亚磷酰胺形式实现的PEG活化，能够被结合到低聚核普酸合成的固体阶^更。做为选择，可以通过反应性PEG附着位点的位点-特异性结合，完成《氐聚核苷酸合成。通常，这一过程通过在5'-末端加入自由伯胺(在固相合成的最后一步耦合步骤，使用亚磷酰胺调节剂结合伯胺)来完成。使用这些方法，反应性PEG(例如，PEG被活化，从而使其能够与胺类物质起作用并形成化学键)与纯化的低聚核苦酸结合，且耦合反应在溶液中进行。PEG结合体改变治疗剂生物分布的能力与多种因素有关，包括结合体的外观尺寸(例如，依照流体动力学半径测量)。已知较大的结合体(>10KDa)对于妨碍肾的过滤作用更为有效，并从而增加小的高分子(例如，肽、抗敏低聚核苷酸)的血清半衰期。PEG大小约为50KDa(进一步增加分子量效果不大，这是由于半衰期由巨噬细胞调节的代i射过程决定，而不是由肾的消除决定)的PEG结合体已经表现出妨碍过滤作用的能力。高分子量PEG(>10KDa)的生产是困难的，效率低且价格昂贵。作为合成高分子量PEG-核酸结合体的一种途径，前面的工作主要集中在高分子量活化PEG的生产。生产这种分子的一个方法包括形成一种支链的活化PEG,在这种支链活化PEG中，两个或两个以上PEG附着于带有活化基团的核心处。活化高分子量PEG分子的末端部分，即相对无反应性羟基(-OH)部分，或将其转变为功能性部分，用于4夺一个或一个以上PEG附着在化合物的反应<立点上。支链活4bPEG具有两个以上末端，在两个或两个以上末端被活化的情况下，这种活化的高分子量PEG分子在这里叫做多重活化的PEG。在某些情况下，并不是所有支链PEG分子的末端都是活化的。在支链PEG分子任意两个末端被活化的情况下，这种PEG分子叫做双活化的PEG。在支链PEG分子只有一个末端被活化的情况下，这种PEG分子叫做单活化的PEG分子。作为这种应用的一个例子，已经有文献描述了将两个单曱氧基化PEG分子附着与赖氨酸4亥心制4寻的活4匕PEG(Harrisetal，Nature,vol.2:214-221,2003)。本发明提供了另一种途径来合成包4舌多重聚乙二醇化核酸分子的高分子量PEG-核酸(优选，适体)结合体。本发明还包括PEG-连接的多体低聚核苷酸，例如，适体二聚体。本发明还关于高分子量组合物，其中，PEG稳定部分作为一种连接体将适体分为不同的部分，例如，PEG与单一适体序列结合，从而形成直链排列的高分子量适体组合物，例如，核酸-PEG-核酸(-PEG-核卧复)n,其中，n大于或等于1。本发明的高分子量组合物包括的分子量至少为10KDa。一般，组合物的分子量在10KDa到80KDa之间。本发明高分子量组合物的分子量至少是10KDa,20KDa，30KDa,40KDa，50KDa,60KDa或80kDa。稳定的部分是能够改进本发明高分子量适体组合物的药代动力学性质和药理学性质的分子或分子的一部分。在某些情况下，稳定的部分是能够使两个或两个以上适体、或适体区域相靠近，或提供减少本发明高分子量适体的整体旋转自由度的分子或分子的一部分。稳定的部分可以是聚烯基二醇，例如，直链或支链的聚乙二醇，也可以是均聚物或杂聚物。其他稳定的部分包4舌聚合物，例如肽核酸(PNA)。j氐聚核苦酸也可以是稳、定的部分；这种^f氐聚核苷酸包括修饰的核苷，和/或修饰的连接体，例3口碗代磷酸键。稳、定部分可以是适体组合物的一个完整的部分，即，与适体共价结合的。本发明的组合物包4舌高分子量适体组合物，其中，两个或两个以上核酸部分与至少一个聚烯基二醇部分共价结合。聚烯基二醇部分共价结合于任一适体末端，从而该聚烯基二醇与核酸部分结合成一个分子，该聚烯基二醇被叫做连接部分。在这种组合物中，共价分子的初级结果包括线性排列的核酸-PAG-核酸。一个例子是初级结构为核酸-PAG-核酸的组合物。另一个例子是线性排列的核酸-PEG-核酸-PEG-核酸。为了生产核酸-PEG-核酸结合物，从头合成核酸使其具有一个单一活性位点(例如，是单活化的)。在一种优选的实施方案中，该活性位点是一种氨基基团，该氨基基团是在低聚核香酸固相合成的最后一部通过加入亚磷酸胺修饰剂引入5，-末端的。随后进行修饰的低聚核苦酸的去保护和纯化过程，并在高浓度的溶液中进行重組，高浓度的溶液能够减小活化PEG自然发生的水解作用。在优选的实施方案中，^f氐聚核苷酸的浓度是lmM，重组溶液包含200mMNaHCO3-緩沖液，pH值为8.3。《爰慢的逐步力口入高纯化的双羟基PEG起始结合体合成过程。在优选的实施方案中，通过丙酸琥珀酰亚胺酯衍生作用活化双功能性PEG的两个末端(双活化)。反应之后，用凝月交电泳或液相色"i普纯化PEG-核酸结合体，分离成完全结合、部分结合和未结合的几类。多重PAG分子连接体(例如，作为随机共聚物或嵌合共聚物)或较小的PAG链可以4皮连接成不同的长度(或分子量)。不同长度的PAG链之间可以4吏用非PAG连4妄体。2，-0-甲基、2，-氟代和其他修饰核香的修饰作用使适体对核酸酶稳定，且增加了适体的体内半衰期。3'-3'-dT帽子还增加了适体对核酸外切酶的4氐抗力。参见例如，美国专利第5,674,685;5,668,264;6,207,816;和6,229,002号，这些专矛J通过在jt匕引证全部并入本文。反应性核酸的PAG4汙生作用高分子量PAG-核酸-PAG结合体可以通过单功能性活化的PEG与包含一个以上活性位点的核酸反应而制备。在一个实施方案中，该核酸是双反应性或双活化的，包含两个反应位点通过常见的亚磷酸酯合成引入低聚核苷酸的5，-氨基基团和3，-氨基基团，例如图2表示了3，-5，-双聚乙二醇化过程。在作为选择的实施方案中，使用例如5-嘧啶位点、8-嘌呤位点、或2，-核糖位点作为前体胺的附着4立点，可以将反应4立点引入内部位置。在这种实施方案中，核酸具有多个活化位点或反应位点，净皮称为是多重活化的。合成并纯化之后，在促进低聚核苦酸反应位点进行选择性反应的条件下，修饰的低聚核苷酸与单活化的PEG结合，同时减小自然水解作用的发生。在优选的实施方案中，单甲氧基-PEG用丙酸琥珀酰亚胺酯活化，在pH为8.3的条件下进行耦合反应。为了引发双耳又代PEG的合成，提供关于低聚核苷酸理想配比过剩的PEG。反应之后，用凝胶电泳或液相色"i普纯化PEG-核酸结合体，分离成完全结合体、部分结合体和未结合体几类。连才妄区域还可以有一个或一个以上聚烯基二醇部分附着于此。这种PAGs可以是任意长度的，还可以以合适的结合体一皮使用，从而实现理想的纟且合物分子量。具体的连4妄体的作用可以^皮其化学组合物和其长度影响。太长、太短、或与輩巴分子形成不适宜的空间位阻、和/或不适宜的离子间相互作用的连接体不会再适体和耙分子间形成复合物。由于减少了配体的有效浓度，比跨越核酸之间距离所需更长的连接体会减少结合稳定性。因此，通常需要优化连接体组合物及其长度，从而增大适体对靶分子的亲和力。文，就如同每个专利文件和刊物都^t分另'j明确逐个的引证而合并于本文。引用刊物和专利文件并不表明其是现有技术文献，也不表明对其内容或日期的i人可。本发明已通过书面描述和举例的方式进行描述，本领域技术人员将意识到本发明可在多种不同实施方案中实践。前面的描述和下面的实施例都是用以阐述的而不是对所附权利要求的限制。实施例实施例1适体筛选和测序实施例1ArRfYvWFAl区J或适体筛选使用由2'-OH噤呤核香酸和2'-F嘧咬核苷酸组成的核苦序列库(rRfY)进4亍筛选过禾呈，识别能够结合人或兔vWFAl区Jb戈的适体。筛选方案产生对于人和兔vWFAl区域具有高亲合特异性的适体，其中人和兔vWFAl区域被固定在疏水性的平皿上。基因库制备使用ABIEXPEDITEDNA合成仪合成序列为5'—GGAGCGCACTCAGCCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTTCGACCTCTCTGCTAGC3'(序列号8)的DNA模版，并用标准的方法去保护。在DNA模板(序列号8)中的一系列N可以是4壬一核苷酸的结合，并使产生的适体具有独特的序歹'j区域。用引物5'—TAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCAC-3'(序列号9)和5'-GCTAGCAGAGACGTCGAAA-3'(序列号10)扩增模板，然后作为模板与T7RNA聚合酶(Y639F)—起用于体外转录。转录一般在37。C条件下被培养过夜，使用40mMTris、pH8.0、40mMDTT、1mM亚精胺-HCl，0.002%TritonX-lOO，4%(w/v)PEG-謂O,12mMMgC12,3mM2'-F誦CTP，3mM2'画F-UTP,3mMGTP,3mMATP,0.5X无机焦磷酸酶，和IXT7聚合酶(Y639F),和大约5pM模板DNA。筛选为了筛选人vWFAl区域,在100nLIXDulbecco'sPBS(GibcoBRL,Cat.#14040-133，Carlsbad,CA)中，在室温条件下，将24pmoles的人vWFAl区i或(序歹'J号4,图4)固定到NuncMaxisorp發u7jc,J"生平皿(NuncCat.#—446612，Rochester,纽约)上1小时，起始头104仑筛选。对于第11轮和124仑筛选，将12pmoles人vWF全长序列(序列号7，登录号VWHU,购自CalbiochemCat.#—681300，LaJolla，加拿大)固定到疏水性平皿上。对于兔vWF筛选，在与固定人vWFAl区域相同的条件下固定24pmoles兔vWFAl区域(序列号6，登录号AAB51555，图3)，起始每一轮筛选过程。在所有情况下，在进行一小时的蛋白质固定之后，去掉上清液，用120jiLIXDulbecco'sPBS洗涤小孔4次。然后在室温条件下，用100uL封闭緩冲液(含有1%BSA的IXDulbecco'sPBS)封闭固定蛋白质的小孔1小时。在第一轮，在lOO^LIXDulbecco'sPBS中，在包括BSA-封闭的固定化蛋白质靶分子的小JL中，在室温条件下培养333pmolesRNA序列库(2xIO"独立的分子)1小时。然后去掉上清液，用120[iLIXDulbecco'sPBS洗、泉小孑L。在随后的几轮中，添加另外的洗涤步萆艮来增加阳性筛选步骤的严格度(见表1和2)。从第2轮开始到所有随后的步骤中，在阳性筛选步骤之前包括二个阴性筛选步骤。首先，RNA序列库在未封闭的小孔中室温下培养1小时从而从序列库中去掉塑性结合序列。在第二阴性筛选步骤，在室温条件下，RNA转入BSA封闭的小孔(不包括蛋白质靶分子)中l小时，从而在阳性筛选之前，从序列库中去掉任一BSA结合序列。从第2轮开始到随后的几轮中，在阳性筛选反应中掺入0.1mg/mLtRNA和0.1mg/mL鲑鱼精DNA，作为非特异性竟争剂。在所有情况下，结合固定化蛋白质靶分子的RNA序列库在筛选平皿中，外加反转录混合物(第一轮100uL;第二轮+:50uL;包4舌序列号10的3'-前体和ThermoscriptRT(InvitrogenCat.#11146-016，Carlsbad,CA))直接进4亍反转录，随后在65。C下培养1小时。所得cDNA作为模版进行PCR反应(第一轮500uL;第二轮十250uL;包括序列号9的5，-前体，序列号为10的3'-前体，和Taq聚合酶(NewEnglandBiolabsCat.弁M0267L，Beverly,MA))。PCR反应在下列条件下进行a)变性步骤94°C反应2分钟；b)循环步骤94°C反应30秒，60°C反应30秒，72。C反应1分钟；c)最后的延长步骤72°C反应3分钟。重复这一循环直到生成足够的PCR产物。表1和表2中的"PCR域值"才艮道了生成足够的PCR产物所需的最小循环次数。扩增的模版DNA序列库用异丙醇沉淀，一半PCR产物用作模版在下一轮筛选过程中转录为RNA序列库。每三轮筛选后，用10%的聚丙烯酰胺凝胶纯化转录的RNA序列库，当不用凝月交纯化时，将转录的RNA序列库用两个Centri-Spin10色镨柱(PrincetonSeparationsCat.#CS-101,Adelphia,NJ)脱盐。在所有的情况下，相当于IAO的总转录产物作为起始序列库进入后续的筛选过程中。表1使用rRfY序列库进行的人vWFAl区域筛选条件<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表2使用rRfY序列库进行的兔vWFAl区域筛选条件<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>vWFAl区域结合分析使用夹层过滤结合试验监控筛选过程。将5'-"P-标记的RNA序列库(痕量浓度)与无革巴分子蛋白参照物，100nM人vWFAl区域(序列号4)或100nM兔vWFAl区域(序列号6)在室温条件下，在包含0.1mg/mLtRNA,和0.1mg/mL鲑鱼精E>NA的IXDulbecco'sPBS(总体积50uL)溶液中培养30分，然后用定点印记仪器(SchleicherandSchuell，Keene，NH)中的硝化纤维和尼龙夹层过滤装置处理。经过第6、9、12轮之后，用三点筛选(100nM人vWFAl区域、100nM兔vWFAl区域和无乾分子参照物)的方法计算RNA序列库结合硝化纤维的百分比。将序列库的结合率与原始序列库(第0轮)的结合率相比。表3表示了rRfY序列库结合分析的结果。表<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>与不存在蛋白的对照相比，当观察到相当比例的RNA与存在的人或兔的vWFAl区域结合时，依照操作说明，用TOPOTA克隆试剂盒(invitrogen,Cat.#45-0641,Carlsbad,CA)克隆序列库。对第9轮和第12轮的模版序列库进行克隆和测序(总共125个序列)，产生48个独特的克隆体。转录、脱盐并用5-"P末端标记物标i己独特的克隆体，用三点定点印记筛选(无靶分子参照物、100nM人vWFAl区i或(图3，序列号5)、100nM兔vWFAl区;fe戈(图3，序列号6))的方法进行实验。下面表4的第三栏和第四3兰表示了实验数据，此实验数据是靶分子蛋白存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量与靶分子蛋白不存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量的比值。基于最初的筛选，4吏用定点印记实验测定的12个最好的vWF结合序列的Kos值表示在图4的第五栏内。为了确定KD值，用10%的变性聚丙烯酰胺凝胶纯化适体转录产物，用y-"PATP标记5,-末端。在定点印记实验(lpM，300nM,100nM，30nM,10nM,3nM,1nM,0nM)中《吏用人vWFAl区域(序列号5)的8点蛋白滴定法，使用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51，SynergySoftware)通过满足等式y=(max/(l+K/protein))+yint来计算Ko值。对于实施例中描述的所有用来确定单克隆体KD值的定点印记试验，用包括0.1mg/mLBSA的IXDulbecco，sPBS緩冲液稀释輩巴分子蛋白，例如，人vWFAl区域，并在过滤和定量之间，将稀释的靶分子蛋白与标^己的适体一起在24。C条件下培养30分。表4人和兔的vWFAl区i或rRfY适体结合活性(ND-表实验)<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>序列号5的人vWFAl区域用于适体筛选和适体KDS^fe测定下面列出了表4所表示的rRfY适体的核酸序列。下列每个适体的独特序列开始于第18位核苷，紧接着是序列GGAGCGCACTCAGCCAC(序列号221),—直延伸到3'末端固定的核酸序列TTTCGACCTCTCTGCTAGC(序列号222)。除非另有说明，下面列出的每个序列是从5，端到3，端表示的，且在rRfYSELEXtm条件下进行的篩选，其中所有的噤呤(A和G)是2，-OH嘌呤(核糖)，所有的嘧啶(U和C)是2，-氟代嘧啶。(AMX201.B1)序列号11(AMX198.G1)序列号12(AMX201.H3)序列号13ggagcgcacucagccacuaacgguugaucucaggacuaaauagucaacaaggaugcguuucgaccucucugcuagc(AMX201.B3)序列号14ggagcgcacucagccacagagcccugaguguaugaucgccgagaucuaucgaugcuuuuucgaccucucugcuagc(AMX201.G1)序列号15ggagcgcacucagccacgcucgguggggaaauuuuagccuaauuggcuacuugugcguuucgaccucucugcuagc(AMX198.C6)序列号16ggagcgcacucagccacoguggucagucagugatjaugauuaaguucagcuguggcuguuucgaccucucugcuagc(AMX201.B11)序列号17ggagcgcacucagccacaccgaggcuggauaucuacgagaggaagugcugcuugaauuucgaccucucugcuacc(AMX201.D10)序列号18(AMX198.C10)序列号19(AMX201.H4)序列号20(AMX201.G9)序列号21(AMX201.H11)序列号22(AMX201.C8)(ARC840)序列号23ggagcgcacucagccacccucgcaagcauuuuaagaaugacuugugccgcuggcuguuuucgaccucucugcuagc(AMX201.H1)序列号24(AMX198.E11)序列号25(AMX198.A10)序列号26ggagcgcacucagccaccXguuaugcuggcuuuggucuuugacugucugaguguucguuucgaccucucugcuagc(AMX201.D4)序列号27ggagcgcacucagccacuggogcugaucucgcacgauaguucgugucaaggaugcguuuucgaccucucugcxjagc(AMX201.D3)序列号28ggagcgcacucagccacgcccacgucaaauuauagucuacuuugaugugcccgugguuucgaccucucugcuagc(AMX201.A8)序列号29ggagcgcacucagccacgcuguacacugaugouguaacauguacccccuggciiguuucgaccucucugcuagc(AMX198.E5)序列号30ggagcgcacucagccacuucgacuuucaugucugaagucccugcagugcgagagacguuucgaccuojcugcuagc虽然不希望被任何理论限制，但是基于SELEXTM筛迭所得全长适体和最小化的适体序列(见实施例2a)表示在表4中的结合数据和表示在表21种的胞内实验活性，在图10中，将由适体衍生而来的，能够结合本发明所有实施方案的vWF靼分子的预计基因二级结构和预计核心核酸序列表示为序列号217(使用Version4.1的RNAstructure,参见，Mathews,D.H.;Disney,M.D,;Childs，J丄.；Schroeder,SJ.;Zuker，M.;和Turner,D.H.2004年在美国国家科学院学报101巻7287-7292页发表的名为"将化学修饰限制引入动态^见划法则来预计RNA二级结构"的文献)。ARC840(序列号23)是具有图IO所描述的序列的一个例子，其中，序列表中粗体带下划线的部分表示必需的碱基。实施例1B:rRdYvWFAl区域适体筛选用由2'-OH噤呤和脱氧嘧啶核苷组成的核苷库(rRdY)进行筛选过程来鉴别能够结合(1)人vWFAl区域，(2)兔vWFAl区域或(3)人和兔的vWFAl区域的适体。筛选方案产生的高亲和性适体对固定在疏水平皿上的人和兔的vWFAl区域具有特异性。序列库制备4吏用ABIEXPEDITEDNA合成仪合成序列为5'-GGAGCGCACTCAGCCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNK丽NNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTTCGACCTCTCTGCTAGC國3,(序列号8)的DNA4莫版，然后用标准的方法去保护。DNA冲莫版(序列号8)中的一系列N可以是4壬一核苷酸的结合，并^f吏产生的适体具有独特的序列区^戈。用引物5'-TAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCAC-3'(序列号9)和5'-GCTAGCAGAGAGGTCGAAA-3'(序列号IO)扩增才莫斗反，然后作为才莫板与T7RNA聚合酶(Y639F)—起用于体外转录。转录一般在37。C条件下被培养过夜，使用40mMTris、pH8.0、40mMDTT、1raM亚4青胺-HCl,0.002%TritonX-100，4%(w/v)PEG-8000,12mMMgC12，3mM2，-F國CTP,3mM2'-F-UTP，3mMGTP,3mMATP,0.5X无才几焦磷酸酶，和IXT7聚合酶(Y639F),和大约5pM模板DNA。筛选为了筛选人vWF，在100pLIXDulbecco，sPBS(GibcoBRL，Cat.弁14040-133,Carlsbad，CA)中，在室温条件下，将24pmoles的人vWFAl区域(序列号4)固定到NuncMaxisorp疏水性平皿(NuncCat.#—446612,Rochester,纽约)上1小时，起始头lOl仑筛选。对于第11轮和124仑筛选，将12pmoles人vWF全长序列(序列号7,图4)固定到疏水性平皿上。对于兔vWF筛选，在与固定人vWFAl区域相同的条件下固定24pmoles兔vWFAl区域(序列号6),起始每一轮筛选过程。对于人/兔交互筛选的头两轮，将12pmole的人vWFAl区i或(序列号4)和12pmole兔vWFAl区i或(序列号6)按照前面的描述固定在疏水性平亚上。在交互筛选随后的几轮中，每轮筛选过程中人和兔的vWFAl区域(分别是序列号4和5)交替作为蛋白质靶分子，第ll轮例外，在第11轮，寸吏用人vWF全长序列(序列号7)。在所有情况下，在进行一小时的蛋白质固定之后，去4卓上清液，用120)iLIXDulbecco'sPBS洗涤小孔4次。然后在室温条件下，用100uL封闭緩沖液(含有P/。BSA的IXDulbecco'sPBS)封闭固定蛋白质的小孔1小时。在第一4仑，在100nLIXDulbecco'sPBS中，在包括BSA-封闭的固定化蛋白质靶分子的小孑L中，在室温条件下培养333pmolesRNA序列库(2xIO"独立的分子)1小时。然后去掉上清液，用120pLIXDulbecco'sPBS洗涤小孔。在随后的几^^中，添加另外的洗涤步骤来增加阳性筛选步骤的严格度(见表5、6和7)。从第2轮开始到所有随后的步骤中，在阳性筛选步骤之前包括二个阴性筛选步骤。首先，RNA序列库在未封闭的小孔中室温下培养1小时从而从序列库中去掉塑性结合序列。在第二阴性筛选步骤，在室温条件下，RNA转入BSA封闭的小孔(不包括蛋白质靶分子)中1小时，从而在阳性筛选之前，从序列库中去掉任一BSA结合序列。从第2轮开始到随后的几轮中，在阳性筛选反应中掺入0.1mg/mLtRNA和0.1mg/mL鲑鱼精DNA，作为非特异性竟争剂。在所有情况下，结合固定化蛋白质輩巴分子的RNA序列库在筛选平皿中，外加反转录混合物(第一轮100uL;第二轮+:50uL;包4舌序列号为10的3'画前体和ThermoscriptRT(InvitrogenCat.#11146-016,Carlsbad,CA))直4妄进行反转录，随后在65。C下培养l小时。所得cDNA作为模版进行PCR反应(第一轮500uL;第二轮+:250uL;包括序列号9的5'-前体，序列号为10的3'-前体，和Taq聚合酶(NewEnglandBiolabsCat.#M0267L,Beverly,MA))。PCR反应在下列条件下进行a)变性步骤94。C反应2分钟；b)循环步骤94°C反应30秒，60°C反应30秒，72。C反应1分钟；c)最后的延长步骤72t:反应3分钟。重复这一循环直到生成足够的PCR产物。表5、6和7中的"PCR域值，，才艮道了生成足够的PCR产物所需的最小循环次数。扩增的模版DNA序列库用异丙醇沉淀，一半PCR产物用作模版在下一轮筛选过程中转录为RNA序列库。每二轮筛选后，用10%的聚丙烯酰胺凝月吏凝胶纯化转录的RNA序列库。当不用凝胶纯化时，将转录的RNA序列库用两个Centri-Spin10色"i普柱(PrincetonSeparationsCat.#CS-lOl，Adelphia,NJ)脱盐。在所有的情况下，相当于1/10的总转录产物作为起始序列库进入后续的筛选过程中。表5使用rRdY序列库进4亍的人vWFAl区域筛选条仵<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>表6使用rRdY序列库进4亍的兔vWFAl区域筛选条件<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>表7使用rRdY序列库进行的人/兔vWFAl区域交互篩选条件<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>vWF结合分析使用夹层过滤结合试验监控筛选过程。将5'-"P-标记的RNA序列库(痕量浓度)与无輩巴分子蛋白参照物，100nM人vWFAl区域(序歹'J号4)或100nM兔vWFAl区域(序列号6)在室温条件下，在包含0.1mg/mLtRNA,和0.1mg/mL鲑鱼精D:NA的IXDulbecco'sPBS(总体积50uL)溶液中培养30分，然后用定点印记仪器(SchleicherandSchuell,Keene,NH)中的硝化纤维禾口尼龙夹层过滤装置处理。经过第6、9、12轮之后，用三点筛选(100nM人vWFAl区域、100nM兔vWFAl区域和无靶分子参照物)的方法计算RNA序列库结合硝化纤维的百分比。将序列库的结合率与原始序列库(第O轮)的结合率相比。表8表示了rRfY序列库结合分析的结果。表8vWFAl区i或rRdY筛选序列库结合实验<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>与不存在蛋白的对照相比，当观察到相当比例的RNA与存在的人或兔的vWFAl区域结合时，依照操:作i兌明，用TOPOTA克隆试剂盒(mvitrogen,Cat.#45-0641,Carlsbad，CA)克隆序列库。对第9轮和第12轮的模版序列库进行克隆和测序(总共185个序列)，产生3个序列族总共78个独特的克隆体。转录、脱盐并用5-32P末端标i己物标记所有独特的克隆体，用三点定点印记筛选(无鞋^分子参照物、100nM人vWFAl区域(序列号5)、100nM兔vWFAl区域(序列号6))的方法进行实验。下面表9的第三栏禾-第四栏表示了实-验数据，此实-验数据是靶分子蛋白存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量与靶分子蛋白不存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量的比值。在三个序列族中，族1#和2#的序列和两个独立的非序列族适体能够与人vWFAl区域(序列号5)和兔vWFAl区域(序列号6)结合。基于最初的篩选，使用定点印记实-睑测定的16个最好的vWF结合序列的KoS值表示。为了确定KD值，用变性聚丙烯酰胺凝胶纯4匕适体4争录产物，用y-"PATP标记5，-末端。在定点印记实-验(lHM,300nM,100nM,30nM,10nM,3nM，1nM,0nM)中使用人vWFAl区域(序列号5)的6点蛋白滴定法，使用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51,SynergySoftware)通过满足等式y=(max/(l+K/protein))+yint来计算Kd但。对于实施例中描述的所有用来确定单克隆体KD值的定点印记试验，用包括O.lmg/mLBSA的IXDulbecco'sPBS緩沖液稀释乾分子蛋白，例如，人vWFAl区i或，并在过滤和定量之间，将稀释的輩巴分子蛋白与标记的适体一起在24°C条件下培养30分。表9人和兔的vWFAl区域rRdY适体结合活性<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>下面列出了表9所表示的rRdY适体的核酸序列。下列每个适体的独特序列开始于第18位核苦，紧接着是序列GGAGCGCACTCAGCCAC(序列号221),—直延伸到3'末端固定的4亥酸序列TTTCGACCTCTCTGCTAGC(序列号222)。除非另有说明，下面列出的每个序列是从5，端到3'端表示的，且在rRdYSELEXTM条件下进行的筛选，其中所有的三磷酸腺苦和三磷酸鸟苷是2，-OH,三磷酸胞苷和三磷酸尿苷是脱氧的。vWFrRdY筛选Familv#1下列序列中黑体和力口下划线的部分表示了vWFrRdYFamily#1的核心輩巴分子蛋白结合部分(AMX203.G9MARC842)序列号44GGAGCGCACTCAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTGGCTGGTCTCGAAGGGTTTCGACCTCTCTGCTAGC(AMX203.F9)序列号47GGAGCGCACTCAGCCACTGAAGGGTAAGGACGAGGAGGGTATACAGTGTGCGCGTGTATTTCGACCTCTCTGCTAGC(AMX203.A6)序列号42GGAGCGCACTCAGCCACCACGGGGACGGGTAGGGCGGGCGAGCTGGTGGCATTAGCGTTTCGACCTCTCTGCTAGC预计的能够结合本发明一些实施方案中vWF耙分子的二级结构和核心核酸序列在图12种表示为序列号218.vWFrRdYSELEXFamily#2(AMX203.D6)序列号31GGAGCGCACTCAGCCACAGTTCTGTCGGTGATGAATTAGCGCGAGAGCTGTGGGACGTTTCGACCTCTCTGCTAGC(AMX205.H8),序列号32GGAGCGCACTCAGCCACAAACGGACGGTGATGGATTAACGCGGGTrTATGGCAAGGTTTCGACCTCTCTGCTAGC(AMX205.H11),序列号33GGAGCGCACTCAGCCACGGCACGACGGTGATGGATTAGCGCGGTGTCGGTGGTGTCATTTCGACCTCTCTGCTAGC(AMX205.D11),序列号35GGAGCGCACTCAGCCACGGCACGACGGTGATGAATTAGCGCGGTGTCGGTGGTGTCATTTCGACCTCTCTGCTAGC(AMX206.F9),序列号36GGAGCGCACTCAGCCACGGAGCGTCGGTGATGGATTAGCGCGGCTCCGTGGTACACATTTCGACCTCTCTGCTAGC(AMX206.H9),序列号37GGAGCGCACTCAGCCACGGAGCGTCGGTGATGGATTAGCGCGGTTCCGTGGTACACCTTTCGACCTCTCTGCTAGC(AMX206.A10),序列号38GGAGCGCACTCAGCCACGGCATGACGGTGATGAATTAGCGCGGTGTCGGTGGTGTCATTTCGACCTCTCTGCTAGC(AMX205.F9),序列号39GGAGCGCACTCAGCCACGGAGCGTCGGTGATGGATTAGCGCGGCTCCGTGGTACGCCnTCGACCTCTCTGCTAGC(AMX206.E7),序列号40GGAGCGCACTCAGCCACGGAGCGTCGGTGATGGATTAGCGCGGCTCCGTGGTACACCTTrCGACCTCTCTGCTAQC(AMX206,D7)，序列号41GGAGCGCACTCAGCCACGGCACGACGGTGATGAATTAGCGCGGTGTCGGTGGTGTTATTTCGACCTCTCTGCTAGC(AMX203.A1),序列号43GGAGCGCACTCAGCCACAGTTCTGTCGGTGATGAATTAGCGCGGGAGCTGTGGGACGTTTCGACCTCTCTGCTAGC(AMX205丑9),序列号45GGAGCGCACTCAGCCACGACGGTGATGGATTAGCGCGGTGGAGAAGATGCGCTGTTGTTTCGACCTCTCTGCTAGC(AMX206.D8),序列号46GGAGCGCACTCAGCCACGACGGTGATGGATTAGCGCGGTGGATCTTAACGTGCGAGTTTCGACCTCTCTGCTAGC(AMX205.G9)，序列号48GGAGCGCACTCAGCCACAACTGGTrGTCGGTGATGGCATTAACGCGGACCAGQCATGTTTCGACCTCTCTGCTAOC(AMX205.H10),序列号50GGAGCGCACTCAGCCACTGiTGCCGACGGTGATGTATTAACGCGGGCAACGTTGGTGTTTCGACCTCTCTGCTAGCvWFrRdYSELEX单一序列下面的黑体和加下划线部分表示了序列号49的预计核心核酸结合部分(AMX205.F7)(ARC841)序列号49GGAGCGCACTCAGCCACACGACATTGGCGGGTTCTAATTACCACGCATGGCTG'nTCiJTlCGACCTCTCTGCTAGC(AMX205.A7),序列号34GGAGCGCACTCAGCCACTCAAGGGGGTCGCGTGGGGACGAAGGGTTGCAGTGTGTCGTTTCGACCTCTCTGCTAGC预计的能够结合本发明某些实施方案的vWF靶分子的核心核酸序列和二级结构在图13中表示为序列号219.实施例1C:vWFAl区i或适体DNA筛选#1用由脱氧核苷(DNA)组成的核苷库进行筛选来鉴别能够结合(1)人vWFAl区^戈，(2)兔vWFAl区域或(3)人和兔的vWFAl区域的适体。筛选方案产生的高亲和性适体对固定在疏水平i上的人和兔的vWFAl区i或具有特异性。序列库制备使用ABIEXPEDITEDNA合成仪合成序歹'J为5'-CTACCTACGATCTGACTAGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCTTACTCTCATGTAGTTCC-3'(序列号51)(ARC493)的DNA模版，然后用标准的方法去保护。DNA才莫版(序列号51)中的一系列N可以是任一核香酸的结合，并使产生的适体具有独特的序列区域。用引物(5'-CTACCTACGATCTGACTAGC-3，)(序列号52)和(5'國AGGAACTACATGAGAGTAAGC(OH)-3')(序列号53)在标准条件下#"增才莫板。PCR产物用石威水解(333mMNaOH,90°C，15分钟)之后沉淀。用10%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA，以较慢移动性移动的单链DNA从凝胶中分离出来，用异丙醇被动的洗提沉淀。筛选为了筛选人vWF，在100nLIXDulbecco'sPBS(GibcoBRL,Cat.#14040-133,Carlsbad，CA)中，在室温条件下，将24pmoles的人vWFAl区i或(序歹'J号4)固定到NuncMaxisorp疏水性平皿(NuncCat.#—446612,Rochester,纽约)上1小时，起始头IO專仑筛选。对于第114&和12轮筛选，将12pmoles人vWF全长序列(序列号7)固定到疏水性平皿上。对于兔vWF筛选，在与固定人vWFAl区域相同的条件下固定24pmoles兔vWFAl区域(序列号6)，起始每一轮筛选过程。对于人/兔交互筛选的头两轮，将12pmole的人vWFAl区i或(序歹'J号4)和12pmole兔vWFAl区i或(序列号6)按照前面的描述固定在發u水性平亚上。在交互筛选随后的几轮中，每轮筛选过程中人和兔的vWFAl区域(分别是序列号4和5)交替作为蛋白质靶分子，第ll轮例外，在第11轮，使用人vWF全长序列(序列号7)。在所有情况下，在进行一小时的蛋白质固定之后，去掉上清液，用120jaLIXDulbecco'sPBS洗涤小孑L4次。然后在室温条件下，用100uL封闭緩冲液(含有1。/。BSA的IXDulbecco'sPBS)封闭固定蛋白质的小孔1小时。在第一轮，在100IXDulbecco，sPBS中，在包括BSA-封闭的固定化蛋白质乾分子的小孔中，在室温条件下培养333pmolesRNA序列库(2x1014独立的分子)1小时。然后去才卓上清液，用120[xLIXDulbecco'sPBS洗〉条小孑L。在随后的几轮中，添加另外的洗涤步骤来增加阳性篩选步艰《的严格度(见表10、11和12)。乂人第2轮开始到所有随后的步骤中，在阳性筛选步骤之前包括二个阴性筛选步骤。首先，RNA序列库在未封闭的小孔中室温下培养1小时从而从序列库中去掉塑性结合序列。在第二阴性筛选步骤，在室温条件下，RNA转入BSA封闭的小孔(不包括蛋白质靶分子)中1小时，从而在阳性筛选之前，从序列库中去掉任一BSA结合序列。从第2轮开始到随后的几轮中，在阳性筛选反应中掺入0.1mg/mLtRNA和0.1mg/mL鲑鱼精DNA，作为非特异性竟争剂。在所有情况下，结合固定^f匕蛋白质輩巴分子的RNA序列库用2x100含有洗提緩沖液(预加热至90°C，7M尿素，100mMNaOAc，pH5.3,3mMEDTA)的洗涤液洗提5分钟。倒出洗脱液并用乙醇沉淀，然后用初始PCR反应(100jxL反应物包括序列号52的5'-前体、序列号为53的3'-前体和Taq聚合酶(NewEnglandBiolabsCat.#M0267L,Beverly,MA))。PCR反应在下列条件下进行a)变性步骤94°C反应2分钟；b)循环步骤94°C反应30秒，60°C反应30秒，72。C反应1分钟；c)最后的延长步骤72°C反应3分钟。重复这一循环直到生成足够的PCR产物。表10、11和12中的"PCR域值"报道了生成足够的PCR产物所需的最小循环次数。lOpLPCR产物加入到另外300nLPCR混合物中进行制备规模的PCR反应(prep-scalePCR)。制备规才莫的PCR反应产物用10%的变性聚丙烯酰胺凝月交电泳分离DNA,以4交'隻移动性移动的单链DNA从凝胶中分离出来，用异丙醇被动的洗提沉淀。在所有的情况下，相当于1/2的总转录产物作为起始序列库进入后续的筛选过程中。表l(H吏用DNA序列库进行的人vWFAl区域筛选条件<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>表11使用DNA序列库进行的兔vWFAl区域筛选条件<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>表124吏用DNA序列库进行的人/兔vWFAl区域交互筛选条件<formula>formulaseeoriginaldocumentpage106</formula>vWF结合分析使用夹层过滤结合试验监控筛选过程。将5'-"P-标记的RNA序列库(痕量浓度)与无革巴分子蛋白参照物，100nM人vWFAl区域(序歹'J号4)或100nM兔vWFAl区域(序列号6)在室温条件下，在包含0.1mg/mLtRNA,和0.1mg/mL鲑鱼精I>NA的IXDulbecco'sPBS(总体积50uL)溶液中培养30分，然后用定点印记仪器(SchleicherandSchuell,Keene,NH)中的硝化纤维和尼龙夹层过滤装置处理。经过第6、9、12轮之后，用三点筛选(100nM人vWFAl区域、100nM兔vWFAl区域和无扭分子参照物)的方法计算RNA序列库结合硝'化纤维的百分比。将序列库的结合率与原始序列库(第0轮)的结合率相比。表13表示了rRfY序列库结合分析的结果。表13vWFAl区域DNA篩选序列库结合实验<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>与不存在蛋白的对照相比，当观察到相当比例的DNA与存在的人或兔的vWFAl区域结合时，依照才乘作i兌明，用TOPOTA克隆试剂盒(invitrogen,Cat.#45-0641，Carlsbad,CA)克隆序列库。对第94仑和第12^^的模版序列库进行克隆和测序(总共243个序列)，产生8个序列族总共106个独特的克隆体。其中41个能够结合vWF靶分子，且属于下面描述的序列族。所有独特的克隆体用三点定点印记筛选(无耙分子参好、物、100nM人vWFAl区域(序歹'J号5)、100nM兔vWFAl区域(序列号6))的方法进行实验。下面表14的第三栏和第四栏表示了实验数据，此实验数据是靶分子蛋白存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量与靶分子蛋白不存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量的比值。基于最初的筛选，使用定点印记实验测定的IO个最好的vWF结合序列的Kos值表示在图4的第五栏内。为了确定Ko值，用"32PATP标记5，-末端，以100nM的持续的蛋白浓度进行竟争性定点印记试—验。4吏用0.1mg/mLBSA加IXDulbecco'sPBS緩冲液进行8点冷却竟争性DNA滴定(333nM,100nM，33nM,10nM,3nM,lnM,33pM,0nM)30分，使用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51,SynergySoftware)通过满足等式y=(max/(l+K/protein))十yint来计算Ko值。表14列出蛋白结合特性的结果。表14人和兔的vWFAl区域rRdY适体结合活性<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>使用序列号5的人vWFAl区域用于适体筛选和适体KDs值测定ND-未实验下面列出了表14所表示的DNA适体的核酸序列。下列每个适体的独特序列开始于第21位核苷，紧接着是序列CTACCTACGATCTGACTAGC(序列号52),—直延伸到3'末端固定的核酸序列GCTTACTCTCATGTAGTTCC(序列号223)。除非另有说明，下面列出的每个序列是从5，端到3，端表示的，且在DNASELEXTM条件下进行的筛选，其中所有核苦都是是脱氧的。DNASELEXtm1，Familv#1在适体AMX199.B3(序列号54)和一致性序列(序列号95)中用黑体力。下划线表示了预计的DNASELEX1，Family#l核心核酸结合序列。(AMX199.B3)序列号54CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATCAGAATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTC(AMX200.C11)序列号59CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAGTGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX200.G11)序列号56(AMX199.D11)序列号55CTACCTACQATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX200.D8)序列号58(AMX200.D11)序列号57(AMX199.F7)序列号61(AMX200.A7)序列号62(AMX202.D6)序列号91(AMX200.B1)序列号64(AMX199.G10)序列号60(AMX200.B8)序列号66(AMX200.B9)序列号63(AMX202.B8)序列号卯(AMX202.H10)序列号89CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAAGGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX200.F9)序列号69CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGGATGCTGATGGATTGGTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX202A3)序列号92(AMX199.C2)序列号65CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGGTGGATTGCCCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATG1AGTTCC(AMX200.F11)序列号67CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGGATGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAX3TTCC(AMX200.D1)序列号68CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAGTGCTGATGGATTGCTCAGGTCTACTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX199.C4)序列号72CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGGATGCTGATGGATTGCACAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX200.D3)序列号71(AMX199.B7)序列号70CTACCTACGATCTGACTAGCGGGATGAGAGTGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX200.E8)序列号73CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGGATGCTGGTCGATTGCTCAGGTCTGTTGGCTGCTTACTCTCATOTAGTTCCDNASELEX1,Family#1的一致'性序列:^下所示序列号95CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGRATGYTGRTGGATTGCHCAGGTCTRYTGRCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC其中Y-C或T,R-A或G且H:A，C或TDNASELET1Family#2(AMX199.F10)序列号74(AMX199.F10)序列号74qTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTTCCGTTCTGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX199.F6)序列号75(AMX199.H7)序列号78CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTTCCGCnTGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX199.G5)序列号76(AMX199.F11)序列号77CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTTCTGCTCTGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX199.A10)序列号'79CTACCTACGATCTGACTAGCGGAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTCCCGTTTTQCTTACTCTCATGTACTTCC(AMX199.G1)序列号80CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGATTGGTGTGTTCCCGCTTTGCTTACTCTCATGTACTTCC(AMX199.G4)序列号82CTACCTACGATCTGACTAGCGAAACACTAGGTTGGTTAGGGTTCGTGTQTTCCCGCTTTGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX199.F1)序列号81DNASELEXFamily#2的一致性序列如下所示序列号96CTACCTACGATCTGACTAGCGRAACACTAGGTTGGTTAGGRTTGGTGTGTTYCYGYYHGCTTACTCTCATGTAGTTCC其中Y-C或T,R-A或G且H-A,C或TDNASELETTM1Family#3(AMX199.B6)序列号86CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTTGGTACCTCCGGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX199.D8)序列号87CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTCGCGTGCTTGGCATCTTCGGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX199.F8)序列号85CTACCTACGATCTGACTAbCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTTGGCACCTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX200.E10)序列号88CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTCGGCACCTTTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX202.F6)序列号94CTACCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTOGCGTGCTCGGCACCTTCGGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX202.A8)序列号93ZW乂5EL￡^入Fom办斜(AMX200.A11)序列号83CTACCTACGATCTGACTAGCTGAGTAGTTAGTAACmTTATTATGGTTTGGTGGGTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC(AMX200.H8)序列号84CTACCTACGATCTGACTAGCTGAGTAGTCAGTAATnTTTATTATGGTTTGGTGGGCCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCC实施例ID:vWF适体DNA筛选#2在交互筛选过程中，使用人vWF全长序列和兔vWFAl区&戈进行单组DNA筛选。虽然不希望局限于任何理论，但是我们假定，这种筛选需要成功筛选的适体与vWF全长结合，与vWFAl区域特异性结合，且能够在人和兔蛋白间发生交互作用。如下面实施例3所述，从第二组DNA筛选所得的显性序列族能够结合人vWF全长序列、兔vWFAl区域，且在FACS和BIPA生物实验中具有功能性。用人vWF全长序列/兔vWFAl区域交互筛选方法进行筛选过程来鉴別能够结合人vWF全长序列和兔vWFAl区A戈的适体。该筛选使用由脱氧核苷(DNA)组成的核苷酸序列库。筛选方案产生的高亲和性适体对固定在疏水平亚上的人vWF全长序列和兔vWFAl区域具有特异性。序列库制备使用ABIEXPEDITEDNA合成仪合成序歹'J为5'扁CTACCTACGATCTGACTAGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN丽NNNNNNNNNGCTTACTCTCATGTAGTTCC-3'(序列号51)(ARC493)的DNA才莫版，然后用标准的方法去4呆护。DNA模版(序列号51)中的一系列N可以是任一核苦酸的结合，并使产生的适体具有独特的序列区域。用引物(5'-CTACCTACGATCTGACTAGC-3')(序列号52)和(5'-AGGAACTACATGAGAGTAAGC(OH)-3')(序列号53)在标准条^牛下扩增才莫玲反。PCR产物用碱水解(333mMNaOH，90°C，15分钟)之后沉淀。用10%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA,以專史慢移动性移动的单链DNA从凝胶中分离出来，用异丙醇被动的洗提沉淀。筛选对于头3轮人vWF全长序歹iJ/兔vWFAl区域交互筛选，将24pmoles的人vWF全长序列(序歹'J号7)和24pmoles兔vWFAl区域固定。在随后的几4仑中，每轮筛选过程中人vWF全长序列和兔的vWFAl区域交替作为蛋白质耙分子。在所有情况下，在进行一'J、时的蛋白质固定之后，去掉上清液，用120IXDulbecco'sPBS洗涤小孔4次。然后在室温条件下，用100uL封闭緩冲液(含有1%BSA的IXDulbecco'sPBS)封闭固定蛋白质的小孑L1小时。在第一轮，在100|xLIXDulbecco'sPBS中，在包括BSA-封闭的固定化蛋白质靶分子的小孔中，在室温条件下培养333pmolesRNA序列库(2xIO"独立的分子)1小时。然后去掉上清液，用120piLIXDulbecco'sPBS洗涤小孔。在随后的几轮中，添加另外的洗涤步骤来增加阳性筛选步骤的严格度(见表15)。在第84仑，暂停筛选而加入一种高盐的洗涤条件，作为一种可能的方法来增加SELEXTM的严格度(使用IXDulbecco'sPBS+400mMNaCl)。乂人第24仑开始到所有随后的步骤中，在阳性筛选步骤之前包括二个阴性筛选步骤。首先，RNA序列库在未封闭的小孔中室温下培养1小时从而v^序列库中去掉塑性结合序列。在第二阴性筛选步骤，在室温条件下，RNA转入BSA封闭的小孔(不包括蛋白质耙分子)中1小时，从而在阳性筛选之前，从序列库中去掉任一BSA结合序列。从第2轮开始到随后的几轮中，在阳性篩选反应中才参入0.1mg/mLtRNA和0.1mg/mL鲑鱼精DNA，作为非特异性竟争剂。在所有情况下，结合固定化蛋白质靶分子的RNA序列库用2x100fiL含有洗提》爰沖液(预加热至90°C，7M尿素，100mMNaOAc,pH5.3，3mMEDTA)的洗涤液洗提5分钟。倒出洗脱液并用乙醇沉淀，然后用初始PCR反应(100(xL反应物包括序列号52的5'-前体、序列号为53的3'-前体和Taq聚合酶(NewEnglandBiolabsCat.#M0267L，Beverly,MA))。PCR反应在下列条f牛下进行a)变性步骤94°C反应2分钟；b)循环步骤94°C反应30秒，60°C反应30秒，72。C反应1分钟；c)最后的延长步骤72°C反应3分钟。重复这一循环直到生成足够的PCR产物。表15中的"PCR域值"报道了生成足够的PCR产物所需的最小循环次数。IOjxLPCR产物力口入到另外300pLPCR混合物中进行制备规模的PCR反应(prep-scalePCR)。制备规模的PCR反应产物用10%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA，以较慢移动性移动的单链DNA从凝胶中分离出来，用异丙醇被动的洗提沉淀。在所有的情况下，相当于一半的总转录产物作为起始序列库进入后续的筛选过程中。表15使用DNA序列库进行的人vWF全长序列/兔vWFAl区i或交互筛选条件<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>vWF结合分析使用夹层过滤结合试验监控筛选过程。将5'-"P-标记的RNA序列库(痕量浓度)与无耙分子蛋白参照物，100nM人vWF全长序歹'J(CalbiochemCat.#681300，LaJolla，CA)或lOOnM兔vWFAl区域在室温条件下，在包含0.1mg/mLtRNA，和0.1mg/mL鲑鱼精DNA和0.1mg/mLBSA的IXDulbecco'sPBS(总体积50uL)溶液中培养30分，然后用定点印记仪器(SchleicherandSchuell,Keene，NH)中的^e肖化纤维和尼龙夹层过滤装置处理。经过第7和9轮之后，通过将无乾分子蛋白参照物、lOOnM人vWF全长序列(CalbiochemCat.#681300，LaJolla,CA)和100nM兔vWFAl区i或(序列号6)—起筛选，来计算RNA序列库结合硝化纤维的百分比。将序列库的结合率与原始序列库(第0轮)的结合率相比。表16表示了rRfY序列库结合分析的结果。表16人vWF全长序列/兔vWFAl区域的DNA筛选序列库结合实验<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>与不存在蛋白的对照相比，当乂见察到相当比例的DNA与存在的人或兔的vWFAl区域结合时，依照操作i兌明，用TOPOTA克隆试剂盒(rnvitrogen,Cat.#45-0641,Carlsbad,CA)克隆序列库。对第7轮和第11轮的模版序列库进行克隆和测序(总共218个序列)，产生12个序列族总共146个独特的克隆体。其中6个序列族表现出结合vWF靶分子活性。所有独特的克隆体用三点定点印记筛选(无耙分子参照物、20nM人vWF全长序列(CalbiochemCat.#681300，LaJolla，CA)、20nM兔vWFAl区域)的方法进行实验。下面表17的第三栏和第四栏表示了实验数据，此实验数据是靶分子蛋白存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量与草巴分子蛋白不存在的情况下适体片断结合硝化纤维的量的比值。基于最初的筛选，4吏用定点印记实验测定的3个最好的vWF结合序列的KoS值。为了确定Ko值，用Y-32pATP标记5，-末端，并通过实-睑直接与人vWF全长序列和兔vWFAl区i或结合。在0.1mg/mLBSA力口IXDulbecco'sPBS緩冲液中，在定点印记实验中室温条件下，进行12点蛋白滴定(300nM,100nM,30nM,10nM,3nM，1nM,300pM，100pM，30pM，10pM,3pM，0pM)30分。使用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51，SynergySoftware)通过满足等式y=(max/(HK/protein))+yint来计算Ko值。表17列出蛋白结合特性的结果。表17人vWF全长序列和兔的vWFAl区域DNA适体结合活性<table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>(序列号1S8)62AMX236JH1(序列号159)1,1063《序夠,1斷1.181.20抑MD64AMX236朋(序列号161)1.41ND65AMX238.D9(序列号162)NDND66AMX238J7(序列号163)l,銘NDND67AMX236.G1(序列号164)1.471.S1ND-使用的序列号7的人vWF全长序列和兔vWFAl区域用于适体筛选和适体Kos值测定ND-未实验下面列出了表17所表示的DNA适体的核酸序列。下列每个适体的独特序列开始于第21位核苷，紧接着是序列CTACCTACGATCTGACTAGC(序列号52),—直延伸到3'末端固定的核酸序列GCTTACTCTCATGTAGTTCC(序列号223)。除非另有说明，下面列出的每个序列是从5，端到3'端表示的，且在DNASELEXTM条件下进行的筛选，其中所有核苷都是是脱氧的。vWFDNASELEX2,Family1.1序列族1.1和1.2产生了ARC1029(序列号214)的母适体。AMX237.E9(序列号104)和AMX238.H5(序列号118)中用黑体加下划线表示了预计的能结合耙分子血管性血友病因子的核心核酸结合序列。AMX237,E9(序列号104)CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTGTCTAATAACCGTGCGGTGCCTCCCTGAGCTTACTCTCATOTAOTTCCAMX237,B11(序列号109)CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCTAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX237.A11(序列号98)CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCCAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATOTAGTTCCAMX238.G5(序列号106)ctacctacgatctgactXgctccagtgttttattcaataaccgtgcggtgcctccgtgagcttactctcatgtagttccAMX238JD8(序列号111)CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTnTATCCAACAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX237JE2(序列号102)CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTCATCTAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX237,H5(序列号101)CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTCATTTAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTrcCAMX238.D5(序列号108)CTACCTACGATCTGAGTAGCTCCAGTGTTTTATTCAATAACCGTGCGGTGTCTCCG丁GAGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX237.A2(序列号99)CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTOTTTCATCCAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX238,D12(序列号100)CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTCATTCAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX237J76(序列号110)CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCTAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGATGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX237.D11(序列号105)CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATATAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGATGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX237.B4(序列号103)CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTCATCCAATAACCGTGCGGTGCTTCCGTGAGCTTACTCTCATOTAGTTCCAM^236.F8(序列号113)CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTnTATCCAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGATGCTrACTCTCATCTAGTTCCAMX237.C7(序列号107)CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATTCAATAACCGTGCGGTGCCTCCOTGATGCTTACTCTCATGTAXJTTCCAMX238.G6(序列号112)CTACCTACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCCAATAACCGTGCGGGGCCTCCGTGATGCTTACTCTCATGTjVGTTCCvWFDNASBLEX2,Family#12AMX238.H5(序列号118)CTACCTACGATCTGACTAGCCTGCACTGCCTATTCTAGGCCCTGCGGTGCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTrCCAMX237.C11(序列号119)CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCTATTCTAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCATGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX238.E7(序列号116)CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCTATTTTAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX237.G6(序列号114)AMX238.F2(序列号120)AMX238.E9(序列号115)CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCCATCTrAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX238JF3(序列号117)CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCTATTTTAGGTCGTGCGGGGCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX237J10(序列号124)AMX237.C5(序列号126)AMX236.H2(序列号125)CTACCTACGATCTGACTAGCGTGCAGTGCCTATCCCAGGCCGTGCGGTAGCCTCCGTCACGCTTACTCTCATGTAGTTCC适体筛选中Family#l所包4舌的，结合本发明某些实施方案中靶分子vWF所需的预计二级结构和核心核酸序列在图15中表示为序列号220。vWFDNASELEX2.结合Familv#2AMX237.C9(序列号123)CTACCTACGATCTCACTAGCTTGGTAGTGACTTTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX237JF12(序列号122)CTACCTACGATCTOACTAGCTTCGTAGCGATTTTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATCTAGTTCCAMX237.F9(序列号121)CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGATTCTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTrACTCTCATGTAGTTCCAMX237.G7(序列号134)CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTTTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX236.A12(序列号127)CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTCTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX236.G4(序列号136)CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTTTGTGGAGATGCGGTTTGGTTGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX236.C12(序列号132)CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTCCGTOGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX236:A11—「—f一列，129),'AMX236JE6(序列号131)CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACCCTGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX236,B8(序列号128)AMX237.H8(序列号135)CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTTTGTGGAGCTGCGGTTraGTCGACATCAGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX237.D5(序列号130)CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACACTGTGGAGCTGCGGTTrGGTTGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX237,H10(序列号133)CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACTCAGAGGAGCTGCGGTrTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATGTAGTrCCAMX237.B1(序列号149)CTACCTACGATCTGACTAGCTTGGTAGCGACACAGTGGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTTACTCTCATCTAGTTCCDNASELEX2Family#2的一致性序列如下序列号325TCAGCTTACTCTCATGTAGTTCC其中Y-C或T,R-A或G且(Y/A)=C，T或A:vWFDNASELEX1M2.结合Family#3这一序列族与上面描述的vWFDNASELEX1,Family弁1是等《介的，两个序列力矣具有至少90%的一致性。AMX238.A11(序列号143)CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAGTGTTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX237.C1(序列号140)AMX236.C6(序列号144)CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAGTGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX236.C1(序列号137)AMX237,E10(序列号138)AMX238,F6(序列号145)AMX236.E2(序列号146)CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGTATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX237.B12(序列号141)CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCAGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX238.A6(序列号142)AMX238JF5(序列号139)CTACCTACGATCTGACTAGCGGAATGAGAAGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX237.G2(序列号156)CTACCTACGATCTGACTAGCnTCAGTCTTTCATATTTATAGGGTTTGGCATTGGGTCTGGCTTACTCTCArcTAGTTCCAMX237.C4(序列号151)ctacctacgatctgactagctttcagtcttccacatttatagggtttggcattgggtctggcttactctcatgtagttccAMX237.F5(序列号154)CTACCTACGATCTOACTAGCTnTAGTCTTCCACATTTATAGGGTTTGGCATTGGGTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX238.H11(序列号155)ctacctacgatctgactagcttt6agtctttcacatttatagggtttggcattgggtctggcttactctcatgtagttccAMX238.G4(序列号147)CTACCTACGATCTGACTAGCTTGTCGCACnTTGGTrGGTCTGGTTGGTTCTAAGTGCGCTTACTCTCATGTAGTrCCAMX237,E5(序列号152)CTACCTACGATCTGACTAGCTTTCAGTCTTCTACATTTATAGCGTTTGGCATTGGGTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX238,H9(序列号148)CTACCTACGATCTGACTAGCTTGTCGCACTTTTGGTTGGTCTGGTTGGTnTAAGTGCGCTrACTCTCATGTAGTTCCAMX237.F1(序列号153)CTACCTACGATCTGACTAGCnTCAGTCTTCCACGTTTATAGGGTTTGGCATTGGGTCTGGCTTACTCTCATGTAGTTCCv^FiW』孤#2.尸麵7v#5AMX236.G1(序列号164)CTACCTACGATCTGACTAGCCTCAGATTGACTCCGGCTGACTTGTTTTAATCTTCTGAGTGCTTACTCTCATGrAGTTCCAMX236JB3(序列号161)CTACCTACGATCTOACTAGCCTTACCTATTCCCTTCTGCGGAATACGTCGAGTACTATGCTrACTCTCATGTAGTTCCAMX236JF7(序列号160)CTACCTACGATCTGACTAGCCCCCACTTATCGTGTACCTTATGATATGTCGAATACTCTTGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX236.H1(序列号159)CTACCTACGATCTGACTAGCCTCAGATTGACTCCGGCCGACTTGTTTTAATCTTCTGAGTGCTTACTCTCATGTAGTTCCSELEX2Family#5的DNA—致性序列如下序列号326Family5.1=序列号164和序列号159CTACCTACGATCTGACTAGCCTCAGATTGACTCCGGCTGACTTgtttTAATCTTCTGAGTGCTTACTCTCATGTAGTTCC其中Y-C或T序列号327Family5.2=序列号161和序列号160CTACCTACGATCTGACTAGCCYYACYTATY(C/G)Y(C/G)T(T/A)CY(GTT)YR(G/T)RATAYGTCGARTACT(AJC)TGCTTACTCTCATGTAGTTCC其中Y:C或T,R二A或GvWFDNASELEX2.Family#6AMX238.A3(序列号150)CTACCTACGATCTGACTAGCTCAAAGTATTACTTATTGGCAATAAGTCGTTTACTCTATAGCTTACTCTCATOTAGTTCCAMX238.F7(序列号163)CTAfCTACGATCTGACTAGCAAGGGGATTGGCTCCGGGTCTGGCGTGCTTGGCATCnTGGCrrACTCTCATGTAGTTCCAMX236.C9(序列号158)CTACCTACGATCTGACTAGCCAGTTCTGGGAAAAATrATTnTTTATTTCGATCGTATTTGCTTACTCTCATGTAGTTCCAMX238.D9(序列号162)CTACCTACGATCTGACTAGCCAGTTCTGGGAAAAATCATTTTTTATTTCGATCGTATTTGCTTACTCTCATGTACTTCCAMX238'A12(序列号157)CTACCTACGATCTGACTACCCAGTTCTGGGAAAAATTATTnTTTATrrcGATCGTATATGCTTACTCTCATGTAGTrCC实施例2:组合物、序列优化和测序实施例2A:rRfYvWF适体的切断基于实施例1所描述的vWF结合分析和下面实施例3描述的基于细胞的实马全数据，从rRfY筛选林重选择适体ARC840(AMX201.C8)(序列号23)进4亍进一步定性分才斤。为了鉴定结合vWF所需的核心结构成分，确定了ARC840(AMX201.C8)(序列号23)的3，-边界。RNA專争录产物全长序列的5'-末端用y-32patp和T4聚核苷酸激酶标记。放射性标记的配体经过部分碱水解，然后在经过；肖化纤维过滤器之前，在溶液中，选择性的与500nM人血管性血友病因子Al区域(序列号5)结合。保留的和未保留的低聚核苦酸分别溶解于8%的变性聚丙雄酰胺凝胶中。能够与vWF结合的最小的低聚核苷酸定义为3，-边界。基于边界实验和预计折叠的视觉检测，设计了一组最小化序列。<吏用/人Rochester大学下载的第4.1片反RNAstructure预计本发明核酸序列的折叠。RNAstructure是Zuker运算法则的Windows执4亍方式，可以4艮据自由能最小化原理(参见Mathews,D.H.;Disney,M.D.;Childs,J丄.；Schroeder,SJ.;Zuker，M.;和Turner,D.H2004年在美国国家科学院学寺艮101巻7287-7292页发表的名为"将化学修饰限制引入动态规划法则来预计RNA二级结构，，的文献")预计RNA二级结构。RNAstructure4.1使用得自Turner实-验室最新的热力学参凄t。对于最小化rRfY适体，如下所述，噤呤包括2，-OH修饰，所述嘧啶包括2，-F修饰，同时，模版和引物包括未修饰的脱氧核糖核苷。对于最小化rRfY适体5'—GGAGCGCACUCAGCCACCCUCGCAAGCAUUUUAAGAAUGACUUGUGCCGCUGGCUG-3'(序列号165)，4吏用5'PCR引物5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(序列号166)和3'PCR引物5，-CAGCCAGCGGCACAAGTC-3'(序列号167)来扩增才莫片反5'-TCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCACCCTCGCAAGCATTTTAAGAATGACTTGTGCCGCTGGCTG國3'(序列号168).为了最小化适体5'-GGACCACCCUCGCAAGCAUUUUAAGAAUGACUUGUGCCGCUGGUCC-3'(序列号169),使用5'PCR引物5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(序列号166)和3'PCR引物5'-GGACCAGCGGCACAAGTC-3，(序列号170)来扩增模版5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATCTGGTCC-3'(序列号171).为了最小化适体5'-GGACCACCCUCGCAAGCAUUGAGAAAUGACUUGUGCCGCUGGUCC-3'(序列号172)，使用5'PCR引物5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(序列号166)和3'PCR引物5，-GGACCAGCGGCACAAGTC-3'(序列号170)来扩增才莫版5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGACCACCCTCGCAAGCATTGAGAAATGACTTGTGCCGCTGGTCC-3'(序列号173).为了最小化适体5'—GGACCACCCUCGCAACGAGAGUUGUGCCGCUGGUCC-3'(序列号174),使用5'PCR引物5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(序列号166)和3'PCR引物5'-GGACCAGCGGCACAACTC-3'(序列号175)来扩》曾才莫版5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGACCACCCTCGCAACGAGAGTTGTGCCGCTGGTCC-3'(序列号176).转录上述所有最小化适体，并用15%变性聚丙蜂酰胺凝胶纯化，用Y"PATP进行5-"P末端标记，然后，用两个Centri-SpinlO色i普柱(PrincetonSeparationsCat.弁CS-IOl,Adelphia,NJ)脱盐，这些最小化适体在后面实施例3的细胞实验中进行初步定性。实施例2B:rRdYvWF适体的切断基于实施例1所描述的vWF结合分析和下面实施例3描述的基于细胞的实-验数据，分别对适体AMX203.G9(序列号44)和AMX205.F7(序列号49)进行进一步定性分析。为了筌定结合vWF所需的核心结构成分，确定了AMX203.G9(序列号44)和AMX205.F7(序列号49)的3，-边界。RNA转录产物全长序列的5，-末端用y-32patp和T4聚核普酸激酶标记。》文射性标记的配体经过部分碱水解，然后在经过硝'化纤维过滤器之前，在溶液中，选择性的与500nM人血管性血友病因子Al区域(序列号5)结合。能够与vWF结合的最小的低聚核苷酸定义为3，-边界。基于边界实验和预计折叠的视觉检测，使用RNAstructure4.1版:没计了一组最小化序列如下所述，为了最小化rRdY适体，所有的噪p令都是2'-OH嘌呤，所有的嘧啶都是脱氧嘧啶，同时模版和引物包括未修饰的脱氧核糖核酸。下列三组最小化适体序列4汙生自DL.159.87.70(序歹寸44):为了最小化适体序列5，-GGAGCGCACTCAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTGGCT-3'(序列号177),使月5'PCR前体5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA國3'(序列号166)和3'PCR前体5'-AGCCACATACCCGCCGTC-3，(序列号178)来扩增模版5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTGGCT-3'(序列号179).为了最小化适体序列5'-GGAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTGGCTCC-3'(序列号180),使用5'PCR前体5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(序列号166)和3'PCR前体5'-GGAGCCACATACCCGCCG-3'(序列号181),来扩增模版5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTGGCTCC-3，(序列号182).为了最小化适体序列5'-GGGACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTCCC國3'(序列号183),使用5'PCR前体5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(序列号166)和3'PCR前体5'-GGGACATACCCGCCG-3'(序列号184)，来扩增才莫版5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGGACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTCCC-3'(序列号185).下列7个最小化适体衍生自序列号49的适体为了最小化适体序列5'-GGAGCGCACTCAGCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTG-3'(序列号186),使用5'PCR前体5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA國3'(序列号166)和3'PCR前体5'-CAGCCATGCGTGGTAATT-3'(序列号187),来扩增才莫版5'—GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTG-3'(序列号188).为了最小化适体序列5'-GGAGCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTCC-S'(序列号189)，4吏用5'CR前体5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(序列号166)和3'PCR前体5'-GGAGCCATGCGTGG-3'(序列号190),来扩增才莫版5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTCC-3'(序列号191).为了最小4匕适体序列5'-GGAGCCACACGACATTGGCGGGCGAGAGCCACGCATGGCTCC-S'(序列号192)，4吏用5'PCR前体b5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(序列号166)和3'PCR前体5'-GGAGCCATGCGTGG-3'(序列号190),来扩增模版5'—GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGACATTGGCGGGCGAGAGCCACGCATGGCTCC-3'(序列号193).为了最小化适体序列5'—GGAGCCACACGACATTGGCGAGAGCCACGCATGGCTCC-S'(序列号194),使用5'PCR前体5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(序列号166)禾口3'PCR前体5'-GGAGCCATGCGTGG-SX序列号190),来扩增才莫版5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGACATTGGCGAGAGCCACGCATGGCTCC-3'(序列号195).为了最小化适体序列5，-GGAGCCACACGAGAGTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTCC-S'(序列号196)，4吏用5，PCR前体5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(序列号166)和3'PCR前体5'-GGAGCCATGCGTGG-3'(序列号190),来扩增才莫片反5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGAGAGTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTCC-3'(序列号197).为了最小化适体序列5'-GGCCACACGACATTGGCGGGCGAGAGCCACGCATGGCC-3'(序列号198),使用5'PCR前体5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(序列号166)和3'PCR前体5'-GGCCATGCGTGGCTCTC-3'(序列号199),来扩增模版5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGCCACACGACATTGGCGGGCGAGAGCCACGCATGGCC-3，(序列号200).为了最小化适体序列5，-GGAGCCACACGACATTGGCGCGAGAGCGCATGGCTCC曙3'(序列号201)，使用5'PCR前体5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(序列号166)和3'PCR前体5，-GGAGCCATGCGCTCTCG-3'(序列号202)，来扩增才莫片反5，國GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGACATTGGCGCGAGAGCGCATGGCTCC-3'(序列号203)。rRdYvWF最小化序列结合转录所有最小序列，用15%变性聚丙烯酰胺凝胶纯化，用？2PATP进行5-32P末端标记，然后4吏用2个Centri-Spin10色谱柱(PrincetonSeparationsCat.#CS-101，Adelphia,NJ)脱盐。为了确定KD值，在包含0.1mg/mLBSA的IXDulbecco'sPBS溶液(总体积为50uL)中使用0-300nM(3倍稀释)的8点蛋白滴定方法检测最小转录产物，在室温条件下反应30分，使之直接与人vWF(序列号7)全长序列、人vWFAl区域(序列号5)和兔vWFAl区域(序列号6)结合，然后然后用定点印记仪器(SchleicherandSchuell,Keene,NH)中的》肖化纤维和尼龙夹层过滤装置处理。<吏用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51,SynergySoftware)通过满足等式y-(max/(l+K/protein))+yint来计算KD值。表18列出蛋由结合特性的结果。表18:rRdY适体最小结合体数据，在细胞反应中，只测试了显示出潜在活性的适体的结合亲和性(ND二未实-睑)<table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table>实施例2C:DNASELEXTM#1vWF适体的切断基于上面实施例1所述的vWF结合分析和预计折叠的禾见觉抬r查，从族#1中设计出一组最小化序列，作为最好的一类结合体。在这种情况下，从族#1中得到的所有结合体是结构相关的，且通过分子5，-末端和3，-末端的碱基互补规则测定，这些结构羼于四个互斥折叠(用RNAstructure4.1预测的)之一。我们分別合成并测试这四种预计折叠。四种合成的最小化DNA适体序列分别々口下所示序列号2045，-CCAGCGGAATGAGAATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGG-3'ARC845(序列号205)5，ATGAGAGTGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCAT-3，序列号2065，-CGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGGTGGATCG-3'序列号2075，-GATCTGACTAGCGCAATGAGGATGCdTGATGGATTGCTCAGGTC-3'所有的最小化DNA序列都是化学合成的，用Y"pATP进行5-32P末端标i己，然后用两个Centri-Spin10色i普牙主(PrincetonSeparations,Cat.#CS-IOl,Adelphia,NJ)脱盐。为了确定KD值，使用竟争性定点印记试-睑，维持10nM稳定的蛋白浓度，室温下，在包含0.1mg/mLBSA的IXDulbecco'sPBS溶液中(最终体积为50uL)进行12点冷竟争性DNA滴定(3uM,1uM,333nM，100nM，33nM,10nM,3.3nM，1nM，333pM，100pM,33.3pM，0pM)30分，从而测定最小化序列与人vWFAl区域(序列号5)的结合。使用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51,SynergySoftware)，通过等式y=(max/(l+K/protem))+yint计算Kd但。表19列出了蛋白结合特性结果。如图所示，最小化序列构建物中，只有ARC845即能与人vWFAl区域结合，又能与兔vWFAl区域结合。表19DNA1最小化序列结合数据(ND-未实验)<table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table>基于这些结合结果，ARC845(序列号205)代表了DNASELEXTM1，；娱1适体的核心核酸结合序列。实施例2D:DNAvWF交互筛选适体最小4匕基于实施例1所描述的vWF结合分析和下面实施例3描述的基于细胞的实验数据，还有对适体AMX237.B11(序列号109)和AMX236.A12(序列号127)预计折叠的视觉观察，设计了一系列最小化适体。另外，基于观察，在细胞实验中适体AMX237.G6(序列号114)，AMX238.E9(序列号115)，和AMX238.H5(序列号118)更为有效，因此合成了一系列最小化序列ARC1027-1031(序列号212-216)。最小化序列序列号208和序列号209代表了两个乂人适体AMX237.B11(序列号109)中预计的互斥^斤叠。上述最小化DNA适体的核酸序列如下:(序列号208)5,-GGACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCTAATAACCGTCC-3'(序列号209)5，-GGAGCTCCAGTGTTTTATCTAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTCC-3，(序列号210)5，-GGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTCC-3'(序列号211)5，-GGTAGCGACTCTGTGGAGCTGCGGTTTGG-3，ARC1027(序列号212)5'-GGCGTGCAGTGCCTATTCTAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCC-3T-3'ARC1028(序列号213)5，-dGCGTGCAGTGCCT-[PEG]-AGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCC-3T-3，ARC1029(序列号214)5，-GGCGTGCAGTGCC-[PEG〗-GGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCC-3T-3'ARC1030(序列号215)5，-GGCGTGCAGTGCCTATTCTAGGCCGTGCGG-[PEG]-CCGTCACGCC-3T-3'ARC1031(序列号216)5，-GGCGTGCAGTGCCT-[PEG]-AGGCCGTGCGG-[PEG]-CCGTCACGCC-3T-3，上述所有最小化适体都是化学合成的，用15%变性聚丙烯酰胺凝力交凝胶纯化，然后按照标准方法才支术用两个Centri-Spin10色i普牙主(PrincetonSeparationsCat.#CS-IOl，Adelphia,NJ)脱盐。嗦口下面实施例3所述，最小化序列在细胞实验中进行定性。在从序列号208到序列号211的最初的一系列核酸中，只有序列号208在细胞实验中表现出活性(见下面实施例3)。将适体AMX237.B11(序列号109)和适体AMX237.G6(序列号114)、适体AMX238.E9(序列号115)及适体AMX238.H5(序列号L18)进行比较可知，它们是密切相关的，且能够支持最小化适体(序列号208)的预计二级结构(见图14和图15)。分子ARC1027-1031(序列号212-216)进一步测试了我们关于适体AMX237.G6(序列号114)、AMX238.E9(序列号115)和AMX238.H5(序列号118)的4斤叠和二级结构的個—i殳(见图5、14和15)。为了测定Ko值，用Y-"PATP对在实施例3所述的细胞实-验中表现出有效活性的最小化序列进行5'-"P末端标记，然后用两个Centri-Spin10色^普^主(PrincetonSeparations,Cat.#CS-IOl,Adelphia,NJ)脱盐。在包含0.1mg/mLBSA的IXDulbecco'sPBS緩冲液中，室温条件下，进行9点蛋白滴定(100nM,30nM,10nM,3nM，1nM,300pM,100pM,30pM,0pM)30分，观'J试最小化适体与人vWF全长序列(序列号7)和兔vWFAl区域(序列号6)的直接结合，然后用定点印记仪器(SchleicherandSchuell,Keene,NH)中的硝化纤维和尼龙夹层过滤装置处理。使用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51,SynergySoftware)通过满足等式y=(max/(l+K/protein))+yint来计算Ko值。表20列出蛋白结合特性的结果。表20DNA2适体最小化序列结合数据，只测定了在细胞实验中表示出有效活性的适体最小化序列(见下面实施例3)(<ND，=未实验)<table>tableseeoriginaldocumentpage142</column></row><table>实施例2E:通过适体药物化学优化ARC1029通过系统的合成修饰方法鉴定具有高稳定性和有效性的ARC1029(序列号214)变异体，该方法包括适体合成、纯化和结合活性实验5个步骤。在适体修饰过程中，为了促进化学合成的简化，ARC1029(序列号214)的PEG间隔体用一种，豆的^f氐聚核苦酸序列dTdTdC耳又4、，得到ARC1115(序列号221)，如下面图16和表21所示。在ARC1115(序列号221)的三个最初的末端合成一种高度稳定的3，-反向dT,得到ARC1172(序列号222)，序列号222表示出与人vWF序列的结合能力，在下面的实施例中，将ARC1172(序列号222)作为修饰的基础模板。在修饰过程的步骤1,ARC1172(序列号222)中的每个残基分别被相应的包含2'-0-甲基的残基(除非另有指出，该残基的dT被取代)取代，得到ARC1194(序列号223)-ARC1134,如下面表21和图16所示。另外，在步骤1中，在ARC1172(序列号222)的支链部分发生一组复合耳又代，得到ARC1235到ARC1243,3o下面表21和图16所示。例^口，3口实施例1、2、3所述，在对ARC1029(序列号214)进行克隆筛选和切断的过程中，适体的结合试验(定点印记)、FACS实验和BIPA实验的相关效力具有很好的一致性。因此，用定点印记结合实验测定方法测得的人vWF全长序列的亲和性可以用来表现大多数合成的适体变异体的相对亲和性特点。为了测定K。值，化学合成的适体用变性聚丙烯酰胺凝力吏电泳纯化，用Y-32PATP标记5'末端，并才企测与人vWF全长序列(CalbiochemCat.#681300,LaJolla,CA)的直接结合能力。在包含0.1mg/mLBSA的IXDulbecco'sPBS緩冲液中，在定点印迹实-验中室温条件下，进行8点蛋白滴定(100nM,30nM，10nM,3nM,1nM,300pM，100pM,0pM)30分。使用KaleidaGraph(KaleidaGraphv.3.51，SynergySoftware)通过满足等式y=(max/(l+K7protein))+yint来计算Ko值。合成、纯化并测试ARC1029(序列号214)衍生物序列与人vWF全长序列的结合能力，表21列出蛋白结合特性的结果，在表21中，结合亲和性(KD)表示在第四栏，适体与100nMvWF的结合禾呈度表示在最后一栏。表21步骤1修饰过程结合结果<table>tableseeoriginaldocumentpage144</column></row><table>226ARC1197dGdGdCmGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T246227ARC1198dGdGdCdGmUdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T0.950228ARC1199(IGdGdCdGTmGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T1928229ARC1200dGdGdCdGTdGmCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T25230ARC醒dGdGdCdGTdGdCmAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T0.96231ARC1202dGdGdCdGTdGdCdAmGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T0.456232ARC1203dGdGdCdGTdGdCdAdGmUdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T340233ARC1204dGdGdCdGTdGdCdAdGTmGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T245234ARC1205dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGmCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T150235ARC薩dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCmCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC_3T250<table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage148</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage149</column></row><table>从表21中的结合数据可以看出，最容易耐受脱氧残基被2'-O-曱基残基取代的位点与ARC1029(序列号214)二级结构所示意的序列保守性很好的联系起来，并进一步为提议的适体结构提供支持。图15B中表示了ARC1172(序列号222)上不耐受2'-0-Me修饰的4立点和忍受2'-0-Me修饰的位点。基于上述修饰过程步骤1描述的单个或多个脱氧适体到甲氧基适体的结构活性关系(SAR)结果，设计、合成、纯化和测试能够结合vWF的第二系列适体。这些和随后的适体的目的是获得保持亲和性为10nM或更好，且对100nMvWF的结合程度至少为35%的分子。如图17和表21所示，在修饰过程步骤2中合成ARC1338(序列号273)-ARC1348(序列号283)。基于4务饰步骤1的耐受性个体取代，合成带有封闭修饰的ARC1338(序列号273)到ARC1342。合成分别带有不同硫代磷酸酯磷酸骨架修饰的ARC1343(序列号278)-ARC1345(见图17和表21)。最后，合成ARC1346(序列号281)-ARC1348(序列号283),如图17和表21所示，来测i式茎l环、茎2环和ARC1342的两个茎环结构中一对碱基对的移除。表22:步骤2^多饰结合结果<table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage151</column></row><table>如表22所示，适体修饰步骤2所得的结果显示ARC1346(序列号281)是高耳又代的ARC1029(序列号214)衍生物适体迄今为止产生的最有效的适体。有趣的是，如ARC1347(序列号282)和ARC1348(序列号283)的结果所示，高修饰的序列不能耐受茎2环中一对碱基对的移除。如表23和图17所示，在适体^"饰步骤3种合成ARC1361(序歹'j号284)到ARC1381(序列号304)。由于在适体《奮饰步骤1中实—验变异抹的6位上对dG到mG取代的耐受力较差，且6位上的鸟噤呤与36位上胞嘧咬成对出现，所以，如下表23所示合成在36位上带有从mC到dC修饰的ARC1346(序列号281)可以得到ARC1361(序列号284)。如下表23所示，ARC1361(序列号284)作为部分列，引入单一辟u代磷酸酯磷酸骨架修饰，得到ARC1362到ARC1381(序列号304)。表23:修饰步骤3结合结果<table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage153</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage154</column></row><table>如表23所示，尽管步骤3种测试的大多数修饰作用很小或者没有有效作用，但是ARC1368(序列号291)与其母体化合物ARC1172(序列号222)对人vWF分子具有一致的(在实验i吴差范围内)结合亲和性，其中，ARC1368在mG-20和dT-21之间具有单一-危代A，酸酯f务饰。在适体修饰步骤4和步骤5中，如图18所示，合成ARC1524(序列号305)到ARC1535(序列号316),ARC1546(序列号317)和ARC1759(序列号318)。合成一种序列的循环排列，如图19所示，该循环」排列能够关闭茎1环和打开茎2环。如下表24所示，这些适体中大多数都能与vWF结合，但是没有一个像ARC1368(序列号291)这样有效。有趣的是，尽管在适体修饰步骤1中持续生成SAR,但是只包含27位上从dT到mT单一改变的ARC1525表现出对vWF没有结合性。在随后进行的ARC1368(序列号291)的生物实验中，将ARC1525作为阴性参照物。此外，在适体修饰步骤3中维持SAR数据，ARC1759(序列号318)的结合亲和性相对于ARC1172表现出重大的进步，ARC1759在21位的G和22位的T之间具有单一硫代石庳酸酯耳又代，除此之外，该序列与ARC1172(序列号222)具有一致性。<table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table>311ARC1530mCmGmUdGdCdAmGmUniGmCmCmUmUmUmGmGmCdCmG-s-TmGdCdGdGT迈GmCdCmUdCdCmGmUmCmAmCmG-3T15.019.2312ARC1531mCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCPEGmGmGmCdCmG-s-TmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmG-3T1.520.0313ARC1532InCmGmUdGdCdAmGmUmGmCniCPEGmGmGmCdCmG-s-TmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUmCmAmCmG-3T2.619.3314ARC1533mCmGmGmCdCmG-s-TmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUmCmAmCPEGmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmG-3T4.031.7315ARC1534mCmGmGmCdCmG-s-TmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUmCmAmCmUroUmUmGmUdGdGdAmGmUmGmC迈C迈G-3T62.825.6316ARC1535mCmQnGmGmCdCmG-s-TmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmU迈CmAmCmUmUmUniGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmGmG-3T27.148.3317ARC1546mCmCmGmGmCdCmG-s-TmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGniUdCmAmCmGmUmUmCmCDiGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmGmG-3T2426318ARC1759dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdG-s-TdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T0.746实施例2F:4务饰适体的PEG部分结合聚烯基二醇部分通过胺活化化学体与ARC1368(序列号291)和ARC1172(序列号222)得5，末端相结合。化学合成低聚核苷酸ARC1635NH2-mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-s隱dTmGdCdGdGdTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T(5，-己胺寸奮饰的ARC1368(序列号291))和ARC1884(序列号322)NH2-dGdGdCdGdTdGdCdAdGdTdGdCdCTdTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T(5，-己胺修饰的ARC1172(序列号222))。如下表25所示，胺修饰的适体与后合成的不同的PEG部分结合。表25:己胺^f奮饰或PEG结合适体<table>tableseeoriginaldocumentpage158</column></row><table>320ARC1779PEG20K-NH2-mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-s-TmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T321ARC1780PEG40K-NH2-mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-s-TmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T322ARC1884NH2-dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T323ARC1885PEG20K-NH2-dGdGdCdGTdGdCdAdGTdGdCdCTTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T实施例3:功能性细胞实验vWF生物依赖性实駘，本实施例描述了在多种生物实-验中不同的适体在封闭vWF功能中的效力。在一个实-验中4吏用了botrocetin。Botrocetin是从蛇毒中分离出来的蛋白，已知该蛋白可以诱导血管性血友病因子与活的且固定的血小板上的gplb受体结合。这一反应通过vWF多聚作用可以导致固定化血小板悬浮液的胶合。在制备富集血小板的血浆(PRP)时，在vWF/botrocetin感应到月交合作用之后，血小板的代i發活动导致第二步血小板凝聚。这两个反应vWF结合固定的血小板和vWFi秀导的血小板凝聚可以用来测定本发明适体的活性。可以用vWF的抗体来测定与固定化血小4反结合的vWF的量。结合抗体与带有荧光剂的抗体一起培养并检测其中的荧光信号，用流式细胞计定量。本发明适体阻碍vWF与血小板结合的能力与荧光信号的减弱有关。Botrocetini秀导vWFAl区域以及全长蛋白与血小^反结合。发明者确定，6-组氨酸标记的兔Al区域vWF纯化蛋白可以被Botrocetini秀导与人冻干的血小^反结合。用抗-聚-His抗体测定兔Al区域结合的血小板，然后与藻红蛋白结合的二级抗体一起培养。可以用流式细胞仪定量结合程度。适体阻碍兔Al与人固定化血小板结合的能力与焚光信号的减少有关。在从人血中分离出来的富集血小板的血浆中，botroeetin通过vWF诱导血小板凝聚。由于血小板的凝聚使血浆变的澄清，所以，血小板凝聚的形成可通过ChronologModel490-4D血小板凝聚计上透光率％的增加3见觉测定。在人血中，分冲斤本发明的适体抑制botrocetin诱导的血小板凝聚作用("BIPA")的能力。在加入botrocetin之后六分钟内，如果本发明适体能够防止凝聚形成，则i/v为本发明的适体是由活性的。利用PFA-100血小板功能分析仪,本实施例的另一个试验是一种使用PFA-100血小板功能分析仪的不依赖于激动剂，但依赖于vWF的试验(参见Harrisonetal.,Clin.Lab.Haem.，v24,p225-32(2002))。在体内高剪切压的条件下，PFA-100血小板功能分析仪通过记录血小板凝聚需要的时间，阻断含枸橼酸盐的全血力仡过涂有胶原和肾上腺素或者ADP的薄膜中的微小窗口，来模拟止血栓的形成。由于血流过^f鼓小窗口导致剪切力，当高分子量vWF多聚体在薄膜上时结合固定的胶原，然后结合并活化血小板，这种活性具有血管性血友病因子依赖性。因此，由于具有vWF依赖性，这种试验对于BIPA和FACS试验来i井是值得称赞的，然而，它具有某些优点，就是他不需要加入vWF激动剂botrocetin，并使用全血代替富集血小板的血浆。本实施例的另一个试-验^^用ADP来导致血小斧反凝聚。通过多种方式可以导致富集血小板的血浆(PRP)的凝聚。如上所述蛇毒蛋白botrocetin处理vWF，稳、定vWF与血小^反受体gplb的相互作用，从而导致血小板凝聚。vWF与gplb的结合是血小板凝聚的早期步骤，因此，存在一种可能性，就是阻碍凝聚过程的下游成分(即，IIbIIIa拮抗物IntegrelinTM和ReoProTM)也可能预防botrocetin导致的血小板凝聚。然而，对于直接作用于血小板导致凝聚作用的激动剂(例如ADP)，可以预料到激动剂上游拮抗物可能是无效的(例如一种抗-vWF适体)，而直接作用于血小板的拮抗物(IIbIIIa拮抗物)可能保持有效性。结合治疗，vWF拮抗物相对于IIbIIIa拮抗物的特异性能够通过缩短出血时间增加抗vWF拮抗物的安全性。对于在狭窄动脉患有动脉粥样硬化的患者，当血小板在动脉粥样斑表面结合固定有胶原的vWF时发生血小板凝聚。因此抑制vWF/gplb相互作用且阻断IIbIIIa受体结合纤维蛋白能够防止血小才反凝聚。与抗IIbllla治疗不同，耙分子vWF给予的生物学特异性确保血小纟反本身不直4妄作为乾分子，保证它们仍然可以用其它方式活化，因此减少抗血小;fel治疗潜在的出血并发症。如下所述，在实施例3A-3D中使用了下列材料人血管性血友病因子(序列号7),和从Calbiochem购买的牛血清白蛋白(分别为Cat#—681300和#—126593)(LaJolla,CA);利用才示准方法和条件表达并纯化的兔vWFAl区域(序列号6)。冻干的人血小板(P/N299-2)、电池(P/N312)，4觉4半才奉(P/N311)，血小氺反凝聚分析仪(model490-4D),和从Chronolog购买的AGGRO/LINK專欠件(Haverton,PA)。Pentapharm(巴塞尔，瑞士)制造的botrocetin(12201-100U-B)。从健康的、非甾醇类抗炎药(NSAID")无偿献血者处获得新鲜血液，倒入5mL0.105M柠檬酸钠真空管(Cat#—369714)(BectonDickinson-FranklinLakes,NJ)中。Aldon公司制造的生理盐水(Cat#_9420306)(Avon,NY)和从Cellgro乂>司(Herndon,VA)购买的磷酸盐緩沖盐水(Cat#—21-040-CV)。在BDBiosciencesFACSCAN仪上进行流式细胞实-险，并用CellQuest软件(SanJose,CA)分析。/人GTI(Waukesha,WI)购买的抗血管性血友病因子鼠单克隆抗体(Cat#—GTI-VIA)。从Qiagen(德国)购买的penta-HIS-生物素结合物单克隆抗体(Cat#—34440)。从BDBiosciences(SanDiego,CA)购买的抗鼠IgG2a-FITC结合物(Cat#—553390)。乂人JacksonImmunoResearch实3全室(WestGrove,PA)购买的抗鼠IgG-PE结合物抗体(Cat#_715-116-150)。实施例3A:人血管性血友病因子全长序列血小板结合试-验通过流式细胞分析仪评估适体阻断人vWF结合冻干血小板的效力。用5nM的人vWF全长序列室温条件下，在体积为50uL的FACS緩冲液(PBS溶液加0.5%牛血清白蛋白)中预培养适体的滴定4勿(0nM、0.1nM到1000nM)。向适体/vWF中力口入另夕卜50uLFACS緩冲液，此FACS緩冲液中包含5uL冻干血小板力口1uL0.1U/uL的botrocetin。在37。C下，进行15分钟反应，随后补充200uLFACS緩沖液。通过以1470转每分旋转收集血小板，丟弃上清液。将血小板重新悬浮在100uL包含1:100稀释的抗vWF抗体的FACS緩沖液中，并在室温条件下培养30分钟。之后用200uLFACS緩冲液稀释，以1470转每分旋转血小板6分钟，丟弃上清液。将血小板重新悬浮在1:100的抗IgG2a-FITC抗体溶液中，并在室温条件下黑暗中培养30分钟。将全部100uL稀释到200uLFACS緩冲液中，并立即用流式细胞分析4义在FACSCAN中分析。通过在单一的和凝聚的血小板周围划分一个差值，从被污染的反应物中除去人为数据。通过流式细胞计分别定量^皮分析的样品的平均荧光强度("MFI")示数。从所有^l据点中减去背景MFI。通过计算人vWF全长序列在适体以给定的浓度存在条件下与血小板的结合量与没有任何一种适体存在条件下的结合量的百分比，来表示抑制百分比(参见图7)。vWF结合血小板的抑制百分比是适体浓度的参数，通过满足下列等式来确定IC50值%抑制性=%抑制性max/(l+ICso/适体浓度)下面的表26列出了Botrocetin诱导的vWF结合特性结果'实施例3B:兔血管性血友病因子A1区域血小板结合试-验通过流区域结合冻干血小板的能力。用4nM的兔vWFAl区域室温条件下，在体积为50uL的FACS纟爰冲液(PBS溶液力tr0.5%牛血清白蛋白)中预培养适体的滴定物(0nM、0.1nM到1000nM)。向适体/vWF中加入另夕卜50uLFACSi爰沖液，此FACS纟爰冲液中包含5uL冻干血小板力口1uLO.lU/uL的botrocetin。在37。C下，进行15分钟反应，随后补充200uLFACS緩冲液。通过以14704争每分旋转收集血小板，丢弃上清液。将血小板重新悬浮在100uL包含1:200稀释的抗-penta-HIS-生物素的FACS缓冲液中，并在室温条件下培养30分钟。之后用200uLFACS《爰冲液稀释，以1470转每分旋转血小板6分钟，丢弃上清液。将血小板重新悬浮在1:100的抗IgG-PE抗体溶液中，并在室温条件下黑暗中培养30分钟。将全部100uL稀释到200uLFACS緩冲液中，并立即用流式细胞分析仪在FACSCAN中分析。通过在单一的和凝聚的血小^反周围划分一个差值，从被污染的反应物中除去人为数据，从10000个事件中收集数据。通过流式细胞计定量每个分析样品的荧光强度中值("MedFI")示数(为了比较目的，荧光强度中值示数通常等于上面实施例3a所述的MFI示数)。从所有数据点中减去背景MFI。通过计算人vWF全长序列在适体以给定的浓度存在条件下与血小板的结合量与没有任何一种适体存在条件下的结合量的百分比，来表示抑制百分比(参见图7)。vWF结合血小寿反的抑制百分比是适体浓度的参数，通过满足下列等式来确定ICso值%抑制性=%抑制性max/(l+ICso/适体浓度)下面的表26列出了Botrocetin资导的兔vWFAl区i或结合净争性结果。表26:FACS和BIPA试—睑的结果(，ND，=未试验)适体序列在FACS试验中VWF全长序列结合抑制性在FACS试验中兔VWFAl区域结合抑制性在BIPA试-险中《200nM的适体在6分钟时给出>90%的阻断ICso的范围ICw的平均值IC^的范围ICso的平均值rRdY适体(AMX203.D6)无活性NDND序列号31(AMX205.H8)无活性NDND序列号32(AMX205.H11)无活性NDND序列号33(AMX205.D11)无活性NDND序列号35(AMX206.F9)无活性NDND序列号36<table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage166</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage167</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table>实施例3C:抑制Botrocetin诱导的血小板凝聚(BIPA试验)为了确定适体对活的人血小板的活性，使用新制备的富集血小4反的血浆进行BIPA试I全。血液得自健康的献血者，该献血者至少有5天没有服用NSAIDS。使用从BectonDickinson购买的213/4标准蝶形针汲耳又血液浸入0.105M的4宁檬酸钠真空管中。收集血液，倒入15ml的圆锥试管中，在室温条件下静置。剩余的血液以2500g离心10分钟，回收血浆澄清层在室温下静置，其中，血浆澄清层叫做贫血小;f反血浆("PPP，，)。将PRP以470pL的体积整分入包含搅拌浆的试管中。将500的PPP整分入试管中，然后;改入血小板凝聚分析4义的PPP参比室中。在用于BIPA试验前，PRP样品在血小板凝聚分析仪中在37。C下预热3-5分钟。首先，通过滴定确定i秀导每个献血者的血小^反凝聚所需的botrocetin浓度。在试验余下的步骤中一直使用该botrocetin浓度。接下来，在预热后的PRP中进行1分钟的适体滴定(0、1nM到1000nM)，对适体进行试-验，随后加入botrocetin。随着血小板凝聚，可以看到投射光振幅的增加(图8)。表26的最后一栏报道了6分钟之后能够阻止90%或更多的血小板凝聚的浓度。使用Aggro/LINK软件可以从凝聚分析仪曲线下计算出曲线下面积("AUC，，)，在botrocetin诱导的血小板凝聚中，曲线下面积被用来计算任意给定浓度的适体的抑制性，如关于适体ARC1029(序列号214)的图9所示。实施例3D:筛选的《奮饰适体在一系列生物试验中的生物活性如上面实施例2所述，药物化学〗多饰过程鉴定的ARC1172(序列号222)、ARC1346(序列号281)、ARC1368(序列号291)，ARC1525(阴性参照)，ARC1779(序列号320),ARC1780(序列号321),和ARC1885(序列号323)在一系列生物试验中进行了测试。这些试验包括FACS(如实施例3A和3B所述)和BIPA试验(如实施例3C所述)，还有下面描述的血小板PFA-100试验。材料在血小板功能分析(PFA)试验中使用了下列材料得自健康的，未服用非甾体类抗炎药(NSAID)的献血者的新鲜的全血，使用213/4标准蝶形针(Cat存367287，BectonDickenson)将全血收集到5ml0.105M的4宁檬酸钠试管(Cat弁369714,BectonDickenson)中。得自健康的，未服用非甾体类抗炎药(NSAID)的猕猴体内的新鲜的全血。在无添加的真空试管(Cat弁366434，BectonDickenson)中用从Aldon购买的生理盐水(Cat弁9420306)稀释适体。将样品;故入PFA-100血小斧反功能分析仪(DadeBehringM吏用的coUagen/epinephrine^式马全填料室(Cat弁B4170-2OA,DadeBehring)内。使用引发溶液(Cat弁B4170-50,DadeBehring)进行自测并预润湿试-验填料室。在自测和O型环清洁过禾呈中l吏用O型环清洁垫(Cat#B4170-73，DadeBehring)。PFA才全须寸在测试样品之前，PFA-100血小板功能分析仪通常要先运行一种包括O型环清洁过禾呈的自测过考呈，/人而确保分冲斤4义合适的功能。如下表27所示，从健康的献血者或猕猴身上收集新鲜全血，其中，献血者或猕猴至少在三天内没有服用NSAID。收集乂人献血人身上得到的血液用213/4标准蝶形针;改入5ml0.105M的柠檬酸钠试管中，然后轻轻的倒转试管三次，确保血液与柠檬酸钠混合。在整个试验过禾呈，每隔五分钟将全血试管轻轻倒转一次以避免沉淀。为了试验全血中的适体滴定，将适体加入到无添加的真空试管中，并用生理盐水稀释到理想浓度(例如，0nM、lnM到1000nM)，终体积为60^iL。当PFA-100准备好运4亍下一组冲羊品时，向含有一定浓度的适体的试管中加入1940^L的全血。将此试管轻轻的倒转3次使适体和全血完全混合。PFA-100常常成〗咅的运4亍才羊品。800|uL血混合物i文入coUagen/epinephrine试-验》真一,室内，将此试验填料室装入PFA-100分析仪中。用PFA-100测定孔径的封闭时间，最大值为300秒。我们估计本试验中的IC95就是能够将封闭时间延长到300秒的最小适体浓度。图20描纟会了ARC1368(序列号291)和阴性乂于照ARC1525在PFA-100血小板功能分析试-验中人全血凝聚时间，该凝聚时间是适体浓度的函数。下面的表27列出了FACS,BIPA和PFA-100试-险的其他结果。表27:FACS,BIPA和PFA-100试-验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage170</column></row><table>(<table>tableseeoriginaldocumentpage171</column></row><table>如希望的一样，在上面实施例2所描述的结合试验中只见察到的适体对vWF的亲和性与生物试验中他们的相对效力之间存在密切关系。无结合的阴性参照ARC1525在其所进行的任何试-验中都不显示活性。实施例3E:在BIPA、PFA-100和AIPA4t测中的ARC1368、Integrilin和ReoProTM在人全血PFA-100试-验，人PRPBPA试'险(分别如上面实施例3D和3C所述)和ADP诱导的血小板凝聚(AIPA)试验中评价ARC1368、IntegrilinTM和ReoProTM的效力。用人PRP,严格按照、上面实施例3C所述进行BIPA的方法进行AIPA试-验，只是不力口入botrocetin，改为力口入IO孩吏摩尔ADP(Chronolog,Haverton，PA)i秀导血小板凝聚。图21表示了PFA-100结果。图22表示了BIPA结果。图23表示了AIPA结果。如图21和22所示，与ReoPro相比，在PFA-IOO和BIPA试验中ARC1368(序列号291)表现出一定效力。与上面描述的vWF依赖才几制一致，在图23所示试验中，当IIbIIa颉抗物^f呆持效力时，抗-vWF适体对阻断AIPA无活性。实施例4:药代动力学研究在实施例4和5中，质量单位的浓度数据只涉及适体低聚核苷酸部分的分子量，不考虑由于PEG结合体引入的质量。实施例4A:抗-vWF适体仔人和兔血浆中的稳定性化—睑人和兔血浆内ARC1172(序列号222),ARC1346(序列号281),ARC1368(序列号291)和ARC1533的核酸酶稳定性。如下所述，血浆核酸酶的降解作用通过变性聚丙蜂酰胺凝月交电泳来测定。简单的说，为了确定血浆稳定性，使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化化学合成的适体，用Y-"PATP进行5，-末端标记，然后再进行一次凝胶纯化。32-P标记的适体在100nM未标记的适体存在条件下培养，所述未标记的适体位于20(H敖升结合反应的95%人或兔的血浆中。用相同的成分单独进4亍零时刻的反应，只是其中的血浆换成PBS緩冲液。这样可以保证凝胶上的量或方文射性标记在试—验过程中是恒定的。除非另有i兌明，在温度循环4义中i咅养反应4勿1、3、10、30和100小时。在每个时间电，移除20樣吏升的反应物，与200微升甲酰胺装载染料结合，在液氮中速冻并存储在-20。C条件下。在最后一个时间点完成后，解冻冷冻才羊品，从每个时间点的样品中移出20微升。在小样品中加入SDS至终浓度为0.1%。样品在90。C条件下培养10-15分钟，然后直接装入15%的变性PAGE凝胶中，在12W电压下运行35分钟。用Storm860phosphoroimager系统定量凝月交上的^:射寸生标"i己^;。通过定量适体全长条带并除以泳道总量，可以确定出每个时间点的适体全长序列百分比。然后相对零时刻适体全长序列百分比标准化每个时间点的适体全长序列分数。适体全长序列分数是时间函数，该分数能够满足下列等式Ml*e八(画m2*mO)其中，ml是适体全长序列y。最大值(ml=100);m2是降解速度。适体半衰期(T1/2)等于(ln2)/m2。图24表示了人血浆的样品数据，表28概括了测试的适体结果。与我们的期望一致，适体在人血浆中比在兔血浆中更稳、定，且2，-0-Me修饰的数量越多，血浆越稳定。表28:适体血浆稳定性半衰期<table>tableseeoriginaldocumentpage173</column></row><table>实施例4B:猕猴ARC1368聚乙二醇化衍生物的PK/PD向猕猴(n-3/组)体内静脉注射剂量为3mg/kg的ARC1368(序列号291)，1779(序列号320)和1780(序列号321)(如上面实施例2所述)，这里使用的剂量能够产生3jaM的静脉血浆浓度，大约是^f叚定有效剂量的30倍。随后，间隔一定时间收集柠檬酸化的血才羊品并处理得到血浆。为了证明适体在体内具有药代动力学活性，给药5分钟后进行Botracetin以最大血浆浓度C加x诱导的血小板凝聚(BIPA)。在这一时间点所以动物都对BIPA具有完全的抑制性，从而证明适体在体内具有功能性。随后，使用Oligreen试验(Grayetah,AntisenseandNucleicAcidDrugDevelopment7(3):133-140(1997)测定血浆适体浓度。随后使用程序WinNonlin分析数据，得到如图29到31所示的药代动力学参数。另外，图25表示了灵长类动物的血浆适体浓度，在这里血浆适体浓度是时间的函凄t。基于01igreen试-验的平均浓度-时间曲线显示，ARC1368(序列号291)、ARC1368(序列号291),ARC1780(序列号321)和ARC1779(序列号320)的药代动力学曲线主要是单相的。未聚乙二醇化的适体(ARC1368(序列号291))与ARC1779(序列号320)和ARC1780(序列号321)相比显示出快速的分布相。与ARC1368(序列号291)不同，40kDa的PEG结合ARC1780(序列号321)与ARC1779(序列号320)相比，显示出延长的分布相。ARC1779(序列号320)显示分布相的a-半衰期为2小时。表29:基于Oligreen试验凌t据，对猴子IV给药3mg/kg之候,ARC1368的非房式药代动力学参数估计<table>tableseeoriginaldocumentpage174</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage175</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage176</column></row><table>Oligreen试-险分析之后，利用有效的基于HPLC的试验确定服用ARC1779(序列号320)的动物体内的血浆适体浓度。利用程序WinNonlin,通过非房室和2-房室分析法来分析HPLC数据。用更灵敏的HPLC方法重新分4斤猴子才羊品，产生ARC1779(序列号320)的浓度-时间图，该图双相显示了分布相和排除相。与利用OliGreen试验观察到的结果一致，HPLC结果表明ARC1779(序列号320)的分布半衰期(t1/2tt)是1.4小时，消除半衰期是12.9(t1/2p)小时。实施例4C:猕猴体内ARC1779的PK/PD值单一静脉注射(IV)0.5mg/kg剂量之后，评价ARC1779在三只猕猴体内的-PK/PD相关关系。血浆中ARC1779的水平与ARC1779对血小板功能或皮肤出血时间(CBT)延长的抑制作用有关。iv给药后，在3艮药后不同的时间点经皮采血，用于pk:和pd分析。通过PFA-100试马t确定ARC1779对血小板功能的PD作用，通过CBT时间测定ARC1779对出血的作用。另夕卜，用HPLC分析血浆样品，从而定量ARC1779的水平。用2-房室分4斤确定PK参凄t估计。图26表示出结果。每只猴子产生的浓度-时间曲线主要表示了ARC1779的药代动力学分布相。可以确定分布半衰期大约是l.O小时(t1/2a)。从现有数据中不能很好的确定消除半衰期(t!邻)。图26表示了PFA-100试-睑测定的ARC1779对血小板凝聚的PD作用。当ARC1779的血浆浓度超过300nM时，如同PFA-100分析仪所估计的一样，血小板功能被抑制。然而当血浆适体浓度减少到大约77nM时，血小4反功能恢复正常。义人图26中还可以看出，在本研究中，ARC1779对出血时间延长的作用是最小的。总之，ARC1779在血浆浓度大约是300nM时能够在体内抑制血小板功能。这个体内浓度比观察到的体外抑制血小板功能所必需的适体浓度大约高3倍。可是，即使在高血浆浓度(1000nM)条件下，ARC1779在单一注射给药后，仍然表现对皮肤出血时间具有最小的作用。实施例5:功能性细胞试验在实施例4和5中，质量单位的浓度凄t据只涉及适体低聚核苷酸部分的分子量，不考虑由于PEG结合体引入的质量。实施例5A:猕賓吳体内ARC1179的药^动力学对猕猴IV注射剂量为0.5mg/kg的ARC1779(序列号320)。在整个研究过程中，PFA-100闭合时间、BIPA和皮肤出血时间("CBT")作为时间的函凄t进4亍测量。如前面实施例3中所逸测量BIPA和PFA-100闭合时间。使用下面描述的标准方法测量皮肤出血时间。在前臂的二头肌部分使用血压袖带，从而检测并膨胀以维持40mmHg的恒定血压。4吏用Surgicutt自动切割装置(ITC,Edison，NJ),从前臂末端的手掌表面側部到肘前皱切出一个纵向的切口。在切割开始时启动秒表。在切割15-30秒之后，用Surgicurt⑧出血时间吸水纸(ITC,Edison,NJ)将血液吸走，同时避免吸7Jc纸与伤口直接4妄触。每隔15-30秒，将吸水纸旋转并用纸上干净的部分重新吸血。重复吸血过程，直到血液不再纟皮吸到纸上或者直到流血时间满30分钟为止，这两种情况无论那种先发生都要停止吸血过程。当血液不再^皮吸水纸吸取时，确定流血时间在30秒4中之内。图27中的表显示了关于ARC1779(序列号320)对三只不同的动物给药后，以分4f为单位的猕《吳出血时间，第一栏显示了在不同时间点，以nM为单位的BIPAIC90值和以nM为单位的PFAIC95的值。图28显示了从服用ARC1779(序列号320)的三只猕求吳体内，在服药后不同时间点的取出的血液中的平均PFA-100闭合时间。图29显示了服用ARC1779(序列号320)的三只猕猴，在服药后不同时间点的皮肤出血时间。图30使服用ARC1779(序列号320)的三只猕猴的皮肤出血时间(左纵轴)与PFA-100闭合时间(右纵轴)相互关联。如图27到30所示，在BIPA和PFA-100闭合时间被最大程度的抑制的大于并包括2小时的时间点，皮肤出血时间增加4艮小。当抗gpllblla颉抗物IntegrilinTM的浓度能够对血小板凝聚产生非体内相似抑制性时，此浓度下模版或皮肤出血时间在20和30分钟之间。参见e.g.Phillips,D.R.andScarborough,R.M.，AmJCardiol，80(4A):11B-20B(1997)。尽管不希望被任意特定的理论限制，但是这些数据与我们的假设一致，并能够为我们的假设提供支持，其中，我们的假设是，抗-vWFAl区域适体颉抗物能够通过妨碍血小板与固定化vWF在血管创伤位点结合，来妨碍血小板活性，但不抑制血小板功能，因此不会延长皮月夫出血时间。实施例5B:在猕猴体内由电解产生的血栓模型中ARC1779的评值进行研究来检测ARC1779(序列号320)在记录详细的非人灵长类动物电解血栓模型中，对有创动脉血栓的抑制作用。参见，例如Roteetal,Stroke,1994:25,1223-1233。将十三只猕猴分为4组，施与下表32所示的治疗方案。表32:电解产生的血栓研究设计<table>tableseeoriginaldocumentpage179</column></row><table>DVE-体积剂量相当；IV-静月永内在外科手术前麻醉每只动物，4翁入导管并通过体积调节呼吸器输送异氟烷吸入式麻醉剂以维持麻醉状态。在外周静脉血管内插入静脉导管，在过程中给药乳酸盐林格氏溶液。在股动乐^中插入一才艮导管来连续监#见动务^血压。相似的，在股静JI永中也插入一才艮导管来收集血液样品。每个颈动脉都装有Doppler流量探4hDoppler流量摞:4十与一种流量计相连。流量探针放置在静脉周围最接近插入有创动脉电极和通道收缩的位置。通道^)欠缩》文置在每个颈动月永周围，从而在不改变平均血流量的同时将血流量降低大约50%到60%。在整个观察过程中持续监控并i己录颈动月永的血;危量。通过放置一个血管内电极，在每个颈动J^的内膜表面制造电解产生的伤口。每个电极都与一种持续电流装置的正极相连，负才及与间隔的皮下^立点相连。向每个血管fir送持续的电流，输送时间选择3个小时或完全闭合后30分钟中更短的一个。一旦电相二故置到正确的颈动脉^立置("RCA"),如表32所示对动物给药试-验材料。在给药试验材料大约15分钟后，使用100HA的电解电流。按照图31中血液样品收集时间表所示的特定时间点收集血液4羊品和CBT测量值。在血液流量信号稳定为零流量(这表明该位点处形成了封闭的血栓)30分钟后，或电刺激180分钟后停止电流。给药试验材料大约195分钟后，对左颈动脉("LCA")以与上述RCA相似的方式施用电流。当所有的手术禾呈序和才羊品收集完成之后，对每个动物实施安乐死。图32表示了治疗组3中每只动物体内ARC1779(序列号320)相对于时间的血浆浓度(用HPLC测定)。图33中显示了通过Doppler流量计测定的每个治疗组的封闭时间。从图33中可以确定，在这种动物血栓模型中，ARC1779(序列号320)在对猕猴颈动乐^进行连续的180分4中电损伤时间内，能够抑制血才全开^成。实施例5C:在猕猴电解产生的血管模型中，对不同剂量的ARC1779进行评估在非人灵长类动物电解产生的血栓模型中，延用上面实施例5B所描述的研究测试低适体剂量水平的ARC1779(序列号320)在抑制创动乐;K血栓方面的岁爻力。d争另夕卜10只猕贫吳(2.5Kg到3.5Kg)分为处理组5到7,按照下表33指出的方案进4亍处理。表33:研究i殳计<table>tableseeoriginaldocumentpage181</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage182</column></row><table>:接照实施例5B中处理动物的禾呈序处理表33中的每个处理组中的动物。图33中指出了每个试验组用Doppler流量计测量的闭合时间。在未进行任何血小板颉抗治疗(参照动物)的情况下，100%的颈动脉在60分钟内产生封闭血栓。相反，在用Reopro治疗后，只有20%的动脉发生封闭血才全。在ARC1779处理组中，当对恒定血浆水平的灌流速度为1000nM,750nM,500nM和300nM时，分别有0%,25%,63%和100%的颈动脉发生封闭血4全。除了封闭血栓的形成，我们还可以评估ARC1779对皮肤出血时间的影响，^!口图34所示。乂人图34中可以看出，在某些剂量和/或某个时间点下，在这个动物才莫型中可以观察到延长的CBT,而在其他的剂量和时间点下，CBT没有4皮延长。本发明已通过书面描述和举例的方式进行描述，本领i或技术人员将意识到本发明可在多种不同实施方案中实践。前面的描述和实施例都是用以说明为目的的，并不是对所附权利要求的限制。权利要求1.包括核酸序列的适体，所述核酸序列与选自由ARC1029(序列号214)，ARC1115(序列号221)，ARC1172(序列号222)，ARC1346(序列号281)，ARC1361(序列号284)，ARC1368(序列号291)，ARC1635(序列号319)，ARC1759(序列号318)，和ARC1884(序列号322)组成的组的序列有95％同源性。2.根据权利要求1所述的适体，其中适体包括初级核酸序列，该初级序列与选自由ARC1029(序列号214),ARC1115(序列号221),ARC1172(序列号222)，ARC1346(序列号281),ARC1361(序列号284),ARC1368(序列号291),ARC1635(序列号319),ARC1759(,序歹'j号318),牙口ARC1884(,序歹'J号322)纟且,成的组的初级核酸序列具有95%的同源性。3.根据权利要求1所述的适体，其中适体核酸序列包括一种化学修饰，且与选自由ARC1029(序列号214),ARC1115(序列号221),ARC1172(序列号222),ARC1346(序列号281),ARC1361(序列号284),ARC1368(序列号291),ARC1635(序列号319)，ARC1759(序列号318),和ARC1884(序列号322)组成的组的包括化学修饰的核酸序列具有95%的同源性。4.根据权利要求1所述的适体，其中该适体与一种高分子量、非免疫原性化合物相结合，或与一种亲脂性化合物相结合。5.根据权利要求4所述的适体，其中，适体与一种非免疫原性、高分子量化合物相结合，此化合物是聚烯基二醇。6.根据权利要求5所述的适体，其中聚烯基二醇是聚乙二醇。7.才艮据权利要求6所述的适体，其中聚乙二醇包括的分子量选自由5kDa、10kDa、20kDa和40kDa戶斤纟且成的组。8.根据权利要求7所述的适体，其中，适体选自由ARC1779(序列号320)，ARC1780(序列号321)和ARC1885(序列号323)所组成的组。9.一种组合物，包括治疗有效量的权利要求1所述适体或其盐和一种药学上可^妻受的载体或稀释剂。10.治疗、预防或緩解由vWF调节的疾病的方法，包括对哺乳动物纟合药4又利要求9所述的组合物。11.治疗有需要的病人的方法，包4舌在:袭一斤、CABG手术、经皮冠状动月永介入治疗或心瓣膜置换手术之前、其间和/或之后，对患者给药权利要求9所述的组合物。12.根据权利要求IO所述的方法，其中组合物包括与20KDaPEG相结合的ARC1368(序列号291)或其片断。13.根据权利要求12所述的方法，其中组合物包括ARC1779(序列号320)。14.根据权利要求11所述的方法，其中组合物包括与20KDaPEG相结合的ARC1368(序列号291)或其片断。15.根据权利要求14所述的方法，其中组合物包括ARC1779(序列号320)。16.—种组合物，包^舌治疗有效量的权利要求8所述适体及其盐和药学上可接受的载体或稀释剂。17.治疗、预防或緩解由vWF调节的疾病的方法，包括对哺乳动物给药^又利要求16所述的组合物。18.能够特异结合血管性血友病因子靶分子的适体。19.根据权利要求18所述的适体，其中，血管性血友病因子靶分子是人血管性血友病因子。20.根据权利要求18所述的适体，其中，适体调节血管性血友病因子调节的血小板凝聚。21.—种根据权利要求18所述的适体，能够特异性结合血管性血友病因子全长靶分子和血管性血友病因子Al区域耙分子。22.权利要求21所述的适体，其中，血管性血友病因子全长耙分子和血管性血友病因子A1区域靶分子来源于不同的物种。23.—种诊断方法，包括将权利要求18所述的任意一种适体与怀1€包括血管性血友病因子或其变异体的组合物相接触，并枱r测血管性血友病因子及其变异体的存在或缺失。24.鉴定能够调节适体靶分子生物功能的适体的方法，包括a)制备一种单链核酸的候补混合物；b)将此候补混合物与全长蛋白质靶分子和全长蛋白质靶分子的一个区域相接触；c)分离对全长蛋白质靶分子和全长蛋白质靶分子的一个区域具有增加的亲合性的核酸；和d)体外扩增亲合性增加的核酸，从而产生一种特异性耙分子蛋白质富集的适体混合物。25.才艮据权利要求24所述的方法，其中该方法进一步包括e)将特异性靶分子蛋白质富集的适体混合物与全长靶分子蛋白质接触；f)分离对全长靶分子蛋白质具有增加的亲合性的核酸；和g)体外扩增亲合性增加的核酸，从而产生靶分子特别富集的适体混合物；h)将此特异性靶分子富集的适体混合物与蛋白质目标领域接触；i)分离对蛋白质目标领域具有增加的亲合性的亲合性核酸；和j)体外扩增亲合性增加的核酸，从而产生特异性靶分子蛋白质富集的适体混合物。26.^4居权利要求25所述的方法，其中，该方法进一步包4舌筛选能够体内妨碍靶分子蛋白全长生物功能的适体。27.根据权利要求25所述的方法，其中，靶分子蛋白全长得自第一物种，靶分子蛋白区域得自第二物种。28.根据权利要求27所述的方法，进一步包括筛选能够结合第一和第二物种靶分子蛋白的适体。29.使用权利要求26所述方法鉴定的适体。30.能够特异性结合血管性血友病因子的适体，包括一种4刀级核酸序列，该初级核酸序列与选自由序列号31到50，序列号54到94,序列号98到164，序列号177,序列号180,序列号183,序列号186,序列号189，序列号192,序列号198,序列号201,序列号205,序列号208,序列号212-214,ARC1115〔序列号221),ARC1172(序列号222),ARC1194(序列号223)到ARC1240(序列号269),ARC1338(序列号273)到ARC1346(序列号281),ARC1361(序列号284)到ARC1381(序列号304),ARC1524(序列号305)，ARC1526(序列号307)到ARC1535(序列号316)，ARC1546(序列号317),ARC1759(序列号318),ARC1635(序列号319),,ARC1779(序列号320)到ARC1780(序列号321)和ARC1884(序列号322)到ARC1885(序列号323)组成的组的任意一个初级核酸序列具有至少95%的同源性。31.—种组合物，包括治疗有效量的权利要求30所述适体或其盐和药学上可接受的载体或稀释剂。32.治疗、子贞防或纟爰解vWF调节的疾病的方法，包括^f哺乳动物给药权利要求31所述组合物。33.治疗有需要的病人的方法，包括在透析、CABG手术、经皮冠状动脉介入治疗或心瓣膜置换手术之前、其间和/或之后，对患者给药权利要求31所述的组合物。34.—种诊断方法，包括将权利要求30所述的任意一种适体与怀疑包括血管性血友病因子或其变异体的组合物相接触，并检测血管性血友病因子及其变异体的存在或缺失。35.—种根据权利要求30所述的适体，用于体外诊断。36.—种根据权利要求30所述的适体，用于体内诊断。37.根据权利要求24所述的方法，其中适体靶分子是血管一生血友病因子。38.根据权利要求24所述的方法，其中靶分子蛋白全长区域是血管寸生血友病因子Al区i或。39.根据权利要求25所述的方法，其中靶分子蛋白全长是血管性血友病因子。40.根据权利要求39所述的方法，其中靶分子蛋白区域是血管性血友病因子Al区域。41.根据权利要求28所述的方法，其中第一和第二物种的耙分子蛋白是血管性血友病因子靶分子。42.根据权利要求41所述方法鉴定的适体。全文摘要本发明主要涉及核酸领域，更尤其涉及能结合血管性血友病因子，在血栓形成性疾病和/或其他疾病的诊断和治疗过程中用作治疗剂的适体，在所述血栓形成性疾病和/或其他疾病中，血管性血友病因子调节的血小板凝聚牵连其中。本发明进一步涉及用于给药能结合血管性血友病因子的适体的材料和方法。文档编号C07H21/00GK101300361SQ200580035683公开日2008年11月5日申请日期2005年9月7日优先权日2004年9月7日发明者丹尼尔·H·A·莱加斯,约翰·L·戴纳申请人:阿切埃米克斯有限公司