专利名称：用于诊断和治疗癌症的aimp2dx2的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及命名为AIMP2DX2、特异表达于癌细胞中的缺失外显子2的AIMP2的变异体，及其用于诊断和治疗癌症的用途。
相关技术详述癌症的死亡率在全球范围内持续增加。尽管存在关于癌症的研究很多，它仍是全球死亡率的主要原因。
人们需要一种能够简单快速诊断癌症的方法以提高治疗方法例如手术、放射疗法、化学疗法或常规疗法的效果。
有必要开发针对特定癌症的标记物以诊断癌症并对特定癌症提供一种有效的治疗方法。在细胞毒疗法首次用作抗癌药物后其在最近五十年已广泛用于治疗癌症。这种治疗有严重的副作用，例如，它非特异作用于与癌细胞相比具有快速细胞分裂率的其它器官的细胞而导致强烈毒性。为了克服副作用和那些已知抗癌药物的耐药性，已有许多研究来开发抗癌药物，这些抗癌药物中的癌症特异标记物特异作用于由正常细胞转化为癌症中形成的肿瘤细胞。在癌症靶向疗法中发现特异于癌细胞的基因是非常重要的，而癌症靶向疗法被认为是使抗癌药物毒性降低到最小的方法。
在这种情况下，本发明者已进行了深入研究开发了一种新型癌症特异性分子并且因此发现了缺失外显子2的AIMP2的变异体，即AIMP2DX2，它特异表达于癌细胞中且能够用作诊断癌症的标记物以提供更可信的结果。此外，本发明者已发现特异于AIMP2DX2蛋白质的抗体，或特异于AIMP2DX2 mRNA的小干扰RNA(siRNA)和反义寡核苷酸可被用于癌细胞的特异治疗方法。
因此，本发明的目的是提供AIMP2DX2蛋白质，该蛋白质缺失AIMP2蛋白质的外显子2区域。
本发明的另一目的是提供一种核酸分子，该核酸分子包含编码AIMP2DX2蛋白质的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种重组载体，该重组载体携带编码AIMP2DX2蛋白质的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供一种转化体，该转化体由所述的携带编码AIMP2DX2蛋白质的核苷酸序列的重组载体进行转化而来的。
本发明的另一目的是提供制备AIMP2DX2蛋白质的方法，所述方法包含培养上述的转化体。
本发明的另一目的是提供特异作用于AIMP2DX2蛋白质的抗体。
本发明的另一目的是提供一种癌症诊断试剂盒，该试剂盒包含特异于AIMP2DX2蛋白质的抗体。
本发明的另一目的是提供一种诊断癌症的方法。
本发明的另一目的是提供一种筛选AIMP2DX2蛋白质作为癌症标记物的方法，该方法包含(a)提供分析用样本和(b)检测来自于样本的编码AIMP2DX2蛋白质的核苷酸序列的表达。
本发明的另一目的是提供特异于AIMP2DX2蛋白质mRNA的siRNA核酸分子。
本发明的另一目的是提供一种治疗癌症的药学组合物，包含特异于AIMP2DX2蛋白质mRNA的siRNA核酸分子。
本发明的另一目的是提供一种治疗癌症的方法，包含施用特异于AIMP2DX2蛋白质mRNA的siRNA核酸分子。
本发明的另一目的是提供与AIMP2DX2蛋白质的mRNA区域互补的反义寡核苷酸。
本发明的另一目的是提供一种治疗癌症的药学组合物，包含与AIMP2DX2蛋白质的mRNA区域互补的反义寡核苷酸。
本发明的另一目的是提供一种治疗癌症的方法，包含施用与AIMP2DX2蛋白质的mRNA区域互补的反义寡核苷酸。
本发明的另一目的是提供一种筛选AIMP2DX2蛋白质的mRNA作为癌症标记物的方法，包含使用能够区分AIMP2蛋白质的mRNA和AIMP2DX2蛋白质的mRNA的引物或探针。
本发明的另一目的是提供一种筛选药物的方法，所述药物能抑制AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质间异源二聚体的形成，包含以下步骤(a)使测试物质和包含AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质的组合物接触；和(b)确定该测试物质是否抑制了AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质间异源二聚体的形成，其中所述的抑制了AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质间异源二聚体形成的测试物质评价为抗癌药物。
本发明的另一目的是提供一种筛选药物的方法，所述药物能抑制AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质间异源二聚体的形成，包含以下步骤(a)使测试物质和包含AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质的组合物接触；和(b)确定该测试物质是否抑制了AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质间异源二聚体的形成，其中所述的抑制了AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质间异源二聚体的形成的测试物质评价为抗癌药物。
附图简述
图1a-1e表示AIMP2在TGF-β信号传导及其与Smad2/3的相互作用中的功能重要性。比较AIMP2+/+和AIMP2/-MEFs对TGF-β在细胞增殖(图1a)、菌落形成(图1b)、细胞周期进行(图1c)和Smad2和Smad3的核转运(图1d)中的作用。在图1a中，细胞用标明的浓度(0、2和4ng/ml)的TGF-β1培养6小时。未处理细胞中胸苷参入量记为1，并且这些值为四次独立实验的平均值。在图1b中，AIMP2+/+和AIMP2/-MEFs(14.5天)在TGF-β(2ng/ml)存在下培养4天，用多聚甲醛固定且菌落用吉姆萨染色显影。在图1c中，MEFs用TGF-β处理24小时，G0/G1期细胞比例用流式细胞仪检测。在图1d中，MEFs用TGF-β(2ng/ml)处理1小时。Smad2和Smad3与它们的特异抗体反应并且用缀合FITC(异硫氰酸荧光素)的抗体(绿色)显影。细胞核用PI(碘化丙啶)(红色)染色。在图1e中，AIMP2与Smad2和Smad3的相互作用通过使用针对Smad2和Smad3的抗体的免疫共沉淀来检测。
图2a-2f表示AIMP2在TGF-β信号传导中的工作机制。在图2a中，A549细胞在TGF-β(2ng/ml)处理后在标明的时间收集起来且提取的蛋白质用抗Smad2或Smad3抗体免疫沉淀，并且AIMP2的共沉淀用抗AIMP2抗体来确定。WCL代表全细胞裂解物的蛋白质印迹(Western blots)。在图2b中，通过RT-PCR测定对照和AIMP2转染的DU145中TGF-β靶基因的表达，p15、p21和PAI-1。图2c证实了在AIMP2/-MEFs中AIMP2在Smad2的磷酸化中的作用。在图2d中，Smad2的不同结构域(Mad-同源结构域、MH1、MH2和连接臂)表达为LexA融合蛋白并且通过在酵母X-gal培养基中的蓝色菌落形成来检测其与B42融合AIMP2的相互作用。在图2e中，Smad2与TGF-β受体的依赖TGF-β的相互作用通过免疫共沉淀来测定。在37℃下用TGF-β处理MEFs并且在免疫沉淀前在8℃的温度下进行培养。TGF-β受体与Smad2的结合通过使用抗TβRI抗体的免疫印迹法监测。图2f显示了总Smad2、磷酸化的Smad2(p-Smad2)的时间过程，和TGF-β处理后在AIMP2+/+和AIMP2/-MEFs中的AIMP2水平。
图3a-3f表示AIMP2的差异表达和其缺失外显子2形式的产生。通过蛋白质印迹分析(图3a)和流式细胞术(图3b)在多种癌细胞系中比较AIMP2水平。A549、NCI-H460、-H322和H290是肺癌细胞系而DU145和HCT116分别是前列腺癌和结肠癌细胞系。在图3b中，“阴性”表明仅用二级抗体处理的DU145。每个细胞系分析2000个细胞。在图3c中，通过使用不同引物对的RT-PCR来比较AIMP2转录水平。跨越外显子3-4和1-3的转录物分别由引物对6/7和1/5产生(参见图8b)。GAPDH是上样对照。注意到用于外显子1-3的转录物的引物对产生了较小AIMP2转录物。此较小转录物是缺失外显子2的AIMP2(AIMP2DX2)的选择性拼接形式。此转录物仅通过使用引物DX2-F和另一个特异于外显子1和3间接点序列的引物(DX2-B)的RT-PCR(参见图8b)自低AIMP2细胞系中生成。在图3d中，在用TGF-β孵育2小时后通过免疫荧光染色法检测TGF-β依赖型诱导作用和AIMP2核转运。在图3e中，通过[3H]胸苷参入(n＝4)比较TGF-β在标明细胞的增殖中的作用。在图3f中，在用TGF-β孵育2小时后通过RT-PCR比较靶基因p21和PAI-1的TGF-β依赖型诱导作用。
图4a-4h证实了AIMP2DX2对AIMP2细胞稳定性的作用。在图4a中，DX2转染至未用TGF-β处理或用TGF-β处理2小时的DU145中，并且用蛋白质印迹法检测AIMP2水平。c-Myc、DX2和GAPDH(对照)的表达通过RT-PCR来监测。在图4b中，DX2或空载体转染至DU145中，并且其在TGF-β依赖型的细胞生长抑制中的作用通过胸苷参入(n＝4)来监测。在图4c中，AIMP2F和-DX2间的相互作用通过先前描述的酵母双杂交测定法(Rho，S.B.等人，PNAS.USA，964488-93(1999))进行测定。在图4d中，AIMP2F和-DX2在[35S]蛋氨酸存在下通过体外翻译合成，与GST-AIMP2F或-CDK2(对照)混合，并且用谷胱苷肽-琼脂糖(glutathione-Sepharose)沉淀。沉淀的蛋白质用SDS-PAGE分离并且用放射自显影法检测。在图4e中，AIMP2F或-DX2与融合结合蛋白质的相互作用(FBP；Kim，M.J.等人，Nat.Genet.34330-3362003)和Smad2用酵母双杂交测定法测定。在图4f中，在产生DX2的H322细胞中通过使用抗AIMP2抗体的蛋白质印迹法监测蛋白酶体抑制剂ALLN(50μM，4小时)对全长(F)和AIMP2的DX2水平的作用。DX2形式通过与其体外合成的对应物(counterpart)在凝胶上的共迁移来确定。在图4g中，经ALLN(20μM，2小时)处理的AIMP2的增加还通过在H322细胞中使用抗AIMP2抗体的免疫荧光染色法来显示。在图4h中，myc标记的DX2转染至ALLN处理的DU145中。然后，AIMP2用抗AIMP2抗体免疫沉淀，并且遍在化(ubiquitinated)AIMP2分子通过使用抗遍在蛋白质抗体(Ubi)的免疫印迹法监测。
图5a-5e表示AIMP2DX2对细胞生长调控和TGF-β传导中的破坏作用。在图5a中，DX2(或空载体)转染至MEFs中并且监测其对细胞生长的作用。细胞和菌落分别通过光学显微镜检查(顶端)和吉姆萨染色(底部)显影。图5b显示编码特异于DX2的编码siRNAs的核苷酸序列。在图5c中，构建了表达siRNAs 3的每个载体，将其转染至H322和H460细胞系中，并且评价其对AIMP2水平和Smad2磷酸化的作用。在图5d中，4号或5号siRNA转染至H322中，并且用TGF-β测定其对细胞死亡(左)和细胞周期停滞(右)的作用。在图5e中，将靶向AIMP2DX2的siRNA(si-DX2)导入H322中并且其对DX2转录物的抑制作用用RT-PCR(顶部)测定。si-DX2不影响全长AIMP2转录物如用外显子3-4的转录物的RT-PCR所显示。si-DX2对Smad2磷酸化和AIMP2表达的作用还由蛋白质印迹法(底部)测定。si-DX2对TGF-β传导的恢复作用还用使用H322细胞的p-Smad2免疫荧光染色法(图5f)、3TP启动子下的TGF-β依赖型报告子分析方法(图5g)和生长停滞(图5h)测定。在图5f中，p-Smad2和细胞核在TGF-β处理30分钟后分别用缀合FITC的二级抗体(绿色)和PI(红色)染色。注意到p-Smad2增加和由si-DX2转染定位的核。
图6a-6f表示AIMP2与肺癌形成的联系。在图6a中，在将苯-(α)-芘腹膜内给药至AIMP2+/+和AIMP2+/-小鼠后的时间间隔中监测肺肿瘤形成。“N”代表被处死的小鼠的数目。在图6b中，总的RNAs是从肺癌患者的正常和肿瘤区域分离出来的，并且用DX2-特异的引物进行RT-PCR。同一患者(用代号表示)的正常和肿瘤组织用抗AIMP2抗体进行RT-PCR(图6c)。
图7表示与AIMP2相互作用有关的Smad2结构域的测定。我们将编码AIMP2或CDK2的cDNAs连接至pGEX4T-1的EcoRI和XhoI位点，使它们在E.coli BL21(DE3)中表达为GST融合蛋白并且根据生产商说明书纯化它们。在[35S]蛋氨酸存在下使用TNT偶联的翻译试剂盒(Promega)通过体外翻译来合成Smad2的不同缺失片段。结合于谷胱苷肽琼脂糖凝胶珠上的GST融合蛋白与[35S]蛋氨酸标记的Smad2片段在结合缓冲液中孵育，该缓冲液为含有0.5mM EDTA、0.5mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)和1％TritonX-100的PBS缓冲液(pH7.4)。结合混合物在4℃下旋转孵育过夜并且用含有0.5％TritonX-100的结合缓冲液冲洗四次。加入SDS样品缓冲液后，结合蛋白质通过煮沸洗脱并且用SDS凝胶电泳法分离。Smad2片段的存在用放射自显影法检测。
图8a和8b显示了人AIMP2基因的外显子排列和AIMP2 cDNA上的引物位置。在图8a中，AIMP2基因由四个编码标明大小的多肽的外显子组成。图8b是用于产生跨越AIMP2不同区域的cDNA的引物位置及其序列的示意图。
图9a至9d证实AIMP2的表达减少了，以及在癌细胞系中生成了AIMP2DX2。在图9a中，为了比较DX2-阳性和阴性细胞中的AIMP2水平，我们在一个平板上培养DU145和H460细胞，并且用抗AIMP2抗体(绿色)进行免疫荧光染色。这两个细胞系用p53(红色)免疫荧光染色来区分，因为DU145细胞由于其突变高水平表达p53，而含有野生型p53的H460细胞所表达的p53维持在低水平。用TGF-β处理这些细胞2小时，然后用甲醇固定。在图9b中，为了确定AIMP2DX2对AIMP2表达的作用，用流式细胞仪监测AIMP2水平。将2μg/ml空载体或DX2转染至DU145细胞中，培养24小时。然后用70％乙醇固定细胞并且与抗AIMP2抗体反应，随后与缀合FITC的二级抗体反应。在图9c中，AIMP2DX2对TGF-β依赖型细胞周期停滞的作用用流式细胞术来比较。尽管G0/G1期细胞比例在用空载体转染的DU145细胞中增加，但是在DX2转染的细胞中没有增加。黑线和蓝线分别显示未用TGF-β处理和用TGF-β处理的细胞。在图9d中，我们比较未用10μM ALLN处理(对照)或用10μM ALLN处理2小时的H460细胞中的AIMP2水平。“阴性”表示细胞仅用缀合FITC的二级抗体培养。
图10a和10b显示了在肺癌组织中AIMP2DX2的生成和AIMP2的抑制。在图10a中，肺是从注射了苯并芘(benzoypyrene)的AIMP2+/+和AIMP2+/-小鼠中分离出来的，并且RNAs是从每个肺中分离出来进行RT-PCR以检测AIMP2DX2的生成。所有生成DX2的肺显示了肺中的肿瘤形成(标记+)。
图11a和11b表示了AIMP2DX2在多种癌组织和癌细胞系中的表达。在图11a中，RT-PCR用来检测肝癌组织中AIMP2DX2的表达。图11b显示了多种癌细胞系中AIMP2DX2的表达。
图12显示了与正常表达AIMP2的野生型小鼠比较，敲除了(AIMP2+/-)小鼠中癌症的指征。图12a，用DNA印迹法(Southern blotting)和PCR分析检测AIMP2基因处的突变。使用引物f3和r2从小鼠AIMP2基因内含子I区域产生了1223bp的PCR片段，并且将其用作探针与小鼠基因组DNA的Sac I片段杂交。引物f6、r6和pKOf2的混合物用于PCR分析。野生型和突变型等位基因分别生成大约1.2和1.9kb PCR产物。对p AIMP2表达的突变作用由使用AIMP2 cDNA探针的RNA印迹法(Northernblotting)和使用针对纯化的人AIMP2的多克隆兔抗体的蛋白质印迹法(Westernblotting)来检测。在RNA印迹法(数据未显示)的每个泳道中都检测到同样量的肌动蛋白。+/+、+/-和-/-代表野生型、杂合型和纯合型突变小鼠。基因捕获插入的位置由突变等位基因的基因组DNA的序列分析来检测。图12b显示了在AIMP2+/-小鼠和野生型小鼠中的肿瘤形成的比率。图12c显示了每个AIMP2+/-小鼠和野生型小鼠的肿瘤的平均数目。图12d显示了在AIMP2+/-小鼠和野生型小鼠中生成的乳头瘤。
图13显示了携带AIMP2DX2基因的表达载体。在图1 3中，缩写pCMV、BGH pA、f1 ori、neomycin、ampicillin、SV40、SV40 pA、ColE1、T7和Sp6分别表示人巨细胞病毒即刻早期启动子、牛生长激素多聚腺苷酸化信号、f1复制起点、新霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、SV40复制起点、SV40多聚腺苷酸化信号、ColE1复制起点、T7病毒启动子和Sp6病毒启动子。
发明详述命名为AIMP2/JTV-1或AIMP2的AIMP2(ARS-相互作用多功能蛋白质2)是涉及氨酰tRNA合成酶形成的蛋白质之一。
本发明者指出AIMP2的基因断裂诱导原癌基因(c-myc)过表达从而导致由于肺泡上皮细胞的过度增殖使初生小鼠死亡并且转化生长因子-β(TGF-β)诱导AIMP2表达并有助于将其转运到细胞核来下调c-myc(M.J.Kim，等人，Nat.Genet.34330-336(2003))。
根据之前的研究，本发明者已揭示AIMP2是新肿瘤抑制子，通过与Smad2/3的直接相互作用在TGF-β传导中起到独特的作用。此外，我们已发现缺失外显子II的AIMP2的异常变异体(AIMP2DX2)在癌细胞系和组织中特异表达。使用组合的AIMP2特异引物通过RT-PCR可以证实缺乏外显子II的AIMP2(AIMP2DX2)的存在。当引物用于生成跨越外显子3和4的AIMP2 cDNA时，在细胞中未观察到AIMP2转录物的减少，在蛋白质印迹分析中显示AIMP2的水平降低。当我们用引物生成外显子1至3的转录物时，我们不仅得到了预期大小的转录物，还得到较小的转录物。此小转录物的序列分析显示其缺失编码AIMP2的69个氨基酸残基的外显子2。使用以外显子1和3的接合点序列为靶的引物的RT-PCR分析显示表达较低AIMP2水平的细胞系生成较小转录物，证实了作为AIMP2变异体的AIMP2DX2的生成。
此外，本发明人观察到在转染了AIMP2DX2的细胞中AIMP2水平显著减少与TGF-β无关，说明AIMP2DX2的生成导致了AIMP2活性的丧失。此外，将AIMP2DX2导入细胞提高了c-myc的表达且再次出现了TGF-β引起的生长停滞。我们发现AIMP2DX2与AIMP2形成无活性的异源二聚体并且通过诱导AIMP2水平的降低与肿瘤发生密切相关。体内研究提供进一步的证据证实AIMP2DX2与肺癌、肝癌、皮肤癌、乳癌、肾癌和骨肉瘤等强烈相关。
AIMP2DX2蛋白质优选包括AIMP2氨基酸序列，其中所述的AIMP2氨基酸序列的外显子2区域被删除。
AIMP2DX2蛋白质是缺失外显子2的AIMP2的缺失变异体。在数个数据库(312氨基酸版本登记号AAC50391.1或GI1215669；320氨基酸版本登记号AAH13630.1，GI15489023和BC013630.1，来自GenBank)和出版物(312氨基酸版本Nicolaides，N.C.，Kinzler，K.W.和Vogelstein，B.Analysis of the 5’region of PMS2 reveals heterogeneoustranscripts and a novel overlapping gene，Genomics 29(2)329-334(1995)；320氨基酸模型Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNAsequences，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)16899-16903(2002))中发现了AIMP2蛋白质的氨基酸序列。AIMP2DX2蛋白质的氨基酸序列优选包含由如前述已知序列的缺失外显子2区域的AIMP2氨基酸序列。韩国专利申请10-2003-0018424公开了AIMP2蛋白质的癌症治疗作用，其中的教导在此通过参考其全文与本文合并。
AIMP2DX2蛋白质包括AIMP2同等物的外显子2缺失的变异体，例如，显示了与野生型AIMP2基本上同样活性的功能同等物，它们是通过对AIMP2的置换、删除、插入或其组合得到的，或显示了与野生型AIMP2基本上同样活性的功能衍生物，它们经修饰改变了野生型AIMP2的物理和/或生化性质。
如本文描述的AIMP2中外显子2的缺失是指AIMP2中跨越外显子2区域的氨基酸序列(对应氨基酸46-114)被部分或整体删除以生成能够与AIMP2形成异源二聚体的AIMP2的缺失变异体，从而抑制AIMP2的正常功能和促进AIMP2的降解。相应地，本发明的AIMP2DX2蛋白质可包括全部或部分外显子2缺失的AIMP2的任意变异体，其中外显子1、3和/或4是天然的或通过氨基酸置换、删除或插入被修饰的，只要变异体能够与AIMP2形成异源二聚体以抑制AIMP2的正常功能。AIMP2DX2蛋白质优选包含外显子2的全部缺失和完整外显子1、3和4。AIMP2DX2蛋白质更优选包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
AIMP2DX2蛋白质可包含其天然氨基酸序列和具有修饰序列的变异体，只要变异体保持上述AIMP2DX2蛋白质的活性。AIMP2DX2蛋白质变异体是指蛋白质的序列不同于天然氨基酸序列，它们通过删除、插入、非保守或保守置换或它们的组合制备得到的。对氨基酸残基进行沉默改造实质上不会损害蛋白质活性，这是本领域技术人员众所周知的(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。这些氨基酸改造包括但是不限于Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
此外，AIMP2DX2蛋白质可包含翻译后修饰，例如磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化和法尼基化。
AIMP2DX2蛋白质及其变异体可从天然来源中分离得到、通过合成(Merrifleld，J.Amer.Chem.Soc..852149-2156(1963))或重组DNA技术(Joseph Sambrook等人，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))获得。应用重组DNA技术时，宿主细胞用携带编码AIMP2DX2的核酸分子的表达载体转化，然后培养，随后收集被表达的AIMP2DX2。
如前所述，本发明的AIMP2DX2蛋白质在包括乳癌、肺癌、肝癌、血癌、皮肤癌、肾癌和骨肉瘤的多种癌细胞中特异表达，说明AIMP2DX2蛋白质能够用作癌症诊断标记物。
在本发明的另一方面，提供了一种核酸分子，该核酸分子包含编码上述AIMP2DX2蛋白质的核苷酸序列。上述编码AIMP2DX2蛋白质的核苷酸序列包括外显子2缺失的AIMP2同等物的变异体，例如，显示与野生型AIMP2基本上相同活性的AIMP2的功能同等物，它们通过对AIMP2置换、删除、插入或其组合得到。SEQ ID NO2的AIMP2DX2蛋白质优选由包含SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸分子编码。本发明的核酸分子可是单或双链DNA(cDNA和gDNA)或单链RNA(mRNA)。
编码AIMP2DX2蛋白质的核酸分子可从天然来源中分离来制备、通过合成或重组DNA技术制备。AIMP2DX2核酸分子可包含在适当的载体中以提供AIMP2DX2蛋白质。
在本发明的另一方面，提供了一种重组载体，所述重组载体包含核酸分子，所述核酸分子包含能编码AIMP2DX2蛋白质的核苷酸序列。
如本文所用的术语“重组载体”是指在适当的宿主细胞中能表达目标蛋白质或RNA的基因载体，包含一段相应的外源序列，该序列可操作连接至核酸表达调控序列(例如启动子、信号序列和转录因子结合位点阵列)。
如本文所用的术语“可操作地连接”是指在核酸表达调控序列和第二目标核酸序列之间的功能连接，其中所述表达调控序列影响与所述第二序列相应的核酸的转录和/或翻译。本发明的载体可根据常规重组DNA技术构建，其中使用商业可获得的酶来进行定点DNA切割和连接。
本发明的载体包括但是不限于质粒、粘粒、噬菌体和病毒载体。载体可包含表达调控元件例如启动子、操纵子、起始和终止密码子、多聚腺苷酸化信号和增强子还有膜定位或分泌的信号或前导序列。用在载体中的启动子可以是组成型的或诱导型的。此外，载体可以携带用于选择包含载体的宿主细胞的选择标记物和复制起点。
载体中的信号序列包括但是不限于用于埃希氏菌(Escherichia)宿主细胞的PhoA和OmpA信号序列、用于杆菌(Bacillus)宿主细胞的α-淀粉酶和枯草芽孢杆菌素信号序列、用于酵母宿主细胞的MFα和SUC2信号序列和用于动物宿主细胞的胰岛素、α-干扰素和抗体分子信号序列。
在本发明的另一方面，提供了一种用本发明上述的重组载体转化的转化体。
转化可根据任何已知将核酸转化至生物体、细胞、组织或器官的方法来实现，包括但是不限于电穿孔法、原生质融合、CaPO4沉淀、CaCl2沉淀、硅尿素纤维搅拌、农杆菌介导的转化、PEG、硫酸葡聚糖和脂质体(lipofectamine)。适当的转化方法可以根据宿主细胞的类型来选择。
通常根据表达水平和翻译后修饰来决定适当的宿主细胞。宿主细胞包括但是不限于原核细胞例如大肠埃希杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌(Streptomyces)、假单胞杆菌(Pseudomonas)、奇异变型杆菌(Proteus mirabilis)和葡萄球菌(Staphylococcus)、真菌(例如曲霉属真菌(Aspergillus))、酵母(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa))、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种通过培养前述转化细胞来制备AIMP2DX2蛋白质的方法。
所述转化细胞的培养通过本领域技术人员已知的常规方法在适合表达目标AIMP2DX2蛋白质的条件下进行。
表达的AIMP2DX2蛋白质可通过常规方法纯化，例如盐析(例如硫酸铵和磷酸钠沉淀)、溶剂沉淀(例如用丙酮或乙醇的蛋白质分级沉淀)、透析、凝胶过滤、离子交换、反相柱层析、超滤或它们的组合(Maniatis等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)Sambrook等人，MolecularCloningA Laboratory Manual，3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)；和Deutscher，M.，Guide to Protein Purification Methods，Enzymology，vol.182.AcademicPress.Inc.，San Diego，CA(1990))。
在本发明的另一方面，提供了一种特异于AIMP2DX2蛋白质的抗体。
如本文所用的术语“抗体”是指特异定向于抗原位点的蛋白质分子。本发明的抗体是指特异识别与AIMP2有差别的AIMP2DX2的抗体，包括多克隆和单克隆抗体。
抗新蛋白质AIMP2DX2的抗体可通过本领域技术人员已知的常规技术来制备。
多克隆抗体可通过已知方法制备，其中将作为免疫原的AIMP2DX2蛋白质注入动物体中然后收集抗血清。被免疫的动物包括但是不限于山羊、兔、绵羊、猴、马、猪、牛和狗。
单克隆抗体可通过融合方法(Kohler和Milstein，European Journal of Immunology，6511-519(1976))、重组DNA方法(USP 4,816,567)或噬菌体抗体库(Clackson等人，Nature，352624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，22258，1-597(1991))来制备。
抗AIMP2DX2蛋白质的抗体可以是具有两个全长轻链和两个全长重链的完整免疫球蛋白分子或其含有抗原结合部位例如F(v)、Fab、Fab’和F(ab’)2的片段。
根据本发明的特异于AIMP2DX2的抗体通过抑制AIMP2DX2的活性能用于诊断和治疗癌症。当抗体用作治疗药物时，它们可与常规治疗药物以直接或间接(通过连接臂)方式偶联。
与本发明的抗体偶联的治疗药物包括但是不限于放射性核素(例如131I、90Y、105Rh、47Sc、67Cu、212Bi、211At、67Ga、125I、186Re、188Re、177Lu、153Sm、123I和111In)、药物(例如甲氨蝶呤和阿霉素)、淋巴因子(干扰素)、毒素(蓖麻毒素、相思豆毒素和白喉)和与其它抗体形成复合物的异功能抗体，具有对癌细胞和效应细胞(例如杀伤性T细胞)的双功能结合能力。
本发明的抗体可以单独或药学组合物形式施用。
包含抗体的药学组合物可用药学可接受的载体制备。药学组合物的形式根据给药方式变化。一般组合物包含一种表面活性剂以促进跨膜转运。此表面活性剂包括甾体衍生化合物、阳离子脂质体例如N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲基铵(DOTMA)、半琥珀酸胆固醇和磷脂酰甘油。
施用药学有效量的包含本发明的抗体的药学组合物治疗癌症或预防癌症转移。药学组合物可以单次或多次给药方案施用。药学组合物的给药方式包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和局部给药。肠胃外给药包括皮下、真皮内、肌内、静脉内、粘液内(intrabursa)、胸骨内、鞘内和腹膜内注射。为使抗体稳定(化学和物理稳定性)和安全，药学组合物通常配制为pH范围4-8。此外，药学组合物可制备为口服剂量形式。使用标准临床技术优化典型的剂量。。
此外，本发明的抗体可以核酸分子形式施用来诱导抗体的体内生成(WO 96/07321)。
在本发明的另一方面，提供了一种癌症诊断试剂盒，其包含特异于AIMP2DX2蛋白质的抗体。
本发明的癌症诊断试剂盒可包含特异于AIMP2DX2的抗体以及用于免疫测定的常用工具和试剂包括载体、检测信号生成的标记物、溶解试剂、洗涤试剂、缓冲液和稳定剂。当酶用作标记时，可包括其底物和反应淬灭剂。载体的非限制实例包括可溶性载体，例如本领域公知的生理上可接受的缓冲液(例如PBS)、不可溶性载体，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联葡聚糖、多糖、聚合物例如用单金属、纸、玻璃、多金属、琼脂糖及其组合物涂层的橡胶制成的磁微粒。
本发明的癌症诊断试剂盒中有效的测定体系的非限制实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)平板、试条法装置、免疫层析试纸和扩散分离免疫测定装置和流动系统装置。
如本文所用的术语“癌症标记物”是指通过定性或定量检测其在组织或细胞中的表达来提供信息评价癌症可能性、发生或发展的物质。该术语优选为以不同于正常细胞的表达形式在癌细胞中进行表达的有机生物分子(例如蛋白质、DNA和RNA)。本发明的AIMP2DX2基因或蛋白质在癌细胞中特异表达而正常细胞中不表达，从而允许精确诊断癌症。使用AIMP2DX2表达的癌症诊断优选在mRNA和/或蛋白质水平进行。本发明的抗体用于诊断癌症，例如肺癌、肝癌、乳癌、皮肤癌、肾癌和骨肉瘤。
在本发明的另一方面，提供了一种筛选AIMP2DX2蛋白质作为癌症诊断标记物的方法，其包含以下步骤(a)提供待测样品；和(b)检测样品中编码AIMP2DX2蛋白质的核苷酸序列的表达，其中检测到编码AIMP2DX2蛋白质的核苷酸序列的表达说明有癌症。
本发明中所用的术语“待测样品”包括任何生物样品例如组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液、精液、尿、滑液和脊髓液并且可被预处理以用于检测。
在本发明中，样品中编码AIMP2DX2蛋白质的核苷酸序列的表达可在蛋白质或mRNA水平实现。当进行AIMP2DX2蛋白质的检测时，使用特异识别AIMP2DX2蛋白质的抗体并且检测是通过使试样接触特异于AIMP2DX2蛋白质的抗体并且评价抗原-抗体复合物的形成来进行的。
本发明中所用的术语“抗原-抗体复合物”是指AIMP2DX2蛋白质和生物样品中特异于AIMP2DX2蛋白质的抗体之间的组合物。对抗原-抗体复合物形成的评价可使用免疫组织化学染色法、放射性免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀测定法、免疫扩散测定法、补体结合测定法、荧光激活细胞分类术(FACS)和蛋白质芯片测定法来进行。对抗原-抗体复合物形成的评价可定性或定量进行，特别是通过测量检测标记物的信号。
产生抗原-抗体复合物形成的测量信号的标记物包括但是不限于酶、荧光团、配体、发光体、微粒、氧化还原分子和放射性同位素。酶标记物包括但是不限于β-葡糖醛酸糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶、GDPase、核糖核酸酶(RNase)、荧光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶、β-内酰胺酶。荧光标记物包括但是不限于荧光素、异硫氰酸酯、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、allophysocyanin、邻苯二甲酸盐和荧光胺。作为标记物的配体包括但是不限于生物素衍生物。发光标记物的非限制实例包括吖啶酯、荧光素和荧光素酶。作为标记物的微粒包括但是不限于胶体金和彩色橡胶。标记用的氧化还原分子包括但是不限于二茂铁、lutenium复合化合物、紫精、醌、Ti离子、Cs离子、二酰亚胺、1，4-苯醌、对苯二酚、K4W(CN)8、[Os(bpy)3]2+、[Ru(bpy)3]2+和[Mo(CN)8]4-。放射性同位素包括但是不限于3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
当本方法用来检测AIMP2DX2 mRNA时，检测步骤可通过本领域公知的扩增反应或杂交反应来进行。
如本文所用的短语“AIMP2DX2 mRNA的检测”意指通过使用与AIMP2DX2 mRNA特异杂交的引物或探针分析作为细胞中癌症诊断标记物的AIMP2DX2 mRNA的存在或数量。
如本文所用的术语“引物”意指游离3’羟基的寡核苷酸，它可以是在纯化的限制性内切酶酶切消化中自然产生也可以是合成产生的，它能够与互补模板形成碱基对并且当处于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时用作合成的起始点。
如本文所用的术语“探针”是指天然或修饰的单体或连接物的线性寡聚物，包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸等等，它能够与不论天然产生或合成生成的靶核苷酸序列特异杂交。本方法中所用的探针可以寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针和RNA探针形式制备。可用生物素、FITC、若丹明、DIG和放射性同位素标记。例如，SEQ ID No.8或16的核苷酸序列可用作探针。
使用引物或探针检测AIMP2DX2 mRNA的方法包括但是不限于DNA序列分析、RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)、引物延伸方法(Nikiforov，T.T.等人，Nucl Acids Res 22，4167-4175(1994))、寡核苷酸连接分析(OLA)(Nickerson，D.A.等人，Pro Nat Acad Sci USA，87，8923-8927(1990))、等位基因特异性聚合酶链反应(Rust，S.等人，Nucl Acids Res，6，3623-3629(1993))、RNA酶错配裂解(Myers R.M.等人，Science，230，1242-1246(1985))、单链构型多态性(SSCP；Orita M.等人，Pro Nat Acad Sci USA，86，2766-2770(1989))、SSCP和异源双链同时分析(Lee等人，Mol Cells，5668-672(1995))、变性梯度凝胶电泳法(DGGE；Cariello NF.等人，Am J Hum Genet，42，726-734(1988))和变性高效液相色谱法(D-HPLC，Underhill PA.等人，Genome Res，7，996-1005(1997))。
扩增反应的方法优选使用能够区别AIMP2DX2的mRNA和AIMP2的mRNA的引物通过RT-PCR来进行。由P.Seeburg(1986)提出用于RNA研究的RT-PCR方法包含从mRNA逆转录获得的的cDNA的PCR扩增。扩增时，使用特异退火至AIMP2DX2的引物对。引物优选设计为在电泳中生成两条不同大小的条带，其中一条特异于AIMP2mRNA，而另一条特异于AIMP2DX2 mRNA。或者，引物设计为仅生成特异于AIMP2DX2mRNA的电泳带。制备能生成AIMP2 mRNA和AIMP2DX2 mRNA的两个不同大小条带的引物对是为了扩增与外显子2对应的区域。此引物的核苷酸序列不受限制；最优选的一组引物由SEQ ID NOs5和6组成。为了观察只有一条特异于AIMP2DX2 mRNA的电泳带，其中一个引物设计为包含外显子1的C端和外显子3的N端间的连接序列。下述实施例中，进行RT-PCR时，退火至连接序列的SEQ ID NO8的引物与SEQ ID NO7的引物一起使用或退火至连接序列的SEQ ID NO16的引物与SEQ ID NO6的引物一起使用。因为通过观察电泳带带型来评价AIMP2DX2 mRNA的表达完成癌症的诊断，从这个意义上来说RT-PCR分析十分方便。
包括肺癌、肝癌、乳癌、皮肤癌、肾癌和骨肉瘤的癌症症状可通过样品和对照间AIMP2DX2表达的明显差别来诊断。
根据本发明的优选方面，提供了一种特异于AIMP2DX2的mRNA的siRNA(小干扰RNA)分子。
如本文所用的术语“siRNA”是指通过mRNA裂解诱导RNAi(RNA干扰)现象的短RNA双链。siRNA由与靶mRNA对应的有义RNA链和与靶mRNA互补的反义RNA链组成。抑制靶基因表达的siRNA提供有效基因敲除方法或基因治疗方法。
本发明的siRNA不限制为两条链完全配对的RNA双链且可包含非配对部分例如与非互补碱基的错配部分和没有对应碱基的突起。siRNA的全长是10-100个核苷酸，优选15-80个核苷酸，更优选20-70个核苷酸。siRNA还可包含平末端或粘性末端只要它能够由于RNAi效应沉默AIMP2DX2表达。粘性末端可制成3’末端悬垂结构或5’末端悬垂结构。悬垂碱基的长度不受限制，例如1-8个核苷酸，优选2-6个核苷酸。如本文描述的全长表达为中心双链部分和末端单链悬垂部分的全部长度。此外，只要AIMP2DX2 siRNA能够保持其对靶基因的基因沉默作用，它可含有低分子量RNA(可以是天然RNA分子例如tRNA、rRNA或病毒RNA，或人工RNA分子)，例如在其任一末端的悬垂部分。AIMP2DX2 siRNA的两个末端不必都有裂解结构。本发明的AIMP2DX2siRNA可包含与任一末端(头或尾)通过连接臂相连的茎环结构。只要不损害茎结构的碱基配对，连接臂的长度不受限制。
如本文所用的术语“特异”是指抑制靶基因的表达且不影响其它基因。本发明的siRNA特异于AIMP2DX2基因。
本发明的siRNA优选包含含有外显子1和3间连接序列的相应序列的有义链和含有互补序列的反义链。
短语“基因表达的抑制”是指自靶基因生成的mRNA和/或蛋白质水平被结束或减少，它通过发生mRNA裂解的RNA干扰来诱导。
本发明的siRNA可体外合成然后通过转染导入细胞。此外，它可以siRNA表达载体或PCR衍生siRNA表达盒的形式转染到细胞中。适合的制备和转染方法可经考虑实验目的和靶基因功能来决定。
siRNA的序列和长度不受限制只要它能够特异抑制AIMP2DX2 mRNA。在下文描述的实施例中使用了3种说明性的沉默AIMP2DX2的siRNA表达载体，它们抑制AIMP2DX2的细胞水平并且恢复AIMP2功能和TGF-β信号转导。
本发明的优选siRNA包含与AIMP2DX2 mRNA的外显子1和3间连接序列相应的序列。本发明的siRNA更优选为如下描述的RNA双链(i)由SEQ ID NOs9和10的核苷酸序列表达的两个RNA分子组成的3号siRNA，(ii)由SEQ ID NOs11和12的核苷酸序列表达的两个RNA分子组成的4号siRNA，或(iii)由SEQ ID NOs13和14的核苷酸序列表达的两个RNA分子组成的5号siRNA。最优选的siRNA由SEQ ID NOs11和12的核苷酸序列表达的两个RNA分子组成。可以使用siRNA分子的单一或混和类型。
在本发明的另一方面，提供了一种与AIMP2DX2蛋白质的mRNA区域互补的反义寡核苷酸。
如本文所用的术语“反义寡核苷酸”是指与靶mRNA的碱基序列互补的核酸，优选DNA、RNA或其衍生物，特征为它们与靶mRNA结合并且干扰其翻译为蛋白质。本发明的反义寡核苷酸是指结合于AIMP2DX2 mRNA且与其互补的DNA或RNA序列，它们能够抑制AIMP2DX2 mRNA的翻译、易位、成熟或其它生物学功能。反义核苷酸长为6-100个，优选8-60，更优选10-40个核苷酸。
反义寡核苷酸可在碱基、糖或主链上最少有一个修饰以获得较高的抑制作用(DeMesmaeker等人，Curr Opin Struct Biol.，5(3)343-55(1995))。修饰的核酸主链包含硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基内糖连接臂或短链杂原子或杂环内糖连接臂。反义寡核苷酸还可包含一个或多个取代的糖部分。反义核酸可包括一个或多个修饰碱基，例如次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧啶(特别是5-甲基胞嘧啶)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和gentobiosyl HMC、2-氨基腺嘌呤、2-硫脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶(thiothymine)、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2，6-二氨基嘌呤。本发明的寡核苷酸的另一修饰包括与寡核苷酸进行化学连接的一个或多个部分或缀合物，它们能增强寡核苷酸的活性或细胞摄取。此部分包括但是不限于脂质部分例如胆固醇部分、胆甾醇部分、胆酸、硫醚、硫胆固醇、脂肪链、磷脂、多胺、聚乙二醇链、乙酸金刚烷胺、棕榈酰基部分、十八胺、己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。包含亲脂部分的寡核苷酸和制备此寡核苷酸的方法在本领域公知，例如美国专利US 5,138,045、5,218,105和5,459,255。上述的修饰能增强抗核酸酶降解的稳定性并且增加反义寡核苷酸对其靶mRNA的亲合力。
特异于AIMP2DX2的反义寡核苷酸优选包含与AIMP2DX2 mRNA的外显子1和3间的连接区域互补的序列。
反义RNA分子在体外常规合成然后转入细胞。此外，它由外源序列转录在细胞内生成。体外合成包括RNA聚合酶I。制备反义RNA的体内转录使用的载体的识别区域起点(MCS)在相反方向。反义RNA优选包含抑制翻译为肽的翻译终止密码子。
在本发明的另一方面，提供了一种治疗癌症的药学组合物，它包含(a)作为活性成分的特异于AIMP2DX2 mRNA的反义寡核苷酸或siRNA，和(b)药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供了一种治疗癌症患者的方法，包含施用于患者的药学组合物，该药学组合物包含(a)作为活性成分的特异于AIMP2DX2 mRNA的反义寡核苷酸或siRNA，和(b)药学上可接受的载体。
包含至少一种AIMP2DX2 siRNAs或反义寡核苷酸的药学组合物可含有其它药物来抑制肿瘤细胞增殖和促进siRNA或反义核苷酸的转导，例如，脂质体(美国专利US4,897,355、4,394,448、4,235,871、4,231,877、4,224,179、4,753,788、4,673,567、4,247,411和4,814,270)，或包括甾醇例如胆固醇、胆酸盐和脱氧胆酸的亲脂载体。此外，siRNA或反义核酸与细胞吸附肽例如肽类激素、抗原和肽毒素缀合(Haralambid等人，WO89/03 849；Lebleu等人，EP 0263740)。
当药学组合物用药学上可接受的载体制备用于口服给药时，它可包含结合剂、润滑剂、崩解剂、稀释剂、助溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、色素和甜味剂。当药学组合物制备用于注射时，它可包含缓冲液、防腐剂、镇痛药、助溶剂、张度剂和稳定剂。局部给药时，药学组合物可含有基质、稀释剂、润滑剂和防腐剂。药学组合物的制剂可通过与上述药学上可接受的载体一起配制来制备。口服给药时，药学组合物可以是片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆剂和糯米纸囊剂(wafer)的形式。注射组合物可制备为足量的单位剂量或多剂量形式。
本发明包含AIMP2DX2 siRNA或反义寡核苷酸的药学组合物的正确剂量根据特殊组成、应用形式、患者的年龄、体重和性别、饮食、给药时间、患者情况、药物联合用药、反应灵敏度和疾病严重性而不同。可以理解为普通熟练医师将能够很容易决定本药学组合物的正确剂量并开处方。
药学组合物的给药形式包括口服和肠胃外例如皮下、真皮内、肌内、静脉内、粘液内(intrabursa)、胸骨内、鞘内和腹腔内注射。
在本发明的另一方面，提供了一种筛选抑制权利要求1的AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质间异源二聚体形成的药物的方法，包含以下步骤(a)使试样和包含AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质的组合物接触；和(b)测定试样是否抑制AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质间的异源二聚体形成，其中抑制AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质间的异源二聚体形成的试样评价为抗癌药物。
AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质间异源二聚体的形成如下文中描述的实例中表示的与癌症相关。因此，能够抑制异源二聚体形成的物质被评价为抗癌药物的候选物。
筛选异源二聚体形成的方法包括例如酵母双杂交测定法和体外pull-down测定法。
在由Field&Song(1989)首先发展的酵母双杂交测定法中，AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质能够用作“诱饵”或“猎物”(参见例如美国专利US 5,283,317；Zervos等人，Cell 72，223-232(1993)；Maduraetal.，J.Biol.Chem.268，12046-12054(1993)；Bartel等人，BioTechniques 14，920-924(1993)；Iwabuchi等人，Oncogene 8，1693-1696(1993)；和Brent WO 94/10300)来鉴别抑制AIMP2DX2与AIMP2相互作用形成异源二聚体的物质。双杂交系统是基于大多数转录因子的模块性质，其由可分离的DNA结合和激活区域组成。简言之，该测定法利用两个不同的DNA构造。例如，在一个构造中，编码AIMP2DX2蛋白质的多核苷酸能与编码已知转录因子(例如Lex)的DNA结合区域的多核苷酸融合。在另一个构造中编码AIMP2蛋白质的DNA序列能与编码已知转录因子(例如B42)的激活区域的多核苷酸融合。
如果经处理进入表达双杂交系统细胞的试样能够抑制AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质间的相互作用，转录因子的DNA结合和激活区域无法接近。这种接近允许报告基因(例如lac Z)的转录，其可操作地连接至响应转录因子的转录调节位点。报告基因的表达能够容易地检测到。
在一个体外pull-down测定法方式中，AIMP2DX2基因和AIMP2基因能够用作诱饵或猎物。例如，在一个诱饵构造中，AIMP2蛋白质与能使AIMP2蛋白质结合于固体载体的蛋白质融合。例如，谷胱苷肽-S-转移酶(GST)融合蛋白能被谷胱苷肽琼脂糖珠或谷胱苷肽衍生微量滴定板吸附。在另一个猎物构造中，AIMP2DX2蛋白质通过使用35S的体外翻译系统(例如网织红细胞裂解物)来合成。放射性AIMP2DX2蛋白质与试样一起加入结合于谷胱苷肽琼脂糖珠的GST-AIMP2蛋白中。冲洗反应混合物并且洗脱结合于琼脂糖珠的蛋白质，随后电泳。
如果加入反应混合物的试样能够抑制AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质间的相互作用，电泳结果显示没有条带。
在本发明的另一方面中，提供了一种筛选抑制AIMP2DX2基因表达的药物的方法，包含以下步骤(a)使试样和表达AIMP2DX2基因的细胞接触；和(b)确定试样是否抑制AIMP2DX2基因的表达或促进AIMP2DX2蛋白质的破坏，其中抑制AIMP2DX2基因的表达或促进AIMP2DX2蛋白质的破坏的试样评价为抗癌药物。
在本方法中，在mRNA或蛋白质水平上评价AIMP2DX2基因的表达。当本方法用来检测AIMP2DX2 mRNA表达时，优选通过使用上文描述的AIMP2DX2特异引物的RT-PCR来进行。当本方法用来检测AIMP2DX2蛋白质表达时，优选通过多种免疫测定法例如使用如前描述的使用AIMP2DX2特异抗体的蛋白质印迹法来进行。
以下特殊实施例将说明本发明并且不应解释为限制如附加权利要求所定义的本发明的范围。
实施例方法细胞培养、化学试剂和细胞周期测量细胞在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640中培养。小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)是从12.5-14.5天的胚胎中分离出来的并且在含有20％FBS的DMEM(Dulbecco’sModified Eagle Medium)中培养。为了评价TGF-β在细胞周期中的作用，细胞用2ng/mlTGF-β在无血清或1％含FBS的培养基中培养24小时并且收集用于FACS分析。细胞增殖也由[3H]胸苷参入进行测定。细胞在无血清培养基中用或不用TGF-β培养20小时，然后在1μCi/ml[3H]胸苷存在下培养4小时。参入的胸苷用如前描述的液滴闪烁计数法(Kim，M.J.等人，Nat.Genet.34，330-336(2003))进行定量。TGF-β购买自R&D system，抗Smad2和抗Smad4抗体购买自Santa Cruz。抗AIMP2抗体如下制备将分离的500ugAIMP2蛋白质与500ul完全佐剂(Sigma，1mg/ml)混合皮下注射到兔(雄性，新西兰)中。7天后，将分离的500ug AIMP2蛋白质与500ul完全佐剂(1mg/ml)混合注射到兔中，然后每间隔7天注射测试物，进行2次。3天后，从兔血中分离抗AIMP2 Ab。
免疫印迹和免疫沉淀细胞用TGF-β处理所标明的次数并且蛋白质用含有蛋白水解酶的RIPA缓冲液提取，经10-12％SDS-PAGE分离，并且用使用ECL系统的特异性抗体进行免疫印迹。进行免疫沉淀时，细胞裂解物用IgG和缀合琼脂糖的蛋白质A预处理来清除。离心后，上清液用特异性抗体和缀合琼脂糖的蛋白质A培养2小时。用冰预冷的PBS洗涤两次和RIPA洗涤一次后，用特异性抗体沉淀结合的蛋白质，洗脱并进行蛋白质印迹分析。
RT-PCR总RNAs根据生产商(Qiagen)的使用说明进行分离。简言之，将新鲜制备的组织(3×3×3mm)剁碎为小片，与350μl裂解缓冲液混合并且使用匀浆器或注射器匀浆化。加入350μl 70％乙醇后，裂解物倒置数次，上样至柱子，在13,000RPM离心15秒。用洗涤缓冲液洗涤柱子两次后，RNAs用40μl无RNase DW洗脱。进行逆转录时，将分离的1μgRNA用作AIMP2特异引物的模板(图8b)。反应后，混合物用DW稀释3倍并且其1μl等分试样用于30μl PCR反应，其中含有0.5μl dNTP(每种2.5mM)、0.5μl所标明的引物(每种10pM)、1.5μlDMSO和0.1μlTaq聚合酶(5U/μl)。
用si-RNA抑制AIMP2DX2为了抑制AIMP2DX2的表达，制备抗AIMP2DX2的siRNAs。设计编码抗AIMP2DX2的siRNA的序列并且将其克隆至16 IMG-700载体系统(Imgenex)的SalI和XbaI位点，随后经DNA序列分析以确证被克隆的序列。将2μg的si-DX2表达载体转染至H322细胞中。用DNA-脂质体复合物在1ml无血清培养基中培养3小时后，用1ml含有20％FBS的RPMI-1640处理H322细胞。然后，细胞在有或没有TGF-β的无血清培养基中培养20小时。
酵母双杂交分析使用特异引物通过PCR获得编码人AIMP2和Smad2的cDNAs(及其缺失片段)。Smad2和AIMP2的PCR产物用EcoRI和XhoI消化，并且分别连接至pEG202(LexA)和pJG4-5(B42)的相同位点(Gyuris，J等人，a human G1 and S phase protein phosphatasethat associates with Cdk2.Cell 75，791-803(1993))。Lex-Smad2片段和B42-AIMP2间的相互作用通过如前所述的它们在含有X-gal的酵母培养基中生长的能力来进行分析(Rho，S.B.et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 96，4488-93.(1999))。
稳定生成AIMP2DX2的细胞的构建野生型MEFs用pcDNA-AIMP2DX2或pcDNA本身进行转染并且在含有400μg/mlG418的DMEM培养基中选择转染细胞。弃去未转染的细胞后，将转染细胞在无G418的正常培养基中培养3天，用2％PFA固定并且吉姆萨染色。
免疫染色和组织学分析将冷冻的组织载片用2％多聚甲醛固定并且用冰预冷的PBS冲洗。在封闭和用含有0.2％Triton X-100(PBST)和1％BSA的PBS渗透后，载片用抗AIMP2抗体培养2小时。用PBS冲洗后，再用抗兔羊IgG-FITC和碘化丙啶(50μg/ml)孵育1小时，用PBS冲洗，装好，在共聚焦显微镜下观察。
AIMP2DX2表达载体的构建为了构建AIMP2DX2表达载体，将AIMP2DX2的cDNA克隆到pcDNA3.1-myc中。首先，使用引物和EcoRI和XhoI的连接臂扩增H322 cDNA中的AIMP2DX2并且使用EcoRI和XhoI将其克隆到pcDNA3.1-myc(Invitrogen)中。将表达AIMP2DX的pcDNA3.1-myc/AIMP2D X2载体(图12)导入E.coli DH5α中，该E.coli DH5α于2004年10月25日保藏于国际保藏机构(International Depository Authority)，韩国典型菌种保藏中心(KCTC)并且给予的保藏编号为KCTC 10710BP。
敲除小鼠的产生和特征小鼠基因组DNA的突变通过基因捕获方法产生(Zambrowicz等人，Nature，9，608-611，1998)。基因捕获载体用于产生来自129/SvEvBrd小鼠的胚胎干细胞的随机突变体库(OmniBank library，Lexicon Genetics，USA)。在该库中，证实OST7994克隆中AIMP2DX2基因被破坏。使用以上克隆，根据Lexicon Genetics的标准方法得到C57/BL6杂合小鼠。然后将所述杂合小鼠交配以获得纯合突变小鼠。将13.5天的小鼠胚胎分离出来用刀片切碎，胰蛋白酶消化且放置于培养皿中培养。
突变体通过使用从小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离出来的基因组DNAs的DNA印迹法和PCR分析法确证。AIMP2表达通过RNA印迹和蛋白质印迹分析来测定。基因捕获插入的位置通过基因组DNA的序列分析来测定。进行DNA印迹分析时，从小鼠尾巴中分离基因组DNA并且将其用SacI消化。切割的DNA片段通过变性凝胶电泳分离并且将其与AIMP2基因与SEQ NOs17和18的引物的放射性标记的1.2kb PCR产物杂交。杂交带用磷光计分析器检测。使用SEQ NOs 19和20，SEQ NOs 20和21的特异引物对，还可将被分离的基因组DNA用于PCR分析。
进行RNA印迹分析时，使用RNeasy Midi kit(QIAGEN)根据生产商说明从小鼠胚胎成纤维细胞中制备总的细胞RNA。独立的RNAs(30ug)通过1.2％琼脂糖/2.2M甲醛凝胶的电泳分离，转移至Hybond N膜上(Amersham)，然后通过紫外线照射固定在膜上。使用ExpressHyb杂交溶液(CLONTECH)使膜上的RNAs与通过AIMP2 cDNA的PCR生成的特殊探针杂交。从小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞中提取蛋白质，经SDS-PAGE分离并且用抗AIMP2多克隆抗体进行蛋白质印迹分析，所用方法描述在(Park等人，274，16673-16676，1999；Kim等人，J Biol Chem，275，21768-21772，2000)中。
肺癌形成32只AIMP2+/-小鼠(19只雄性和13只雌性小鼠)和25只AIMP2+/+小鼠(14只雄性和11只雌性小鼠)用于实验。我们通过将化学致癌物苯-(α)-芘(BP，100mg/kg)注射到AIMP2+/+和AIMP2+/-小鼠腹腔内诱导肺肿瘤，并且监测肺中肿瘤的形成。作为对照组，3只AIMP2+/+(2只雄性和1只雌性)和5只AIMP2+/-小鼠(4雄性和1雌性)用bical溶液(10％DMSO和35％PEG40盐溶液)注射。
使用敲除小鼠的皮肤癌模型33只两种性别的野生型(WT)和AIMP2敲除(KO)小鼠分成以下组别WT雄性对照(3)、WT雄性处理(6)、WT雌性对照(2)、WT雌性处理(6)、KO雄性对照(2)、KO雄性处理(6)、KO雌性对照(3)和KO雌性处理组(5)。
单一剂量(0.2μmol/0.2ml丙酮)的7，12-二甲苯[a]蒽(7，12-dimethybenz[a]anthracene))(DMBA)局部施用给处理组小鼠去毛的背部，而对照组小鼠仅用丙酮处理。一周后，施用了DMBA的小鼠(DMBA-initiated mice)用12-O-十四酰-佛波醇-13-醋酸盐(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate)(TPA，10nmol/0.2ml丙酮)每周处理两次共处理21周。对照动物在整个研究中仅用丙酮处理。从经促进剂处理的1周开始，对最少1mm直径的肿瘤每周进行计数。21周后，处死小鼠并且对肿瘤样品进行校正用于随后的生物化学分析。
实施例1AIMP2在TGF-β传导中的功能重要性和工作模式为了观察AIMP2在TGF-β传导中的重要性，我们比较了AIMP2+/+和AIMP2/-MEFs对TGF-β诱导的生长停滞、Smad2/3的核易位和AIMP2与Smad2/3的相互作用的反应。当野生型细胞的生长被TGF-β抑制时，AIMP2缺乏的细胞对通过胸苷参入、菌落形成和流式细胞术(图1a、1b和1c，分别地)确定的信号无应答。当MEFs用TGF-β处理时，Smad2和Smad3在正常细胞中易位至细胞核，但在AIMP2/细胞中不易位(图1d)。所有这些结果提示了AIMP2在通过Smad2和Smad3的TGF-β传导中的功能重要性。
AMIP2与Smad2和Smad3的可能相互作用通过免疫共沉淀来检查。AIMP2显示了被TGF-β增强的与Smad2/3的相互作用(图1e)。AIMP2与两个R-Smads的直接相互作用还被酵母双杂交和体外pull-down测定法所证实(图2和7)。与Smad2/3结合的AIMP2的量根据被TGF-β诱导的AIMP2而增加(图2a)。当AIMP2水平通过转染增加时，TGF-β靶基因的表达被增强，暗示了其在TGF-β传导中的刺激作用(图2b)。由于AIMP2与Smad2和3都结合，我们预期它对这两个R-Smads以类似方式起作用并且因此将关注点集中在其与Smad2的具体关系上。Smad2的TGF-β依赖的磷酸化作用在AIMP2缺乏的MEFs中被抑制，但是当将AIMP2导入AIMP2/-细胞时恢复(图2c)。Smad2中涉及与AIMP2的相互作用的结构域通过酵母双杂交(图2d)和体外pull-down测定法(图7)来确定。这两个实验显示相互作用涉及Smad2的MH2结构域。
为了确定AIMP2在TGF-β传导中的工作模式，在正常细胞和AIMP2缺乏细胞中比较Smad2与TGF-β受体的TGF-β诱导的联系。用TGF-β处理细胞并且Smad2和受体的联系通过I类受体与Smad2在时间间隔的免疫共沉淀来监测。在早期时间点观察与TGF-β受体结合的TGF-β诱导的Smad2并且它在野生型细胞中降低，而在AIMP2缺乏细胞中经TGF-β处理后结合于Smad2的受体在晚期累积(图2e)。在TGF-β诱导的Smad2的磷酸化作用中，磷酸化的Smad2在野生型细胞中逐渐增加，但是在AIMP2/-细胞中被严重抑制(图2f)。这些结果说明AIMP2通过其与R-Smad2的直接相互作用在R-Smad2的TGF-β诱导的磷酸化作用中起到关键的作用。
实施例2AIMP2的抑制和癌细胞中其缺失变异体的产生为了探索AIMP2与癌症形成的可能联系，在不同癌细胞系中观察AIMP2水平的差异[可自美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的A549(肺上皮癌)、DU145(前列腺癌)、HCT116(人结肠直肠癌)、H460(大细胞肺癌)、H322(肺细支气管肺泡癌)和H290(间皮瘤癌细胞系)]。这六种检测细胞系中的三种在蛋白质印迹法(图3a)和FACS分析(图3b)中显示了较低AIMP2水平。所有低AIMP2水平的细胞系表达了正常水平的TGF-βII型受体并且保持其激酶活性，暗示低AIMP2水平不是由于受体的功能出现障碍(mal-functionality)导致的。为了测定AIMP2水平的差异是否是由于转录的差异造成的，使用不同组合的AIMP2特异引物进行RT-PCR。AIMP2基因由四个外显子组成(图8a)。当SEQ ID Nos.3和4的引物用于产生跨越外显子3和4的AIMP2 cDNA时，在显示AIMP2水平降低的细胞中未发现AIMP2转录物的减少(图3c，第一行)，暗示其不是由于较低转录造成的结果。当使用SEQ ID Nos.5和6的引物产生外显子1至3的转录物时，不仅获得了预期大小的转录物还有一个较小的转录物(图3c，第二行)。此小转录物的序列分析显示其缺乏编码AIMP2的69个氨基酸的外显子2(图8b)。为了证实生成了这种较小转录物，设计了靶向外显子1和3的连接序列的SEQ ID No.8的引物(图8b，引物DX-B)，，其中所述的连接序列是由于外显子2的缺失生成的，并且用SEQ ID No.7的引物进行RT-PCR。表达较低AIMP2水平的细胞系生成了该较小转录物(命名为DX2，图3c，第二及第三行)。
使用抗AIMP2抗体的蛋白质印迹分析只检测到全长AIMP2，而没有检测到DX2(图2a)，这暗示DX2可能在蛋白质水平是非常不稳定的。免疫荧光染色法也证明了在H460、H322和H290中的较低的AIMP2水平(图3d)。为了排除染色伪差的可能性，将H460和DU145细胞在同一平板上共培养且染色AIMP2。AIMP2在H460中的染色强度再次比在DU145中弱很多(图9a)。此外，在低AIMP2表达的细胞中未观察到AIMP2的TGF-β依赖的核定位(图3d，底部行)。为了找到AIMP2水平和TGF-β功能性间的关系，我们检测了TGF-β对这些细胞系的生长抑制。当A549和DU145细胞的生长被TGF-β抑制时，低AIMP2水平的细胞对TGF-β无应答(图3e)。这个结果与前面报道的A549是敏感的而H460对TGF-β信号是抵抗的(Osada，H.等人，Cancer Res.61，8331-8339(2001)；Kim，T.K.等人，Lung Cancer 31，181-191(2001))一致。此外，靶基因在A549和DU145中被TGF-β诱导，但在H322和另外两个低AIMP2的细胞系中未被诱导(图3f)。
实施例3无活性的缺失变异体与功能AIMP2形成复合物为了了解DX2生成和AIMP2抑制的因果关系，在将DX2转染至DU145后检查AIMP2水平的变化。AIMP2在DX2转染细胞中减少，如蛋白质印迹(图4a，第一行)和FACS分析(图9b)所显示。此外，AIMP2的靶c-myc的表达由于导入DX2而提高(图4a，第三行)。DX2还减轻了由于TGF-β造成的生长抑制(图4b和9c)。然后我们研究DX2如何影响功能性的AIMP2(AIMP2F)。由于AIMP2具有形成同源二聚体的可能性(Quevillon，S.等人，J.Mol.Biol.285，183-195(1999)；和Kim，J.Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，7912-7916(2002))，我们通过酵母双杂交测定法检查AIMP2DX2是否与AIMP2F相互作用。AIMP2DX2显示它与AIMP2F有相互作用，但是与它自己没有相互作用(图4c)。在体外pull-down测定中，放射性合成的AIMP2F和-DX2都与GST-AIMP2F共纯化(图4d)，而DX2却不能，这证明了AIMP2F和-DX2间的直接相互作用。为了观察DX2在TGF-β传导中是否有活性，我们用酵母双杂交测定法检测其与Smad2的相互作用。当AIMP2与Smad2和AIMP2的已知靶点FBP相互作用时(Kim，M.J.等人，Nat.Genet.34，330-336(2003))，DX2不与任何这些蛋白质结合，这暗示其是没有功能活性的(图4e)。
为了了解异源二聚体的形成是如何抑制AIMP2的，我们检查AIMP2水平是否被蛋白酶体依赖的降解过程调控。产生DX2的H322细胞用蛋白酶体抑制剂ALLN处理(Zhou，M.，等人，J.Biol.Chem.271，24769-24775(1996))并且检测AIMP2水平是否通过阻断蛋白酶体而增加。AIMP2水平通过ALLN处理显著增加，如蛋白质印迹(图4f)、免疫荧光染色(图4g)和流式细胞术(图9d)所示，这暗示其细胞水平可能由蛋白酶体介导的降解所调控。此外，AIMP2DX2形式还可通过抑制蛋白酶体来检测(图4f)，这就证实了DX2由于蛋白酶体依赖的快速降解而不稳定的观点。与正常AIMP2比较，AIMP2DX2的强度低看起来是由于较低转录造成的，这通过RT-PCR分析(图3c)得到证实，和/或由于抗AIMP2抗体的识别效率差造成的。由于AIMP2降解是蛋白酶体介导的，我们检测其遍在蛋白化是否被DX2促进。当AIMP2从经ALLN处理及用抗遍在蛋白质抗体标记的对照和DX2转染细胞中免疫沉淀时，与对照细胞中的遍在蛋白质化的AIMP2比较，在DX2转染细胞中观察到较高量的遍在蛋白质化的AIMP2(图4h)。总之，DX2作为显性负性突变体与AIMP2形成无活性复合物，该复合物快速进入降解过程。
实施例4AIMP2DX2使TGF-β的传导失活和促进细胞生长将DX2转染至MEFs并且通过显微镜分析和菌落形成检测其在细胞生长中的作用。通过导入DX2显著增强细胞的生长(图5a)。然后我们导入特异抑制DX2转录的siRNA(si-DX2)并且检查它是否能够在表达DX2的H322细胞中恢复AIMP2的正常水平和TGF-β传导。当用表达4号或5号siRNA的载体转染H322细胞时，用FACS测定TGF-β导致的细胞死亡的提高(左)和细胞周期停滞的产生(右)(图5d)。为了检测siRNA是否能恢复AIMP2的正常水平和TGF-β传导，将特异抑制DX2特异表达的生成4号siRNA(si-DX2)的载体转染入表达DX2的H322细胞中。si-DX2消融了DX2转录物(图5e顶部)并且使AIMP2恢复正常水平和恢复了Smad2的TGF-β诱导的磷酸化作用(图5e底部和图5f)、p-Smad2的核定位(图5f)、TGF-β依赖的报告表达(图5g)和生长抑制(图5h)。所有这些结果说明DX2对TGF-β传导和细胞生长调控具有破坏作用。
实施例5AIMP2缺失变异体与人肺癌的联系由于AIMP2的减少时常在不同癌细胞系中(图3a、3b和3d)检测到，并且AIMP2的丧失导致肺细胞的过增殖(Kim，M.J.等人，Nat.Genet.34，330-336(2003))，我们检测了AIMP2的异常与肺癌形成的联系。我们通过在AIMP2+/+和AIMP2+/-小鼠中腹腔内注射化学致癌物苯-(α)-芘(BP，Wang，Y等人，Cancer Res.63，4389-4395(2003))诱导肺肿瘤，并且监测肺中的肿瘤形成。从BP给药后6周，观察到AIMP2+/-小鼠中肺肿瘤的发生率为50-70％，而在野生型同窝出生仔中大约30％(图6a)，这暗示杂合小鼠对BP诱导的肿瘤生成更敏感。从AIMP2+/-小鼠中分离的四个肺中的三个显示了肿瘤，而三个AIMP2+/+小鼠中仅有一个产生肿瘤并且所有这些肿瘤都产生DX2(图10)，进一步支持了DX2与肿瘤形成的关联性。然后我们比较人肺中炎症但是无肿瘤和肿瘤组织的AIMP2水平。DX2只在肿瘤组织中产生(图6b)。为了排除AIMP2水平和DX2形成可能依赖于不同个体的可能性，我们对从同一患者中分离的一对正常和肿瘤组织进行RT-PCR和免疫荧光分析。在癌区域中显示正常AIMP2水平的一例中未检测到DX2(图6e和6f，患者22872)。
实施例6AIMP2、AIMP2DX2及其缺失变异体的联系在人组织和癌细胞系中检测AIMP2、AIMP2DX2及其缺失变异体与癌症的关系。
通过RT-PCR评价在来自肝细胞癌的正常和癌组织中的AIMP2DX2形成。另外，检测不同癌细胞系中的AIMP2DX2形成(图11a)。将细胞在6孔板中以1×105的密度培养并且于24小时后收集。收集的细胞用GSS缓冲液裂解，与含有酸性苯酚(pH4.3)和氯仿的4％异戊醇混合，然后离心。离心获得的上清液用异丙醇沉淀并且再次离心，随后得到沉淀。沉淀用乙醇冲洗并且溶解于DW中。RNA用M-MLV逆转录酶(invitrogen)在42℃逆转录1小时然后使用引物SEQNos.16和17进行PCR，95℃1分钟、60℃1分钟和72℃1分钟循环38个周期。AIMP2DX2在肺癌细胞系(H226、H460、H322和H290)、胚胎肾细胞系(293)、骨肉瘤细胞系(SaOS2)、皮肤癌细胞株系(HaCAT)和乳癌细胞系(MCF7)中表达(图11b)。
实施例7使用AIMP2敲除小鼠对肿瘤发生的研究在AIMP2DX2敲除小鼠和野生小鼠中观察肿瘤的敏感性。
作为结果，AIMP2DX2敲除小鼠中在皮肤上具有肿瘤的小鼠数目和小鼠的肿瘤数目都显著增加。具体地说，当小鼠的肿瘤发生被DMBA诱导和被TPA促进时，AIMP2敲除雌性小鼠中肿瘤形成的比例比野生型雌性对照小鼠增加大约1.3倍。此外，AIMP2敲除雄性小鼠中肿瘤形成的比例比野生型雄性对照小鼠增加大约2倍(图12b)。在AIMP2敲除雌性小鼠中形成的肿瘤的数目比野生型雌性对照小鼠增加了大约4倍。在AIMP2敲除雄性小鼠中形成的肿瘤的数目比野生型雄性对照小鼠增加了大约2倍(图12c和图12d)。
已描述了本发明的一个优选实施例，应当理解其落入本发明精神的变异体和修饰体对于本领域技术人员是显而易见的，并且本发明的范围通过附加权利要求和其同等物来确定。
关于国际承认的用于专利目的的微生物保藏的布达佩斯条约国际表格原始保藏的受理根据7.1条颁布的致金松宏韩国首尔151-742广津区新林洞#56-1首尔大学药学院ARS网络中心
序列表<110>Seoul National University Industry Foundation<120>Use of AIMP2DX2 for the diagnosis and treatment of cancer<150>KR20040097164<151>2004-11-24<150>KR20050039073<151>2005-05-10<160>21<170>Kopatentln 1.71<210>1<211>756<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
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<220>
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<223>si-DX2#3 coding nucleic acid sequence<400>9tcgaggccac gtgcaggtta cgggagtagg ccgtaatcct gcacgtggcc tttt 54<210>10<211>55<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>si-DX2#5 coding nucleic acid sequence
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权利要求
1.包含AIMP2氨基酸序列的AIMP2DX2蛋白质，其中所述AIMP2氨基酸序列的外显子2区域被删除。
2.根据权利要求1所述的AIMP2DX2蛋白质，其中所述AIMP2DX2蛋白质包含SEQID NO2的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的AIMP2DX2蛋白质，其中所述AIMP2DX2蛋白质被用作癌症标记物。
4.包含编码权利要求1所述的AIMP2DX2蛋白质的核苷酸序列的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述的核酸分子包含SEQ ID NO1的核苷酸序列。
6.一种重组载体，该重组载体中的核酸分子包含编码权利要求1所述的AIMP2DX2蛋白质的核苷酸序列。
7.一种转化体，该转化体用权利要求6所述的重组载体进行转化。
8.一种制备权利要求1所述的AIMP2DX2蛋白质的方法，包含培养权利要求7所述的转化体。
9.一种特异于权利要求1所述的AIMP2DX2蛋白质的抗体。
10.一种癌症诊断试剂盒，该试剂盒包含特异于权利要求1所述的AIMP2DX2蛋白质的抗体。
11.一种筛选作为癌症标记物的AIMP2DX2蛋白质的方法，其中包含以下步骤(a)提供待测样品；和(b)检测所述样品中编码权利要求1所述的AIMP2DX2蛋白质的核苷酸序列的表达，其中编码所述AIMP2DX2蛋白质的所述核苷酸序列的表达的检测指示有癌症。
12.根据权利要求11的方法，其中步骤(b)中所述检测通过使所述样品和特异于权利要求1所述的AIMP2DX2蛋白质的抗体接触来进行。
13.根据权利要求11的方法，其中步骤(b)中所述检测通过扩增反应或杂交反应来进行。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述扩增反应通过使用能够区别AIMP2DX2的mRNA和AIMP2的mRNA的引物的RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)来进行或所述杂交反应通过使用能够区别AIMP2DX2的mRNA和AIMP2的mRNA的探针来进行。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述引物的序列包含SEQ ID No.5和6、SEQID No.7和8或SEQ ID No.16和6；或所述探针的序列包含SEQ ID No.8或16。
16.一种包含SEQ ID No.3、4、5、6、7、8或16的核苷酸序列的核酸分子。
17.特异于权利要求1所述的AIMP2DX2蛋白质的mRNA的siRNA核酸分子。
18.根据权利要求17所述的siRNA核酸分子，其中所述siRNA核酸分子包含编码SEQID Nos.9和10、SEQ ID Nos.11和12或SEQ ID Nos.13和14的核苷酸序列的有义和反义RNA。
19.一种治疗癌症的药学组合物，其中包含权利要求17所述的siRNA核酸分子。
20.一种治疗癌症的方法，其中包含施用权利要求17所述的siRNA核酸分子。
21.一种反义寡核苷酸，该寡核苷酸与权利要求1所述的AIMP2DX2蛋白质的mRNA区域是互补的。
22.一种治疗癌症的药学组合物，其中包含权利要求21所述的反义寡核苷酸。
23.一种治疗癌症的方法，其中包含施用权利要求21所述的反义寡核苷酸。
24.一种筛选抗癌药物的方法，所述的抗癌药物抑制权利要求1所述的AIMP2DX2蛋白质和AIMP2蛋白质间异源二聚体的形成，包含以下步骤(a)使测试物质和包含所述AIMP2DX2蛋白质和所述AIMP2蛋白质的组合物接触；和(b)确定所述测试物质是否抑制所述AIMP2DX2蛋白质和所述AIMP2蛋白质间的所述异源二聚体的形成，其中抑制所述AIMP2DX2蛋白质和所述AIMP2蛋白质间的所述异源二聚体形成的所述测试物质被评价为抗癌药物。
25.根据权利要求24的方法，其中该方法通过酵母双杂交测定法或体外pull-down测度法进行。
26.一种筛选抗癌药物的方法，所述抗癌药物抑制权利要求1所述的AIMP2DX2基因的表达或促进所述AIMP2DX2蛋白质的破坏，包含以下步骤(a)使测试物质和表达所述AIMP2DX2基因的细胞接触；和(b)确定所述测试物质是否抑制所述AIMP2DX2基因的表达或促进所述AIMP2DX2蛋白质的破坏，其中所述抑制所述AIMP2DX2基因表达的所述测试物质被评价为抗癌药物。
27.根据权利要求26的方法，其中此方法通过RT-PCR或蛋白质印迹法进行。
全文摘要
本发明涉及命名为AIMP2DX2、特异表达于癌细胞中的缺失外显子2的AIMP2的变异体。该AIMP2DX2蛋白质和基因能够成功用于癌症诊断和治疗的发展中。
文档编号C07K14/47GK101087804SQ200580037802
公开日2007年12月12日 申请日期2005年11月18日 优先权日2004年11月24日
发明者金松宏 申请人:首尔大学工业基地