从表达腺病毒e1a蛋白的细胞中获得唾液酸化增加的重组蛋白质的方法及由此获得的蛋白质的制作方法

专利名称：：从表达腺病毒e1a蛋白的细胞中获得唾液酸化增加的重组蛋白质的方法及由此获得的蛋白质的制作方法
技术领域：
：本发明涉及重组蛋白质生产领域，特别涉及重组蛋白质如红细胞生成素的糖基化，更特别涉及当在表达腺病毒E1A的细胞中生产时重组蛋白质的糖基化。
背景技术：
：如WO00/63403所示，表达至少腺病毒E1A蛋白的永生化人胚胎视网膜细胞可适用于生产重组蛋白质。在表达腺病毒E1A的细胞中产生的具有N联糖基化的重组蛋白质具有特异性糖基化模式，例如特征在于存在Lewis-X结构，如WO03/038100所述。在表达E1A的细胞中产生的蛋白质的另一特征是呈现相对低的半乳糖基化及低唾液酸化的N联聚糖(WO03/038100)。对于某些目的，这可能是有益的，但对于其它目的，较高水平的半乳糖基化及优选同时唾液酸化是有益的。例如，在表达E1A的细胞中产生的红细胞生成素(EPO)具有显著量的Lewis-X结构和在N联聚糖中相对低百分比的半乳糖基化和唾液酸化(WO03/038100)，产生非常适于治疗缺血/再灌注损伤但不太适合治疗贫血的分子。对于治疗贫血，已经确定EPO的高度唾液酸化有益于增加治疗对象血清中EPO的半衰期，由此延长该物质处于活性的时间而增加红细胞计数(Goldwasseretal.，1974)。因此，对于治疗缺血/再灌注损伤，在表达E1A的细胞中表达EPO对于为此用途产生的EPO的优选糖基化模式具有潜在益处。然而，对于EPO的其它应用，不同的糖基化模式可能是有益的。对于其它蛋白质可存在类似情况，即对于某些应用，基于在表达E1A的细胞中表达而观察到的特定糖基化模式可能是高度有益的，而对于其它目的，不同的糖基化模式也许更适合。已经对于其它细胞类型描述了在细胞中过表达唾液酸转移酶以增加在该细胞中产生的重组蛋白质的唾液酸化(例如Grabenhorstetal.，1995；Minchetal，1995；Jenkinsetal，1998；Zhangetal，1998；Weikertetal，1999；Fukutaetal.，2000；Pratietal.，2000)。然而考虑到糖基化的复杂性及仍未清楚E1A在其中的作用(WO03/038100)，从前还未知这种方案是否在表达E1A的细胞中产生所期望的结果。特别地，在表达E1A的细胞中糖基化过程中不同糖基化转移酶与其它参与者之间的相互影响和潜在竞争使得尚无法预料及不可预知唾液酸转移酶在这种细胞中的过表达对因此产生的蛋白质糖基化模式方面的结果。为了拓宽在表达E1A的细胞中产生的重组蛋白质的潜在应用范围，增加这种蛋白质的半乳糖基化和唾液酸化是有益的。本发明的一个目的是提供实现这个目的的方法。本发明进一步涉及提供得自表达E1A的细胞的新的红细胞生成素组合物。本发明的另一目的是提供降低在细胞例如表达腺病毒E1A的细胞中重组表达的蛋白质上LacdiNAc结构的平均含量的方法。附图简述图1.通过对商购EPO(EPREXTM，泳道A)、在PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10中产生的EPO(泳道B)及在PER.C6-EPO克隆25中产生的EPO(泳道C)进行等电聚焦确定的唾液酸含量。图中也示出了每个EPO分子推定的唾液酸数目。图2.在DMEM中，贴壁细胞培养物(A)及在无血清培养基中悬浮细胞培养物(B)中产生的PER.C6-EPO的去唾液酸化N联糖的MALDI-MS谱。图3.对在VPRO培养基中无血清悬浮培养物中不过表达唾液酸转移酶的PER.C6细胞中产生的EPO(泳道1)、在VPRO中无血清悬浮培养物中过表达α-2，6-唾液酸转移酶的PER.C6细胞(即PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10)中产生的EPO(泳道2)及商购的EPO即EPREXTM(泳道3)通过等电聚焦确定的唾液酸含量。图4.如实施例5所述通过HPLC离子交换方法分析由不过表达α-2，6-唾液酸转移酶的PER.C6细胞产生的EPO(PER.C6-EPO，组A)及过表达α-2，6-唾液酸转移酶的PER.C6细胞产生的EPO(PER.C6-ST-EPO，组B)的每N联糖的唾液酸数目。图中标记出具有0、1、2、3或4个唾液酸的糖的洗脱位置。图5.对不同PER.C6-EPO制品和Eprex的等电聚焦。PER.C6-EPO表示由不过表达α-s，6-唾液酸转移酶的PER.C6细胞产生的EPO分子的总数；PER.C6-ST-EPO表示由过表达α-s，6-唾液酸转移酶的PER.C6细胞产生的EPO分子总数。分级分离的PER.C6-ST-EPO表示使用实施例6所述分级分离/纯化方案得自泳道2示出的材料的高度唾液酸化的EPO。Eprex表示商购的EPO制品。图6.使用实施例6所述的方法获得的分级分离的、高度唾液酸化的PER.C6-EPO的去唾液酸化N联糖的MALDI-MS谱。图7.如本申请所述具有不同唾液酸含量的EPO同种型。1由不过表达唾液酸转移酶的PER.C6产生的EPO(实施例2)。2由过表达α-2，6-唾液酸转移酶的PER.C6产生的EPO(实施例3)。3分级分离的高度唾液酸化的EPO(实施例6)。4Eprex(商购的EPO)。见实施例8所述。图8.pCP-EPO和pEPO-ST3表达载体的质粒图谱。CMV＝巨细胞病毒启动子，BGHp(A)＝牛生长激素聚腺苷酸化序列，f1ori＝f1复制起点，SV40＝猿猴病毒40启动子，Neo＝新霉素抗性标记，SV40p(A)＝猿猴病毒40聚腺苷酸化序列，EPO＝红细胞生成素，ColE1＝ColE1复制起点，Amp＝氨苄青霉素抗性标记。见实施例9所述。图9.在瞬时转染后，在PER.C6细胞中产生的EPO(pCP-EPO)及伴随人α-2，3-唾液酸转移酶过表达在PER.C6细胞中产生的EPO(pEPO-ST3)的等电聚焦(IEF)凝胶。见实施例10详述。图10.对表达EPO和人α-2，3-唾液酸转移酶(ST3)的稳定克隆的IEF分析。泳道1EprexTM(对照，商购的EPO)；2EPO-ST3克隆118；3EPO-ST3克隆150；4EPO-ST3克隆165；5EPO-ST3克隆176；6EPO-ST3克隆183；7在不过表达ST3的PER.C6中产生的EPO(对照)；8EprexTM(对照，商购的EPO)；9EPO-ST3克隆185；10EPO-ST3克隆186；11EPO-ST3克隆199；12EPO-ST3克隆213；13EPO-ST3克隆028；14EPO-ST3克隆059；15在不过表达ST3的PER.C6中产生的EPO(对照)。见实施例11详述。图11.亲和纯化的2，3EPO的去唾液酸化的N联糖的MALDI-MS谱(将实施例12详述)。图12.EPO制品的IEF分析。泳道1PER.C6-EPO(平均唾液酸含量3.1)，泳道2EprexTM(对照，商购的EPO，平均唾液酸含量12.4)，泳道32，3EPO-1(Ultrodex纯化的，见实施例14所述，平均唾液酸含量13.6)，泳道32，3EPO-2(Ultrodex纯化的，见实施例14所述，平均唾液酸含量14.3)。发明描述本发明提供了一种包含一或多种同种型红细胞生成素(EPO)的组合物，所述红细胞生成素包含与其连接的聚糖，特征在于所述聚糖平均包含a)每个EPO分子至少0.5个、优选至少1个LewisX结构，和b)每个EPO分子至少6个唾液酸部分。优选地，所述聚糖平均包含每个EPO分子至少7个、更优选至少8、更优选至少9、更优选至少10、更优选至少11个唾液酸部分。在某些实施方案中，所述聚糖平均包含a)每个EPO分子1-2个Lewisx结构，和b)每个EPO分子8-10个唾液酸部分。在其它实施方案中，所述聚糖平均包含a)每个EPO分子0.5-1个Lewisx结构，和b)每个EPO分子11-13个唾液酸部分。在某些实施方案中，EPO是具有三个N联聚糖的人EPO。本发明进一步提供了一种获得包含一或多种同种型红细胞生成素(EPO)的组合物的方法，所述红细胞生成素包含与其连接的聚糖，其中所述聚糖平均包每个EPO分子至少6个唾液酸及0-2个Lewisx结构，所述方法包括a)提供含有可表达形式的编码腺病毒E1A蛋白的核酸序列及进一步含有可表达形式的编码EPO的核酸的真核细胞，其中所述细胞进一步含有在异源启动子控制下的编码唾液酸转移酶、优选α-2，6-唾液酸转移酶或α-2，3-唾液酸转移酶的核酸序列；b)在无血清培养基中培养所述细胞，使得EPO在所述细胞中表达；c)从所述细胞和/或培养基中收获表达的EPO；及d)纯化并分级分离EPO以获得每个EPO分子的N联聚糖的平均唾液酸含量增加的级分，由此获得包含一或多种同种型EPO的组合物，所述EPO包含与其连接的聚糖，其中所述聚糖平均包含每个EPO分子至少6个唾液酸及0-2个Lewisx结构。在某些实施方案中，所述含有可表达形式的编码腺病毒E1A蛋白的核酸序列的真核细胞衍生自人胚胎视网膜细胞，优选衍生自如于1996年2月29日在ECACC中以96022940号保藏的PER.C6细胞。在某些优选的实施方案中，所述聚糖平均包含每个EPO分子少于1个的Lewisx结构及至少10个唾液酸。在进一步优选的实施方案中，所述聚糖平均包含每个EPO分子少于一个的Lewisx结构及10-15个唾液酸，优选检测不到Lewisx结构。在其它优选的实施方案中，所述聚糖平均包含每个EPO分子少于0.3个Lewisx结构及13-15个唾液酸，优选检测不到Lewisx结构。在某些实施方案中，所述组合物包含4种或更少的EPO同种型，其一共占所述组合物中存在的EPO的至少70％。技术人员了解EPO是一种包含N联聚糖的蛋白质的模型蛋白质，因此很明显这些方法也可用于其它糖基化的蛋白质。本发明因此进一步提供了一种在表达至少一种腺病毒E1A蛋白的细胞中产生感兴趣的糖基化蛋白质的方法，所述方法包括a)提供表达至少一种腺病毒E1A蛋白及进一步含有可表达形式的编码感兴趣的蛋白质的核酸的细胞，其中所述细胞进一步含有在异源启动子控制下的编码唾液酸转移酶、优选α-2，6-唾液酸转移酶或α-2，3唾液酸转移酶的核酸序列；b)在无血清培养基中培养所述细胞并使得感兴趣的蛋白质在所述细胞中表达；c)从所述细胞和/或培养基中收获表达的感兴趣的蛋白质；和d)纯化并分级分离感兴趣的蛋白质以获得每个感兴趣分子的蛋白质N联聚糖的平均唾液酸含量增加的级分。本发明进一步提供了一种降低在细胞中重组表达的蛋白质上的LacdiNAc结构的平均含量的方法，所述方法包括在所述细胞中过表达α-2，3-唾液酸转移酶。在某些实施方案中，所述细胞是含有可表达形式的编码腺病毒E1A蛋白的核酸序列的真核细胞。在某些实施方案中，所述方法进一步增加所述蛋白质的平均唾液酸含量。在某些实施方案中，所述蛋白质是红细胞生成素。发明详述本发明发现并描述了作为含有N联聚糖的蛋白质的一种模型蛋白质的红细胞生成素(EPO)，当在表达E1A的细胞优选PER.C6细胞中产生时，可以获得唾液酸化显著增强的组合物，本发明还揭示了获得这种EPO组合物的方法。本发明揭示的实施方案提供了从表达E1A的细胞中获得EPO的方法，其中获得的EPO含有令人惊奇的每个EPO分子的高平均唾液酸含量(13-15)，及令人惊奇的使用本发明的方法可获得与商购制品相似体内生物学活性的EPO。这是迄今为止在表达E1A的细胞中产生EPO的糖基化模式的描述中未曾预料的结果(WO03/038100)。本发明示出在表达E1A的细胞如永生化人胚胎视网膜细胞中表达的重组蛋白质的糖基化可以通过代谢和遗传工程而加以改变，以增加半乳糖基化及任选唾液酸化。这个发现在本发明中通过提供在表达E1A的细胞中生产重组蛋白质、获得产生的蛋白质的希望的新的糖形(glycoforms)的新方法而实施。当与在这种细胞中通过已知方法产生的相同蛋白质比较时，这些蛋白质的新的糖形可用于其它目的。因此，在本发明的某些方面中，提供了在细胞中产生感兴趣的蛋白质的方法，所述细胞表达至少腺病毒E1A蛋白及从编码所述感兴趣的蛋白质的核酸序列中表达所述感兴趣的蛋白质，所述核酸序列在异源启动子的控制下，所述细胞进一步从在异源启动子控制下的编码所述糖基转移酶的核酸序列中表达至少一种糖基转移酶，所述感兴趣的蛋白质包含至少一个N联聚糖，所述方法包括在无血清培养基中优选以悬浮方式培养所述细胞，使得重组蛋白质在所述细胞中表达。所述糖基转移酶优选是哺乳动物糖基转移酶，更优选是人糖基转移酶。在优选的实施方案中，所述糖基转移酶是唾液酸转移酶，优选选自α-2，6-唾液酸转移酶和α-2，3-唾液酸转移酶。可以使用的及涵盖在本发明术语“表达E1A的细胞”或者“含有可表达形式的编码腺病毒E1A蛋白的核酸序列的细胞”范围内的表达腺病毒E1A的细胞优选是哺乳动物细胞，包括人来源的细胞，且优选是永生化的。在优选的实施方案中，这些细胞也表达腺病毒的E1B。例子是包含E1的A549细胞(见例如WO98/39411)、293细胞(Grahametal.，1977)、表达E1的羊水细胞(Schiedneretal.，2000；见用腺病毒E1序列对原代羊水细胞进行永生化的美国专利6,558,948)、及表达E1的视网膜细胞如PER.C6细胞(美国专利5,994,128)。它们可优选衍生自胚胎视网膜细胞。优选地，本发明的细胞是人细胞。本发明最优选的细胞衍生自原代人视网膜细胞(人胚胎视网膜细胞，也称作HER细胞)。用腺病毒E1序列对这种细胞的永生化例如在美国专利5,994,128、Byrdetal，1982，1988及Gallimoreetal，1986中描述。原代HER细胞可分离自胎儿(Byrdetal，1982，1988)。永生化HER细胞，包括优选的PER.C6细胞，是通过使用质粒转染原代HER细胞而产生的，所述质粒含有在人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子控制下的腺病毒血清型5(Ad5)E1A-和E1B-编码序列(Ad5核苷酸459-3510)(见美国专利5,994,128)。在优选的实施方案中，所述细胞进一步含有可表达形式的编码至少一种腺病毒E1B蛋白、优选E1B55K和E1B19K这两种蛋白质的核酸。E1B蛋白质的表达可阻止细胞凋亡。为了通过细胞培养而实现重组蛋白质的大规模(连续)生产，优选所述细胞不需要贴壁就能生长。本发明的细胞具有这种能力。对于本发明的方法和应用最优选的细胞是PER.C6细胞。用于本申请目的的PER.C6细胞应是在ECACC中以96022940号保藏的细胞的上游或下游传代或者上游或下游传代的后代的细胞(见例如美国专利5,994,128)。PER.C6细胞与例如也已经用腺病毒E1区永生化的转化人293细胞相比在操纵性能方面更好一些。对PER.C6细胞已经进行了鉴定并且广泛证实，因为它们在方法升级、悬浮生长和生长因子非依赖性方面表现明显更好。特别是PER.C6细胞可以高度可再生方式悬浮培养，使其非常适于大规模生产。另外，已经鉴定了在可以生长至极高密度的生物反应器中生长的PER.C6细胞系。PER.C6细胞在工业方法中的应用已经广泛描述，例如Nicholsetal，2002及特别针对重组蛋白质产生，例如Yallopetal，2005a和2005b所述。本发明的细胞、特别是PER.C6细胞具有的另外优势是其可以在没有动物或人衍生的血清或者动物或人衍生的血清成分的情况中培养。因此较容易分离，同时由于培养物中没有额外的人或动物蛋白质而增加了安全性，该系统非常可靠(合成培养基的再现性极佳)。另外，如本文所示，无血清培养基的使用对产生的重组蛋白质的糖基化模式具有阳性影响。另外，腺病毒早期区域1A(E1A)的存在与没有该特定基因的(人)细胞系相比又增加了额外优势。已知作为转录激活物的E1A增强从CMV立即早期基因的增强子/启动子的转录(Oliveetal.，1990，Gormanetal.，1989)。当要产生的重组蛋白质在CMV增强子/启动子的控制下时，在所述细胞中表达水平增加而在无E1A的细胞中则不增加。E1A的表达影响在这种细胞中产生的蛋白质的糖基化(WO03/038100)。N联聚糖是与多肽的天冬酰胺残基共价连接的糖链(Varkietal.1999)。N糖基化过程始于多萜醇寡糖前体与天冬酰胺前体的附着。这种前体随后被修饰为高甘露糖杂合体或者复杂类型的寡糖。在复杂类型的N联糖中，α3-和α6-连接的甘露糖残基均被N-乙酰基-葡糖胺(GlcNAc)残基取代。复杂类型的N-聚糖可含有称作天线(antennae)的2-5个具有GlcNAc的分支。复杂类型的N联糖的最终结构依赖于其附着的蛋白质、宿主细胞及培养宿主细胞的条件并变化很大。具有GlcNAc的分支可以用半乳糖(Gal)或N-乙酰-半乳糖胺(GalNAc)修饰，形成所谓的LacNAc或LacdiNAc结构。同样，具有GlcNAc的分支可含有多个LacNAc结构，形成所谓的多聚乳糖胺结构。末端半乳糖可以用α2，3-或α2，6-连接的唾液酸修饰，而末端N-乙酰-半乳糖胺仅可以用α2，6-连接的唾液酸修饰。将唾液酸加入末端Gal或GalNAc是通过唾液酸转移酶介导的。人基因组编码大概有20种以上的不同唾液酸转移酶(Harduin-Lepersetal.，2001)。它们在底物特异性、组织分布和多种生物化学参数方面不同。目前还没有描述人唾液酸转移酶可以连接唾液酸与α1，3-连接的岩藻糖修饰的LacNac或LacdiNAc结构。这种岩藻糖与GlcNAc残基连接，从而形成所谓的Lewisx结构。然而，唾液酸化的Lewisx(唾液酸-Lewisx)结构可能存在；它们是通过其中在用α1，3-连接的岩藻糖修饰GlcNAc之前将所述唾液酸与糖附着的方法形成的。唾液酸-Lewisx结构的形成依赖于岩藻糖基转移酶的类型。一些岩藻糖基转移酶仅使用非唾液酸化的LacNac或LacdiNAc结构作为底物，其它仅使用唾液酸化的LacNAc作为底物，第三组的α1，3岩藻糖基转移酶可以使用这两种结构作为底物。在表达E1A的细胞如PER.C6细胞中产生的重组蛋白质如重组人红细胞生成素(EPO)由于Gal的掺入低及由于存在α1，3-连接的岩藻糖而有时唾液酸化较差。本发明提供了一种增加在表达E1A的细胞如PER.C6细胞中产生的蛋白质的唾液酸含量的方法。在两个步骤中获得唾液酸化水平增加第一步包括增加半乳糖基化水平以为唾液酸化提供更多的(接受)位点。当调试PER.C6细胞适于在无血清培养基中悬浮生长时，发现半乳糖基化水平增加。第二步包括增加细胞催化唾液酸化过程的潜力，这通过过表达唾液酸转移酶而实现。由于在PER.C6细胞中表达的重组蛋白质的N联糖可能含有仅可以用α2，6-连接的唾液酸修饰的LacdiNAc结构，因此首先使用α2，6-唾液酸转移酶增加唾液酸化水平。然而，如下文示出，本文令人惊奇地发现并揭示了也可以使用α-2，3-唾液酸转移酶，这样导致产生的蛋白质上的LacdiNAc结构减少。因此，两方面看起来与增加在表达腺病毒E1A蛋白的细胞中产生的蛋白质的唾液酸化相关半乳糖基化的改良增加唾液酸化底物数目，并增加可利用的Gal和GalNAc底物的唾液酸化。本发明改良了目前描述的在表达E1A的永生化HER细胞中生产蛋白质的方法，这通过在这些细胞中过表达糖基化酶、优选唾液酸转移酶(遗传工程化)及通过在无血清培养基中优选悬浮培养这种细胞(代谢工程化)而实现。与目前描述的在不存在糖基转移酶过表达及在含血清培养基中以贴壁方式培养的细胞中进行的生产方法相比，通过组合这些措施，唾液酸化的成熟N联糖的形成可以显著改良。这两种措施即参与蛋白质翻译后修饰的酶的过表达及细胞在无血清培养基中悬浮生长中的每一种措施均有助于改良的最终结果，因此本发明还包括其中每次仅采用这两种措施中的一种措施的实施方案。当希望获得具有高度半乳糖基化及末端唾液酸化的N联糖的蛋白质时，最好组合本发明的这些措施。技术人员将明了这些措施可用于增加在本发明的细胞中产生的包含N联糖的任何蛋白质的N联糖的唾液酸化。在一个实施方案中，红细胞生成素(EPO)或其片段、其突变蛋白或其衍生物是根据本发明的方法产生的感兴趣的蛋白质。根据这种方法产生的EPO具有比在表达腺病毒E1A的细胞中产生的EPO更高的唾液酸含量，并因此更类似商购的EPO制品。商业的EPO制品通常是在CHO或BHK细胞中重组产生的，且分离的是含有高度唾液酸化的级分，因为增加的唾液酸化有益于所述蛋白质的半衰期，因此有益于发挥其提高血红蛋白和红细胞计数的治疗作用。因此，本发明的新细胞和方法提供了使用表达E1A的细胞如表达E1A的人胚胎视网膜细胞如PER.C6细胞重组产生半衰期增加的EPO的可能性。另外，所述方法得益于可以在本发明的细胞中的高水平生产。当然，在过表达唾液酸转移酶的表达E1A的细胞中产生的EPO或其它蛋白质也可以进行分级分离以进一步获得具有更高的唾液酸含量的级分，对于EPO商业制品也如此进行。一方面，本发明产生的EPO经阴离子交换柱纯化以获得高度唾液酸化的级分。本文示出使用这种方法，可以自表达E1A的细胞、特别是自表达E1A的永生化HER细胞获得具有令人惊奇的高平均唾液酸含量的EPO。在宿主细胞中产生蛋白质的方法已经充分确立并为本领域技术人员所已知。为此目的表达E1A的HER细胞的应用在WO00/63403中描述。通常，在宿主细胞中重组蛋白质的产生包括将可表达形式的核酸导入宿主细胞中，在有益于所述核酸表达的条件下培养该细胞，使得所述核酸在所述细胞中表达。或者，在希望的宿主细胞中天然表达但水平不足的蛋白质可以通过导入合适的调节序列如与希望的基因可操纵地连接的强启动子而增加其表达水平(见例如WO99/05268所述，其中内源EPO基因通过在人细胞中所述基因上游导入强启动子而被过表达)。所述蛋白质可以在细胞内表达，但优选分泌进培养基中。天然分泌的蛋白质如用于药物学应用的许多感兴趣的蛋白质含有引起产生的蛋白质分泌的分泌信号。如果需要，分泌信号也可以通过本领域已知的方法加入某些蛋白质中。编码蛋白质的可表达形式的核酸可以是表达盒形式，通常需要能引起所述核酸表达的序列，如增强子、启动子、聚腺苷酸化信号等。几种启动子可用于表达重组核酸，其包括病毒启动子、哺乳动物启动子、合成启动子等。在某些实施方案中，驱动感兴趣的核酸表达的启动子是CMV立即早期启动子，例如包含CMV立即早期基因增强子/启动子的-735至+95位核苷酸，这个启动子已经示出在表达腺病毒E1A的细胞中提供高表达水平(见例如WO03/051927所述)。感兴趣的核酸可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA、这些DNA组合等等。细胞培养基可得自多个供应商，现在无血清培养基经常用于细胞培养，因为它们比含有血清的培养基更明确。本发明的细胞在含血清培养基以及在无血清培养基中均生长良好。通常需要短时期使PER.C6细胞从含血清培养基如DMEM+9％FBS至适应无血清培养基。非常适用于本发明的无血清培养基的一个例子是EX-CELLTMVPRO培养基(JRHBiosciences，编号14561)。另一个例子是HyQCDM4RetinoTM(HyClone)。可以获得并使用其它的无血清培养基。本发明的细胞通常在含血清培养基中贴壁生长，但在无血清培养基中非常适应悬浮生长至高细胞密度(10×106细胞/ml及更高)，这意味着它们不需要附着的表面，而是在大多数时间保持彼此及与培养容器壁的相对游离。将本发明细胞培养至高密度和/或从这些细胞中获得极高产物产量的方法已经有描述(WO2004/099396)。改变细胞中产生的重组蛋白质的糖基化的遗传工程观念已经充分确立，例如在美国专利5,047,335中详细描述。在该专利中论述了遗传改变糖基化的一般观念，需要向宿主细胞中导入能表达至少一种酶的至少一个基因，所述酶选自糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、半乳糖基转移酶、β-乙酰半乳糖胺转移酶、N-乙酰糖胺转移酶基及磺基转移酶(在此统称作糖基化酶)，在所述细胞中表达足量的至少一种所述酶从而改变所述细胞产生的蛋白质的糖基化。在这个文献的实施例中，CHO细胞的糖基化被改变，这通过转染的大鼠α-2，6-唾液酸转移酶基因的重组表达、导致NeuAc-alfa-2，6Gal序列存在于细胞表面碳水化合物上而实现，而在没有转染的基因时，仅NeuAc-alfa-2，3Gal序列在这些细胞中产生。随后的研究确定糖基化工程可用于在宿主细胞中产生重组蛋白质(例如Grabenhorstetal.，1995；Minchetal，1995；Jenkinsetal，1998；Zhangetal，1998，Weikertetal，1999；Fukutaetal.，2000；Pratietal.，2000)。因此，如此的糖基化遗传工程方法充分确立并为本领域技术人员所已知，可为本发明有益地应用。本文示出表达E1A的细胞也可以被遗传工程化，因此可获得具有令人惊奇的高平均唾液酸含量的、作为糖基化蛋白质模型的重组EPO蛋白质的组合物。为此，将可表达形式的编码希望的糖基化酶的核酸导入本发明的细胞中，在本发明细胞培养期间当感兴趣的蛋白质被表达时所述希望的糖基化酶被表达。这导致与无重组糖基化酶在细胞中表达的情况相比，感兴趣的蛋白质的糖基化模式被改变。在优选的实施方案中，所述糖基化酶是唾液酸转移酶，更优选α-2，3-唾液酸转移酶和/或α-2，6-唾液酸转移酶。优选地，编码的糖基化酶是哺乳动物酶，更优选是人的酶。编码希望的糖基化酶的核酸优选在异源启动子控制下，所述启动子在本发明细胞中应是有活性的或者具有被调节的可能性。优选地，将编码糖基化酶的核酸整合进细胞基因组中，以保证稳定遗传，并为所述酶在随后的细胞世代中提供稳定表达。本文描述了将糖基化酶导入表达E1A的永生化HER细胞中。从实施例中可以看出，唾液酸转移酶的表达增加了在这些细胞中重组蛋白质的唾液酸化。另外，当表达唾液酸转移酶的表达E1A的细胞在本发明的无血清培养基中悬浮生长时，观察到在这些细胞中表达的重组蛋白质的N联聚糖的唾液酸化清楚显著增加，从下文实施例3可见。因此，在本发明方法的优选实施方案中，本发明的细胞包含可表达形式的编码糖基化酶、优选唾液酸转移酶如α-2，6-唾液酸转移酶的核酸，其例如在异源启动子即不是编码所述糖基化酶的基因的天然启动子的启动子的控制下。合适的α-2，6-唾液酸转移酶是人α-2，6-唾液酸转移酶，其序列由Grundmannetal，1990描述。在另一优选的实施方案中，所述细胞包含可表达形式的编码α-2，3-唾液酸转移酶的核酸，例如在异源启动子的控制下。所述α-2，3-唾液酸转移酶可例如是人α-2，3-唾液酸转移酶，称作SIAT4C或STZ(Genbank登记号L23767，也见于美国专利5,494,790)。如上述及WO03/038100所述，包含LewisX结构的EPO分子可以在表达腺病毒E1A序列的细胞如PER.C6细胞中适当产生。存在于糖蛋白如EPO的N联聚糖上的LewisX结构是在乳糖胺类型天线结构中包含与N-乙酰葡糖胺附着的α1，3-连接的岩藻糖的结构。有两种类型的LewisX结构一种具有末端半乳糖，一种具有末端N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基。这些末端基团可以或不与唾液酸连接；当与唾液酸连接时，LewisX结构是唾液酸-LewisX结构。因此，对于本发明，唾液酸-LewisX结构是LewisX结构的亚型。在WO03/038100中描述的包含具有LewisX结构的N联聚糖的蛋白质的一个优势是这种结构可有助于所述蛋白质与某些选择蛋白结合并提供抗炎性质。然而如上文所述，如果这种蛋白质包含增加的末端唾液酸化则对于增加半衰期及因此蛋白质在某些治疗应用中的效力也是有益的。例如，如WO03/038100所述在PER.C6细胞中产生的红细胞生成素(EPO)包含LewisX结构，但唾液酸水平低(见实施例8，表4)。本发明所述方法提供了获得包含LewisX结构及与其糖结构附着的唾液酸部分数目增加的蛋白质分子的可能性。本发明因此提供了一种包含一或多种同种型红细胞生成素(EPO)的组合物，所述红细胞生成素包含与其连接的聚糖，其中所述聚糖平均包含a)每个EPO分子至少1个LewisX结构，及b)每个EPO分子至少6个唾液酸部分。这种同种型的混合物可以通过在无血清培养基中悬浮培养的、进一步过表达唾液酸转移酶的PER.C6细胞中产生EPO而获得。先前揭示的在PER.C6细胞中产生EPO的方法(WO03/038100)产生包含LewisX结构但唾液酸量明显较低的EPO(见表4第1条)。所述组合物通常作为EPO同种型的混合物获得，但是本领域技术人员可以分离出单独的同种型，如美国专利5,856,298特别是其实施例1所述。在更优选的实施方案中，所述组合物平均包含每个EPO分子至少7个唾液酸部分，更优选每个EPO分子至少8个唾液酸部分。唾液酸部分主要作为末端唾液酸存在于N联聚糖上，但一些唾液酸可存在于O联聚糖上并组成所述组合物的平均唾液酸含量。在某些实施方案中，本发明的EPO分子包含3个N联聚糖。在某些实施方案中，本发明的EPO分子包含3个N联聚糖和1个O联聚糖。LewisX结构存在于EPO分子的N联聚糖上。本文示出在过表达唾液酸转移酶及在无血清培养基中悬浮培养的PER.C6细胞中表达时，获得平均具有每个EPO分子大约1.2-1.8个LewisX结构和大约9个唾液酸的EPO分子的组合物(见表4第2条)。在某些实施方案中，本发明因此提供了一种包含一或多种同种型红细胞生成素(EPO)的组合物，所述红细胞生成素包含与其连接的聚糖，其中所述聚糖平均包含a)每个EPO分子1-2个LewisX结构，及b)每个EPO分子8-10个唾液酸部分。这种组合物可用于进一步纯化及获得更优选的平均唾液酸含量仍较高的组合物。本发明因此还提供了包含一或多种同种型红细胞生成素(EPO)的组合物，所述红细胞生成素包含与其连接的聚糖，其中所述聚糖平均包含a)每个EPO分子至少0.5个LewisX结构，及b)每个EPO分子至少10个唾液酸部分。优选地，这种组合物平均包含每个EPO分子至少11个唾液酸部分。本文示出分离时可以获得平均包含每个EPO分子大约0.6个LewisX结构及大约12.6个唾液酸部分的EPO级分(见表4第3条)。在某些实施方案中，本发明因此提供了一种包含一或多种同种型红细胞生成素(EPO)的组合物，所述红细胞生成素包含与其连接的聚糖，其中所述聚糖平均包含a)每个EPO分子0.5-1个LewisX结构，及b)每个EPO分子11-13个唾液酸部分。对比之下，以同样方式分析的商购EPO制品不包含LewisX结构，平均每个EPO分子含有大约12.4个唾液酸(见表4第3条)。本发明提供了更优选的EPO组合物，其平均包含少于1个、优选少于0.5个、更优选少于0.3个Lewisx结构，在优选的实施方案中不包含Lewisx结构(或者至少在如本文所揭示方法的检测低限之下)，同时进一步平均包含每个EPO分子12-15、更优选13-15个唾液酸。在某些实施方案中，所述EPO平均含有每个EPO分子少于0.3个Lewisx结构至使用本发明所述方法不可检测到Lewisx结构及14-15个唾液酸。本发明的组合物优选包含5或更少个EPO同种型，其一共占所述组合物中存在的EPO的至少70％、优选至少80％，更优选包含4或更少个EPO同种型，其一共占所述组合物中存在的EPO的至少70％、优选至少80％。所述EPO组合物可以根据本文揭示的方法制备，根据本发明可以获得多种EPO组合物，其体内生物学活性各不相同，从少于10％至大约100％的EPOBRP标准或商购EPO制品。在某些实施方案中，根据Pharmacopoiea(PHEUR)标准方法测定由此获得的EPO具有1％-20％的体内生物学活性。在其它实施方案中，获得这些数值为20％-40％的制品，在另外的实施方案中，这些数值为40％-120％，优选60％-120％，更优选80％-120％。因此可以提供具有不同体内生物学红细胞生成活性和/或不同药动学的EPO制品系列。较低的红细胞生成形式(具有相对低的唾液酸含量)可适用于细胞保护目的，而较高的红细胞生成形式(具有相对高的唾液酸含量)适于红细胞生成以及细胞保护目的。对于后者而言，可有利地应用较高的唾液酸化形式，因为其半衰期延长及药动学性质改良，同时红细胞生成活性可被或不被削弱。具有削弱的红细胞生成活性的EPO的例子是如Leistetal(2004)所述EPO突变蛋白，例如EPOS100E或R103E，其不具有明显的红细胞生成活性但在细胞保护中仍具有作用这种EPO也可以根据本发明揭示的方法制备，从而改良施用后的半衰期。红细胞生成素优选是人红细胞生成素、人红细胞生成素的片段或人红细胞生成素的突变蛋白。这种红细胞生成素应优选是生物学活性的，这意味着其应具有至少一种如下活性a)导致骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞的产生，增加血红蛋白合成或铁的吸收(见例如美国专利4,703,008)(统称作红细胞生成活性)，和/或b)选自如下的应答性细胞保护性活性保护、维持、增强或恢复应答的哺乳动物细胞、组织或器官的功能或生存力(在本文有时统称作细胞保护性活性)，例如在WO00/61164和WO02/053580中所揭示。人红细胞生成素的序列已熟知(例如美国专利5,441,868；欧洲专利0411678，cDNAGenbank登记号MI1319)。结合EPO受体及具有与EPO相关的一些活性的EPO突变蛋白、类似物、肽或片段例如在美国专利5,457,089、4,835,260、5,767,078、5,856,292、4,703,008、5,773,569、5,830,851、5,835,382及国际出版物WO95/05465、WO97/18318和WO98/18926中描述，为了揭示具有生物学活性的EPO片段和EPO突变蛋白的目的，所述文献均并入本文作参考。本发明的EPO也可以被修饰，例如WO02/053580所述，通过对EPO分子中的一或多个赖氨酸进行氨甲酰化而修饰(见例如WO02/053580，Leistetal，2004)，这种修饰的EPO无红细胞生成活性，但保留其组织保护性活性。也已经发现某些EPO突变体具有这些性质(Leistetal，2004)，如在第100位的丝氨酸突变为谷氨酸的EPO(EPO-S100E)及第103位的精氨酸突变为谷氨酸的EPO(EPO-R103E)。这些及其它EPO突变体的目录在WO2004/003176中揭示，所述文献在此并入作参考。所有这些修饰的EPO分子及所有这些突变蛋白均包括在本发明红细胞生成素的范围中。在某些实施方案中，EPO是人EPO，其含有4个碳水化合物链。其中三个含有与天冬酰胺的N键，一个含有与丝氨酸残基的O-键。糖基化在EPO生物学活性中的重要性已经充分证实(Delormeetal.1992；Yamaguchietal.1991)。上述EPO组合物可以使用本文揭示的新方法获得。本发明因此进一步提供了一种获得包含一或多种同种型红细胞生成素(EPO)的组合物的方法，所述红细胞生成素包含与其连接的聚糖，其中所述聚糖包含平均每个EPO分子至少6个唾液酸及0-2个Lewisx结构，所述方法包括a)提供含有可表达形式的编码腺病毒E1A蛋白的核酸序列及进一步含有可表达形式的编码EPO的核酸的真核细胞，其中所述细胞进一步含有在异源启动子控制下的编码唾液酸转移酶、优选α-2，6-唾液酸转移酶或者α-2，3-唾液酸转移酶的核酸序列；b)在无血清培养基中培养所述细胞并使得EPO在所述细胞中表达；c)从所述细胞和/或培养基中收获表达的EPO；及d)纯化并分级分离EPO以获得每个EPO分子N联聚糖的平均唾液酸含量增加的级分，获得包含一或多种同种型EPO的组合物，所述EPO包含与其连接的聚糖，其中所述聚糖包含平均每个EPO分子至少6个唾液酸及0-2个Lewisx结构。所述唾液酸转移酶和所述E1A蛋白在细胞培养期间也被表达。在这个方法的某些实施方案中，使用本文例证的方法在EPO组合物中检测无Lewisx结构，意味着在分离自所述组合物的N联聚糖的MALDI-MS谱的平均值中没有10％或更高强度的峰包含Lewisx结构。在某些实施方案中，少于5％及在某些实施方案中获得的EPO制品中无一聚糖包含Lewisx结构。在其它实施方案中，获得本文所述多种EPO组合物之一。纯化及进一步分级分离EPO组合物、富集每个EPO分子平均唾液酸含量增加的EPO的方法[本发明方法步骤d)]为本领域技术人员所已知，包括例如阴离子交换层析、制备性等电聚焦(IEF)、层析聚焦、亲和层析例如使用凝集素的亲和层析、毛细管区带电泳(CZE)等。例如通过过表达糖基转移酶对本发明细胞系进行工程化的另一优势是由工程化的细胞产生的蛋白质上存在的聚糖天线(antennarity)通常增加，即通常存在更多的三或四天线结构。另外，由此产生的蛋白质上聚糖的复杂性(异质性)通常降低。这是有益的，因为增加的天线可改良蛋白质如EPO的半衰期和/或生物学活性(Takeuchietal，1989)，及对于调节和经济目的而言，希望产生的蛋白质上的聚糖混合物的复杂程度较低。因此，本发明还提供了一种增加在细胞中重组产生的蛋白质的聚糖的天线和/或降低异质性的方法，所述方法特征在于在所述细胞中过表达唾液酸转移酶。在某些实施方案中，所述细胞是表达腺病毒E1A的细胞，如表达E1A的HER细胞，如PER.C6细胞。在某些实施方案中，所述糖基转移酶是唾液酸转移酶，在某些实施方案中其选自α-2，3-唾液酸转移酶和α-2，6-唾液酸转移酶。所述唾液酸转移酶可以是人唾液酸转移酶，例如称作SIAT4C或STZ的人α-2，3-唾液酸转移酶(Genbank登记号L23767，也见美国专利5,494,790)。未曾预料地观察到如本文所述的糖基化工程化提供了有力的细胞培养方法，因为如此产生的重组蛋白质的糖基化性质在细胞培养条件改变时并不明显改变，而对于未工程化的细胞，培养条件改变通常会导致糖基化性质降低。因此，本发明一方面提供了增加糖蛋白在细胞中重组表达的过程的力度的方法，所述方法特征在于在所述细胞中过表达唾液酸转移酶。在某些实施方案中，所述细胞是表达腺病毒E1A的细胞，如表达E1A的HER细胞，如PER.C6细胞。在某些实施方案中，糖基转移酶是唾液酸转移酶，在某些实施方案中其选自α-2，3-唾液酸转移酶和α-2，6-唾液酸转移酶。所述唾液酸转移酶可以是人唾液酸转移酶，例如称作SIAT4C或STZ的人α-2，3-唾液酸转移酶(Genbank登记号L23767，也见美国专利5,494,790所述)。另外，本文示出与预期的相反，表达腺病毒E1A的细胞如PER.C6细胞(其产生在这种细胞中表达时通常在其聚糖中包含所谓LacdiNAc结构的重组蛋白质)可以通过过表达α-2，3-唾液酸转移酶而被工程化，由此观察到产生的蛋白质上高水平的唾液酸化而未观察到LacdiNAc结构。这是未曾预料的，因为认为LacdiNAc结构的形成不依赖于唾液酸化而发生。事实上，LacdiNAc在潜在地加入唾液酸之前形成。本文描述的新发现因此表明α-2，3-唾液酸转移酶的过表达间接抑制LacdiNAc结构的形成。本发明因此提供了一种降低在细胞中重组表达的蛋白质上LacdiNAc结构的平均含量及任选增加唾液酸平均含量的方法，所述方法包括在所述细胞中过表达α-2，3-唾液酸转移酶。在某些实施方案中，所述细胞是表达腺病毒E1A的真核细胞，如表达E1A的HER细胞，如PER.C6细胞。唾液酸转移酶的过表达可以如上述完成。在如上述培养所述细胞期间，所述细胞中唾液酸转移酶的过表达及感兴趣的蛋白质一起表达。所述感兴趣的蛋白质是当表达时含有至少一个N联聚糖的蛋白质。当在所述细胞类型中表达时，在其N联聚糖上含有至少可检测量的LacdiNAc结构，例如在如此产生的至少10％的蛋白质的至少一个N联聚糖上含有至少一个LacdiNAc结构。优选地，所述蛋白质上LacdiNAc结构的平均含量降低至少20％、更优选至少50％、更优选至少80％。最优选地，所述降低是所得蛋白质在其N联聚糖上含有使用本文所述的方法不可检测到量的LacdiNAc结构，例如在对分离自所述蛋白质的N联聚糖进行的MALDI-MS谱的平均值中，没有具有10％或更高强度的峰包含LacdiNAc结构。唾液酸转移酶优选由在异源启动子控制下的编码α-2，3-唾液酸转移酶的核酸编码，该核酸优选整合进细胞的基因组中。本发明的唾液酸转移酶在某些实施方案中是人α-2，3-唾液酸转移酶，如已知的SIAT4C或STZ(Genbank登记号L23767，也见美国专利5,494,790所述)。为了例证本发明，提供了如下实施例，但非限制本发明的范围。实施例实施例1通过过表达α2，6-唾液酸转移酶增加PER.C6细胞产生的EPO的唾液酸化为了确定α2，6-唾液酸转移酶的过表达对于在PER.C6细胞中产生的EPO的唾液酸化的作用，在过表达α2，6唾液酸转移酶的PER.C6细胞系PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10(见WO03/048348的实施例2所述，在此并入作参考)及不过表达α2，6-唾液酸转移酶的亲代细胞系PER.C6-EPO克隆25的贴壁培养物中产生EPO。首先将细胞在T形瓶中在DMEM+10mMMgCl2+9％FBS中培养。在细胞生长至60-70％铺满时，将含有血清的培养基用无血清的DMEM+10mMMgCl2更换。然后在37℃和10％CO2条件下继续培养3-4天。之后收获培养上清，使用WO03/038100(所述内容全文并入本文作参考)所述方法纯化及分析EPO。通过等电聚焦确定PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10及其亲代细胞系产生的EPO的唾液酸含量。从图1所示结果中可观察到，过表达α2，6-唾液酸转移酶的PER.C6细胞中产生的EPO的唾液酸含量高于不过表达α2，6-唾液酸转移酶的亲代PER.C6细胞系产生的EPO的唾液酸含量，表明α2，6-唾液酸转移酶的过表达导致PER.C6-产生的EPO的唾液酸化增加。实施例2通过将细胞适应在无血清培养基中悬浮生长使PER.C6细胞产生的EPO的半乳糖基化和岩藻糖基化水平增加使用产生EPO的稳定PER.C6细胞系PER.C6-022评价当贴壁培养细胞(使用实施例1所述方法)及当使细胞适应在无血清培养基中生长时EPO的半乳糖基化水平。对于后者，揭示了一种方法以在无血清培养基中悬浮培养PER.C6细胞以产生EPO。所述方法在下文描述及应用于一些产生EPO的PER.C6细胞系。使用PER.C6-EPO-022细胞产生具有N联聚糖结构的EPO，所述结构对于未修饰的PER.C6细胞是典型的，如WO03/038100所述。为了产生PER.C6-EPO，将上述细胞系适应无血清培养基，即Excell525(JRHBiosciences)。因此，首先在T80培养瓶中在DMEM+9％FBS+10mMMgCl2中培养细胞至形成70％-90％铺满的单层，之后根据常规培养技术用PBS洗涤及经胰蛋白酶消化。随后将细胞悬浮于DMEM+9％FBS+10mMMgCl2中并在台式离心仪中在1000rpm离心5分钟。弃去上清，将细胞再悬浮于无血清培养基Excell525+4mML-谷氨酰胺中，细胞密度为0.3×106细胞/ml。将25ml细胞悬浮液置于250ml摇瓶中，以100rpm在37℃及5％CO2条件下摇动。在达到≥1×106细胞/ml的细胞密度之后，将细胞进行亚培养。因此，将细胞在1000rpm旋转5分钟，悬浮于新鲜的Excell525+4mML-谷氨酰胺中，细胞密度为0.2或0.3×106细胞/ml，在摇瓶中在37℃、5％CO2及100rpm条件下进一步培养。为了产生EPO，将细胞移至无血清生产培养基即VPRO(JRHBiosciences)中，所述培养基支持PER.C6细胞生长至极高细胞密度(通常在一批培养物中＞107细胞/ml)。为此，首先将细胞在Excell525中培养至≥1×106细胞/ml，然后以1000rpm旋转5分钟，随后悬浮于VPRO培养基+6mML-谷氨酰胺中至密度为1×106细胞/ml。然后将细胞在摇瓶中在37℃、5％CO2及100rpm条件下培养7-10天。在此期间，细胞生长至＞107细胞/ml的密度。在细胞存活力开始下降之后收获培养基。将细胞以1000rpm旋转5分钟，使用上清量化和纯化EPO。EPO的浓度使用ELISA(R&Dsystems)确定，由PER.C6-EPO-022产生的EPO为14,044eU/ml。之后，如先前所述(WO03/038100，并入本文作参考)使用抗EPO抗体通过亲和层析纯化EPO。对由PER.C6细胞产生的EPO上N联聚糖的组成使用MALDI-MS进行分析。因此，使用MilliporeMicrocon10浓缩仪对糖蛋白样品进行浓缩并用20mM磷酸钠(pH7.2)缓冲置换，获得终浓度为大约1μg/μl。随后，将所述糖蛋白用PNGaseF消化，释放N联聚糖，将样品与神经氨酸酶一起保温，除去唾液酸残基。使用MALDI-MS分析不用进一步纯化的去唾液酸化的聚糖集合。以反射模式(reflectormode)在AppliedBiosystemsVoyagerDEPro质谱仪上进行阳离子MALDI-MS；使用2，5-二羟基苯甲酸作为基质(DHB，10mg/ml于50/50/0.1乙腈/水/三氟乙酸中)。使用DataExplorer软件中的函数和参数对用上述方法获得的质谱进行平滑化(smoothed)。首先，使用高级基线校正工具(peakwidth32，flexibility0.5，degree0.1)对质谱进行基线校正。之后，使用NoiseRemoval函数(stddevtoremove＝2)降低质谱中的噪音。图2示出在PER.C6细胞贴壁培养物及在无血清培养基中的PER.C6悬浮细胞培养物中产生的EPO上N联聚糖的代表性质谱模式。所述质谱显然不同，示出在悬浮培养物中产生的N联糖的质谱通常远大于在贴壁培养物中产生的那些，表明EPO在无血清培养基中悬浮培养的PER.C6细胞中更充分的糖基化。为了获得对在不同细胞培养条件下糖基化差异的更深入的了解，使用GlycoMod软件(www.expasy.ch/tools/glycomod)将聚糖组成和碳水化合物结构归于在质谱中观察到的峰。这个软件基本上预测了具有任何特定观察到的质量的聚糖结构上的N-乙酰-氨基己糖(HexNAc)、己糖(Hex)和脱氧己糖(dHex)的数目。使用这种方法，可以正确地将复杂类型的碳水化合物组成归于强度≥10％的所有峰。无迹象表明强度≥10％的任何峰均含有磷酸盐或硫酸盐。为了进一步预测碳水化合物的结构，假定N联糖均含有两个HexNAcs(2×GlcNAc)、三个己糖(3×甘露糖)和一个dHex(1×岩藻糖)的一个基本核心结构。这种假设基于通常已知的复杂类型N联糖的岩藻糖基化的核心结构(Varkietal.，1999)及基于如WO03/038100(并入本文作参考)所述的PER.C6产生的EPO上N-聚糖的序列数据，证实PER.C6产生的EPO上基本上所有N联聚糖均含有一个岩藻糖基化核心结构。PER.C6产生的EPO的质谱图(见例如图2)示出观察到的所有种类的糖均具有大于仅具有岩藻糖基化核心的相应糖的质量。因此，PER.C6产生的EPO的N-聚糖除了这种岩藻糖基化的核心结构之外，还含有其它HexNAc和/或Hex和/或dHex残基。这些残基形成复杂的N联糖的天线。假定任何额外的dHex残基均是α1，3-连接的岩藻糖，任何额外的Hex残基均是半乳糖，任何额外的dHex残基均是GlcNAc或GalNAc。这种假设基于由哺乳动物和人细胞产生的复杂类型的N联糖的通常已知结构(Varkietal.，1999)，基于如WO03/038100(并入本文作参考)所述的PER.C6产生的EPO上N-聚糖的序列数据及基于观察到PER.C6产生的EPO上N联糖可含有GalNAc(也在WO03/038100中描述，并入本文作参考)。基于上述假设，将推定的聚糖结构归于质谱中存在的强度≥10％的所有峰。随后使用相对峰高度确定不同种类聚糖的相对出现。由于参与GlcNAc-Gal(LacNAc)结构中的Gal残基的数目可以从推定的聚糖结构中推导出，因此可以计算PER.C6-EPO上存在的每个N联聚糖的Gal残基的平均数目(EPO含有3个N联聚糖，因此获得的数目可以乘以3以获得每个EPO分子这种残基的平均数)(见表1所示)。表1示出在适应无血清培养基(VPRO(S))中悬浮生长的细胞中产生的EPO中Gal残基的平均数明显高于在存在血清下(DMEM)贴壁生长的细胞产生的EPO中的相应残基数。因此可以推断半乳糖基化水平通过使细胞适应在无血清培养基中悬浮生长而被显著增加。表1示出参与GlcNAc-GalNAc(LacdiNAc)结构中的GalNAc残基的平均数目明显不受培养条件改变的影响。形成所谓Lewisx结构的推定的α1，3-连接的岩藻糖的平均数目适应在无血清培养基中悬浮培养的细胞中显著增加。这可以部分由这样的事实解释即在这些条件下半乳糖基化增加，由此导致其中可以加入α1，3连接的岩藻糖的更多GlcNAc-Gal序列形成。向其中可以加入α1，3连接的岩藻糖的另一结构是GlcNAc-GalNAc(LacdiNAc)。然而，增加的α1，3-岩藻糖基化似乎不是归因于LacdiNAc结构的出现增多，因为GalNAc残基的平均数不明显受改变培养条件的影响。Gal+GalNAc残基的平均数相应于可以向其中潜在地加入α1，3-连接的岩藻糖的LacNAc和LacdiNAc结构的平均数。当确定了Gal+GalNAc(LacNAc和LacdiNAc结构的一部分)的出现与Lewisx结构的出现之间的比率时(见表1)，可以推断当细胞在无血清培养基中悬浮生长时与细胞在存在血清下贴壁培养时相比，参与Lewisx结构的可用Gal+GalNAc残基多两倍以上。这表明在无血清培养基中悬浮培养的细胞中(α1，3)岩藻糖基化增加。实施例3在过表达α2，6-唾液酸转移酶并在无血清培养基中悬浮培养的细胞中唾液酸化水平进一步增加我们论述了在无血清培养基中悬浮培养物中半乳糖基化水平增加有益于在过表达α2，6-唾液酸转移酶的细胞中获得较高水平的唾液酸化，因为增加的半乳糖基化导致更多的唾液酸可以与之连接的GlcNAc-Gal结构形成。因此，使PER.C6-EPO克隆25-3.10适应在无血清培养基中悬浮培养，及如实施例2所述在VPRO培养基中产生EPO。基本如WO03/038100所述，使用等电聚焦分析EPO的唾液酸含量。不用Western印迹分析观察EPO，而将EPO用胶体蓝(colloidalblue，Novex)染色。条带代表含有每个EPO分子不同量的唾液酸的EPO同种型。将在过表达α2，6-唾液酸转移酶的PER.C6细胞中产生的EPO的唾液酸含量与Eprex及不过表达唾液酸转移酶的PER.C6细胞产生的EPO进行对比(图3)。结果表明过表达大鼠α2，6唾液酸转移酶的PER.C6细胞中产生的EPO较不过表达唾液酸转移酶的PER.C6中产生的EPO含有明显更多的唾液酸。特别地，在Eprex中存在的高度唾液酸化的EPO同种型在衍生自过表达唾液酸转移酶的PER.C6细胞的EPO制品中充分再现，而这些同种型在普通PER.C6细胞(即不过表达唾液酸转移酶)产生的EPO中未充分再现或不存在。也呈现出衍生自在VPRO中产生的PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10(该细胞已经适应在无血清培养基中悬浮生长)的EPO的唾液酸含量高于衍生自未适应无血清培养基的同样细胞系的EPO的唾液酸含量(图1与图3对比)。这表明适应在无血清培养基中悬浮生长及过表达α2，6-唾液酸转移酶均有助于唾液酸化水平的增加。实施例4PER.C6细胞中α2，6唾液酸转移酶的过表达导致α1，3岩藻糖基化降低在过表达α2，6-唾液酸转移酶的细胞即PER.C6-EPO-ST25-3.10细胞的无血清悬浮培养物及在其不过表达唾液酸转移酶的亲代细胞系即PER.C6-EPO克隆25中产生EPO以分析α2，6-唾液酸转移酶的过表达对于EPO的糖基化的作用。生产和分析N联聚糖的方法如实施例2所述。对聚糖的分析(表2)示出由过表达α2，6-唾液酸转移酶的细胞产生的EPO平均每个N联聚糖含有0.4-0.6个Lewisx结构，而由不过表达唾液酸转移酶的亲代细胞系产生的EPO平均每个N联聚糖含有0.9个Lewisx结构。这示出唾液酸转移酶的过表达导致α1，3-岩藻糖基化降低。提示负责加入α1，3-连接的岩藻糖的岩藻糖基转移酶与唾液酸转移酶竞争修饰末端GlcNAc-Gal和GlcNAc-GalNAc序列。实施例5α2，6唾液酸转移酶的过表达导致每N联聚糖具有高唾液酸含量为了确定α2，6-唾液酸转移酶的过表达对于PER.C6产生的EPO(PER.C6-EPO)的各个N联糖的唾液酸化的作用，监测PER.C6-EPO的N联糖的唾液酸含量。因此，基于电荷分离PER.C6-EPO的N联糖以区分含有0、1、2、3或4个唾液酸的糖。为此，浓缩衍生自过表达或不过表达α2，6-唾液酸转移酶的细胞的PER.C6-EPO样品，用20mM磷酸钠(pH7.2)缓冲置换，使用MilliporeMicrocon10浓缩仪浓缩至浓度为大约0.25-0.5μg/μl。随后，将糖蛋白用PNGaseF消化，释放N联聚糖。将释放的聚糖通过乙醇沉淀(75％v/v，4℃)从蛋白质中分离，在室温于SpeedVac离心机中干燥。接着，将所述聚糖于含有1M硼氢化氰(cyanoborohydride)的二甲亚砜-冰乙酸(30％v/v)的10μl邻氨基苯甲酸中溶解及用邻氨基苯甲酸(AA)标记。反应在65℃进行2小时，之后将标记混合物加到玻璃支持物中的纤维素平皿(直径1-cm)上。将该平皿用1ml96％(v/v)乙腈洗涤5次以除去AA及其它反应物。将标记的聚糖用水(0.5ml)洗涤3次而洗脱，在室温于SpeedVac离心机中干燥，之后进行分析。使用弱阴离子交换柱(Vydac，301VHP575P)在HPLC上以0.4ml/分钟的流速分离AA标记的聚糖，二元梯度为A(于水中20％的乙腈)和B(500mM乙酸铵pH5.0，20％乙腈)。使用这种方法，分离无、单、二、三和四唾液酸化的聚糖，这已经用已知的寡糖标准如NA2、A1、A2[F]、A3和A4F(GlykoInc.，OxfordGlycoSciences，amdDextra-Labs)证实。图4中的结果示出在过表达α2，6-唾液酸转移酶的PER.C6细胞中产生的N联糖与在不过表达α2，6-唾液酸转移酶的PER.C6细胞中产生的EPO的N联糖相比含有明显更多的唾液酸。这表明α2，6唾液酸转移酶的过表达与α2，6-唾液酸转移酶未过表达相比产生具有较多唾液酸含量的N联糖。实施例6通过离子交换层析分离高唾液酸化的PER.C6-EPO由PER.C6产生的高唾液酸化的EPO的分离基于离子交换(特别是阴离子交换)层析，在此期间将高唾液酸化的EPO分子从较低唾液酸化的分子中分离。首先，将根据实施例3所述方法由PER.C6-EPO-ST克隆25-3.10细胞产生的EPO通过亲和层析纯化，如WO03/038100所述使用EPO特异性E14单克隆抗体进行。在这个步骤中，将EPO用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)洗脱，通过加入磷酸钾缓冲液(pH8.0)立即中和。所得缓冲液随后使用Hiprep26/10脱盐柱置换为20mMTris、20μMCuSO4(pH7)。然后，将纯化的EPO加样于HiTrapQHP柱(Pharmacia)。首先将该柱用加样缓冲液(20mMTris，20μMCuSO4(pH7))洗涤，然后用浓度逐步增加的洗脱缓冲液(20mMTris，20μMCuSO4，1MNaCl)逐步洗脱。含有低或中等唾液酸含量的EPO首先用11.5％洗脱缓冲液(115mMNaCl)洗脱，高唾液酸化的EPO用25％洗脱缓冲液(250mMNaCl)洗脱。所得EPO级分的唾液酸含量使用实施例3所述的等电聚焦分析。图5示出分级分离的和未分级分离的PER.C6-EPO的唾液酸含量。结果示出分级分离程序使得高唾液酸化的EPO分子得以纯化和富集。图6示出为了进行质谱分析进行去唾液酸化的高唾液酸化的PER.C6-EPO级分的MALDI-MS质谱。基于实施例2所述假设对所述质谱进行的解释表明分级分离的、高唾液酸化的PER.C6-EPO制品主要含有四天线的、完全半乳糖基化的N联糖。对每个N联聚糖的Gal、GalNac和Lewisx结构的平均数进行量化表明源自EPO分子总集合中的分级分离的EPO分子含有较高平均数的Gal残基，但含有较低平均数的GalNAc和Lewisx结构(见表3所示)。这示出当使用离子交换层析对高唾液酸化的EPO分子基于其电荷进行分级分离和富集时，可以选择具有Gal残基数增加而GalNAc和Lewisx残基数减少的EPO分子。实施例7高唾液酸化的PER.C6-EPO的红细胞生成活性为了揭示PER.C6-EPO的唾液酸含量增加导致红细胞生成活性增加，在大鼠中研究如根据实施例4产生的高唾液酸化的PER.C6-EPO的红细胞生成活性。重组人EPO刺激红细胞产生的潜力可以在由Barboneetal.(1994)描述的啮齿动物模型中监测。根据这个模型，网织红细胞计数的增加用作重组人EPO制品的生物学活性的测量标准。网织红细胞是红细胞的前体，其应答EPO的产生可用作EPO刺激红细胞产生的潜力的测量标准。接着，红细胞的产生增加导致较高的血细胞比容值。在6组3只Wag/Rij大鼠中对比高唾液酸化的PER.C6-EPO与Eprex的活性。在第0、1和2天经阴茎静脉通过静脉内注射不同剂量的PER.C6-EPO、Eprex和用作阴性对照的稀释缓冲液。施用PER.C6-EPO和Eprex的剂量为1、5、25或者125eU(Elisa单位)，根据商购的EPO特异性R&DElisa试剂盒确定。将所有EPO制品在总体积为500μl的PBS/0.05％Tween80中稀释为合适的浓度。在第3天，通过舌穿刺取250μl的EDTA血样。同一天，确定总红细胞群中网织红细胞的百分比。或者，根据EuropeanPharmacopoeia(PHEUR01/20021316)所述在Normocythaemic小鼠中在体内生物学分析中测定红细胞生成活性(见实施例13所述)。实施例8通过等电聚焦和光密度分析确定PER.C6产生的EPO的唾液酸含量使用等电聚焦分析多种亲和纯化的PER.C6产生的EPO样品的唾液酸含量，所述分析在浸泡在含有8M尿素的pH3-10的两性电解质溶液中的IsoGel琼脂糖IEF平板(Cambrex)上进行。用胶体蓝(Novex)观察EPO条带。如图7所示，条带表示含有每个EPO分子不同数目唾液酸的EPO同种型。每个同种型的相对量使用光密度分析条带而确定。每个EPO分子的唾液酸残基的平均数使用下式计算Σn=0-15(An*n)]]>A＝每个同种型的相对量n＝同种型数目(相应于每个EPO分子唾液酸残基的数目)使用这种方法，发现由克隆PER.C6-EPO-022产生的EPO(如实施例2所述)及由PER.C6-EPO-ST细胞系克隆25-3.10产生的EPO(如实施例3所述)及在分级分离高唾液酸化的PER.C6-EPO-ST分子之后获得的EPO(如实施例6所述)以及EPREX的平均唾液酸含量分别为3.0、9.0、12.6和12.4。也可以使用另外的计算重组EPO级分的唾液酸含量的方法，例如美国专利5,856,298的实施例2所述方法，或者CA2309810A1的实施例5所述方法，或者Jourdianetal，JBiolChem.246，430(1971)所述方法，或者对本领域技术人员已知的这些方法的修改方法。实施例9EPO-ST3表达载体的构建为了构建同时表达EPO和α2，3-唾液酸转移酶的表达载体，将EPO编码序列通过PCR扩增(正向引物5’-CCAGGCGCGCCACCATGGGGGTGCACGAATGTCC-3’(SEQ.ID.NO.1)，反向引物5’-CCGGGTTAACTCATCTGTCCCCTGTCCTGC-3’(SEQ.ID.NO.2))。将所得PCR片段用AscI和HpaI消化，插入表达质粒pcDNA3002Neo的相同限制位点中，产生载体pCP-EPO(图8A)。将人α2，3-唾液酸转移酶编码序列(称作SIAT4C或STZ的基因；GenBank登记号no.L23767，也见美国专利5,494,790所述)通过PCR扩增(正向引物5’-GGACTAGTGGATCCGCCACCATG-3’(SEQ.ID.NO.3)，反向引物5’-GCTCTAGATCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3’(SEQ.ID.NO.4))，用BamHI和XbaI消化，插入pCP-EPO的BamHI和NheI位点中。所得载体称作pEPO-ST3(图8B)。实施例10pEPO-ST3在PER.C6细胞中的瞬时表达在转染前一天，将PER.C6细胞以3千5百万个细胞/瓶的密度接种在T175培养瓶中，在含有10mMMgCl2和9％胎牛血清的DMEM中、在37℃和10％CO2条件下培养。利用本领域技术人员已知的技术，根据厂商指导使用Lipofectamine(Gibco)，用28μg/瓶的pEPO-ST3(见实施例9，图8B)或者pCP-EPO(作为对照；见实施例9，图8A)进行转染。在转染3或4天后，收获培养上清，通过离心和过滤澄清。上清中的EPO浓度通过ELISA(使用购自R&Dsystems的试剂盒)确定，将EPO通过亲和层析纯化。纯化的EPO样品的浓度通过HPLC确定，随后将18μg纯化的EPO样品通过等电聚焦(IEF)分析，以分离EPO同种型(图9)。发现用pEPO-ST3构建体瞬时转染的PER.C6细胞产生唾液酸化水平显著增加的EPO(与没有α2，3-唾液酸转移酶的对照构建体pCP-EPO相比)。这表明与α-2，6-唾液酸转移酶相同，α2，3-唾液酸转移酶的共表达也可用于增加在PER.C6细胞中产生的EPO的唾液酸化水平。实施例11pEPO-ST3在PER.C6细胞中的稳定表达亲代克隆的转染、分离和筛选通过从单一质粒pEPO-ST3中表达人EPO及人α-2，3唾液酸转移酶而生产可产生高唾液酸化的红细胞生成素(EPO)的PER.C6克隆(见实施例9)。为了获得稳定克隆，用构建体pEPO-ST3进行基于lipofectAMINE的转染。在补加了10％胎牛血清的含有选择剂Geneticin(终浓度为0.5mg/ml)的DMEM(Gibco)中选择稳定克隆。在开始转染3周后，长出Geneticin-抗性克隆。选择共479个克隆进行分离。将分离的克隆在选择培养基中培养，直至在96孔平板中达到70-90％铺满。在从96孔平板向24孔平板传代期间，收获上清并在2-8℃贮存直至进行筛选。使用EPO特异性ELISA(QuantikineIVDHumanEpoImmunoassay，manufacturersprotocol)对346个克隆的上清筛选EPO的产生。发现克隆之间的表达水平在背景水平之间变化，超过400eU/ml/天。选择15％的最高等级克隆和15％的随机选择的克隆(产生超过50eU/ml/天但低于15％最高生产者的克隆)进行亚培养，产生共103个克隆。在细胞扩增期间，确定选择的克隆的平行培养物以确定EPO水平。使用这个第二次筛选的信息选择50个克隆。克隆在含血清培养基中的生产力和性质在T80培养瓶中开始对这些克隆进行贴壁培养，以产生进行纯化/分析的材料。将细胞在补加了10％胎牛血清的DMEM中培养3-5天。然后，收获材料。培养上清中存在的EPO的量为541-3783eU/ml。在通过亲和层析纯化EPO之后，通过如前述等电聚焦凝胶电泳分析样品。代表性结果示于图10。一些克隆未显示出EPO的唾液酸化水平明显增加(例如第9-12泳道)，但可以看出一些分析的克隆产生的EPO与未过表达α-2，3-唾液酸转移酶产生的EPO相比具有明显改良的唾液酸化(即平均更多的EPO同种型具有高数目的唾液酸)(例如泳道2、3，特别是泳道13和14)。显然，对一些克隆进行筛选足以鉴别具有希望的唾液酸化水平增加的克隆。总之，从单一质粒中共表达人EPO和人α-2，3-唾液酸转移酶与仅表达EPO的克隆相比产生EPO分子的唾液酸化水平增加的克隆。实施例12过表达唾液酸转移酶的PER.C6细胞中EPO在无血清培养基中的稳定表达产量及性质在稳定转染的PER.C6细胞中2，6EPO和2，3EPO的产生在这个实施例中，EPO是在无血清悬浮培养的、稳定转染的过表达唾液酸转移酶的PER.C6细胞(α-2，6-唾液酸转移酶或α-2，3-唾液酸转移酶，见上述实施例；这种细胞被称作PER.C6-ST细胞)中重组产生的。将产生的EPO制品分别称作2，6EPO和2，3EPO，而在不过表达唾液酸转移酶的PER.C6细胞中产生的EPO称作PER.C6-EPO。预培养将含有冷藏的产生EPO的PER.C6-ST细胞的安瓿在含有Mab培养基的Erlenmeyer摇瓶中解冻。将摇瓶培养物保持在轨道摇床上的湿化温箱中(37℃、5％CO2、100RPM)。每2-3天将细胞通过离心用完全培养基更新进行亚培养。每次传代的目标接种密度为0.2-0.3×106存活细胞/ml。制备分批方法中生产接种物为了制备接种物，在VPRO培养基中进行最后的预培养传代。将在Mab培养基中预培养的表达EPO的PER.C6-ST细胞通过离心进行亚培养，并将完全培养基更换为VPRO培养基。目标接种细胞密度为0.4-0.6×106存活细胞/mL，将摇瓶培养物保持在轨道摇床上的湿化温箱中(37℃、5％CO2、100RPM)。在保温3-4天后，将培养物用作分批生产的接种物。或者，在Mab培养基中制备接种物。在这种情况中，将在Mab培养基中预培养的细胞通过离心及以0.2-0.3×106存活细胞/mL的目标细胞密度接种在含有Mab培养基的摇瓶或生物反应器中进行亚培养。将摇瓶培养物保持在轨道摇床上的湿化温箱中(37℃、5％CO2、100RPM)。生物反应器的设定如下温度保持在37℃，溶解氧浓度(dO2)通过喷射O2控制在50％空气饱和度，接种时培养物pH通过在顶部加入CO2控制在7.3以下。pH值无低限。在保温2-3天后，将培养物用作分批生产的接种物。分批生产在VPRO培养基中的分批培养是通过将在VPRO培养基中制备的接种物在新鲜VPRO培养基中稀释、或者在接种物是在Mab培养基中制备的情况中通过离心将完全培养基更换为VPRO培养基而起始。分批培养是在摇瓶或生物反应器中以0.2-0.4×106存活细胞/mL的目标接种密度开始。将摇瓶培养物保持在轨道摇床上的湿化温箱中(37℃、5％CO2、100RPM)。生物反应器的设定如下温度保持在37℃，溶解氧浓度(dO2)通过喷射O2控制在50％空气饱和度，接种时培养物pH通过在顶部加入CO2控制在7.3以下。pH值无低限。收获在达到最大存活细胞密度之后1天收获表达EPO的PER.C6-ST细胞培养物；典型地在开始分批培养后5-9天之间收获。通过ELISA根据细胞系、特定克隆及培养形式确定的EPO浓度范围在大约1000-10000ELISA单位/mL(1ELISA单位(eU)相应于大约5-10ng)。材料的收获通过在300g离心5分钟(Heraeus，Multifuge)，随后经一次性粗净化滤膜(Millipore，ClarigardOpticapXL，3μm)澄清及一次性细滤膜(Sartorius，Sartopore2，0.8/0.45μm)过滤，从粗制的分批收获物中除去细胞。纯化及阴离子交换在与CNBr-激活的Sepharose4B(AmershamBiotech)柱结合的90mlCV小鼠单克隆抗-EPO(IgG1)上以5ml/分钟的流速从过滤的批次中纯化EPO。如实施例6所述通过阴离子交换进行洗脱和分级分离。将所有分级分离的和未分级分离的材料通过大小排阻层析柱(HiPrep26/10)均移至标准贮存缓冲液(StandardStorageBuffer，于PBS中的0.03％Tween80、0.5％甘氨酸，pH7.4)中。在缓冲置换后，将样品经0.2μm滤膜(Pall，AcrodiscPN4908)过滤灭菌。Source15Q分级分离将纯化的材料使用Hiprep26/10脱盐柱(GEHealthcare)经20mMTris/20μMCuSO4pH8.0缓冲置换。在加样之后，用20mMTris/20μMCuSO4、50mMNaClpH6.0洗涤Source15Q柱(Amersham)，随后用增加量的于20mMTris/20μMCuSO4pH6.0中的(1M)NaCl洗脱。使用5-15％、15-25％、25-30％、30-50％及50-100％梯度。集合在250-300mMNaCl洗脱的级分。使用如实施例3所述IEF分析EPO级分的唾液酸含量。分析后，集合级分。如此获得的2，6EPO的平均唾液酸含量为12.1，如此获得的2，3EPO的平均唾液酸含量为12.7。MALDI分析根据实施例2所述方法产生并分析2，3EPO的MALDI谱(见图11)。表5示出与PER.C6-EPO的相比，2，3EPO的N联糖的一些特性。对N联糖进行分析表明与PER.C6-EPO相比，2，3EPO含有相对更多的三和四天线糖。这表明α-2，3-唾液酸转移酶的过表达导致N联糖的更完全的分支。另外，在2，3EPO中不能检测到Lewisx，表明α-2，3-唾液酸转移酶的过表达导致α-1，3-岩藻糖基化实际上被完全抑制。此外，发现PER.C6-EPO含有大量的二天线岩藻糖基化的LacdiNAc结构(m/z值为2185.05，见实施例2)，这些结构在2，3EPO中不存在。这表明α-2，3-唾液酸转移酶的过表达导致LacdiNAc结构的形成被抑制。分级分离的2，3EPO和2，6EPO的分析通过SDS-PAGE分析表明与商购的EPO(EprexTM)相比略低的表观分子量，通过PNGaseF除去N联聚糖后这种差异消失。另外，通过大小排阻层析(HP-SEC)分析表明与Eprex相比，2，6EPO和2，3EPO的保留时间略增加，除去N联聚糖后这种差异消失。如实施例2所述方法制备MALDI谱。与2，6EPO和PER.C6EPO相反，在2，3EPO中在≥10％强度未观察到含有LewisX的峰。在2，3EPO和2，6EPO中在≥10％强度未检测到含有乳糖胺重复的峰。实施例13EPO的生物学活性测试PER.C6EPO(于无血清培养基中的不过表达唾液酸转移酶的PER.C6细胞产生，如实施例2所述)及2，3EPO和2，6EPO(如实施例12产生)的体外和体内生物学活性。体外生物学活性通过测定与EPOBRP(EPO参考标准)相比刺激UT-7细胞增殖的能力而测试。与EPO-BRP相比，PER.C6EPO、PER.C62，3EPO和PER.C62，6EPO分别具有60％、129％和94％的相对能力，提示产生的EPO在体外的全部功能性。PER.C6EPO、PER.C62，3EPO和PER.C62，6EPO的体内生物学活性根据EuropeanPharmacopoeia(PHEUR01/20021316)所述在Normocythaemic小鼠中在体内生物分析中测试。如表6所示，PER.C6EPO的体内活性低于检测极限，而2，6EPO和2，3EPO的体内活性分别为EPOBRP(参考标准)的15％和32％。这些制品的药动学与体内活性一致，2，3EPO和2，6EPO的曲线介于PER.C6EPO(最低曲线)与EPOBRP(最高曲线)之间，2，3EPO与2，6EPO(未示出)相比具有较长的半衰期(及在曲线下较大的面积)。显然，在过表达α-2，6-唾液酸转移酶或α-2，3-唾液酸转移酶的PER.C6细胞中产生的EPO与在不过表达唾液酸转移酶的PER.C6细胞中产生的EPO相比具有明显增加的体内生物学活性。实施例14获得并测试唾液酸含量增加的EPO在实施例13中所示，获得的α-2，3-唾液酸化增加的EPO(2，3EPO)具有改良的体内生物学活性，但与具有相似唾液酸含量的标准(EPOBRP)相比仍然活性较低。测试具有仍然进一步增加的唾液酸含量的级分是否可以得自在PER.C6-ST细胞中产生的材料，及这种级分与起始物相比是否示出进一步改良的体内生物学活性。如实施例12所述产生一批新的2，3EPO及进行亲和纯化。为了富集具有较高唾液酸含量的级分，使用如下所述的两种可选择的制备性等电聚焦(IEF)方法。或者使用制备性大小排阻层析(HP-SEC)。Ultrodex纯化将亲和纯化的材料在制备性IEF凝胶上以低pH范围((Ultrodex，pH3-5；AmershamBiosciences)在存在5M尿素的条件下进一步分离。样品被分离成同种型。从Ultrodex中通过用0.5MTris-HClpH8.0洗脱提取同种型。集合级分并用PBS透析。加入Tween-80和甘氨酸至终浓度分别为0.03％(v/v)和0.5％(w/v)，将制品过滤灭菌(0.22μmMillex-GV滤膜，Millipore)。Rotofor纯化或者，使用制备性IEF(Rotofor，Biorad)进一步分离亲和纯化的材料。将2.5-5mg纯化的EPO加样于Rotofor中，在低pH范围pH2-4于5M尿素中分离同种型。这样产生最多10种具有不同同种型的级分。集合适当的级分。将这些集合的级分用PBS透析。加入Tween-80和甘氨酸至终浓度分别为0.03％(v/v)和0.5％(w/v)，将制品过滤灭菌(0.22μmMillex-GV滤膜，Millipore)。使用如实施例3所述的IEF分析EPO不同级分的唾液酸含量，示于下表。在制备性IEF或HP-SEC之后具有平均SA(唾液酸)含量的样品在IEF凝胶上，样品2，3EPO-1和2，3-EPO-2在PER.C6EPO(平均SA为3.1)和Eprex(平均SA为12.4)旁边电泳，如图12所示。根据PHEUR01/20021316所述，在Normocythaemic小鼠中在体内生物分析中测试如此获得的唾液酸含量为14.3的EPO(PER.C62，3EPO-2，大约产量为3％)的体内生物学活性。这种制品的特异性活性为113.881IU/mg[95％置信区间94836-139361IU/mg]，这个结果与测试的商购Epo制品(EprexTM，其在活性和唾液酸含量方面与EPOBRP标准类似)相似。这些实验表明使用表达E1A的细胞和本发明的方法可以获得具有与商业EPO制品相似体内生物学活性的EPO。表表1表1PER.C6-产生的EPO上存在的每个N联聚糖的Gal、GalNAc和Lewisx结构的平均数。EPO是以贴壁培养(DMEM)或在无血清VPRO培养基(VPRO[S])中悬浮培养产生的。最后一列表示末端Gal+GalNac残基的平均数与Lewisx结构的平均数的比率。表2表2过表达α2，6唾液酸转移酶的PER.C6细胞(即PER.C6-EPO-ST克隆25-3.20)或不过表达α2，6唾液酸转移酶的PER.C6细胞(即PER.C6-EPO克隆25)中产生的EPO上存在的每个N联聚糖的Lewisx结构的平均数。表3表3在无血清悬浮培养的过表达α2，6唾液酸转移酶的PER.C6细胞中产生的EPO分子总和及在其高唾液酸化的EPO级分中发现的每个N联聚糖的Gal、GalNAc和Lewisx结构的平均数，使用实施例4所述方法获得。表4.表4不同EPO制品的聚糖上LewisX和唾液酸含量(见实施例8)。含量是对于每个EPO分子而言。表5表5如实施例2和12所述，从亲和纯化的PER.C6-EPO和2，3EPO的MALDI谱中计算的每个EPO分子的N联聚糖的天线及平均Lewisx含量。表6.表6.在Normocythaemic小鼠中的体内活性(见实施例13)CI置信区间参考文献ByrdP，BrownKW，GallimorePH.1982.Malignanttransformationofhumanembryoretinoblastsbyclonedadenovirus12DNA.Nature29869-71.ByrdPJ，GrandRJA，GallimorePH.1988.DifferentialtransformationofprimaryhumanembryoretinalcellsbyadenovirusE1regionsandcombinationsofE1A+ras.Oncogene2477-484.DelormeE，LorenziniT，GiffinJ，MartinF，JacobsenF，BooneT，ElliotS(1992)Roleofglycosylationonthesecretionandbiologicalactivityoferythropoietin.Biochemistry31，9871-9876.FukutaK，AbeR，YokomatsuT，KonoN，AsanagiM，OmaeF，MinowaMT，TakeuchiM，MakinoT(2000)Remodelingofsugarchainstructuresofhumaninterferon-γ.Glycobiology4412-430.Gallimore，P.H.，Grand，R.J.A.andByrd，P.J.(1986).Transformationofhumanembryoretinoblastswithsimianvirus40，adenovirusandrasoncogenes.AntiCancerRes.6，p499-508.GoldwasserE，EliasonJF，SikkemaD(1975)Anassayforerythropoietininvitroatthemilliunitlevel.Endocrinology97，315-23.GormanCM，GiesD，McCrayG，HuangM(1989)Thehumancytomegalovirusmajorimmediateearlypromotercanbetrans-activatedbyadenovirusearlyproteins.Virology171，377-385.GrabenhorstE，HoffmannA，NimtzM，ZettlmeisslG，andConradtHS(1995)ConstructionofstableBHK-21cellscoexpressinghumansecretoryglycoproteinsandhumanGal(β1-4)GlcNAc-Rα2，6-sialyltransferase.Eur.J.Biochem.232718-725.GrahamFL，SmileyJ，RusellWCandNaimR(1977)CharacteristicsofahumancelllinetransformedbyDNAfromhumanadenovirustype5.J.Virol.36，59-74GrundmannU，NehrlichC，ReinT，ZettlmeisslG(1990)CompletecDNAsequenceencodinghumanbeta-galactosidealpha-2，6-sialyltransferase.NucleicAcidsRes.18667.Harduin-LepersA，Vallejo-RuizV，Krzewinski-RecchiMA，Samyn-PetitB，JulienS，andDelannoyP(2001)Thehumansialyltransferasefamily.Biochimie83727-737.JenkinsN，BuckberryL，MarcA，MonacoL(1998)Geneticengineeringofalpha2，6-sialyltransferaseinrecombinantCHOcells.BiochemSocTrans.26，S115.LeistM，etal(2004)Derivativesoferythropoietinthataretissueprotectivebutnoterythropoietic.Science305，239-242.MinchSL，KallioPT，BaileyJE(1995)TissueplasminogenactivatorcoexpressedinChinesehamsterovarycellswithalpha(2，6)-sialyltransferasecontainsNeuAcalpha(2，6)Galbeta(1，4)Glc-N-AcRlinkages.BiotechnProg.11，348-351.NicholsWW，LardenoieR，LedwithBJ，BrouwerK，ManamS，VogelsR，KaslowD，ZuidgeestD，BettAJ，ChenJandothers.2002.Propagationofadenoviralvectors；useofPER.C6cells.InCurielD，DouglasJT，editors.Adenoviralvectorsforgenetherapy.SanDiegoElsevier.p129-167.OliveDM，Al-MullaW，SimsekM，ZarbanS，al-NakibW(1990)Thehumancytomegalovirusimmediateearlyenhancer-promoterisresponsivetoactivationbytheadenovirs-513SE1Agene.ArchVirol.112，67-80.PratiEGP，MatasciM，SuterTB，DinterA，SburlatiAR，andBaileyJE(2000)Engineeringofcoordinatedup-anddown-regulationoftwoglycosyltransferasesoftheO-glycosylationpathwayinChinesehamsterovary(CHO)cells.Biotech.andBioeng.68239-244.SchiednerG，HertelSandKochanekS(2000)EfficienttrarsformationofprimaryhumanamniocytesbyE1functionsofAd5generationofnewcelllinesforadenoviralvectorproduction.Hum.Gene.Ther.11，2105-2116.TakeuchiM，InoueN，StricklandTW，KubotaM，WadaM，ShimizuR，HoshiS，KozutsumiH，TakasakiS，KobataA(1989)RelationshipbetweensugarchainstructureandbiologicalactivityofrecombinanthumanerythropoietinproducedinChinesehamsterovarycells.ProcNatlAcadSciUSA.86，7819-7822.VarkiA，CummingsR，EskoJ，FreezeH，HartGandMarthJ(1999)Essentialsofglycobiology.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork.WeikertS，PapacD，BriggsJ，CowferD，TomS，GawlitzekM，LofgrenJ，MehtaS，ChisholmV，ModiN，EpplerS，CarrollK，ChamowS，PeersD，BermanP，KrummenL(1999)EngineeringChines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