由于和功能域抗体缀合而具有提高的血清半衰期的plad功能域肽的制作方法

专利名称：：由于和功能域抗体缀合而具有提高的血清半衰期的plad功能域肽的制作方法由于和功能域抗体缀合而具有提高的血清半衰期的PLAD功能域肽相关申请本申请是2005年11月10日提交的国际申请PCT/GB2005/004319的部分继续，其指定了美国；而且是2005年5月31日提交的国际申请PCT/GB2005/002163的部分继续，其指定了美国，其要求2004年12月2日提交的美国临时专利申请60/632,361的利益，在此将上述申请的全部教导引入作为参考。
背景技术：
：许多药物具有能用于治疗和/或诊断目的的活性，但由于给药时，它们迅速地从机体排除，因此具有有限的价值。例如，许多具有治疗用途活性的多肽通过肾脏迅速地从循环中清除。因此，为了获得想要的治疗效果，必须给药大剂量。需要改良的治疗与诊断剂，其具有改良的药学动力学特性。能结合血清白蛋白的多肽是本领域已知的。(参见，例如，EP0486525Bl(CemuBioteknikAB);US6，267，964Bl(Nygren等);WO04/001064A2(Dyax，Corp.);WO02/076489Al(Dyax，Corp.);WO01/45746(Ge腦tech，Inc.))。发明概述本发明涉及包含PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的药物组合物、融合体与缀合物。一个方面，本发明是一种药物融合体，其包括X，与Y，部分，其中X，是PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体；Y，是具有结合位点的多肽结合部分，该结合位点能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽。在一些实施方案中，多肽结合部分特异性结合血清白蛋白。例如，多肽结合部分可以是抗体的抗原结合片段，该抗体能特异性结合血清白蛋白。PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体优选包括至少大约10个连续氨基酸的区域，其与选自TNRR1、TNFR2、FAS、LT卩R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40与DR4的PLAD功能域的PLAD功能域的氨基酸序列中的氨基酸相同。例如，PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的氨基酸序列与选自TNFR1、TNFR2、FAS、LT卩R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40与DR4的PLAD功能域的PLAD功能域的氨基酸序列具有至少大约90%的氨基酸序列同一性。在另一个例子中，所述的PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的氨基酸序列与选自SEQIDNO:87、SEQIDNO:88、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDNO:91、SEQIDNO:92、SEQIDNO:93、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96和SEQIDNO:97的氨基酸序列具有至少大约卯％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，药物融合体包括X，与Y，部分，其中X，是PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体；Y，是特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白重链可变区，或特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白轻链可变区。在这些实施方案中，X，可位于Y，的氨基端，或Y，可位于X，的氨基端。优选地，重链可变区与轻链可变区特异性结合人血清白蛋白。在某些实施方案中，Y，包括选自SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25与SEQIDNO:26的氨基酸序列。在其他的实施方案中，Y，包括选自SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22与SEQIDNO:23的氨基酸序列。PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体优选包括至少大约10个连续氨基酸的区域，所述氨基酸与选自TNFR1、TNFR2、FAS、LT|3R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40与DR4的PLAD功能域的PLAD功能域的氨基酸序列中的氨基酸相同。例如，PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的氨基酸序列与选自TNFRl、TNFR2、FAS、LTpR、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40与DR4的PLAD功能域的PLAD功能域的氨基酸序列具有至少大约90%的氨基酸序列同一性。在另一个例子中，所述的PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的氨基酸序列与选自SEQIDNO:87、SEQIDNO:88、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDNO:91、SEQIDNO:92、SEQIDNO:93、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96和SEQIDNO:97的氨基酸序列具有至少大约90%的氨基酸序列同一性。其他的方面中，本发明是一种药物缀合物，其包括特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白重链可变区，或特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白轻链可变区，和与所述免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区共价键合的PLAD功能域，或PLAD功能域的功能性变体。在一些实施方案中，PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体与所述免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区通过连接体部分共价键合。在某些实施方案中，特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白重链可变区，或特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白轻链可变区，包括选自SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22与SEQIDNO:23的氨基酸序列。PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体优选包括至少大约10个连续氨基酸的区域，所述氨基酸与选自TNFR1、TNFR2、FAS、LTpR、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40与DR4的PLAD功能域的PLAD功能域的氨基酸序列中的氨基酸相同。例如，PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的氨基酸序列与选自TNFRl、TNFR2、FAS、LT卩R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40与DR4的PLAD功能域的PLAD功能域的氨基酸序列具有至少大约90%的氨基酸序列同一性。在另一个例子中，所述的PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的氨基酸序列与选自SEQIDNO:87、SEQIDNO:88、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDNO:91、SEQIDNO:92、SEQIDNO:93、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96和SEQIDNO:97的氨基酸序列具有至少大约90%的氨基酸序列同一性。本发明还涉及一种编码本发明的药物融合体的分离的或重组的核酸与核酸构建体。本发明还涉及一种包含本发明的重组核酸的宿主细胞，而且涉及一种生产药物融合体的方法，其包括在适于所述重组核酸表达的条件下保持宿主细胞，借此生产药物融合体。本发明还涉及一种药物组合物，其包括本发明的药物融合体或药物缀合物与生理学上可接受的载体。本发明还涉及一种治疗患有炎性疾病的个体的方法，包括对所述个体给药治疗有效量的本发明的药物缀合物或药物融合体。在特定的实施方案中，炎性疾病是关节炎。本发明还涉及药物缀合物或药物融合体在治疗，诊断或预防中的应用，和涉及使用本发明的药物缀合物或药物融合体用于制造治疗炎性疾病，如这里公开的疾病的药物(例如关节炎)。本发明还涉及包括PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的药物组合物，该PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体与具有结合位点的多肽结合部分连接，该结合位点能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽，与所述的PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体相比，其中所述的药物组合物具有较长的体内血清半衰期，而且具有所述PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的至少大约90%的活性。本发明涉及包括PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体与能延长体内血清半衰期的多肽的缀合物或融合蛋白。例如，血清白蛋白，白蛋白片段或白蛋白变体，或者新的Fc受体。在缀合物中，PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体与能延长体内血清半衰期的多肽，可以如这里所述的直接或间接并且共价或非共价地缀合结合。在融合蛋白中，PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体与能延长体内血清半衰期的多肽，能以单拷贝或多拷贝并以任何所需的方向存在。附图简述图1A是通过结合小鼠血清白蛋白(MSA)选择的三个V,s的氨基酸序列的序列比对。比对的氨基酸序列来自于指定为MSA16，其也称为DOM7m-16(SEQIDNO:1)，MSA12，其也称为DOM7m画12(SEQIDNO:2)，以及MSA26，其也称为DOM7m画26(SEQIDNO:3)的VKS。图IB是通过结合老鼠血清白蛋白(RSA)选择的六个VKS的氨基酸序列的序列比对。比对的氨基酸序列来自于指定为DOM7r-l(SEQIDNO:4)、DOM7r國3(SEQIDNO:5)、DOM7r陽4(SEQIDNO:6)、DOM7r-5(SEQIDNO:7)、DOM7r画7(SEQIDNO:8)以及DOM7r-8(SEQIDNO:9)的VKS。图1C是通过结合人血清白蛋白(HSA)选择的六个VKS的氨基酸序列的序列比对。比对的氨基酸序列是来自于指定为DOM7h-2(SEQIDNO:10)、DOM7h誦3(SEQIDNO:11)、DOM7h画4(SEQIDNO:12)、DOM7h-6(SEQIDNO:13)、DOM7h-l(SEQIDNO:14)以及DOM7h-7(SEQIDNO:15)的VkS。图ID是通过结合人血清白蛋白与共有序列(SEQIDNO:23)选择的七个VHS的氨基酸序列的序列比对。比对的氨基酸序列是来自于指定为DOM7h画22(SEQIDNO:16)、DOM7h画23(SEQIDNO:17)、DOM7h画24(SEQIDNO:18)、DOM7h國25(SEQIDNO:19)、DOM7h誦26(SEQIDNO:20)、DOM7h-21(SEQIDNO:21)以及DOM7h誦27(SEQIDNO:22)的VHS。图IE是通过结合人血清白蛋白与老鼠血清白蛋白选择的三个VKS的氨基酸序列的序列比对。比对的氨基酸序列是来自于指定为DOM7h-8(SEQIDNO:24)、DOM7r-13(SEQIDNO:25)和DOM7r-14(SEQIDNO:26)的VkS。图2A和2B是分别用于表达MSA16IL-lra(也称为DOM7m-16/IL-lra)和IL-lraMSA16(也称为IL画lra/DOM7m隱16)融合体的载体的图谱。图2C-2D示例了编码IL-lraMSA16融合体(也称为IL-lra/DOM7m-16)的核苷酸序列(SEQIDNO:27)以及该融合体的氨基酸序列(SEQIDNO:28)。图2E-2F示例了编码MSA16IL-lra融合体(也称为DOM7m-16/IL-lra)的核普酸序列(SEQIDNO:29)以及该融合体的氨基酸序列(SEQIDNO:30)。图2G-2H示例了编码不与血清白蛋白结合的DummylL-lra融合体的核苷酸序列(SEQIDNO:31)以及该融合体的氨基酸序列(SEQIDNO:32)。图3A示例了IL-1诱导了通过Hela细胞产生IL-8，而且示例了在ELISA分析中检测到IL-8的机制。图3B的图表显示了，通过MRC-5细胞，IL-lra(，标记的"R&D")，MSA16IL-lra(■)与IL-lraMSA16(▲)每个都抑制IL-1诱导的IL-8的分泌。观察到的抑制是IL-lra，MSAl6IL-lra和IL-lraMSA16剂量依赖的。图4A-4C的图表显示了，通过培养的MRC-5细胞，在分析中IL國lra()与MSA16IL-lra(■)都抑制了IL-1诱导的IL-8的分泌，其包括没有小鼠血清白蛋白(4A)，5%小鼠血清白蛋白(4B)或100/。小鼠血清白蛋白(4C)。观察到的抑制在所有测试条件下都是IL-lra和MSA16IL-1ra剂量依赖的。图5是ELISA结果的图示，其证实了MSA16ILl-ra融合体与IL-lraMSA16融合体都结合血清白蛋白，但是虚构的ILl-ra融合体不结合血清白蛋白。图6A-6C的sensograms与表格显示了，与人血清白蛋白(HAS)结合的克隆DOM7h-l(6A)，与HAS结合的DOM7h-7(6B)，以及与老鼠血清白蛋白(RSA)结合的DOM7r-l(6C)的BIACORE亲和性数据。图7的表格显示了DOM7h画l、D0M7r誦l、DOM7h國2、DOM7r-3、DOM7h-7、DOM7h-8、DOM7r-8、DOM7r画13、DOM7M4、DOM7m画16、DOM7h-22、DOM7h-23、DOM7h-26、DOM7r國16、DOM7m-26、DOM7r-27以及DOM7R-31对它们结合的血清白蛋白的亲和性。DOM7h-8也结合猪血清白蛋白，而且亲和性(KD)为60nM。图8A图示了编码人白细胞间介素1受体拮抗剂(IL-lra)的核酸的核苷酸序列(SEQIDNO:33)，该人白细胞间介素1受体拮抗剂(IL-lra)在GenBank以登录号NM_173842保存。该核酸的开放阅读框从第65位开始。图8B示例了由图8A中所示的核酸(SEQIDNO:33)编码的人IL-lra的氨基酸序列(SEQEDNO:34)。该成熟蛋白由152个氨基酸残基组成(SEQIDNO:34的26-177位氨基酸残基)。图9显示了单次静脉(i.v.)注射(剂量为大约1.5mg/kg)到CD1林雄性动物中后，小鼠血清中结合dAb/HA抗原表位标签融合蛋白的MSA的浓度(ng/mL)随时间(天)变化的曲线图。使用山羊抗-HA(Abeam，UK)捕获和蛋白质L-HRP(Invitrogen，USA)检测试剂，通过ELISA来测定血清浓度。在存在lx小鼠血清以确保与测试样品的可比性时，建立已知浓度的结合dAb/HA融合体的MSA的标准曲线。用一个区室模型(WinNonlinSoftware,PharsightCorp.，USA)进行模拟，显示结合dAb/HA抗原表位标签融合蛋白的MSA具有29.1小时的末期tl/2，与559hr>g/mL曲线下的面积。图IO示例了通过结合老鼠血清白蛋白(RSA)选择的V^的氨基酸序列。示例的序列来自于指定为DOM7r-15(SEQIDNO:37)、DOM7r-16(SEQIDNO:38)、DOM7r-17(SEQIDNO:39)、DOM7r-18(SEQIDNO:40)、DOM7r國19(SEQIDNO:41)的VKS。图11A-11B示例了结合老鼠血清白蛋白(RSA)的V朋的氨基酸序列。示例的序列是来自于指定为DOM7r-20(SEQIDNO:42)、DOM7r-21(SEQIDNO:43)、DOM7r画22(SEQIDNO:44)、DOM7r-23(SEQIDNO:45)、DOM7r-24(SEQIDNO:46)、DOM7r-25(SEQIDNO:47)、DOM7r誦26(SEQIDNO:48)、DOM7r画27(SEQIDNO:49)、DOM7r-28(SEQIDNO:50)、DOM7r-29(SEQIDNO:51)、DOM7r腸30(SEQIDNO:52)、DOM7r誦31(SEQIDNO:53)、DOM7r-32(SEQIDNO:54)以及DOM7r國33(SEQIDNO:55)的VHS。图12显示了单次静脉(i.v.)注射(剂量为大约1.5mg/kg)到CD1林雄性动物中后，D0M7m-16、DOM7m-26或不结合MSA的对照dAb的浓度随时间变化的曲线图，其中D0M7m-16，DOM7m-26或不结合MSA的对照dAb每个都含有HA抗原表位标签。使用山羊抗-HA(Abeam，UK)捕获和蛋白质L-HRP(Invitrogen,USA)检测试剂，通过ELISA来测定血清浓度。在存在lx小鼠血清以确保与测试样品的可比性时，建立已知浓度的结合dAb/HA融合体的MSA的标准曲线。用一个区室模型(WinNonlinSoftware,PharsightCorp"USA)进行模拟，显示对照dAb具有20分钟的末期tl/2p，而DOM7m-16，DOM7m-26在血清中持续的显著更长。图13的图表显示了，在小鼠胶原质诱导的关节炎(CIA)模型中，DOM7m-16/IL-lra治疗关节炎比IL國lra或ENBREL(entarec印t;ImmunexCorporation)更有效。诱导关节炎，而且从第21天开始，用0.4mg/Kg(类固醇)的地塞米松、1mg/Kg的(IL-lra/抗-SAlmg/kg)或10mg/Kg(IL-lra/抗-SA10mg/kg)的DOM7m-16/IL陽lra、1mg/Kg或10mg/Kg的IL-lra、5mg/Kg的ENBREL(entarecept;ImmunexCorporation)或盐处理小鼠。结果显示，在该研究中DOM7m-16/IL誦lrat匕IL-lra或ENBREL(entarecept;imm[upsilonnexCorporation)更有效。对IL-lra的应答是剂量依赖的，如所预期的，对DOM7m-16/IL-lra的应答也是剂量依赖的。用1mg/Kg的DOM7m-16/IL-lra处理的平均分数始终如一地4氐于用10mg/kg的IL-lra处理获得的平均分数。该结果表明，在该研究中用DOJVHm-16/IL國lra处理比IL國lra有效10倍。图14A-14G示例了皂草素多肽的氨基酸序列，图14A示例了以Swissprot登录号P27559保藏的皂草素-2前体的氨基酸序列(SEQ1DNO:56)。信号肽是SEQIDNO:56的1-24位氨基酸。图14B示例了以Swissprot登录号P27560保藏的皂草素-3的氨基酸序列(SBQIDNO:57)。图14C示例了以Swissprot登录号P27561保藏的皂草素-4前体的氨基酸序列(SEQIDNO:58)。信号肽为SEQIDNO:58的第1-24位氨基酸。图14D示例了以Swissprot登录号Q41389保藏的皂草素-5的氨基酸序列(SEQIDNO:59)。图14E示例了以Swissprot登录号P20656保藏的皂草素-6前体的氨基酸序列(SEQIDNO:60)。信号肽为SEQIDNO:60的笫1-24位氨基酸，而且可能的前肽propeptide为SEQIDNO:60的第278-299位氨基酸。成熟多肽为SEQIDNO:60的第25-277位氨基酸(SEQIDNO:61)。图14F示例了以Swissprot登录号Q41391保藏的皂草素-7的氨基酸序列(SEQIDNO:62)。图14G示例了包括急草素-6的几个变体和同工型的共有氨基酸序列(SEQIDNO:63)。图15示例了WO2004/041862中所述的结合小鼠血清白蛋白的几个Cfl附e/,V/K冊的氨基酸序列。序列A(SEQIDNO:68)、序列B(SEQIDNO:69)、序列C(SEQIDNO:70)、序列D(SEQIDNO:71)、序列E(SEQIDNO:72)、序列F(SEQIDNO.73)、序列G(SEQIDNO:74)、序列H(SEQIDNO:75)、序列I(SEQIDNO:76)、序列J(SEQIDNO:77)、序列K(SEQIDNO:78)、序列L(SEQIDNO:79)、序列M(SEQIDNO:80)、序列N(SEQIDNO:81)、序列O(SEQIDNO:82)、序列P(SEQIDNO:83)、序列Q(SEQIDNO:84)。发明详述在该说明书中，已经以能撰写清楚和简明的说明书的方式描述了实施方案，但是它的目的是，而且应当理解，实施方案可以进行各种组合或分开，而不背离本发明。具有与本发明的任何一个实施方案相同的结构式的已知组合物本身被明确地放弃。相反，新的组合物，已知组合物的新组合，已知组合物的新用途或者包括已知组合物的新的方法都不被放弃。如这里使用的，"药物"指任何化合物(例如，小的有机分子，核酸，多肽)，其给药给个体以通过结合和/或改变个体中的生物学靶分子的功能，而产生有利的治疗或诊断效果。靶分子可以是由个体的基因组编码的内源耙分子(例如，由个体的基因组编码的酶，受体，生长因子，细胞因子)，或者由病原体的基因组编码的外源靶分子(例如，由病毒，细菌，真菌，线虫类或其它的病原体编码的酶)。如这里使用的，"药物组合物"指包括与多肽结合部分共价或非共价键合的药物的组合物，其中多肽结合部分含有能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽的结合位点(例如，抗原结合位点)。药物组合物可以是缀合物，其中药物与多肽结合部分共价或非共价键合。药物可与多肽结合部分直接或间接地共价或非共价键合(例如，通过合适的连接体和/或互补结合伴体(例如，生物素和抗生物素蛋白)的非共价键合)。当应用互补结合伴体时，一个结合伴体可直接与药物共价键合或通过合适的连接体部分与药物结合，而且互补结合伴体可与多肽结合部分直接共价键合或通过合适的连接体部分与多肽结合。当药物时多肽或肽时，药物组合物可以是融合蛋白，其中多肽或肽药物与多肽结合部分是连续多肽链的离散部分(moieties部分)。如这里使用的"缀合物"指包括抗体的抗原结合片段的组合物，该抗体结合与药物结合的血清白蛋白。这种缀合物包括"药物缀合物"，其包括抗体的抗原结合片段，该抗体结合与药物共价键合的血清白蛋白，以及"非共价药物缀合物"，其包括抗体的抗原结合片段，该抗体结合与药物非共价键合的血清白蛋白。如这里使用的，"药物缀合物"指包括抗体的抗原结合片段的组合物，该抗体结合与药物共价键合的血清白蛋白。药物可直接或通过合适的连接体部分间接与抗原结合片段共价键合。药物可在任何合适的位置与抗原结合片段结合，例如，氨基-末端，羧基端或通过合适的氨基酸侧链(例如，赖氨酸的S氨基)。如这里使用的，"非共价药物缀合物"指包括抗体的抗原结合片段的组合物，该抗体结合与药物非共价键合的血清白蛋白。药物可直接(例如，静电作用、疏水作用)或间接(例如，通过互补结合伴体(例如，生物素和抗生物素蛋白)的非共价键合，其中一个伴体与药物共价键合，而且互补结合伴体与抗原结合片段共价键合)与抗原结合片段非共价键合。当使用互补结合伴体时，一个结合伴体可直接或通过合适的连接体部分与药物共价键合，而且互补结合伴体可直接或通过合适的连接体部分与结合血清白蛋白的抗体的抗原结合部分共价键合。如这里使用的，"药物融合体"指融合蛋白，其包括结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段和多肽药物。结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段和多肽药物以一个连续多肽链的离散部分(moieties部分)存在。如这里使用的术语"药物基础"指基于用于分析，测定或确定活性的药物(或药物部分)的量标准化的药物组合物和药物的活性。一般，本发明的药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)的分子量比它们包含的药物的分子量大。因此，按重量计算，等量的药物组合物和药物，将包含不同分子或摩尔基础量的药物。例如，如果本发明的药物组合物的分子量是它包含的药物的分子量的两倍，可以使用2吗的药物组合物和ljig药物，根据"药物基础"来测定活性，因为这些量将包含相同量的药物(与游离药物或药物组合物的部分)。使用适当的计算，例如，通过根据每个靶结合位点基础表示活性，或对于酶药物根据每个活性位点基础，可以对活性进行标准化，并以"药物基础"表示。如这里使用的"白细胞间介素1受体拮抗剂"(IL-lra)指天然存在的或内源的哺乳动物IL-lra蛋白，以及具有与天然存在的或内源的相应哺乳动物IL-lra蛋白相同的氨基酸序列的蛋白质(例如，重组蛋白、合成蛋白(也即，使用合成有机化学方法产生的))。因此，如这里限定的，该术语包括IL-lra的成熟蛋白，多态或等位基因变体，以及其它的同工型(例如，通过选择性剪接或其它的细胞方法产生的)，以及前述的修饰或非修饰形式(例如，脂质化、糖基化、PEG化)。天然存在的或内源IL-lra包括野生型蛋白，如天然存在于哺乳动物(例如，人或非人的灵长类动物)中的成熟IL-lra，多态或等位基因变体以及其它同工型。这种蛋白质例如可从天然产生IL-lra的来源重新获得或分离。这些蛋白质，和具有与天然存在的或内源的相应IL-lra相同的氨基酸序列的IL-lra蛋白，以相应的哺乳动物的名称称呼。例如，当相应的哺乳动物是人时，该蛋白质指定为人IL-lra。IL-lra的"功能性变体"包括可使用合适的方法(例如，突变(例如，化学突变，辐射突变)，重组DNA技术)产生的功能性片段，功能性突变蛋白，和/或功能性融合蛋白。"功能性变体"拮抗白细胞间介素-l型l受体。一般，相对于成熟IL-lra，IL-lra的片段或部分包括具有氨基酸(也即一个或多个氨基酸)缺失和/或添加(也即，一个或多个缺失和/或添加)的那些IL-lra(如N-端、C-端或内部缺失)。相对于成熟IL-lra，其中只缺失连续氨基酸或其中只缺失非连续氨基酸的片段或部分也是预见的。人IL-lra的功能性变体可与成熟的152个氨基酸形式的人IL-lra具有至少大约80%,或至少大约85%，或至少大约90%，或至少大约95%,或至少大约96%，或至少大约97%，或至少大约98%,或至少大约99%的氨基酸序列同一性，并拮抗人白细胞间介素-1型1受体。(参见，Eisenberg等，Nature343:341-346(1990).)变体可包括一个或多个添加的氨基酸(例如，包括153或154或多个氨基酸)。例如，变体IL-lra的氨基酸序列包括氨基端的曱硫氨酸残基，后面是SEQIDNO:33的26到177残基。(KINERET(anakinra)，AmgenInc.)。如这里使用的"皂草素"指由植物肥皂草(^/7omrn'fl^/"7r"//s)产生的单链核糖体非活性多肽家族。(Stirpe，F.，等，Biochem.JJl6:617-625(1983)，Bagga，S.等，J.Biol.Chem.278:4813-4820(2003).).皂草素多肽以长度和/或氨基酸序列不同的几种形式存在。(参见，例如，Id.和Barthelemy，I，等，J.Biol.Chem.268:6541-6548(1993).)。皂草素-6是最有活性的皂草素形式。(Bagga，S.等，J.BioI.Chem.278:4813-4820(2003))。已经描述了至少4种天然存在的皂草素-6的同工型，其中成熟多肽(SEQIDNO:61)的第48位氨基酸是Asp或GIu，成熟多肽(SEQIDNO:61)的第91位氨基酸是Arg或Lys。(Barthelemy,I.等，J.Biol.Chem.268:6541-6548(1993).)其它形式的皂草素-6包括多肽，其中成熟多肽(SEQIDNO:61)的第99位氨基酸是Ser或Leu;成熟多肽(SEQIDNO:61)的笫134位氨基酸是Gln或Lys;成熟多肽(SEQIDNO:61)的笫147位氨基酸是Ser或Leu;成熟多肽(SEQIDNO:61)的第149位氨基酸是Ser或Phe;成熟多肽(SEQIDNO:61)的笫162位氨基酸是Asp或Asn;成熟多肽(SEQIDNO:61)的第177位氨基酸是Ala或Val;成熟多肽(SEQIDNO:61)的第188位氨基酸是lie或Thr;成熟多肽(SEQIDNO:61)的第196位氨基酸是Asn或Asp;成熟多肽(SEQIDNO:61)的笫198位氨基酸是Glu或Asp;成熟多肽(SEQIDNO:61)的第231位氨基酸是Asn或Ser;成熟多肽(SEQIDNO:61)的第233位氨基酸是Lys或Arg。包括这些同工型和变体的共有序列如图14G所示(SEQIDNO:63)。因此，术语"皂草素"包括前体蛋白、成熟蛋白、天然蛋白、多肽或等位基因变体，和其它的同工型(例如，通过选择性剪接或其它的细胞方法产生的)，以及前述的修饰或非修饰形式(例如，脂质化、糖基化、PEG化)，包括天然存在的，合成的或重组产生的多肽。天然存在的或内源皂草素包括野生型蛋白如成熟皂草素(例如，成熟皂草素-6)，天然存在于肥皂草中多态或等位基因变体和其它的同工型。这些蛋白质可使用任何合适的方法从肥皂草重新获得或分离。皂草素的"功能性变体"包括可使用合适的方法(例如，突变(例如，化学突变，辐射突变)，重组DNA技术)产生的功能性片段，功能性突变蛋白，和/或功能性融合蛋白。一般，相对于成熟皂草素，皂草素(例如，皂草素-5)的片段或部分包括具有氨基酸缺失和/或添加(也即，一个或多个氨基酸缺失和/或添加)的那些皂草素(如N-端，C-端或内部缺失)。相对于成熟皂草素，其中只缺失连续的氨基酸，或其中只缺失非连续的氨基酸的片段或部分也是预见的。可以制备皂草素的各种功能性变体。例如，已经制备了含有氨基-末端延伸的皂草素-6的融合蛋白，而且显示在兔网状细胞溶解产物分析中保持全部的核糖体抑制活性。(Barthelemy，L等，J，BiolChem.268:6541-6548(1993).)。变体或皂草素-6是一个活性位点残基，Tyr72，TyrUO,Glul76，Arg179或Trp208(SEQIDNO:61的笫72、120、176、179或208位氨基酸)被丙氨酸取代，而且其在离体分析中细胞毒性降低。(Bagga，S.等，J，BiolChan.278:4813-4820(2003).)。因此，如果需要制备皂草素另外的功能性变体，应该避免活性位点残基的突变，置换，取代，缺失或修饰。优选地，含有比天然存在的成熟多肽少的氨基酸的皂草素的功能性变体，至少包括活性位点。例如，皂草素-6的变体，其含有比天然存在的成熟皂草素-6少的氨基酸，包括成熟皂草素-6的活性位点残基(Tyr72、Tyrl20、Glul76、Arg179和Trp208(SEQIDNO:61的第72、120、176、179和208位氨基酸))，而且长度为至少大约137个氨基酸，长度为至少大约150个氨基酸，长度为至少大约175个氨基酸，长度为至少大约200个氨基酸，长度为至少大约225个氨基酸，或长度为至少大约250个氨基酸。皂草素的"功能性变体"具有核糖体灭活活性(例如，rRNAN-糖苷酶活性)和/或细胞毒性。这种活性可使用任何合适的方法分析，如胞系^任何熟知细胞毒素分析。(参见，例如，Bagga，;.4，J.BiolChem.278:4813画4820(2003)和Barthelemy,I，等，J.BiolChem.268:6541-6548(1993).)在一些实施方案中，皂草素的功能性变体与成熟皂草素-6(SEQIDNO:61)具有至少大约80%，或至少大约85%，或至少大约90%，或至少大约91%,或至少大约92n/，或至少大约93%,或至少大约94%,或至少大约95%,或至少大约96%,或至少大约97°/，或至少大约98%，或至少大约99%的氨基酸序列同一性。本发明涉及包括药物和药物结合部分的药物组合物，该多肽结合部分含有能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽的结合位点(例如，抗原结合位点)。如这里关于药物组合物详细所述的，该药物组合物包括特异性结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段，药物与多肽结合部分可彼此共价或非共价键合。在一些实施方案中，药物组合物是包括多肽药物与多肽结合部分的融合蛋白，该多肽结合部分含有一个能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽的抗原结合部分。在其它的实施方案中，药物组合物包括与多肽结合部分共价或非共价键合的药物，该多肽结合部分含有能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽的抗原结合位点。通常，增加体内血清半衰期的多肽是体内天然存在，而且抗降解，或抵抗被从生物体(例如人类)除去不想要的材料的内源机制除去的多肽。例如，增加体内血清半衰期的多肽可选自来自于细胞外基质的蛋白质，血液中发现的蛋白质，血液脑障碍物或神经组织中发现的蛋白质，定位于肾，肝脏，肺，心脏，皮肤或骨的蛋白质，应激蛋白，疾病特异性蛋白质，或Fc转运相关的蛋白质。增加体内血清半衰期的合适的多肽包括，例如，铁传递蛋白受体特异性配体-神经药剂融合蛋白(参见美国专利号5，977，307，其教导引入这里作为参考)，脑毛状内皮细胞受体，铁传递蛋白，铁传递蛋白受体(例如，可溶的铁传递蛋白受体)，胰島素，胰島素样生长因子1(IGF1)受体，胰岛素样生长因子2(IGF2)受体，胰岛素受体，血液凝结因子Xal-抗胰蛋白酶和HNFl-a。增加体内血清半衰期的合适的多肽还包括a-l糖蛋白类(a-酸性糖蛋白；AAG)，a-l抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、a-l微球蛋白(HC蛋白；AM)、抗凝血酶III(ATIII)、栽脂蛋白A-l(ApoA-I)、载脂蛋白B(ApoB)、血浆铜蓝蛋白(Cp)、补体成分C3(C3)、补体成分C4(C4)、CI酯酶抑制剂(CIINH)、C-反应性蛋白(CRP)、铁蛋白(FER)、血液结合素(HPX)、脂蛋白(a)(Lp(a))、甘露糖结合蛋白(MBP)、肌球素(Myo)、前白蛋白(甲状腺素运载蛋白；PAL)、维生素A结合蛋白(RBP)以及类风湿因子(RF)。来自细胞外基质的合适的蛋白质包括，例如，胶原质、层粘连蛋白、整联蛋白和纤连蛋白。胶原质是细胞外基质的主要蛋白质。目前已知大约15种胶原质分子，其发现于机体的不同部分，例如，I型胶原质(占机体胶原质的90%)发现于骨、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏，或II型胶原质发现于软骨，脊推盘，脊索和眼睛的玻璃状液。来自血液的合适的蛋白质包括，例如，血浆蛋白质(例如，纤维蛋白、a-2巨球蛋白、血清白蛋白、纤维蛋白原(例如，纤维蛋白原A、纤维蛋白原B)，血清淀粉样蛋白A、结合珠蛋白、抑制蛋白、遍在蛋白质、子宫球蛋白和P-2-微球蛋白，酶和酶抑制剂(例如，血浆酶原，溶解酵素，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，a-l-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂)，免疫系统的蛋白质，如免疫球蛋白(例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白轻链(k/X))、转运蛋白(例如，微生素A结合蛋白，a-l微球蛋白)，防御素(例如，P-防御素1，嗜中性粒细胞防御素1，嗜中性粒细胞防御素2和嗜中性粒细胞防御素3)，等等。在血液脑障碍物或神经组织中发现的合适的蛋白质包括，例如，黑肾上腺皮质激素受体，髓磷脂，抗坏血酸转运蛋白，等等。增加体内血清半衰期的合适的多肽还包括定位于肾的蛋白质(例如，聚胱氨酸，IV型胶原质，有机阴离子转运蛋白Kl，埃曼氏抗原)，定位于肝脏的蛋白质(例如，乙醇脱氢酶，G250)，定位于肺的蛋白质(例如，分泌成分，其结合IgA)，定位于心脏的蛋白质(例如，HSP27，其与扩张心脏病相关)，定位于皮肤的蛋白质(例如，角蛋白)，骨特异性蛋白如成形素蛋白(BMP),其是证明具有成骨活性的转化生长因子P超家族蛋白的亚型(例如，BMP-2，BMP-4，BMP-5，BMP國6、BMP-7、BMP-8)，肿瘤特异性蛋白(例如，滋养层抗原，herceptin受体，雌激素受体，组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B，其可发现于肝脏和脾)。合适的疾病特异性蛋白质包括，例如，仅仅在激活的T细胞上表达的抗原，包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)、骨保护素配体(OPGL;参见，Nature402，304—309(1999))、OX40(TNF受体家族的成员，表达于激活的T细胞上，而且特别地在人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)产生细胞中上调；参见Immunol.165(1):263-70(2000))。合适的疾病特异性蛋白质还包括，例如，金属蛋白酶(与关节炎/癌症相关)包括果蝇CG6512、人paraplegin、人FtsH、人AFG3L2、鼠的ftsH和血管生成生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、血管内皮生长因子/血管通透因子(VEGF/VPF)转化生长因子-a(TGFa)、肺瘤坏死因子-a(TNF-a)、血管生成素、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-8(IL-8)，血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(P1GF)、midkine血小板衍生生长因子-BB(PDGF)以及fractalkine。增加体内血清半衰期的合适的多肽还包括应激蛋白如热激蛋白(HSP)。HSP通常发现于细胞内。当于细胞外发现它们时，它是细胞已经死亡而且溢出它的内含物的指示。当由于外伤，疾病或损伤时，这种未编程的细胞死亡(坏死)发生，细胞外的HSP引发来自免疫系统的应答。结合细胞外的HSP可导致本发明的组合物定位于疾病位点。与Fc转运相关的合适的蛋白质包括，例如，Brambell受体(亦称FcRB)。这种Fc受体具有两个作用，二者都可能用于传递。作用是(1)把IgG从母亲跨越胎盘转运到幼儿(2)保护IgG以免降解从而延长它的血清半衰期。人们认为该受体重复利用来自核内体的IgG。(参见，Holliger等，NatBiotechnol15(7):632-6(1997))。用于本发明的合适的白蛋白，白蛋白片段或白蛋白变体描述于WO2005/077042A2，其以其全部内容引入这里作为参考。特别地，下列白蛋白，白蛋白片段或白蛋白变体可用于本发明SEQTDNO:1(如WO2005/077042A2中所描述的，该序列明确地引入本说明书作为参考)；白蛋白片段或变体包括或由WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸1-387组成；白蛋白，或其片段或变体，包括选自下列的氨基酸序列(a)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸54到61;(b)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸76到89;(c)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸92到100;(d)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸170到176;(e)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸247到252;(f)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸266到277;(g)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸280到288;(h)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸362到368;(i)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸439到447;(j)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸462到475;(k)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸478到486;以及(l)WO2005/077042A2中SEQIDNO:1的氨基酸560到566。用于本发明的TNFR1结合配体的合适的白蛋白，片段和类似物的另外的例子描述于WO03/076567A2,其以其全部内容引入这里作为参考。特别地，下列白蛋白，白蛋白片段或白蛋白变体可用于本发明如WO03/076567A2中描述的人血清白蛋白，例如，图3中(该序列信息明确地引入本说明书作为参考)；由585个氨基酸的单个非糖基化的多肽链组成的人血清白蛋白(HA)，其式分子量为66,500(参见，Meloun，etal，FEBSLetters58:136(1975);Behrens，etal，Fed.Proc.34:59\(1975);Lawn,etal，NucleicAcidsResearchP:6102-6114(1981);Minghetti，etal"J.Biol.Chem.261:61Al(1986));Weitkamp，etal，Ann.Hum.Genet.37:219(1973)中所描述的白蛋白的多态变体或类似物或片段；EP322094中所述描述的白蛋白片段或变体，例如，HA(l-373"HA(1國388)，HA(1画389)，HA(l-369)，和HA(1-419)以及1-369与1-419之间的片段；EP399666中所描述的白蛋白片段或变体，例如，HA(I-177)和HA(l-200)以及HA(I-X)之间的片段，其中X是从178到199的任何数。本发明的药物组合物可包括含有结合位点(例如，抗原结合位点)的任何多肽结合部分，该结合位点能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽。优选地，多肽结合部分包括至少31，至少大约40，至少大约50，至少大约60，至少大约70，至少大约80个氨基酸，至少大约90个氨基酸，至少大约IOO个氨基酸或至少大约110个氨基酸作为一个单独的分子实体。优选地，多肽结合部分结合增加体内血清半衰期的多肽，该多肽的KD为至少大约大约5mMKD(KD=Koff(kd)/Kon(ka))。在一些实施方案中，多肽结合部分结合增加体内血清半衰期的多肽，该多肽的KD为大约IO到大约100nM，或大约100nM到大约500nM，或大约500nM到大约5mM，如通过表面胞质基因共振所测定的(例如，使用BIACORE仪器)。在特定的实施方案中，多肽结合部分结合增加体内血清半衰期的多肽，该多肽的KD为大约50nM，或大约70nM，或大约100纳米，或大约150nM或大约200nM。优选地，含有能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合部分，不是原核生物的或细菌多肽或肽。优选地，多肽结合部分是真核生物的，哺乳动物或人多肽或肽。在某些实施方案中，含有能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽的结合位点(例如，抗原结合位点)的多肽结合部分，是折叠蛋白功能域。在其他的实施方案中，多肽结合部分以分子量为至少大约4Kda，至少大约4.5Kda，至少大约5KDa，至少大约5.5KDa，至少大约6KDa，至少大约6.5KDa，至少大约7KDa，至少大约7.5KDa或至少大约8KDa，作为一个单独的分子实体。含有结合位点(例如，抗原结合位点)的合适的多肽结合部分，该结合位点能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽，可以使用任何合适的方法进行鉴定，如通过在合适的附着分析中筛选天然存在或非天然存在的多肽。如这里所描述的，优选的多肽结合部分，其具有用于增加体内血清半衰期的多肽的抗原结合位点，是能特异性结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段。不过，能特异性结合增加体内血清半衰期的其他多肽的抗体的抗原结合片段，可用于本发明。如果需要，结合增加体内血清半衰期的多肽的抗体或其抗原结合片段的一个或多个互补决定区(CDR)，可以制成保留抗体或抗原结合片段的抗原结合特异性的非免疫球蛋白结构。本发明的药物组合物可包括这种非免疫球蛋白结合部分。这种非免疫球蛋白结合部分可使用任何合适的方法制备，例如天然的细菌受体如SpA已经用作支架用于嫁接CDR，以产生特异性结合抗原表位的多肽结合部分。美国专利申请号5,831,012中描述了这种方法的细节，其教导引入这里作为参考。其他合适的支架包括那些基于纤粘连蛋白和亲和体。WO98/58965中详细描述了合适的方法。其它合适的支架包括lipocallin和CTLA4，如vandenBeuken等，J.Mol.Biol.310:591-601(2001)中所述，以及支架如WO00/69907(MedicalResearchCouncil)中所描述的那些支架，其基于例如细菌GroEL或其他的伴倡多肽的环状结构。在一些实施方案中，本发明的药物组合物包括能特异性结合血清白蛋白的非免疫球蛋白结合部分，其中非免疫球蛋白结合部分包括这里所述的VH，Vk或Vhh的一个，两个或三个cdr，和一个合适的支架。在某些实施方案中，非免疫球蛋白结合部分包括这里所述的vH，Vk或Vhh的CDR3，而不是CDR1或CDR2，和一个合适的支架。在其他的实施方案中，非免疫球蛋白结合部分包括这里所述的VH，VK或V冊的CDR1和CDR2，而不是CDR3，和一个合适的支架。在其他的实施方案中，非免疫球蛋白结合部分包括这里所述的VH，Vk或Vhh的CDRVk，CDR2和CDR3，和一个合适的支架。在其他的实施方案中，药物组合物仅仅包括这里所述的VH，Vk或Vhh的CDR3，和药物。本发明的药物组合物可使用合适的方法制备，如这里描述的用于制备药物融合体，药物缀合物和非共价药物缀合物的方法。另外，本发明的药物组合物具有这里详细描述的关于药物融合体，药物缀合物和非共价药物缀合物的优点和用途。本发明提供了药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)，与单独的药物(非缀合的药物，非融合的药物)相比较，其具有提高的药物动力学特性(例如，增加血清半衰期)及其他的优点。药物缀合物，非共价的药物缀合物和药物融合体包括，能特异性结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段，和一种或多种想要的药物。如这里所述，本发明的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物，药物融合体)，相较于单独的药物，具有显著延长的体内血清半衰期和/或增加的AUC。而且，药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)中药物的活性通常基本上没有改变。但是，与单独的药物相比，药物组合物的活性的一些改变是可接受的，而且通常被药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)的提高的药物动力学特性所补偿。例如，药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)可以低于单独的药物的亲和性结合药物靶，但是与单独的药物相比较，由于药物组合物提高的药物动力学特性(例如，延长的体内血清半衰期，较大的AUC)，而具有大约相等的或较高的功效。此外，可以给药较低量的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物和药物融合体)，而达到想要的治疗或诊断效果。药物组合物的活性优选与单独的药物有至多大约100，或至多大约50，或至多大约IO，或至多大约5，或至多大约4，或至多大约3，或至多大约2分之一不同。例如，药物可具有1nM的KD，Ki或中和剂量50(ND50),而药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)可具有大约2nM，或大约3nM，或大约4nM，或大约5nM,或大约10nM的KD，Ki或ND50。优选地，与药物的活性相比较，药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)的活性，基本上没有降低。在某些实施方案中，相对于药物的活性，药物组合物的活性降低至多大约10%，至多大约9%，至多大约8%，至多大约7%，至多大约6%，至多大约5。/。，至多大约4%，至多大约3%，至多大约2%，至多大约1%，或基本上没有变化。替换地陈述，药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)保留至少大约90%，至少大约91°/。，至少大约92"/。，至少大约93%,至少大约94%，至少大约95%，至少大约96%,至少大约97%,至少大约98%，至少大约99%的药物活性，或基本上与药物相同的活性。优选地，药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)和药物的活性基于"药物基础"进行测定和/或比较。如这里描述和显示的，本发明的药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)具有比单独的药物更高的活性(例如，体内活性)。例如，如实施例6中所示，当这些试剂按体重计以相同的剂量(10mg/Kg或1mg/Kg)给药时，在小鼠模型中DOM7m-16/IL-lra治疗关节炎比IL-lra更有效。DOM7m-16/IL-lra是更有效的，尽管它的分子量是IL-lra的分子量的大约两倍。因此，接受DOM7m-16/IL-lra的小鼠只接受大约一半的接受IL-lra的小鼠的IL-lra(作为DOM7m-16/IL1-ra中的部分)。在某些实施方案中，药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)具有比药物更高的活性(例如，体内活性)，药物组合物可具有至少大约100%，至少大约150%,至少大约200%,至少大约250%，至少大约300%，至少大约350%，至少大约400%，至少大约450%,或至少大约500%的药物活性。优选地，药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)和药物的活性基于"药物基础"进行测定和/或比较。药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)和药物的活性使用合适的体外或或体内系统进行测定。在某些实施方案中，如体内所测定的，药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)具有比它包含的药物更高的活性。在其他的实施方案中，如体外所测定的，药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)具有比它包含的药物更高的活性。药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)，其包括能特异性结合血清白蛋白的功能抗体(dAb)，提供了另外的优点。功能抗体是很稳定的，比抗体及抗体其他抗原结合片段小，通过在大肠杆菌或酵母(例如，巴斯德毕赤氏酵母)中表达可以高产量生产，而且如这里所述的，结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段，可以很容易地选自人来源的文库或任何想要的物种。因此，包含结合血清白蛋白的dAb的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)，可以比通常在哺乳动物细胞中生产的治疗剂(例如，人，人化或嵌合的抗体)更容易地生产，而且可以使用非免疫原性的dAb(例如，人dAb可用于药物融合体或药物缀合物，用于治疗或诊断人类的疾病)。当药物是包含结合血清白蛋白的多肽结合部分(例如，结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段)的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)的部分时，药物的免疫原性可能被降低。因此，在包含结合血清白蛋白的多肽结合部分的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)的上下文中，药物可具有较低的免疫原性(比单独的药物)或基本上是非免疫原性的。因此，这种药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)可以随时间重复地给药给个体，而功效损失最小，由于个体的免疫系统分解了抗药物抗体。另外，这里描述的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)可具有比单独的药物增加的安全外形和较少的副作用。例如，作为能特异性结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段的血清白蛋白结合活性的结果，药物融合体和缀合物(药物缀合物，非共价药物缀合物)在血管循环中具有增加的停留时间。另外，缀合物和药物融合体在全身给药(例如，血管内给药)之后基本上不能通过血脑屏障，并在中枢神经系统中积累。因此，与单独的药物相比，可给药缀合物(药物缀合物，非共价药物缀合物)和药物融合体，其包含具有神经学毒性或不需要的影响精神的作用的药物，而具有更高的安全和降低的副作用。类似地，缀合物(药物缀合物，非共价药物缀合物)和药物融合体可具有比单独的药物对特定的器官(例如，肾或肝脏)降低的毒性。这里描述的缀合物和药物融合体还可以用于螯合药物或靶，该药物或靶在血管循环中结合药物(例如，毒素)，从而降低药物或靶对组织的作用(例如，抑制毒素的作用)。用于体内半衰期的药物动力学分析和测定的合适的方法是本领域熟知的。这些方法描述于，例如，Kenneth,A等ChemicalStabilityofPharmaceuticals:AHandbookforPharmacists，与Peters等，Pharmacokinetcanalysis:APracticalApproach(1996)中。也参考文献"Pharmacokinetics"，MGibaldi&DPerron,MarcelDekker出版，2ndRev.edition(1982)，其描述了药物动力学参数如ta与tp半衰期(t1/2a，t1/2(3)，以及曲线下的面积(AUC)。半衰期(t1/2a，t1/2p)和AUC可根据缀合物或融合体的血清浓度对时间的曲线来测定。可使用WinNonlin分析程序包(可获自PharsightCorp.,MountainView,CA94040，USA),例如，用于制作曲线。第一阶段(a阶段)，药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)主要分散在患者中，并有一些排出。当药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)已经分散，而且血清浓度随着药物组合物从患者中的清除而降低时，第二阶段(p阶段)是最后阶段。ta半衰期是第一阶段的半衰期，tp半衰期是第二阶段的半衰期。本发明提供了一种药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)，或包含本发明的药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)的组合物，其ta半衰期在15分钟范围内或更长。在一个实施方案中，该范围的下端是30分钟，45分钟，l小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时，9小时，10小时，11小时或12小时。此外，或者可替换地，药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)或本发明的组合物，其ta半衰期高达并包括12小时。在一个实施方案中，该范围的上端是ll，10，9，8，7，6或5小时。一个合适范围的例子是1到6小时，2到5小时或3到4小时。有利地，本发明提供了药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)，其t(J半衰期在2.5小时内或更长。在一个实施方案中，该范围的下端是3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时，9小时，10小时，11小时，或12小时。在一些实施方案中，药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)的tp半衰期高达并包括21天。在一个实施方案中，该范围的上端是12小时，24小时，2天，3天，5天，10天，15天或20天。在特定的实施方案中，本发明的药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)的tp半衰期为12到60小时。在另外的实施方案中，它为12到48小时。仍然在另外的实施方案中，它为12到26小时。上述标准以外，或者可替换地，本发明提供了药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)，其AUC值(曲线下面的面积)为0.01mg.min/mL或更多，或者1mg.min/mL或更多。在一个实施方案中，该范围的下端是O.Ol，0.1，1，5,10，15，20，30，100，200或者300mg.min/mL。在特定的实施方案中，药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)的AUC高达600mg.min/mL。在一个实施方案中，该范围的上端是500，400，300，200，150，100，75或者50mg.min/mL。在其它的实施方案中，药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)的AUC在选自下列的范围内15到150mg.min/mL，15到100mg.min/mL，1575mg.min/mL，15多J50mg.min/mL，0.0150mg.min/mL，0.1到50mg,min/mL，1到50mg.min/mL，5到50mg.min/mL，以及10到50mg.min/mL。本发明涉及药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物，药物融合体)，其包括药物和含有结合位点的多肽结合部分，该结合位点(例如，抗原结合位点)能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽。在药物组合物的优选实施方案中，含有能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽的结合位点(例如，抗原结合位点)的多肽结合部分，能特异性结合血清白蛋白。在一些实施方案中，药物组合物包括与含有结合位点(例如，抗原结合位点)的多肽结合部分共价键合的药物，该结合位点能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽。在这些实施方案中，药物可与多肽结合功能域在任何合适的位置共价键合，如氨基端，羧基端或者通过合适的氨基酸侧链(例如，赖氨酸的e氨基)。在其他的实施方案中，药物组合物包括与含有结合位点(例如，抗原结合位点)的多肽结合部分非共价键合的药物，该结合位点能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽。在这些实施方案中，药物可直接(例如，通过静电相互作用，疏水作用)或者间接地(例如，通过互补结合伴侣(例如，生物素和抗生物素蛋白)的非共价键合，其中一个伴倡与药物共价键合，互补结合伴侣与抗原结合片段共价鍵合)与抗原结合片段非共价键合。当使用互补结合伴侣时，一个结合伴侣可直接或通过合适的连接体部分与药物共价键合，而互补结合伴侣可直接或者通过合适的连接体部分与多肽结合功能域共价键合。在其他的实施方案中，药物组合物是融合蛋白，其包括含有结合位点(例如，抗原结合位点)的多肽结合部分与多肽药物，该结合位点能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽。融合蛋白质包括连续的多肽链，所述的链包括多肽结合部分作为第一部分，该多肽结合部分含有能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽的结合位点(例如，抗原结合位点)，和多肽药物作为第二部分，其作为多肽链的独立部件(部分)存在。笫一和第二部分可通过肽键彼此直接连接，或者通过合适的氨基酸，或肽或多肽连接体连接。另外的部分(例如，第三，笫四)和/或连接体序列的存在视情况而定。相对于第二部分(也即，多肽药物)，笫一部分可位于N-末端，C-末端或内部。在某些实施方案中，融合蛋白包括一个或多个含有能特异性结合增强体内血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合部分，和一个或多个多肽药物部分。在这些实施方案中，融合蛋白可包括l到大约10(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)个多肽药物部分，它们可以是相同的或不同的，和1到大约20(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11,12，13，14，15，16，17，1819或20)个含有能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合部分，它们可以是相同的或不同的。含有能特异性结合增加体内血清半衰期的结合位点的多肽结合部分，与多肽药物部分，可存在于任何预定位置。例如，从氨基端到羧基端，这些部分可以下列顺序存在一个或多个多肽结合部分，一个或多个多肽药物部分，一个或多个多肽结合部分。在另一个例子中，从氨基端到羧基端，这些部分可以下列顺序存在一个或多个多肽结合部分，一个或多个多肽药物部分，一个或多个多肽结合部分，一个或多个多肽药物部分，一个或多个多肽结合部分。如这里说描述的，多肽结合部分与多肽药物部分可通过肽键彼此直接连接，或通过合适的氨基酸，或肽或多肽连接体连接。在某些实施方案中，融合蛋白是具有下式的连续的多肽链(氨基端到羧基端)a-(P)n2画b画(X)nl画c画(Q)n3-d或a陽(Q)n3國b画(X)nl-c-(P)n2國d其中X是多肽药物；P与Q是每个独立地多肽结合部分，其包含能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽的结合位点；a，b，c与d每个独立地缺乏，或者是1到大约100个氨基酸残基；nl，n2与n3分别表示X，P或Q部分存在的数目；nl是1到大约10;n2是0到大约10;而且n3是0到大约10，附带条件是n2与n3不都是0;而且附带条件是当nl和n2都是l，而且n3是0时，X不含有抗体链或抗体链的片段。在一些实施方案中，n2是1，2，3，4，5或6，而且n3是零。在其他的实施方案中，n3是l，2，3，4，5或6，而且n2是零。在其他的实施方案中，nl，n2和n3都是l。在某些实施方案中，X不含有抗体链或抗体链的片段。在优选的实施方案中，P和Q每个独立地是能特异性结合血清白蛋白的多肽结合部分。在尤其优选是实施方案中，药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)包括含有结合位点(例如，抗原结合位点)的多肽结合部分，该结合位点能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽，其中该多肽结合功能域是能特异性结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段。本发明还涉及一种用于增加药物的体内血清半衰期的方法，包括使药物与含有结合位点的多肽结合部分连接，该结合位点能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽，借此产生相对于药物，具有较长的体内血清半衰期的药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)。在一些实施方案中，该方法用于增加药物的体内血清半衰期，而基本上不降低药物的活性，包括使药物与含有结合位点的多肽结合部分连接，该结合位点能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽，借此产生相对于所述药物，具有较长的体内血清半衰期，并具有至少大约90%的所述药物的活性的药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)。在其他的实施方案中，该方法用于增加药物的体内血清半衰期，并降低药物的免疫原性，包括使药物与含有结合位点的多肽结合部分连接，该结合位点能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽，借此产生相对于所述药物，具有较长的体内血清半衰期，和免疫原性低于所述药物的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)。在其他的实施方案中，该方法用于降低药物的免疫原性，而基本上不降低药物的活性，包括使药物与含有结合位点的多肽结合部分连接，该结合位点能特异性结合收针体内血清半衰期的多肽，借此产生免疫原性低于所述药物，并具有至少大约90%的所述药物的活性的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)。在其他的实施方案中，该方法用于增加药物的体内血清半衰期，并降低药物的免疫原性，而基本上不降低药物的活性，包括使药物与含有结合位点的多肽结合部分连接，该结合位点能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽，借此产生相对于所述药物，具有较长的体内血清半衰期，免疫原性低于所述药物，并具有至少大约90%的所述药物的活性的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)。如这里所述，药物与具有能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合部分，可通过共价键(例如，肽键)或非共价键连接，而使用或不使用连接体。在一些实施方案中，药物与含有能特异性结合增强体内血清半衰期的多肽的结合位点(例如，抗原结合位点)的多肽结合部分，通过共价键连接。例如，产生的药物组合物是药物缀合物或药物融合体。在其他的实施方案中，药物与含有能特异性结合增强体内血清半衰期的多肽的结合位点(例如，抗原结合位点)的多肽结合部分，通过非共价键连接，而且该药物组合物是非共价药物缀合物。使用该方法生产的药物组合物可具有比药物更高的活性(例如，体内活性)。在一些实施方案中，该方法用于生产具有比单独的药物更高的活性(例如，体内活性)的药物组合物，包括使药物与含有结合位点的多肽结合部分连接，该结合位点能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽，借此产生相对于药物，具有更高活性的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)。在这些实施方案中，优选地，如这里所述，药物组合物的活性高于药物的活性。在优选的实施方案中，多肽结合部分特异性结合血清白蛋白。在尤其优选的实施方案中，多肽结合部分是抗体的抗原结合片段，该抗体能特异性结合血清白蛋白。在某些实施方案中，该方法包括从一种或多种多肽选择所述多肽结合部分(例如，能特异性结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段)，其中选择的多肽结合部分以至少大约5mM的KD结合增加体内血清半衰期的多肽。本发明还涉及具有结合位点的多肽结合部分用于制备药物的用途，该结合位点能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽，该药物包括药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)，其中药物与所述多肽结合部分连接，用于增加药物的体内血清半衰期。在一些实施方案中，用于制备药物的用途，该药物包括药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)，其中该药物与所述多肽结合部分连接，用于增加药物的体内血清半衰期，而不降低药物的活性超过大约10%。在其他的实施方案中，用于制备药物的用途，该药物包括药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物，药物融合体)，其中该药物与所述多肽结合部分连接，用于增加药物的体内血清半衰期，并降低药物的免疫原性。在其他的实施方案中，用于制备药物的用途，一药物包括药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)，其中一药物与所述多肽结合部分连接，用于降低药物的免疫原性，而不降低药物的活性超过大约10%。在其他的实施方案中，用于制备药物的用途，该药物包括药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)，其中该药物与所述多肽结合部分连接，用于增加药物的体内血清半衰期，并降低药物的免疫原性，而不降低药物的活性超过大约10%。如这里所述，药物组合物包括药物与具有能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合部分，它们通过共价键(例如，肽键)或非共价键连接，而使用或不使用连接体。在一些实施方案中，药物与具有能特异性结合增强体内血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合部分，通过共价鍵连接。例如，药物组合物是药物缀合物或药物融合体。在其他的实施方案中，药物与具有能特异性结合增强体内血清半衰期的多肽的结合位点(例如，抗原结合位点)的多肽结合部分，通过非共价键连接，而且该药物组合物是非共价药物缀合物。在某些实施方案中，用于制备药物的用途，该药物包括药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)，其中该药物与所述多肽结合部分连接，用于增加所述药物的活性(例如，体内活性)。在这些实施方案中，优选地，如这里所述，药物组合物的活性高于药物的活性。在优选的实施方案中，多肽结合部分特异性结合血清白蛋白。在尤其优选的实施方案中，多肽结合部分是抗体的抗原结合片段，该抗体能特异性结合血清白蛋白。结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段本发明的药物缀合物，非共价的药物缀合物和药物融合体包括，结合血清白蛋白的抗体的(也即，一个或多个)抗原结合片段。抗原结合片段可特异性结合动物的血清白蛋白，将对该动物给药药物缀合物或药物融合体。优选地，抗原结合片段能特异性结合人血清白蛋白。然而，兽医应用是期待的，而且抗原结合片段能特异性结合来自预定动物的血清白蛋白，例如来自狗、猫、马、母牛、小鸡、绵羊、猪、山羊、鹿、貂等等的血清白蛋白。在一些实施方案中，抗原结合片段能特异性结合来自超过一个物种的血清白蛋白。例如，如这里所述的，已经生产了能特异性结合鼠血清白蛋白与小鼠血清白蛋白的人dAb，以及能特异性结合鼠，小鼠与人血清白蛋白的dAb。(表1和图7)这些dAb提供了允许使用相同的药物缀合物或药物融合体进行临床前的与临床研究的优点，并避免了使用合适的替代品药物融合体或药物缀合物进行临床前的研究的需要。适合用于本发明的抗原结合片段包括，例如，Fab片段，Fab，片段，F(ab，)2片段，Fv片段(包括单链Fv(scFv)和二硫键连接的Fv)、单链可变区和dAbs(VH，VJ。这些抗原结合片段可使用任何合适的方法生产，如通过使用胃蛋白酶，木瓜蛋白酶或其他的具有需要的裂解特异性的蛋白酶对抗体进行蛋白水解，或使用重组技术。例如，Fv片段可通过用合适的蛋白酶消化抗体，或使用重组DNA技术制备。例如，可制备编码轻链可变区与重链可变区的核酸，该轻链可变区与重链可变区通过合适的肽连接体，如2个到大约20个氨基乙酰残基链连接。可使用任何合适的技术(例如，转染，转化，感染)把核酸引入到合适的宿主(例如，大肠杆菌)中，而且该宿主在适于表达单链Fv片段的条件下保持。可使用抗体基因制备抗体的各种抗原结合片段，其中已经引入一个或多个终止密码子到天然终止位点的上游。例如，可通过在编码重链绞链区的序列的3'端引入翻译终止密码子，来设计编码免疫球蛋白重链的F(ab，)2部分的表达构建体。本发明的药物缀合物，非共价药物缀合物和药物融合体，可包括结合血清白蛋白的抗体的各个重链与轻链，或结合血清白蛋白的各个链的部分(例如，羊个Vh、Vk或VJ。结合想要的血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)的抗体及其抗原结合片段，可选自天然或人造抗体或在合适的宿主中针对合适的免疫原产生的抗体的合适的集合。例如，可通过用血清白蛋白(例如，分离的或纯化的人血清白蛋白)或血清白蛋白的肽(例如，包括至少大约8，9，10，11，12，15，20，25，30，33，35，37，或40个氨基酸残基的肽)，免疫合适的宿主(例如，小鼠，人抗体转基因小鼠，鼠，兔，小鸡，山羊，非人灵长类动物(例如，猴))，来生产抗体。结合血清白蛋白的抗体和抗原结合片段，还可以选自重组抗体或抗原结合片段的文库，如噬菌体展示文库。这种文库可包括含有天然或人工氨基酸序列的抗体或抗体的抗原结合片段。例如，文库可包括含有人工CDR(例如，随机氨基酸序列)和人构架区的Fab片段。(参见，例如，美国专利号6,300,064(Knappik，etat)。)在其他的例子中，文库包括scFv片段或dAb(单链VH，单链V,或单链VJ，其序列有一个或多个CDR不同。(参见，例如，WO99/20749(Tomlinson和Winter)、WO03/002609A2(Winter等)、WO2004/003019A2(Winter等))结合血清白蛋白的合适的抗体及其抗原结合片段包括，例如，人抗体及其抗原结合片段，人化抗体及其抗原结合片段，嵌合抗体及其抗原结合片段，啮齿动物(例如，小鼠，鼠)抗体及其抗原结合片段，和Camelid抗体及其抗原结合片段。在某些实施方案中，药物缀合物，非共价药物缀合物和药物融合体包括结合血清白蛋白的CamelidVHH，CamelidV冊是免疫球蛋白单链可变区多肽，其来源于天然缺乏轻链的重链抗体。这种抗体存在于Camelid物种中，包括骆驼，美洲驼，羊驼，单峰骆驼和大羊驼。VHH分子比IgG分子小大约IO倍，而且如同单个多肽，是很稳定的，并且能抵抗极端pH和温度条件。结合血清白蛋白的合适的CamelidVHH包括WO2004/041862(AblytocN.V.)和这里(附图15和SEQIDNOS:73-84)描述的那些CamelidVHH。在某些实施方案中，CamelidVHH结合人血清白蛋白，而且包括与SEQIDNO:68、SEQIDNO:69、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:74、SEQIDNO:75、SEQIDNO:76、SEQIDNO:77、SEQIDNO:78、SEQIDNO:79、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、EQIDNO:83或SEQIDNO:84具有至少大约80%，或至少大约85%，或至少大约90%，或至少大约95%,或至少大约96%，或至少大约97%,或至少大约98%，或至少大约99°/。的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。氨基酸序列同一性优选使用合适的序列比对算法和缺省参数进行确定，如BLASTP(Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sd.VSAS7(6):2264-2268(1990))。免疫抗原的制备，多克隆和单克隆抗体生产可以使用任何合适的技术进行。已经描述了各种方法。(参见，例如，Kohler等，Nature,256:495-497(1975)和Eur.J.Immunol.6:511-519(1976);Milstein等，Nature266:550-552(1977);Koprowski等，U.S.专利No.4，172，124;Harlow,E.和D.Lane,1988，Antibodies:ALaboratoryManual,(ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY);CurrentProtocolsInMolecularBiology,Vol.2(Supplement27,Summer'94)，A訓bel，F.M.等编辑(JohnWiley&Sons:NewYork,NY)，Chapter11，(1991)。)。一般，想要单克隆抗体时，通过融合来自无限增殖细胞系(例如，骨髓瘤细胞系如SP2/0，P3X"Ag8.653或异源骨髓瘤)的合适细胞与抗体产生细胞来生产杂交瘤。抗体产生细胞可以获自人，人-抗体转基因动物或用目的抗原免疫的其他合适动物的外周血或，优选脾或淋巴结。生产人来源的抗体(例如，人抗体)的细胞，可以使用合适的方法生产，例如，融合人抗体产生细胞和异源骨髓瘤或trioma，或用EpsteinBarr病毒感染的激活人B细胞的无限增殖。(参见，例如，U.S.专利No.6,197,582(Trakht);Niedbala等，Hybridoma,17:299-304(1998);Zanella等，JImmunolMethods,156:205-215(1992);Gustafsson等，HumAntibodiesHybridomas，2:26-32(1991)。)。融合的或无限增殖的抗体产生细胞(杂交瘤)，可使用选择培养条件分离，并通过有限稀释进行克隆。生产具有想要的特异性的抗体的细胞，可使用合适的分析进行鉴定(例如，ELISA)。抗体还可以从人，人-抗体转基因动物或用目的抗原免疫的其他合适的动物的分离的抗原特异性抗体产生细胞直接制备(例如，合成或克隆)(参见，例如，美国专利号5,627,052(Schrader))。将药物缀合物，非共价药物缀合物或药物融合体给药给人时，结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)的抗体或其抗原结合片段可以是人，人化的或嵌合抗体或这种抗体的抗原结合片段。性的，并提供了众所周知的优点。例如，包含人，人化的或嵌合抗体的药物缀合物，非共价药物缀合物或药物融合体，可重复地给药给人而较少或不损失功效(相较于其他的完全免疫原性抗体)，由于结合药物缀合物或药物融合体的人抗体的分解。当药物缀合物，非共价药物缀合物或药物融合体计划用于兽医给药时，可使用类似的抗体或抗原结合片段。例如，来自鼠或人抗体的CDR可以嫁接到来自想要的动物如马或母牛的构架区。人抗体和编码人抗体的核酸，可以获自例如人或人-抗体转基因动物。人-抗体转基因动物(例如，小鼠)是能产生人抗体的基因库的动物，如XENOMOUSE(Abgenix，Fremont,CA)，HUMAB画MOUSE，KIRINTCMOUSE或KM-MOUSE(MEDAREX，Princeton,NJ)。通常，人-抗体转基因动物的基因组已经改变成包括转基因，该转基因包括来自可进行功能性重排的人免疫球蛋白基因座的DNA。可破坏或删除人-抗体转基因动物中的内源免疫球蛋白基因座，以消除动物产生内源基因编码的抗体的能力。用于生产人-抗体转基因动物的合适的方法是本领域熟知的。(参见，例如，美国专利号5，939,598和6,075,181(Kucherlapati等)，美国专利号5，569，825、5,545,806、5,625,126、5,633,425、5,661,016和5,789,650(Lonberg等)，Jakobovits等，Proc.NatlAcad.ScLUSA,90:2551-2555(1993)，Jakobovits等，Nature,362:255-258(1993)，Jakobovits等WO98/50433，Jakobovits等WO98/24893，Lonberg等WO98/24884，Lonberg等WO97/13852，Lonberg等WO94/25585，Lonberg等EP0814259A2，Lonberg等GB2272440A，Lonberg等，Nature368:856-859(1994)，Lonberg等，IntRevImmunol13(1):65-93(1995)，Kucherlapati等WO96/34096，Kucherlapati等EP0463151Bl，Kucherlapati等EP0710719Al，Surani等美国专利号5,545,807，Bruggemann等WO90/04036，Bruggemann等EP0438474Bl，Taylor等，Int.Immunol.6(4)579-591(1994)，Taylor等，NucleicAcidsResearch20(23):6287-6295(1992)，Green等，NatureGenetics7:13-21(1994),Mendez等，NatureGenetics15:146-156(1997)，Tuaillon等，ProcNatlAcadSciUSA90(8):3720-3724(1993)以及Fishwild等，NatBiotechnol14(7):845-851(1996)，前述每个的教导以其全部内容引入这里作为参考。。人-抗体转基因动物可以用合适的抗原(例如，人血清白蛋白)进行免疫，可使用常规方法分离和融合抗体产生细胞以形成杂交瘤。生产具有想要的特性(例如，特异性，亲和性)的人抗体的杂交瘤，可使用任何合适的分析(例如，ELISA)进行鉴定，而且如果需要，使用合适的培养技术进行选择和亚克隆。可以使用任何合适的方法制备人化的抗体及其他CDR嫁接的抗体。CDR嫁接的抗体的CDR，可以源自于结合血清白蛋白的合适的抗体(称为供体抗体)。合适的CDR的其它来源包括天然的和人造血清白蛋白特异性抗体，其获自人或非人类的来源，如啮齿动物(例如，小鼠，鼠，兔)，小鸡，猪，山羊，非人灵长类动物(例如，猴)或文库。人化抗体的构架区优选是人来源的，而且可源自于与供体抗体的抗原结合区的类似或等价区(例如，重链可变区或轻链可变区)具有序列相似性的任何人抗体可变区。人来源的构架区的其它来源包括人可变区共有序列。(参见，例如，Kettleborough，CA.等，ProteinEngineerings773-783(1991);Carter等，WO94/04679;Kabat,E.A.，等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，U.S.GovernmentPrintingOffice(1991))。其它类型的CDR嫁接的抗体，可包括合适来源的构架区，如由来自马，母牛，狗，猫等等的种系抗体基因部分编码的构架区。人来源的构架区可包括氨基酸取代或置换，如"回复突变"，其用来自供体抗体相应位置的残基置换人或动物来源的构架区中的氨基酸残基。可以进行构架区中的一个或多个突变，包括一个或多个氨基酸的缺失，插入和取代。变体可通过各种合适的方法产生，包括非人类供体或受体人链的诱变。(参见，例如，美国专利号5,693,762(Queen等)和5,859,205(Adair等)，其以其全部教导引入这里作为参考。)抗体，抗体链(例如，重链，轻链)或其片段或部分的恒定区，如果存在，可源自于任何合适的来源。例如，人，人化和某些嵌合抗体，抗体链(例如，重链，轻链)或其片段或部分的恒定区，如果存在，可以是人来源的，而且可源自于任何合适的人抗体或抗体链。例38如，人来源的恒定区或其部分可源自于人k或k轻链，和/或人y(例如，yl、y2、y3、y4)，n,a(例如，al，a2)，S或s重链，包括等位变体。在某些实施方案中，抗体或抗原结合片段(例如，人来源的抗体，人抗体)，可包括氨基酸取代或置换，其改变或修整了作用(例如，效应子功能)。例如，人来源的恒定区(例如，yl恒定区，恒定区)可以设计成降低补体激活和/或Fc受体结合。(参见，例如，美国专利号5，648，260(Winter等)，5，624，82KWinter等)和5，834，597(Tso等)，其以其全部教导引入这里作为参考)。优选地，包括这种氨基酸取代或置换的人来源的恒定区的氨基酸序列，与人来源的未改变的恒定区的氨基酸序列全长具有至少大约95%同一性，更优选与人来源的未改变的恒定区的氨基酸序列全长具有至少大约99%同一性。人化抗体，CDR嫁接抗体，人化或CDR嫁接抗体的抗原结合片段，可使用任何合适的方法制备。几个这种方法是本领域熟知的。(参见，例如美国专利号5，225，539(Winter),美国专利号5，530，101(Queen等)。)。人化或CDR嫁接抗体(例如，CDR，骨架，恒定区)的部分，可获自或直接来源于合适的抗体(例如，通过一部分的从头合成)，或者可生产和表达编码具有想要特性(例如，结合血清白蛋白)的抗体或其链的核酸。为了制备链的部分，可以在想要的位置引入一个或多个终止密码子。例如，可使用PCR诱变方法以改变存在的DNA序列，来构建编码人化或CDR嫁接可变区的核酸(例如，DNA)序列。(参见，例如，Kamman，M.，等，Nucl.AcidsRes.17:5404(1989)。)。编码新CDR的PCR引物可与预先人化的可变区的DNA模板杂交，该预先人化的可变区基于相同的或很相似的人可变区(Sato，K.，等，CancerResearch53:851-856(1993))。如果相似的DNA序列不能有效用作模板，可以从合成寡核苷酸来构建包括编码可变区序列的序列的核酸(参见，例如，Kolbinger，F"ProteinEngineering8:971-980(1993))。还可以把编码信号肽的序列整合到该核酸中(例如，合成，插入到载体中)。可以使用来自受体抗体的天然信号肽序列，来自另一个抗体的信号肽序列或其他的合适序列(参见，例如，kettleborough，C.A.，ProteinEngineeringA:112-783(1991))。使用这些方法或其他的合适方法，可以很容易地生产变体。在一个实施方案中，可以对克隆的可变区进行突变，并选择编码具有想要的特异性的变体的序列(例如，来自噬菌体文库；参见，例如，美国专利号5,514,548(Krebber等)和WO93/06213(Hoogenboom等))。结合血清白蛋白的抗体或抗原结合片段，可以是嵌合抗体或嵌合抗体的抗原结合片段。嵌合抗体或其抗原结合片段包括来自一个物种(例如，小鼠)的可变区，和来自另一个物种(例如，人)的恒定区的至少一部分。嵌合抗体和嵌合抗体的抗原结合片段可以使用任何合适的方法制备。几种合适的方法是本领域熟知的。(参见，例如，美国专利号4，816，567(Cabilly等)，美国专利号5,116，946(Capon等)。)。一种用于获得结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段的优选方法，包括从全部基因库抗原结合片段选择能特异性结合想要的血清白蛋白的抗原结合片段(例如，scFvs,dAb)。例如，如这里所描述的，结合血清白蛋白的dAb可选自合适的噬菌体展示文库。已经描述了许多合适的噬菌体显示文库和选择方法(例如，单价展示和多价展示系统)。(参见，例如，Griffiths等，美国专利号6，555，313Bl(引入这里作为参考)；Johnson等，美国专利号5j33，743(引入这里作为参考)；McCafferty等，美国专利号5,969,108(引入这里作为参考)；Mulligan-Kehoe，美国专利号5，702，892(引入这里作为参考)；Winter,G.等；Annu.Rev.Immunol.72:433-455(1994);Soumillion，P.等，ApplBiochem.Biotechnol47(2-3):175-189(1994);Castagnoli，L.等，Comb.Chem.HighThroughputScreen,4(2):121-133(2001);WO99/20749(Tomlinson和Winter);WO03/002609A2(Winter等)；WO2004/003019A2(Winter等)。)。噬菌体文库中展示的多肽可以展示在任何合适的噬菌体上，如丝状噬菌体(例如，fd、M13、Fl)，裂解性噬菌体(例如，T4、T7、30，或RNA噬菌体(例如，MS2)，例如，并选择其与血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)的结合。通常，显示基因库多肽的噬菌体文库与合适的噬菌体外壳蛋白用作融合蛋白。这种文库可以使用任何合适的方法生产，如引入编码显示抗体或其抗原结合片段的噬菌体载体的或噬菌粒载体文库到合适的宿主细菌中，并培养得到的细菌，来生产噬菌体(例如，如果需要，使用合适的辅助噬菌体或补体质粒)。噬菌体的文库可以使用任何合适的方法从这种培养物中重新获得，如沉淀和离心。文库可包括含有任何想要量的氨基酸序列多样性的基因库抗体或其抗原结合片段。例如，基因库可包括抗体或其抗原结合片段，其氨基酸序列相应于来自想要的有机体的天然存在的抗体，和/或可包括随机或随机化的氨基酸序列(例如，CDR序列)的一个或多个区域。这种基因库或文库中的抗体或其抗原结合片段，可包括随机或随机化的氨基酸序列的限定区域，和常见氨基酸序列的限定区域。在某些实施方案中，基因库中全部或基本上全部多肽是想要类型的抗体的抗原结合片段(例如，人Vh或人VJ。例如，基因库中每个多肽可包括VH，Vl或Fv(例如，单链Fv)。可使用任何合适的方法，把氨基酸序列差异引入到抗体或其抗原结合片段的任何想要的区域。例如，使用任何合适的诱变方法(例如，低保真PCR，寡核苷酸介导的或位点定向诱变，使用NNK密码子的多样化)或任何其他的合适方法，制备编码多样化的抗体或其抗原结合片段的核酸的文库，可把氨基酸序列差异引入到目标区域，如抗体可变区的互补决定区。如果需要，待多样化的抗体或其抗原结合片段的区域，可以随机化。合适的噬菌体展示文库可用于选择结合血清白蛋白并具有其他的有益特性的抗体或抗体的抗原结合片段。例如，可选择当展开时能抵抗聚集的抗体或抗原结合片段。聚集受多肽浓度的影响，而且认为在部分折叠或展开中间物的很多情况下出现。促成部分折叠中间物的因素和条件，如高温和高多肽浓度，促进不可逆的聚集。(Fink，A.L.，Folding&Design3:R1-R23(1998).)。例如，以浓缩形式储存纯化的多肽，如冻干制品，经常导致至少部分多肽的不可逆聚集。并且，通过在生物系统如大肠杆菌中表达来生产多肽，常常导致含有聚集多肽的包涵体的形成。从包涵体回收活性多肽可能是很困难的，而且需要增加另外的步骤如再折叠步骤到生物生产系统中。可以从合适的噬菌体展示文库选择，当加热时，抵抗聚集和可逆展开的抗体和抗原结合片段。通常，包括展示的抗体或其抗原结合片段的基因库的噬菌体展示文库被加热到某个温度(Ts)，该温度时至少部分展示的抗体或其抗原结合片段是展开的，然后冷却到某个温度(Tc)，其中Ts>Tc，从而至少部分抗体或其抗原结合片段已经再折叠，而且部分多肽已经聚集。然后，在温度(Tr)时回收可逆展开并结合血清白蛋白的抗体或其抗原结合片段。回收的可逆展开的抗体或其抗原结合片段具有解链温度(Tm)，而且优选地，基因库被加热到Ts，冷却到Tc,在Tr时分离可逆展开的抗体或其抗原结合片段，以便Ts>Tm>Tc，而且Ts>Tm>Tr。通常，在选择之前，噬菌体展示文库被加热到大约801C，并冷却到大约室温或大约40TC。能可逆展开并抵抗聚集的抗体或其抗原结合片段，还可以通过用能可逆展开的残基置换某些氨基酸残基进行设计或基因工程操作。(参见，WO2004/101790(Jespers等)，和美国临时专利申请号60/470,340(2003年5月14日提交)和60/554,021(2004年3月17日提交)详细论述了用于选择和设计或基因操作能可逆展开的抗体或其抗原结合片段的方法。WO2004/101790和前述的两个美国临时专利申请的教导引入这里作为参考)。可逆展开和抵抗聚集的抗体或其抗原结合片段提供了几个优点。例如，由于它们对聚集的抗性，通过使用合适的生物生产系统如大肠杆菌进行表达，能可逆展开的抗体或其抗原结合片段，可以很容易地高产量生产为可溶蛋白。此外，能可逆展开的抗体或其抗原结合片段，可以高于常规多肽的浓度配制和/或储存，而较少聚集和损失活性。DOM7h-26(SEQIDNO:20)是能可逆展幵的人Vh。优选地，结合血清白蛋白的抗体或其抗原结合片段包括可变区(VH、VK、VX)，其中一个或多个构架区(FR)包含(a)人构架区的氨基酸序列，(b)人构架区的氨基酸序列的至少8个连续的氨基酸，或(c)由人种系抗体基因部分编码的氨基酸序列，其中所述的构架区如Kabat所定义。在某些实施方案中，一个或多个构架区的氨同，或者相对于由人种系抗体基因部分编码的所述对应构架区的氨基酸序列，一个或多个所述构架区的氨基酸序列共同地包含高达5个氨基酸的差异。在其他的实施方案中，FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列与由人种系抗体基因部分编码的对应构架区的氨基酸序列相同，或者相对于由所述的人种系抗体基因部分编码的对应构架区的氨基酸序列，FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列共同地包括高达10个氨基酸的差异。在其他的实施方案中，所述的FR1，FR2和FR3的氨基酸序列，与由所述的人种系抗体基因部分编码的对应构架区的氨基酸序列相同。在特定的实施方案中，结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段，包括基于人种系序列的免疫球蛋白可变区(例如，VH，VJ，而且如果需要，可具有一个或多个多样化区域，如互补决定区。用于Vh的合适的人种系序列包括，例如，由Vh基因片段DP4、DP7、DP8、DP9、DPIO、DP31、DP33、DP45、DP46、DP47、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、DP68和DP69,以及JH片段JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5和JH6编码的序列。用于VL的合适的人种系序列包括，例如，由Vk基因片段DPK1、DPK2、DPK3、DFK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPKIO、DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPKI8、DPK19、DPJC20、DPK21、DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26和DPK28，以及由Jk片段Jk1、Jk2、Jk3、Jk4和JK5编码的序列。在某些实施方案中，药物缀合物，非共价药物缀合物或药物融合体不包括结合血清白蛋白的小鼠，鼠和/或兔抗体，或者这种抗体的抗原结合片段。抗原结合片段可以任何想要的亲和性，结合速率(onrate)和解离速率(offrate),结合血清白蛋白。可以选择亲和性(KD)，结合速率(K^或ka)和解离速率(K^或kd),以获得特定药物想要的血清半衰期。例如，获得药物最大的血清半衰期是需要的，该药物中和慢性炎症性紊乱的炎症介质(例如，结合并中和炎性细胞因子的dAb)，而较短的半衰期可能是具有一些毒性的药物所需要的(例如，化疗剂)。一般，对血清白蛋白的快速结合速率和快速或中速解离速率是优选的。包括具有这些特性的抗原结合片段的药物缀合物和药物融合体，在给药后将迅速地结合血清白蛋白，并迅速地解离和重新结合血清白蛋白。这些特性将降低药物的快速清除(例如，通过肾)，但是仍然提供高效的传递并到达药物靶。结合血清白蛋白的抗原结合片段(例如，dAb)，一般以大约lnM到大约500jiM的KD结合。在一些实施方案中，抗原结合片段以大约10到大约100nM，或大约100nM到大约500nM，或大约500nM到大约5mM的KD(KD=K。ff(kd)/K。n(ka))结合血清白蛋白，如通过表面胞质基因共振所测定的(例如，使用BIACORE仪器)。在特定的实施方案中，药物缀合物，非共价药物缀合物或药物融合体包括以大约50nM，或大约70nM，或大约100nM，或大约150nM或大约200nM的KD结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)的抗体的抗原结合片段。这里所述的药物缀合物，非共价药物缀合物和药物融合体的提高的药物动力学特性(例如，延长的tl/2p，增加的AUC)，可能与结合血清白蛋白的抗原结合片段的亲和性有关。因此，具有提高的药物动力学特性的药物缀合物，非共价药物缀合物或药物融合体，一般可使用以高亲和性(例如，大约500nM或较少，大约250nM或较少，大约100nM或较少，大约50nM或较少，大约10nM或较少，或大约lnM或较少，或大约100pM或较少的KD)结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)的抗原结合片段制备。优选地，与结合血清白蛋白的抗原结合片段共轭或融合的药物，以比抗原结合片段对血清白蛋白更强的亲和性(KD)，和/或比抗原结合片段对血清白蛋白更快的Koff(kd)与它的靶(药物靶)结合，如通过表面胞质基因共振所测定的(例如，使用BIACORE仪器)。例如，药物可能以比结合SA的抗原结合片段对SA高大约1到大约100000,或大约100到大约100000，或大约1000到大约100000,或大约10000到大约100000的亲和性与它的靶结合。例如，结合SA的抗体的抗原结合片段，可以大约lOjiM的亲和性结合，而药物以大约100pM的亲和性结合它的耙。在特定的实施方案中，结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段是结合人血清白蛋白的dAb。例如，具有选自SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、EQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的氨基酸序列的VKdAb，或具有选自SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22和SEQIDNO:23的氨基酸序列的VHdAb。在其他的实施方案中，结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段是结合人血清白蛋白，并包括任何上述氨基酸序列的CDR的dAb。在其它的实施方案中，结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段是dAb，其结合人血清白蛋白，并包括与SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22或SEQIDNO:23具有至少大约80%，或至少大约85%，或至少大约90%，或至少大约95%，或至少大约96%,或至少大约97%,或至少大约98°/。，或至少大约99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。氨基酸序列同一性优选使用合适的序列比对算法和缺省参数进行确定，如BLASTP(Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.ScLUSAS7(6):2264-2268(1990))。药物本发明的某些药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物)可包括任何药物(例如，小的有机分子，核酸，多肽)，其可给药给个体以产生有益的治疗或诊断作用，例如，通过结合个体中的生物学靶分子和/或改变个体中生物学靶分子的作用。本发明的其他的药物组合物(例如，药物融合体)可包括多肽或肽药物。在药物融合体的优选实施方案中，药物不包括抗体链或抗体链的片段(例如，vH、VK、VJ。TNFR1是包含结合配体的胞外区，和缺乏内在信号转导活性但是与信号转导分子相关的细胞内功能域的跨膜受体。TNFR1与结合的TNF的复合物包含3条TNFR1链和3条TNF链。(Banner等，Cell,73(3)431-445(1993).)。TNF配体以三聚体存在，其通过3条TNFR1链结合。(Id.)3条TNFR1链在受体-配体复合物中一起紧紧地成簇，而且这种成簇对TNFR1介导的信号转导是必要的。实际上，结合TNFR1的多价试剂，如抗-TNFRl抗体，在缺乏TNF时可诱导TNFR1成簇和信号转导，而且通常用作TNFR1拮抗剂。(参见，例如，Belka等，EMBO，J4(6):1156-1165(1995);Mandik-Nayak等，J.Immunol,767:1920-1928(2001)。)。因此，结合TNFR1的多价试剂，一般不是TNFR1的有效拮抗剂，即使它们阻断TNFa对TNFR1的结合。TNFR1及其他TNF受体超家族成员的胞外区包含一个称为前配体结合装配功能域或PLAD功能域的区域(SEQIDNO:85(人TNFR1)的1-53位氨基酸；SEQIDNO:86(小鼠TNFR1))的1-53位氨基酸(美国政府，WO01/58953;美国专利申请公开号2003/0108992Al，Deng等，NatureMedicine,doi:10.1038/腿1304(2005))。人(智人)TNFR1的胞外区具有下列氨基酸序列lvphlgdreksdsvcpqgoihpq,K!ctkchkgtylyndckjgq:dtdcregbsgsftasenhlkhascskcrkemgqvelssctvdiu>rvcqcrknqybhywsbnlfqcfncslclnatvhlscqekqnrvctchaofflrenecvscsnckkslectklclpqienvkotedsgtt(seqidno;85).鼠的(小家鼠)TNFR1的胞外区具有下列氨基酸序列LVPSLGDREKRDSLCPQOKyVHSKNNSICCTKC!HKGTVLVSDCPSP。RDTVCRECBKGTFTASQNYLRQCLSCKTCRKEMSQ糊PCqADKDTVCaCKENQ]PQRYLSETHFqcvdcspcfngtvtipcketqntvcnchagkflresecvpcshckknebcmsxclpHlanvtnpqd8gta(SEQIDNO:86)。来自特定受体的PLAD功能域在体内彼此结合，而且在存在天然的配体时可预防受体激活。例如，TNFR1的PLAD功能域在体内将结合TNFR1的另一个PLAD功能域(例如，在细胞表面表达的TNFR1)，并抑制受体成簇，以及紧接着结合天然配体随后的信号转导。TNF受体超家族是本领域公认的蛋白质组，其包括TNFRl(p55、CD120a、p60、TNF受体超家族成员1A、TNFRSF1A)、TNFR2(p75、p80、CD120b、TNF受体超家族成员1B、TNFRSFIB)、TNFRSHB〉,CD(TNFRSF3,L讽TOFR2-RP,TNFR哉TNFCRTNF-R-恥OX40(TNTFRSF4,ACT35,TXGP1L),.CD40(TNPRSF5,p50,Bp50),F朋(CD95,TN7RSF6,APCH,APTI),DcR3CTNPRSFi5B),CD27(TOPRSF7，Tp55,S152),CD30CTNFRSF8,KM,DISI"B),CD137(TNPRS界,4-lBB，EA),TRAILR-1(TNFRSF10A,DR4,Ap。2),TRAIL-R2(TNFRSF10B,DR5,KILLER,TRICKZ/^TRICKB〉，TRAILR3(TNFK5F10C'DcRl,LIT,TRID〉,TRAILR4(TNTRSPIOD,DcR2,TRUNDD),RANK(TNFRSFl1A),OPG(TNFRSF11B,OCIF,TR1),DR3CTNFRSia2,TRAMP,WSL-l，LARD,WSLLRDDR3,TR3，APO-3),DR3L(TNFRSF12L)'TAC1(TNFRSF13B》,BAFFRCTNFRSF13C),HVEM(TNFRSF14,ATAR;TR2,LIGHTSHVEA〉,NG孤(TKPRSP16)，BCMA(TNFRSF17，BCM)，AITR(TNFRSFIS'。,,TNJRSF1$,FIJ14993(TNFRSF19L,BBLT),DR6(TNFRSF21),SOBa(TNJRSF22,TdJQtM,281002汰06Rik),mSOB(THFRS1F23,Tnfthl),。本领域已知的几个PLAD功能域，以及其他PLAD功能域和PLAD功能域的功能性变体，可以使用任何合适的方法很容易地分离和制备，如WO01/58953;美国专利申请公开号2003/0108992Al;Deng等，NatureMedicine,doi:10，1038/腿1304(2005)中描述的方法。许多用于制备多肽，蛋白片段，和肽变体的合适的方法，以及合适的结合分析，如这里描述的TNFR1受体结合分析时本领域熟知和常规的。示例性的PLAD功能域如表8所示表8<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>在一些实施方案中，药物融合体或药物缀合物包括PLAD功能域，如TNFR1、TNFR2、FAS、LT卩R、CD40、CD30、CD27、HVEM、0X40、DR4或其它TNF受体超家族成员的PLAD，或PLAD功能域的功能性变体。PLAD功能域的功能性变体可以是，例如，TNFR1、TNFR2、FAS、LT(3R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40或DR4的PLAD功能域，其中一个或多个氨基酸已经被删除，插入或替换，但是保持与TNFR1、TNFR2、FAS、T卩R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40或DR4的相应PLAD结合能力。功能性变体PLAD功能域的氨基酸序列包括至少大约10个连续氨基酸，至少大约15个连续氨基酸，至少大约20个连续氨基酸，至少大约25个连续氨基酸，至少大约30个连续氨基酸，至少大约35个连续氨基酸，或至少大约40个连续氨基酸的区域，该氨基酸与相应PLAD(例如，TNFR1、TNFR2、FAS、LTpR、CD40、CD30、CD27、HVEM、0X40、DR4的PLAD)的氨基酸序列中的氨基酸相同。而且，或者可选择地，功能性变体PLAD功能域的氨基酸序列与对应PLAD(例如，TNFR1、TNFR2、FAS、LTPR、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40或DR4的PLAD)的氨基酸序列具有至少大约80%，至少大约85%，至少大约90%,至少大约91%，至少大约92%，至少大约93%,至少大约94%,至少大约95%,至少大约96%，至少大约97%,至少大约98%,至少大约99%的同一性。在特定的实施方案中，药物融合体或药物缀合物包括PLAD功能域(例如，TNFR1、TNFR2、FAS、LT卩R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40或DR4的PLAD)或功能性PLAD变体，以及结合血清白蛋白或新的Fc受体的dAb。Domantis有限公司于2005年5月31日提交的国际申请号PCT/GB2005/002163中，描述了可用于本发明的另外的合适的药物，包括多肽药物。合适药物的描述公开于该申请的第45页到50页和表8中。这些药物可用于本发明，例如，制备药物组合物，融合体或缀合物，其包括PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体，具有能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合部分，和另一个多肽药物。国际申请号PCT/GB2005/002163的教导引入这里作为参考，尤其是那些涉及用于本发明的合适药物的教导。药物融合体本发明的药物融合体是包括连续多肽链的融合蛋白，所述的链包含结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段作为第一部分，与多肽药物的笫二部分连接。笫一和第二部分可通过肽键彼此直接连接，或者通过合适的氨基酸，或肽或多肽连接体连接。另外的部分(例如，笫三，第四)和/或连接体序列的存在视情况而定。相对于第二部分(也即，多肽药物)，第一部分可位于N-末端，C-末端或内部。在某些实施方案中，每个部分可存在超过1个拷贝。例如药物融合体可包括两个或多个第一部分，每个都含有结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段(例如，结合人血清白蛋白的VH，和结合人血清白蛋白的VL,或结合人血清白蛋白的两个或多个Vh或VJ。在一些实施方案中，药物融合体是具有下式的连续多肽链a-(X)nl-b-(Y)n2-C-(Z)3-d或a-(Z)n3-b-(Y)n2-C-(X)nl-d;其中X是能特异性结合第一靶的多肽药物；Y是特异性结合血清白蛋白的抗体的单链抗原结合片段；Z是能特异性结合第二靶的多肽药物；a，b，c和d每个独立地缺乏，或者是1到大约100个氨基酸残基；nl是l到大约10;n2是l到大约10;和n3是0到大约10，附带条件是当nl和n2都是l，而且n3是0时，X不包括抗体链或抗体链的片段。在一个实施方案中，X和Z都不含有抗体链或抗体链的片段。在一个实施方案中，nl是l，n3是l，n2是2，3，4，5，6，7，8或9。优选地，Y是特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白重链可变区(VH)，或特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白轻链可变区(VJ。更优选地，Y是结合人血清白蛋白的dAb(例如，VH，Vk或Vx)。在一个特定的实施方案中，X或Z是人IL-lra或人IL-lra的功能性变体。在某些实施方案中，Y包括选自SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的氨基酸序列。在其它的实施方案中，Y包括选自SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22和SEQIDNO:23的氨基酸序列。在其他的实施方案中，药物融合体包括X，与Y，部分，其中X，是多肽药物，附带条件是X，不包含抗体链或抗体链的片段；和Y，是特异性结合血清白蛋白的抗体的单链抗原结合片段。优选地，Y，是特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白重链可变区(VH)，或特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白轻链可变区(VJ。更优选地，Y，是结合人血清白蛋白的dAb(例如，VH，Vk或VJ。X，可位于Y，的氨基端，或Y，可位于X，的氨基端。在一些实施方案中，X，与Y，被氨基酸，或被含有2到大约100个氨基酸的肽或多肽连接体隔开。在一个特定的实施方案中，X，是人IL-lra或人IL-lra的功能性变体。在某些实施方案中，Y，包括选自SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的氨基酸序列。在其他的实施方案中，Y，包括选自SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22和SEQIDNO:23的氨基酸序列。在特定的实施方案中，药物融合体包括结合血清白蛋白的dAb，与人IL-lra(例如，SEQIDNO:28)。优选地，dAb结合人血清白蛋白并包括人构架区。在其他的实施方案中，药物融合体或药物缀合物包括人IL-lra的功能性变体，其与成熟的152个氨基酸形式的人IL-lra具有至少大约80%，或至少大约85%，或至少大约90%,或至少大约95%，或至少大约96°/，或至少大约97%,或至少大约98%，或至少大约99%的氨基酸序列同一性，并拮抗人白细胞介素-1型1受体。(参见，Eisenberg等，Nature343:341-346(1990))。变体可包含一个或多个另外的氨基酸(例如，包含153或154个或更多个氨基酸)。本发明的药物融合体可使用任何合适的方法生产。例如，一些实施方案是通过把编码药物融合体的核酸插入到合适的表达载体中来生产。然后把得到的构建体引入到合适的宿主细胞中用于表达。紧接着表达之后，可使用任何合适的方法，从细胞溶解产物或优选地从培养基或周质分离或纯化融合蛋白。(参见，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel，F.M.等，编辑，Vol.2，Suppl.26，pp.16.4.1-16.7.8(簡))。合适的表达栽体可以含有多个成分，例如，复制起点、选择标记基因、一个或多个表达控制元素，如转录控制元素(例如，启动子、增强子、终止子)和/或一个或多个翻译信号、信号序列或前导序列等。表达控制元素和信号序列，如果存在，可以通过载体或其他来源来提供。例如，克隆的编码抗体链的核酸的转录和/或翻译控制序列可以用来指导表达。启动子为所需宿主细胞中的表达作准备。启动子可以是组成型或诱导型。例如，启动子可以可操作地连接编码抗体、抗体链或其一部分的核酸，使得其指导核酸的转录。各种用于原核生物(例如，用于E.coli的lac、tac、T3、T7启动子)和真核生物宿主(例如，猿病毒40早期或晚期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒长末端重复启动子、巨细胞病毒启动子、腺病毒晚期启动子)的合适启动子是可获得的。此外，表达载体通常包括选择标记用于携带载体的宿主细胞的选择，且在可复制表达载体的情况中，包括复制起点。编码给予抗生素或抗药性产物的基因是常用的选择标记并可以用于原核生物(例如，内酰胺酶基因(氨卡青霉素抗性)、用于四环霉素抗性的T^基因)和真核生物细胞(例如，新霉素(G418或geneticin)、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素或潮霉素抗性基因)。二氢叶酸盐还原酶标记基因允许在各种宿主中使用氨曱喋呤的选择。编码宿主营养缺陷标记基因产物的基因(例如，￡T/2、t//L43、好/5*3)通常用作酵母中的选择标记。还考虑了使用病毒(例如，杆状病毒)或噬菌体载体，以及能够整合至宿主细胞中的载体，如逆转录病毒载体。用于在哺乳动物细胞和原核生物细胞(Eco//)、昆虫细胞(果蝇S2细胞、Sf9)和酵母(甲醇毕赤酵母(///1C/^W0//C")、/7"5/0,/s、酉良酒酵母(S.CWW、/"e))中的合适表达载体是本领域公知的。提供了表达药物融合体的重组宿主细胞和制备在此所述的药物融合体的方法。重组宿主细胞包括编码药物融合体重组核酸。可以通过编码蛋白质的重组核酸在合适宿主细胞中的表达来产生药物融合体，或使用其他合适的方法。例如，可以将在此所述的表达构建体引入合适的宿主细胞中，并在适于构建体表达的条件下培养所得到的细胞(例如，在培养物、动物中)。合适的宿主细胞可以是原核生物的，包括细菌细胞，如大肠杆菌、枯草芽胞杆菌和或其他合适的细菌，真核生物的，如真菌或酵母细胞(例如，尸/c/l/fl/7flW0/7'S、曲霉菌种、酿酒酵母、酉良酒酵母、粟酒裂殖酵母(5^/r,'^sflcc/rfl/Y附j^M/;0附6e)、链孢霉(A^Mra印0n1cm^fl))，或其他低等真核细胞，和高等真核生物的细胞，如来自昆虫(例如，Sf9昆虫细胞(WO94/26087(O'Connor))或哺乳动物(例如，COS细胞，如COS-l(ATCC登录号No.CRL-1650)和COS-7(ATCC登录号No.CRL-1651)、CHO(例如，ATCC登录号No.CRL-9096)、293(ATCC登录号No.CRL-1573)、HeLa(ATCC登录号No.CCL國2)、CV1(ATCC登录号No.CCL-70)、WOP(Dailey等，/Wn/.54:739國749(1985))、3T3、293T(Pear等，TVfl".Jcflrf.5W.f/^.A9。8392-8396(1993))、NSO细胞、SP2/0、HuT78细胞等的那些(参见，例如，Ausubel，F.M.等，编辑，C"/re^/V^oco/s/wMo/ecw/fl/*所o/ogy，GreenePublishingAssociatesandJohnWiley&SonsInc.，(1993))。本发明还包括生产药物融合体的方法，包括在适于药物融合体表达的条件下培养本发明的重组宿主细胞。如果需要，该方法可以进一步包括分离或回收药物融合体的步骤。在另一个实施方案中，将药物融合体的成分(例如，结合人血清白蛋白和IL-lra的dAb)化学装配来形成连续的多肽链。缀合物另一个方面中，本发明提供了包括结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段的缀合物，该片段结合药物。这样的缀合物包括"药物缀合物"，其包括结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段，该片段与药物共价键合，和"非共价药物缀合物"，其包括结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段，该片段与药物非共价键合。优选，缀合物足够稳定使得结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段和药物在体内条件下(例如，给药于人时)彼此保持实质性的结合(共价或非共价)。优选，在体内条件下不高于约20%、不高于约15%、不高于约10°/。、不高于约9%、不高于约8%、不高于约7%、不高于约6%、不高于约5%、不高于约4%、不高于约3°/。、不高于约2%、不高于约1%或基本上没有缀合物分解或分裂来释放药物和抗原结合片段。例如，通过在血清(例如，人血清)中371C孵育药物缀合物或非共价药物缀合物24小时来方便地评定"体内"条件下的稳定性。该方法的一个实施例中，将等量的药物缀合物和未缀合的药物稀释至两个不同瓶子的血清中。将每个瓶子的一半内含物立即在-201C冷冻，并将另一半在371C孵育24小时。然后使用任何合适的方法如SDS-PAGE和/或蛋白质印迹来分析全部的四种样品。可以使用结合药物的抗体来探测蛋白质印迹。如果不存在分解，药物缀合物泳道中的所有药物将跑到药物缀合物的大小处。许多合适的方法可以用来测定"体内"条件下的稳定性，例如，使用合适的分析方法来分析如上所述制得的样品，如色谱法(例如，凝胶过滤、离子交换和反相)、ELISA、质谱等。药物缀合物另一方面中，本发明提供了药物缀合物，该缀合物包括具有血清白蛋白结合特异性的抗体的抗原结合片段，和共价键合所述抗原结合片段的药物，附加条件是药物缀合物不是单个连续的多肽链。一些实施方案中，药物缀合物包括具有血清白蛋白结合特异性的免疫球蛋白重链可变区(VH)，或具有血清白蛋白结合特异性的免疫球蛋白轻链可变区(Vl)，和共价键合所述Vh或Vl的葯物，前提条件是药物缀合物不是单个连续多肽链。优选药物缀合物包括单个结合血清白蛋白的Vh或羊个結合血清白蛋白的Vl。特定的实施方案中，药物缀合物包括结合人血清白蛋白的VKdAb并包括选自SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的氨基酸序列。其他实施方案中，药物缀合物包括结合人血清白蛋白的VHdAb并包括选自SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21SEQIDNO:22和SEQIDNO:23的氨基酸序列。药物缀合物可以包括任何所需的药物并可以使用任何合适的方法制得。例如，药物可以通过合适的连接部分在一个或多个位置如氨基端、羧基端或通过氨基酸侧链直接或间接结合抗体的抗原结合片段，抗体结合血清白蛋白。一实施方案中，药物缀合物包括结合人血清白蛋白的dAb和多肽药物(例如，人IL-lra或人IL-lra的功能变体)，且多肽药物(例如，人IL-lra或人IL-lra的功能变体)的氨基端直接地或通过合适的连接体部分结合dAb的羧基端。另一个实施方案中，药物缀合物包括结合人血清白蛋白的dAb和促胰岛素药物(例如，GLP-1或GLP-1类似物)，且促胰岛素药物的氨基端是游离的(即，在缀合物中不是连接的或结合的)和羧基端直接或通过合适的连接体部分结合dAb的氨基端。其他实施方案中，药物缀合物包括结合人血清白蛋白的dAb和两个或多个共价键合dAb的不同药物。例如，第一个药物可以共价键合(直接或间接)dAb的羧基端和第二个药物可以共价键合(直接或间接)或通过侧链氨基(例如，赖氨酸的s氨基)结合氨基端。优选的实施方案中，促胰岛素药物(例如，GLP-1或GLP-1类似物)的氨基端是游离的。可以使用选择性结合的公知方法来制得这样的药物缀合物。(参见，例如，Hermanson，G.T.5/ocwy'"gfl"recte々Mes，AcademicPress:SanDiego，CA(1996"。可以使用各种用于缀合药物和具有血清白蛋白结合特异性的抗体的抗原结合片段的方法。将根据待缀合的药物来选择特定的方法。如果需要，可以使用含有末端官能团的连接体来连接抗原结合片段和药物。通常，通过将含有反应性官能团(或修饰来含有反应性官能团)的药物与连接体反应或直接与结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段反应来实现缀合。通过使含有(或修饰来含有)可以在合适条件下与第二个化学基团反应因此形成共价键的化学部分或官能团的药物反应来形成共价键。如果需要，可以使用任何合适的方法将合适的反应性化学基团添加至抗原结合片段或连接体。(参见，例如，Hermanson，G.T.JJ/tfcwj'Mg^，AcademicPress:SanDiego，CA(1996).)。许多合适的反应性化学基团组合是本领域已知的，例如，胺基可以与亲电子基团如甲苯磺酸盐、甲磺酰酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基湖泊酰酯(NHS)等反应。硫醇可以与马来酰亚胺、吲哚乙酰基、丙烯酰基、吡啶二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯曱酸硫醇(TNB-硫醇)等反应。醛官能团可以结合含有胺或酰肼的分子，叠氮基可以与三价含磷基团反应来形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺键。将活性基团引入分子中的合适方法是本领域已知的(参见，例如，Hermanson，G.T.说》cw/Mgfl^7fec/m/《Mes，AcademicPress:SanDiego，CA(1996))。一些实施方案中，通过两个硫醇反应来形成二硫键将具有血清白蛋白结合特异性的抗体的抗原结合片段结合药物。其他实施方案中，通过异硫氰酸盐基团和伯胺反应来产生异硫脲鍵将具有血清白蛋白结合特异性的抗体的抗原结合片段结合药物。合适的连接体部分可以是直链或支链的，并包括，例如，四乙二醇、C2C12乙烯、國NH國(CH2)p-NH國或國(CH2)p画NH-(其中p是一至十二)、-CH2-0-CH2-CH2.0-CH2-CH2-0-CH-NH-、包括1至约100个(优选l至约12)氨基酸的多肽链等。非共价药物缀合物一些非共价键(例如，氢键、范德华相互作用)可以产生稳定的、高度特异性的分子间连接。例如，在互补结合伴侣之间通过多个非共价鍵获得的分子识别相互作用成为许多重要生物相互作用的基础，如酶与底物的结合、抗体对抗原的识别、配体与其受体的结合以及蛋白质和肽的三维结构的稳定。因此，可以使用这样的弱非共价相互作用(例如，氢键、范德华相互租用、静电相互租用、疏水性相互租用等)来将药物结合具有血清白蛋白结合特异性的抗体的抗原结合片段。优选，连接抗原结合片段和药物的非共价键是足够强的，使得抗原结合片段和药物在体内条件(例如，给药于人时)下彼此保持实质性的结合。通常，连接抗原结合片段和药物的非共价键具有至少约1(TM"的强度。优选的实施方案中，非共价鍵的强度为至少约IO"M-\至少约10"M1、至少约10"M1、至少约10"M"或至少约10"M1。已知生物素和抗生物素蛋白之间以及生物素和抗生蛋白链菌素之间的相互作用在许多条件下是非常有效和稳定的，并且如在此所述的，生物素和抗生物素蛋白之间或生物素和抗生蛋白链菌素之间的非共价键可以用来制备本发明的非共价药物缀合物。可以在具有血清白蛋白特异性的抗体的抗原结合片段和药物之间直接形成非共价键，或可以在合适的互补结合伴侣之间形成(例如，生物素和抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素)，其中一个伴侣与药物共价键合，互补的结合伴倡与抗原结合片段共价键合。使用互补结合伴侣时，结合伴侣之一可以直接或通过合适的连接体部分与药物共价键合，互补结合伴侣可以直接或通过合适的连接体部分与结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段共价键合。互补结合伴倡是成对的选择性彼此结合的分子。许多互补结合伴侣是本领域已知的，例如，抗体(或其抗原结合片段)与其同源的抗原或抗原决定部位，酶与其底物，以及受体与其配体。优选的互补结合伴侣是生物素和抗生物素蛋白，以及生物素和抗生蛋白链菌素。可以如上所述完成互补结合对的成员与具有血清白蛋白结合特异性的抗原结合片段或药物的直接或间接共价键合，例如，通过将含有反应性官能团(或修饰来含有反应性官能团)的互补结合伴侣与结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段反应，使用或没用连接体。将根据待缀合的化合物(例如，药物、互补结合伴侣、结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段)来选择特定的方法。如果需要，可以使用含有末端反应性官能团的连接体(例如，同型双功能连接体、杂双功能连接体)来连接抗原结合片段和/或药物与互补结合伴倡。一实施方案中，可以使用含有两个不同反应部分的杂双功能连接体。可以选择杂双功能连接体，使得反应部分之一与具有血清白蛋白结合特异性的抗体的抗原结合片段或药物反应，且另一个反应部分与互补结合伴倡反应。可以使用任何合适的连接体(例如，杂双功能连接体)并且许多这样的连接体是本领域已知的并是商业来源可获得的(例如，PierceBiotechnology,Inc.,IL)。组合物以及治疗和诊断方法提供了含有本发明药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)的组合物，包括药物或生理组合物(例如，用于人和/或牲畜给药)。药物或生理组合物包括一种或多种药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)，和药物学上或生理学上可接受的载体。通常，这些载体包括水或醇/水溶液、乳浊液或悬浮液，包括盐水和/或緩沖介质。非肠道载体包括氯化钠溶液、Ringer's葡萄糖、葡萄糖和氯化钠和乳酸盐化Ringer，s。合适的生理学上可接受的佐剂，如果需要将多肽复合物保持于悬浮液中，可以选自增稠剂，如羧曱基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻朊酸盐。静脉内载体包括流体以及营养补充剂和电解质补充剂，如基于Ringer's葡萄糖的那些。防腐剂和其他佐剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体，也可以存在(Mack(1982)/em/"g^w、P/m/7M"ceM"cfl/5Wewc^s,第16版)。组合物可以包括所需量的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)。例如，组合物可以包括约5%至约99%重量的药物缀合物、非共价药物缀合物或药物融合体。特定的实施方案中，组合物可以包括约10%至约99%、或约20%至约99%、或约30%至约99%或约40%至约99%、或约50%至约99%、或约60°/0至约99%、或约70%至约99%、或约80%至约99%、或约90%至约99%、或约95%至约99°/重量的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)。在一个实施例中，组合物是冷冻干燥的(冻干)。在此所述的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)通常在预防、抑制或治疗以下病症中发现用途，这些病症为炎症状态(例如，急性和/或慢性炎症疾病)，如慢性梗塞性肺病(例如，慢性支气管炎、慢性梗塞性支气管炎、气肿)、过敏性超敏、癌症、细菌或病毒感染、肺炎，如细菌性肺炎(例如，葡萄球菌肺炎)、自体免疫失调(其包括，但不限于，I型糖尿病、多发性硬化、关节炎(例如，骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、银屑病关节炎、狼疮关节炎、脊柱关节病(例如，强直性脊柱炎))、全身性红斑狼疮、炎性肠病(例如，节段性回肠炎、溃疡性结肠炎)、Behcet's综合症和重症肌无力)、子宫内膜异位、牛皮裤、腹部粘附(例如，腹部手术后)、哮喘和脓毒性休克。在此所述的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)可以用于预防、抑制或治疗疼痛，如慢性或急性外伤疼痛、慢性或急性神经痛、急性或慢性肌肉骨骼疼、慢性或急性癌症疼痛等。还可以给药在此所述的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)用于诊断目的。在此所述的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)还适用于防止、抑制或治疗肺炎、慢性阻塞性呼吸道疾病(例如，慢性支气管炎、慢性阻塞性支气管炎、肺气肿)、哞喘(例如，类固醇抗性哞喘)、肺炎(例如，细菌性肺炎，如葡萄球菌肺炎)、过敏性肺炎、嗜曙红细胞增多的肺渗透、环境性肺病、肺炎、支气管扩张、嚢性纤维化、间质性肺炎、原发性肺动脉高血压、肺动脉栓塞症、胸膜疾病、纵隔疾病、膈膜疾病、肺换气不足、换气过度、睡眠窒息、急性呼吸窘迫综合征、间皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植对宿主疾病、肺癌、过敏性鼻炎、过敏症、石棉沉着病、曲霉肿、支气管扩张、慢性支气管炎、肺气肿、嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化、入侵性肺炎球菌疾病(IPD)、流感、非结核分枝杆菌、胸膜积液、尘肺病、pneumocytosis、肺炎、肺放线菌病、肺部的肺泡蛋白症、肺炭疽、肺水肿、肺栓、肺炎、肺组织细胞增多病X(嗜酸粒细胞肉芽肿)、肺动脉高血压、肺诺卡氏菌病、肺结核、肺静脉闭塞病、类风湿性肺病、结节病、Wegener's肉芽肿病和非小细胞肺癌。在此所述的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)还适用于防止、抑制和治疗流感、RSV-相关呼吸道疾病和病毒性肺(呼吸道)疾病。在此所述的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)还适用于防止、抑制或治疗骨关节炎或炎性关节炎。"炎性关节炎"指的是那些其中免疫系统引起或恶化关节中炎症的关节疾病，并包括类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎和脊柱关节病，如关节强硬性脊柱炎、反应性关节炎、Reiter's综合症、牛皮裤关节炎、肠炎性关节病、肠炎性脊柱炎、幼年-突发性脊柱关节病和未分化的脊柱关节病。通常由滑液组织和/或滑液的白细胞渗透来表征炎性关节炎。使用在此所述的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)可以预防、抑制或治疗的癌症包括淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤、急性骨髓淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)、肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、结直肠癌、头颈部癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、白血病(例如，急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病)、腺癌、肾癌、造血癌(例如，骨髓发育不良综合症、骨髓增生性失调(例如，真性红血球增多症、基础(或原发性)血小板增多症、先天性骨髓纤维化)等。在此所述的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)还适用于预防、抑制或治疗子宫内膜异位、纤维化、不育症、早产、勃起障碍、骨质疏松、糖尿病(例如，II型糖尿病)、生长失调、HIV感染、呼吸窘迫综合征、肿瘤和尿床。在本发明的应用中，术语"防止"涉及在疾病诱导之前给药保护性的组合物。"抑制"指的是诱导事件之后但在疾病临床显现之前给药组合物。"治疗"涉及在疾病症状变得明显之后给药保护性的组合物。可以用于筛选药物组合物(例如，药物缀合物，非共价药物缀合物、药物融合体)在保护或治疗疾病中有效性的动物模型系统是可获得的。用于测试易感大鼠中全身性红斑狼疮(SLE)的方法是本领域已知的(Knight等，(1978)，丄iV/e丄，147:1653;Reinersten等(1978)iVew/Merf.，299:515)。通过用来自另一个物种的可溶性AchR蛋白诱导疾病在S几/J雌性小鼠中测试重症肌无力(MG)(Lindstrom等，(1988)jrfv.J附/mim/.，42:233)。通过注射II型胶原在小鼠易感林系中诱导关节炎(Stuart等(1984)Jww.及ev./wmwm/.42:233)。已经描述了通过注射分枝杆菌热击蛋白在易感大鼠中谦导adjuvantarthitis的模型(VanEden等，(1988)，淑m"，331:171)。可以在其中通过关节内注射胶原酶诱导关节炎的鼠模型中测定治疗骨关节炎的有效性(Blom，A.B.等，Os&卯W/in'他CaW//flge12:627-635(2004)。按照所述的通过给药甲状腺球蛋白在小鼠中诱导曱状腺炎(Maron等，(1980)义五jc/7.M^/.152:1115)。胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)自然地产生或可以在特定的小鼠林系中诱导，如Kanasawa等，(1984)D/由油g/"，27:113所述的那些。小鼠和大鼠中的EAE作为人MS的模型。在该模型中，通过给药髓磷脂碱性蛋白来诱导脱髓鞘疾病(参见Paterson(l986)7kx^0oA:</附附冊o戸"o/ogy，Mischer等，编辑，Crune和Stratton，NewYork,pp.179-213;McFarlin等(1973)5We脏，179:478:和Satoh等(1987)丄/附附Mwo/.，138:179)。本发明的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)可以用作分开给药的组合物或结合其他药剂。这些可以包括各种免疫治疗药物，如cylcosporine、氨曱喋呤、阿霉素或顺铂、免疫毒素等。例如，给药药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)来防止、抑制或治疗肺炎或呼吸道疾病时，可以结合磷酸二酯酶抑制剂(例如，磷酸二酯酶4的抑制剂)、支气管扩张剂(例如，卩2-激动剂、抗胆碱药、茶碱)、短效P-激动剂(例如，舒喘宁、舒喘灵、班布特罗、非诺特罗、isoetherine、异丙肾上腺素、左沙丁胺醇、metaproterenol、p比布特罗、特布他林和tornlate)、长效P-激动剂(例如，福莫特罗和沙美特罗)、短效抗胆碱能药(例如，溴化异丙托品和溴化oxitropium)、长效抗胆碱能药(例如，tiotropium)、茶碱(例如，短效制剂、长效制剂、吸入的类固醇(例如，倍氯米松、beclomatasone、布地缩松、氟尼缩松、丙酸氟替卡松和强的松)、结合的短效P-激动剂和抗胆碱能药(例如，舒喘宁/舒喘灵/ipratopium，和非诺特罗/ipratopium)、结合的长效p-激动剂和吸入的类固醇(例如，舒喘灵/氟替卡松，和福莫特罗/布地缩松)和粘液溶解剂(例如，厄多司坦、乙酰半胱氨酸、bromheksin、羧甲半胱氨酸、guiafenesin和碘化甘油)给药。例如，给药药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)来防止、抑制和治疗关节炎(例如，炎性关节炎(例如，类风湿性关节炎))时，可以结合緩解疾病的抗风湿药(例如，氨甲喋呤、羟基氯喹、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、咪唑硫嘌呤、D-青霉胺、金(口服或肌内)、二曱胺四环素、葡萄球菌蛋白质A)、非甾族抗炎剂(例如，COX-2选择性NSAIDS，如罗非昔布)、水杨酸盐、糖皮质激素(例如，泼尼松)和止痛药来给药。药物组合物可以包括各种细胞毒素或其他药剂的"混合物"。结合本发明的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)，或包括不同药物的根据本发明的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物组合物、药物融合体)的药物组合物的组合。依照任何合适的技术将药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)给药于任何个体或患者。各种给药途径是可能的，包括，例如，口服、饮食、局部、经皮、直肠、非肠道(例如，静脉内、动脉内、肌内、皮下、皮内、腹膜内、鞘内、关节内注射)和吸入(例如，支气管内、鼻内或口服吸入、鼻内滴液)给药途径，取决于药物组合物和待治疗的疾病或病症。给药可以是所示的局部的或全身的。优选的给药模式可以根据选定的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)和待治疗的病症(例如，疾病)而改变。给药的剂量和频率将取决于患者的年龄、性别和状况，其他药物的同时给药，临床医师考虑的conterindication和其他参数。给药药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)的治疗有效量。治疗有效量是在给药的条件下足以获得所需治疗效果的含量。在此限定的术语"患者"或"个体"包括动物，如哺乳动物，包括但不限于，灵长类(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他牛、绵羊、马、犬、猫、啮齿动物或鼠科种。药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)可以作为中性化合物或作为盐来给药。可以获得含有胺或其他碱基的化合物(例如，药物组合物、药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)的盐，例如，通过与合适的有机或无机酸反应，如氯化氢、溴化氢、乙酸、高氯酸等。具有季胺基团的化合物还含有反阳离子，如氯、溴、碘、醋酸盐、高氯酸盐。可以通过与合适的碱反应来制备含有羧酸或其他酸官能团的化合物的盐，碱例如为，氢氧化碱。酸性官能团的盐含有反阳离子，如钠、钾等。本发明还提供了用于将药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)给药于患者(例如，病人)的药盒，该药盒包括药物组合物(例如，药物组合物、非共价药物组合物、药物融合体)、药物传送装置和任选的使用说明书。可以以制剂如冻干制剂来提供药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)。特定实施方案中，药物传送装置选自注射器、吸入器、鼻内或眼睛给药装置(例如，mister，眼睛或鼻滴管)和无针注射装置。可以将本发明的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)冻干，用于存储和在使用前在合适载体中重建。可以使用任何合适的冻干方法(例如，喷雾干燥、滤饼干燥)和/或重建技术。本领域技术人员将认识到冻干和重建将导致不同程度的抗体活性损失(例如，对于常规免疫球蛋白，IgM抗体易于具有比IgG抗体更高的活性损失)，并认识到可以调节使用水平来补偿。特定的实施方案中，本发明提供了含有如在此所述的冻干(冷冻干燥)药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)的组合物。优选，冻干(冷冻干燥)药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)在水合时，其活性损失不超过约20%、或不超过约25%、或不超过约30%、或不超过约35°/。、或不超过约40%、或不超过约45%、或不超过约50%(例如，对于血清白蛋白的结合活性)。活性是在冻干之前产生药物组合物效果需要的药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)的含量。例如，获得并维持所需血清浓度一段所需时间需要的药物缀合物或药物融合体的含量。可以在冻干前使用任何合适的方法来测定药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)的活性，并可以使用相同方法在复水后测量活性来测定损失的活性量。可以给药含有药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)或其混合物的组合物用于预防性和/或治疗性处理。特定的治疗应用中，将给药条件下足以获得所需治疗或预防效果的含量定义为"治疗有效量或剂量"，这些效果如选定细胞群的至少部分抑制、遏制、调节、杀灭或一些其它可测量参数。获得该剂量需要的含量将取决于疾病的严重程度和病人自身免疫系统和一般健康的一般状态，但通常为约10吗/kg至约80mg/kg，或约0.005至5.0mg药物缀合物或药物融合体每公斤体重，更常使用0.05至2.0mg/kg/剂的剂量。例如，可以每天(例如，每天高达四次给药)、每两天、每三天、每周两次、每周一次、每两周一次、一月一次或每两月一次给药本发明的药物组合物(例如，药物融合体、药物缀合物、非共价药物缀合物)，以剂量，例如，约10jig/kg至约80mg/kg、约100jig/kg至约80mg/kg、约lmg/kg至约80mg/kg、约lmg/kg至约70mg/kg、约lmg/kg至约60mg/kg、约lmg/kg至约50mg/kg、约lmg/kg至约40mg/kg、约lmg/kg至约30mg/kg、约lmg/kg至约20mg/kg、约lmg/kg至约10mg/kg、约10jig/kg至约10mg/kg、约10pg/kg至约5mg/kg、约10pg/kg至约2.5mg/kg、约lmg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg。对于预防性应用，含有药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)或其混合物的组合物也可以以相似或略4氐的剂量给药。含有根据本发明药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合体)的组合物可以用于预防性和治疗性环境中来帮助緩解、灭活、杀灭或去除哺乳动物中选择的靶细胞群。实施例白细胞间介素1受体拮抗剂(ILl-ra)是通过竟争性抑制IL-1结合白细胞间介素1受体(IL-1R1)而阻断IL-1生物活性的拮抗剂。应答炎症刺激物诱导了IL-1并介导了各种生物应答，包括炎症和免疫应答。IL-1具有各种活性，包括软骨降解和骨吸收的刺激。在类风湿性关节炎病人中，局部产生的IL-1的含量升高了且天然产生的ILl-ra的水平不足以竟争这些异常升高的含量。存在几种可用于RA的处理，包括疾病改变抗风湿病药物(DMARDS)，如氨曱喋呤，和生物制剂如KINERET(anakinra、Amgen)。KINERET(anakinra、Amgen)是人白细胞间介素-1受体拮抗剂的重组、非糖基化形式，由153个氨基酸构成并具有17.3千道尔顿的分子量。(KINERET(anakinra、Amgen)的氨基酸序列对应于天然产生IL-lra中的152个氨基酸和另外的N-端蛋氨酸)。KINERET(anakinra、Amgen)适用于降低具有一种或多种DMARD无效的18岁年龄或更大患者中中度至严重类风湿性关节炎的信号和症状。剂量是单次使用每日皮下注射lOOmg药物。^1/2是4-6小时且71%病人在14-28天内产生注射部位反应。在此我们证明了连接治疗多肽和血清-白蛋白结合dAb形成化合物，其(i)具有与治疗多肽单独相似的活性和(ii)还结合血清白蛋白。此外，本发明提供了形成长血清半衰期形式治疗多肽的方法。例如，我们已经将血清白蛋白结合dAb结合ILl-ra，这形成了血清半衰期长于ILl-ra单独的化合物。实施例l结合小鼠、大鼠和人血清白蛋白的结构域抗体的选择该实施例说明了制备对准血清白蛋白的单结构域抗体(dAb)的方法。描述了对准小鼠血清白蛋白(MSA)、人血清白蛋白(HSA)和大鼠血清白蛋白(RSA)的dAb的选择。按照WO2004/003019A2中所述的来选择对准小鼠血清白蛋白的dAb。使用了三个人噬菌体展示抗体文库。每个文库基于VH(V3-23/DP47和JH4b)或VK(ol2/o2/DPK9和JK1)的单个人框架，Vh和Vk具有在互朴性决定片段(CDR1、CDR2和CDR3)中引入的NNK密码子编码的侧链多样性。文库1(VH)多样性位置在H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98文库大小6.2xl09文库2(VH):多样性位置在H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98、H99、HIOO、H100A、HIOOB。文库大小4.3xl09文库3(VK)多样性位置在L30、L31、L32、L34、L50、L53、L91、L93、L94、L96文库大小2xl09已经预选了Vh和Vk文庠，用于各自结合种属配体蛋白A和蛋白L，使得选定文库中的大部分克隆是功能性的。以上所示的文库大小对应于预选后的大小。使用各自分开的文库对血清白蛋白进行两轮选择。对于每次选择，将抗原以4mLPBS中lOOjig/ml的浓度涂覆在免疫管(nunc)上。在第一轮的选择中，将三个文库中的每一个对HSA(Sigma)或MSA(Sigma)分开涂布。在第二轮选择中，将来自六个第一轮选择中每一个的噬菌体对(i)相同抗原再次(例如，笫一轮MSA、第2轮MSA)和(ii)对互换的抗原(例如，笫1轮MSA，第2轮HSA)涂布，形成总共12轮选择。在每种情况中，第二轮选择后，测试48个克隆与HSA和MSA的结合。按照对于scFv片段所述的产生可溶性dAb片段，Harrison等，Af^/iorfs五wz;^附o/.1996;267:83-109，并遵'瞎、才示准ELISA方案(Hoogenboom等，(1991)iVMc/d及d，19:4133)，除了将2%吐温PBS用作阻断緩冲剂并用蛋白质L-HRP(Sigma)(用于VKS)和蛋白质A-HRP(AmershamPharmaciaBiotech)(用于VHS)来检测结合的dAb。以ELISA不溶性形式测试给予表示结合MSA、HSA或两者的高出背景信号的dAb，只结合塑料但全部是血清白蛋白特异性的。然后将克隆测序(参见表l),揭示已经鉴定出21个独特的dAb序列。选定的VKdAb克隆之间的最小相似性(在氨基酸水平)是86.25%((69/80)xl00;所有多样化残基不同时的结果，例如，克隆24和34)。选定的VHdAb之间的最小相似性是94y。((127/136)xl00)。接着，测试血清白蛋白结合dAb从溶液中捕获生物素化抗原的能力。遵照ELISA方案(如上)，除了用ljig/ml蛋白L(用于Vk克隆)和ljig/ml蛋白A(用于Vh克隆)覆盖ELISA平板。按照方案从溶液捕获可溶性dAb，并用生物素化MSA或HSA和抗生蛋白链菌素HRP来检测。已经根据制造商的说明制备了生物素化MSA和HSA，目的是获得每个血清白蛋白分子平均2个生物素。在ELISA中鉴定了二十四个从溶液中捕获生物素化MSA的克隆。这些中的两个克隆(以下的克隆2和38)还捕获了生物素化的HSA。接着，测试dAb结合涂覆于CM5Biacore芯片上MSA的能力。在Biacore上发现八个结合MSA的克隆。对于抗MSA-aAb，按照之前所述的选择对准人血清白蛋白和大鼠血清白蛋白的dAb，除了以下对方案的改变合成Vu结构域的噬菌体文库是文库4G，其是基于包括DP47种系基因和JH4片段的人VH3。通过诱变引入以下特定位置的多样性(使用NNK密码子；根据Kabat编号)，CDR1:30、31、33、35;CDR2:50、52、52a、53、55、56;和CDR3:4-12个多样化残基例如，4GH11中H95、H96、H97和H98，以及4GH19中H95、H96、H97、H98、H99、H100、H100a、H100b、H100c、H100d、H100e和H100f。最后三个CRR3残基是FDY，因此CDR3长度在7-15个残基之间改变。文库包括>1xl(T单个克隆。已经预选VH和VK文库的子集用于各自结合种属配体蛋白A和蛋白L，使得未选择文库中的大部分克隆是功能性的。以上所示文库的大小对应于预选后的大小。使用分开的VH和Vk文库的子集对大鼠和人血清白蛋白进行两轮选择。对于每次选择，将抗原(i)以4mlPBS中100ng/ml的浓度涂覆于免疫管(nunc)上，或(ii)生物素化，然后用于可溶性选择，接着在抗生蛋白链菌素珠子(第1轮中)和neutravidin珠子(笫2轮中)上的捕获。(参见表1用于分离每个克隆的选择策略的详细内容)。在每种情况中，在第二轮选择后.测试24个噬菌体克隆与HSA或RSA的结合。如果选择之一中显著比例的克隆在噬菌体ELISA中是阳性的，然后将该选择的DNA克隆至表达载体中，用于生产可溶性dAb，并挑选单个克隆。按照对于scFV片段所述的生产可溶性dAb片段，Harrison等(MethodsEnzymol.1996;267:83-109)，并遵照标准ELISA方案(Hoogenboom等，(1991)NucleicAcidsRes"19:4133)，除了将2%吐温PBS用作阻断緩冲剂并用抗-myc-HRP检测结合的dAb。然后对于结合MSA、RSA或HSA筛选ELISA中的阳性克隆，使用BIACORE表面等离子共振装置(BiacoreAB)。进一步分析结合MSA、RSA或HSA的dAb。然后将克隆测序并鉴定出独特的dAb序列。表l.结合血清白蛋白的dAb的选择方案<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>然后进一步分析BIACORE芯片(BiacoreAB)上结合血清白蛋白的dAb来获得关于亲和性的信息。使用覆盖血清白蛋白的CM5芯片(羧甲基化的葡聚糖基质)进行分析。流动细胞1是未涂覆的、阻断的阴性对照，流动细胞2覆盖HSA，流动细胞3覆盖RSA，流动细胞4覆盖MSA。将血清白蛋白固定于醋酸盐緩冲剂pH5.5中，使用BIACORE覆盖wizard,将其编程来瞄准覆盖材料的500共振单位(RU)。在大肠杆菌的周质中以200mL-500mL规模表达每种目标dAb并使用用于Vh的蛋白A-流线型亲和树脂(Amersham，UK)和用于Vk的蛋白L-琼脂糖亲和树脂(Affitech，Norway)分批吸收从上清液中纯化，接着用pH2.2的甘氨酸洗脱并緩冲交换至PBS。通过稀释至BIACOREHBS-EP緩冲剂中来制备各种浓度的dAb(5nM至5fiM的范围)并流动通过BIACORE芯片。通过使结合速率和解离速率曲线适合KD范围内dAb浓度产生的痕迹从BIACORE痕迹计算亲和性(KD)。鉴定具有不同血清白蛋白亲和性的dAb。10-100nM范围内包括的是DOM7h-8对HSA、DOM7h画2对HSA和DOM7r-l对RSA的亲和性。100nM至500nM范围内包括的是DOM7h-7对HSA、DOM7h-8对RSA和DOM7h-26对HSA的亲和性。500nM至5fiM范围内包括的是DOM7h-23对HSA和DOM7h-l对HSA的亲和性。图6A-6C中包括了实例痕迹。实施例2.格式化抗血清白蛋白抗体作为与IL-1受体拮抗剂(IL-lra)的融合体该实施例描述了制备包括IL-lra和结合血清白蛋白的dAb的融合蛋白的方法。形成两个融合体，一个具有IL-lra的dAbN-端(MSA16IL1-ra)和一个具有IL-1ra的dAbC-端(ILl-raMSA16)。融合体的次序和载体显示于图2C和2D中。还产生了没有结合MSA的对照融合体，其序列显示于图2E中。KINERET(anakina、Amgen)具有4-6小时的短半衰期，推荐的剂量方案要求每日注射。该方案在71%的情况中在14-28天内导致注射部位反应。因此，具有较长血清半衰期的人IL-lra形式将是有益的并可以提高效率和降低给药频率。这些对于药物学都是理想的特征。克隆简而言之，按照以下详述的设计两个多克隆位点(MCS)并插入具有T7启动子的表达栽体中。设计限制位点用于ILl-ra、dAb、GAS前导和连接体的插入。一个(MCS1+3)编码具有IL-lra的dAbN端的蛋白，另一个(MCS2+4)编码具有ILlra的dAbC-端的蛋白。用于dAbIL-1ra融合体的克隆位点1+3Ndel、填充物、Sall、Notl、填充物、Xhol、BamHIgcgcatatgttagtgcgtcgacgtcaaaaggccatagcgggcggccgctgcaggtctcgagtgcgatggatcc(SEQIDNO:35)。用于ILl-radAb融合体的克隆位点2+4Ndel、填充剂、StUI、Sacl、填充剂、Sall、Notl、TAATAABamHIgcgcatatgttaagcgaggccttctggagagagctcaggagtgtcgacggacatccagatgacccaggcggccgctaataaggatccaatgc(SEQIDNO:36)然后通过使用合适的限制酶消化MCS和连接编码前导的退火引物将GAS前导插入每个载体中。接着，以相似的方式插入编码连接体的连接体DNA。通过PCR(使用设计来添加所需限制位点的引物)从cDNA克隆获得编码IL-lra的DNA并插入TOPO克隆载体。通过核酸测序证实正确序列后，从TOPO载体切除编码IL-lra的DNA并连接含有前导和连接体的载体。最后，从dAb表达载体切除编码dAb的DNA并通过插入片段(通过凝胶过滤纯化的)和载体的SalI/Notl消化插入栽体。表达和纯化在大肠杆菌的周质中表达MSA16ILl-ra、ILl-raMSA16和伪IL-lra并使用蛋白L-琼脂糖亲和树脂(Affitech，Norway)的分批吸收接着用pH2，2甘氨酸洗脱从上清液中纯化。然后通过SDS-PAGE凝胶电泳接着库马西染色分析纯化的dAb。对于蛋白质之一(IL-lraMSA16)，>90%的蛋白质是预期大小的并因此分析活性而不需要进一步的纯化。另一种蛋白(MSA16ILl-ra和伪IL-lra)受到较小条带的污染并因此在pH9的RESOURSEQ离子交换柱上通过FPLC离子交换色谱来进一步纯化。使用0-500mMNaCl的线性盐梯度来洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE凝胶电泳分析后，合并含有预期大小蛋白质的级分，产生>卯％纯度的合并部分。将该蛋白质用于进一步的分析。实施例3.dAbILl-ra融合体体外活性的测定MRC-5IL-8测定测试MSA16IL-lra融合体中和通过MRC-5细胞中的IL-l(ATCC登录号No.CCL-171;美国典型培养收集中心，Manassas，VA)诱导IL國8分泌的能力。该方法改编自Akeson，L.等(1996)JournalofBiologicalChemistry271，30517-30523，其描述了HUVEC中通过1L画1诱导IL-8，使用MRC-5来替代HUVEC细胞系。简而言之，用dAbIL-lra融合蛋白质或IL-lra对照，和IL-l(100pg/mL)将涂布于微量滴定平板中的MRC-5细胞孵育过夜。孵育后，将上清液从细胞中吸出并通过夹层ELISA(R&DSystems)来测量IL-8浓度。融合蛋白中IL-lra的活性导致IL-8分泌的降低。将MSA16IL1-ra融合体的活性和IL-lraMSA16的活性引起的IL-8分泌降低与使用IL-lra对照(重组人IL-lra，R&D系统)所观察到的降低相比较。测定每种测试蛋白的中和剂量50(ND5。)并列于表2中。表2蛋白质鼎soIL誦lra0.5nMMSA16IL國lra2nMIL-lraMSA168nM结果证明了IL-lra作为具有抗血清白蛋白dAb的融合构建体的一部分保留了活性。进一步研究MSA16IL-lra蛋白来测定其药物动力学(PK研究)。血清白蛋白、抗IL-lra夹层ELISA测三种dAb/IL-lra融合体结合血清白蛋白的能力并同时通过单克隆抗-ILra抗体来检测。测试的融合体是MSA16IL-lra、IL-lraMSA16和伪IL-lra。简而言之，用10jig/ml的小鼠血清白蛋白覆盖ELISA平板过夜，用0.05%吐温PBS洗涤5x，然后用4%MarvelPBS阻断1小时。阻断后，用0.05"/0吐温PBS将平板洗涤5x，然后用稀释于4%MPBS中的dAb、IL-lra融合体各自孵育1小时。以l^M浓度和7个连续4-倍稀释度(即降至60pM)来孵育每种融合体。孵育后，用0.05%吐温PBS洗涤5x，然后用制造商推荐的稀释于4%MPBS中的兔子多克隆抗体(ab-2573)对人IL-1受体拮抗剂(Abcam，UK)的稀释度孵育1小时。该孵育后，用0.05%吐温PBS将平板洗涤5x，然后用稀释于4%MPBS中的1/2000稀释度的二抗(抗兔子IgG-HRP)孵育lh。用二抗孵育后，用0.05°/吐温PBS将平板洗涤3x和PBS洗涤2x，然后用每孔50jdTMB微孔过氧化物酶底物(KPL，MA)发展并用每孔50nlHCl来停止反应。在450nM处阅读吸收值。在夹层ELISA中以1jiM浓度在高于2x背景水平来检测MSA16IL-lra和IL-lraMSA16蛋白质。在降至3.9nM的稀释度在2x背景或更高来检测MSA16IL-lra，而仅在降至500nM的2x背景来检测IL-lraMSA16蛋白质。显示出MSA16IL-lra融合体与血清白蛋白的结合对于血清白蛋白是特异性的，因为对照构建体(伪IL-lra)没有结合血清白蛋白。实施例4.小鼠PK研究中药物融合体血清半衰期的测定A.小鼠中MSA结合dAb/HA抗原决定部位标记融合蛋白的血清半衰期的测定在大肠杆菌的周质中表达MSA结合dAb/HA抗原决定部位标记融合蛋白并使用蛋白质L-琼脂糖亲和树脂(Affitech，Norway)的分批吸收接着用pH2.2的甘氨酸洗脱来纯化。在单次静脉内(i.v.)注射约1.5mg/kg至CD1柱系雄性动物后在小鼠中测定融合蛋白的血清半衰期。使用山羊抗-HA(Abcam,UK)捕获和用4°/。Marvel阻断的蛋白质L-HRP(Invitrogen，USA)检测通过ELISA来检测血清水平。用0.05"/。吐温-20PBS洗涤。在lx小鼠血清存在下设定已知浓度MSA结合dAb/HA融合体的标准曲线来确保与测试样品的相容性。用1区隔模型的模型化(WinNonlinSoftware,PharsightCorp"USA)显示出MSA结合dAb/HA抗原决定部位标记融合蛋白具有29.1小时的终止期tl/2和559hr.ng/ml的曲线下面积。这证明了超过短为仅有几分钟的HA抗原决定部位标记肽单独的预定半衰期内的极大提高。该使用HA抗原决定部位标记作为药物模型的研究结果，证明了将药物制为具有结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段(例如，dAb)的药物融合体或药物缀合物时，可以延长药物的体内血清半衰期。还测定了小鼠中抗-MSAdAbDOM7m-16和DOM7m-26，和没有结合MSA的对照dAb的体内半衰期。再者，含有HA抗原决定部位标记的DOM7m-16、DOM7m-26和对照dAb，作为药物(例如，肽药物)模型。该研究中，没有结合MSA的对照dAb，具有20分钟的体内半衰期，而DOM7m-16和DOM7m-26的体内半衰期明显延长。(图12)在进一步的研究中发现DOMm-16在小鼠中具有29.5小时的体内半衰期。另一个研究中，评价了小鼠中含有HA抗原决定部位标记的DOM7h-8的体内半衰期(tl/2P)。用2个区隔模型(WinNonlinSoftware,PharsightCorp"USA)的模型化显示出DOM7h-8具有29.1小时的tl/2p。这些使用HA抗原决定部位标记作为药物(例如，肽药物)模型研究中的每一个结果证明了将药物制为具有结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段(例如，dAb)的药物融合体或药物缀合物时，药物的体内血清半衰期显著延长。B.小鼠中MSA结合dAb/IL-lra融合蛋白的血清半衰期的测定在大肠杆菌的周质中表达MSA结合dAb/IL-lra融合蛋白(MSA16IL-lra)并使用蛋白质L-琼脂糖亲和树脂(Affitech，Norway)的分批吸收接着用pH2.2的甘氨酸洗脱来纯化。在单次i.v.注射约1.5mg/kg至CD1柱系雄性动物后测定了小鼠中MSA16IL-lra(DOM7m-16/IL-lra)、具有没有结合MSA的dAb的IL-lra融合体(伪dAb/IL-lra)和融合HA抗原决定部位标记物的抗-MSAdAb(DOM7m-16HA标记物)的体内半衰期。通过IL-lra夹层ELISA(R&DSystems,USA)分析血清水平。在lx小鼠血清存在下设定已知浓度dAb/IL-lra融合体的标准曲线来确保与测试样品的相容性。使用WinNonlin药物动力学软件(PharsightCorp.,USA)来进行模型化。预期与非MSA结合dAb与IL-lra的融合体的对照相比较时，与抗-MSAdAb的IL-lra融合体将显著提高血清半衰期。预测对照非MSA结合dAb/IL-lra融合体具有短的半衰期。研究的结果列于表3中，并显示出具有抗MSAdAb的IL-lra融合体(DOM7m-16/IL-lra)具有比具有没有结合MSA的dAb的IL-lra融合体(伪dAb/IL-lra)长约10倍的血清半衰期。结果还揭示了与伪/IL-lra(AUC:1.5hr小g/ml)相比较，对于DOM7m-16/IL-lra存在>200倍的浓度时间曲线下面积的提高(增加)(AUC:267hr.ng/ml)。表3试剂血清半衰期DOM7m-16/IL-lra4.3小时伪/IL國lra0.4小时DOM7m-16HA标记物29小时这些研究的结果证明了将药物制为具有结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段(例如，dAb)的药物融合体或药物缀合物时，药物的体内血清半衰期显著延长。实施例5.大鼠中RSA结合dAb/HA抗原决定部位标记融合蛋白的血清半衰期的测定在大肠杆菌的周质中表达具有C-端HA的抗大鼠血清白蛋白dAb，并使用用于VkdAb的蛋白质L-琼脂糖亲和树脂(Affitech，Norway)的分批吸收和用于VHdAb的蛋白质A亲和树脂的分批吸收，接着用pH2.2的甘氨酸洗脱来纯化。为了测定血清半衰期，将一组4只大鼠给予单次i.v.注射1.5mg/KgDOM7r-27、DOM7r-31、DOM7r-16、DOM7r-3或结合无关抗原的对照dAb(HEL4)。通过在7天时间段内从尾巴连续抽血来获得血清样品并使用覆盖于ELISA平板上的山羊抗-HA(Abeam,CambridgeUK)的夹层ELISA，接着用蛋白A-HRP(用于VHdAb)或蛋白L-HRP(用于VkdAb)检测来分析。在lx大鼠血清存在下设定已知浓度dAb的标准曲线来确保与测试样品的相容性。使用2个区隔模型的模型化(使用WinNonlin药物动力学软件(PharsightCorp.,USA)的模型化来计算tl/2卩和曲线下面积(AUC)(表4)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>该使用HA抗原决定部位标记作为药物模型的大鼠研究的结果，证明了将药物制为具有结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段(例如，dAb)的药物融合体或药物缀合物时，药物的体内血清半衰期显著延长。人体中半衰期的预测可以4吏用类比法(allometricscaling)从动物获得的半衰期数据来计算人体中dAb、药物融合体或药物缀合物的体内半衰期。将3种动物中测定的体内半衰期的对数对动物体重的对数作曲线。通过绘制的点画一条直线，并将直线的斜率和y-截距用于计算人体内的体内半衰期，使用公式logY=log(a)+blog(W)，其中Y是人体内的体内半衰期，log(a)是y-截距，b是斜率，W是人的体重。使用体重约35克(例如，小鼠)、约260克(例如，大鼠)和约2710克的动物中获得的体内半衰期数据来产生直线。对于该计算，可以考虑人的体重为70,000克。基于在小鼠和大鼠中获得的半衰期值，预计结合人血清白蛋白的dAbs例如DOM7h-8具有约5.5小时-约40小时的tl/2p,以及在人中约150hr.|ug/mL-约2500hr.|ug/mL的AUC。实施例6.胶原诱导的类风湿性关节炎的关节炎模型小鼠中抗-SAdAb/IL-lra药物融合体的功效测定了融合DOM7m-16/IL-lra和IL-lra在公认的类风湿性关节炎小鼠模型中(DBA/1小鼠中的II型胶原诱导的关节炎(CIA))的功效。在整个研究中，将小鼠饲养于标准2型笼子的测试设备中，圏养于20-24"C的HEPA-过滤的Scantainer中，使用12-小时亮12-小时暗的循环周期。随意提供食物(Harlan-Teklad通用膳食201M和UV灭菌的水。在开始研究前将小鼠放入测试设备中至少7天来确保合适的适应(acclimitization)。将7-8周大的DBA/1小鼠(从TaconicM和B获得，Domholtveg，Denmark)注射一次以1:1比例乳化直至乳浊液稳定的Arthrogen-CIA佐剂和Arthrogen-CIA胶原(两者都是MDbiosceiences)的乳浊液。认为将一滴乳浊液加入一烧杯水中形成固体块时，乳浊液是稳定的。然后给小鼠注射乳浊液。乳浊液注射二十一天后，从研究中除去20只关节炎疾病最严重的动物，将剩余的小鼠分成10只动物一组(每组含有5只雄性和5只雌性)。如表5中所示的处理小鼠，所有处理以计算的浓度来传送，使得给药10ml/Kg。表5组处理1IL-lra,lmg/Kg(腹膜内(ip.)快速浓注)2IL-lra,10mg/Kg(ip.快速浓注)3DOM7m-16/IL-lra,lmg/Kg(ip.快速浓注)4DOM7m-16/IL-lra,10mg/Kg(ip.快速浓注)5ENBREL(entarecept;ImmunexCorporation),5mg/Kg(ip.快速浓注)6盐水(阴性对照)，10ml/Kg(ip.快速浓注)7地塞米松(阳性对照)，0.4mg/Kg(皮下注射)从第21天至第49天每周记录关节炎严重程度的临床评分3次。在第49天将小鼠安乐死。如果存在12或更高的关节炎分值或具有严重的活动问题，将个别小鼠提前安乐死。对于临床评分，根据以下的标准将每肢评分并将全部四肢的分值相加来产生该小鼠的总分。该方法对于每只小鼠得到0至16的分值。评分标准为0=正常；1=轻度但的脚踝或腰有一定的红肿，或限于个别足趾的明显红肿，与受影响足趾的数目无关；2=脚踝和腰的中度红肿；3=整个爪包括足趾的严重红肿；4=涉及多个关节的最大发炎肢。使用来自个体小鼠的临床分值计算每个处理天每个处理组的组平均关节炎分值。将出于伦理原因从研究中退出的任何动物定位于最大16的分值。将组平均关节炎分值对时间作图(图13)。使用Wilcoxon测试进行笫49天的组平均关节炎分值的统计学分析。该统计学分析揭示了与盐水对照组(组6)相比较时，用DOM7m-16/IL-lra(lmg/Kg或10mg/Kg(组3和4)处理的两个组在第49天已经显著提高了关节炎分值(各自为p〈:r/。和p〈o.osn/o显著水平)。相反，用lmg/KgIL-lra的处理(组1)在第49天没有导致显著提高关节炎分值，而用10mg/KglL-lra的处理(组2)在P〈5。/c)的显著水平导致显著提高。用ENBREL(entarecept;ImmunexCorporation)的处理(组5)在第49天在P〈10。/o的显著水平导致关节炎分值显著提高。与使用5mg/KgENBREL(entarecept;ImmunexCorporation)的标准处理(组5)相比较时，用10mg/Kg剂量DOM7m-16/IL-lra的处理(组4)，在第49天提高关节炎分值中是有效的(在P<0.5%水平的显著性)。此外，用较低lmg/Kg剂量DOM7m-16/IL-lra的处理(组3)在笫49天提高关节炎分值中比用相同剂量IL-lra单独处理(组l)(在P〈10。/o水平的显著性)更有效。研究的结果表明在该研究中特定剂量的DOM7m-16/IL-lra比IL-lra或ENBREL(entarecept;ImmunexCorporation)更有效。对IL國lra的应答是剂量依赖性的，和预期的一样，对DOM7m-16/IL-lra的应答也是剂量依赖性的。用lmg/KgDOM7m-16/IL-lra治疗的平均分值显著低于用10mg/kgIL-lra治疗获得的平均分值。这些图示的结果(图13)表明在该研究中用DOM7m-16/IL-lra的处理约比IL-lra有效IO倍。即使DOM7-16/IL-lra融合蛋白含有约一半数量的IL-1受体结合抗原决定部位，观察到DOM7m-16/IL-lra这种上等的功效，如重量基的IL-lra(例如，lmg的DOM7m-16/IL-lra(MW-31.2kD)含有约一半数量的IL-1受体结合抗原决定部位作为lmg的IL-lra(MW-17.1kD)。该研究的结果证明了结合血清白蛋白的dAb可以连接IL-lra(对于RA临床上证明有效的疗法)且所得到的药物融合体具有长的血清半衰期特征(dAb给予的)和IL-1受体结合特征(IL-lra给予的)。由于药物融合体的血清停留时间，治疗CIA有效的DOM7-16/IL-lra的剂量相对于IL-lra显著降低。该研究的结果证明了除了延长的半衰期和提高的AUC的益处，以具有结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段(例如，dAb)的药物融合体或药物缀合物制备的药物是提供超过药物单独优势的高度有效的治疗剂。例如，如在小鼠CIA模型中证明的，较低剂量的药物融合体是有效的并与IL-lra单独相比较，抑制了关节炎症和由IL-1引起的关节损伤更长的时间段，并提供了更大的对抗疾病进程的保护。实施例7.抗SAdAb/Saporin非共价药物缀合物核糖体-灭活蛋白Saporin(抗癌药物)对变性剂和蛋白酶是高度稳定的并已经用作T淋巴细胞的靶向毒素。通过生物素-抗生蛋白链菌素连接结合Saporin和DOM7h-8来制备非共价药物缀合物。用该非共价药物缀合物获得的结果证明了与药物结合时DOM7h-8保留了血清白蛋白结合特征。通过在HB2151细胞中重组核酸的表达来制备各种称为DOM7h-8cys的DOM7h-8变体，其中位置108(SEQIDNO:24的氨基酸108)的C-端精氨酸由半胱氨酸残基替代。使细胞生长并在通过离心回收上清液之前在过夜表达自体资导TBreadymix(MerckKGa，Germany)中30TC诱导72小时。使用蛋白质L-琼脂糖上的亲和性捕获从上清液中纯化DOM7h-8cys。然后用10柱体积2xPBS洗涤树脂并用0.1MpH2的甘氨酸洗脱DOM7h-8cys。用0.2x体积的TrispH8中和洗脱的DOM7h-8cys并浓缩至lmg/ml(使用CENTRICON20ml浓缩器(MilliporeCorp.，MA)。使用NAP5脱盐柱(CEHealthcare/AmershamBiosciences,NJ)将浓缩的DOM7h-8cys緩冲交换至PBS并测定浓度。然后使用EZ-LINK磺-NHS-LC-生物素(PierceBiotechnologyInc.,IL)将dAb生物素化(通过伯胺)。将生物素化dAb与抗生蛋白链菌素-saporin以1:1的摩尔比混合。为了证实形成了dAb/saporin复合物，使用夹层ELISA来检测完整的复合物。以每孔lOOjil体积的10|ig/ml将人血清白蛋白(HAS)覆盖在ELISA平板(Nunc,NY)的一半孔上过夜。在过夜孵育后，用PBS、0.05%吐温洗涤平板3次，然后用2%PBS将整个平板阻断。阻断后，用PBS、0.05%吐温将平板洗涤3次，然后用稀释于2%吐温PBS中至0.5nM的DOM7h-8/saporin非共价缀合物孵育1小时。作为相同ELISA平板上的对照，将0.5iM未结合的saporin和0.5jiM未结合的DOM7h8在2%吐温PBS中孵育。另外的对照是在没有覆盖HAS并用2%吐温阻断的ELISA平板的孔上孵育的相同三种稀释的蛋白质。孵育后，用PBS、0.05%吐温将平板洗涤3次，然后用稀释于2%吐温PBS中1/2000稀释度的山羊抗-saporin多克隆抗体(AdvancedTherapeuticSystems)孵育1小时。孵育后，用PBS、0.05o/o吐温将平板洗涤3次，然后用检测二抗(1/2000的抗山羊IgHRP缀合物)孵育1小时。孵育后，用PBS、0.05%吐温将平板洗涤3次，用PBS洗涤一次，在纸上轻叩干燥。用lOOjil3，3，，5，5，-四甲基联苯胺作为底物来发展ELISA,并用50nl1M盐酸停止反应。通过比较缀合物和任一个未缀合部分的OD600来证实DOM7h-8和saporin的非共价缀合物的存在。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>该研究的结果证明了药物可以缀合结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段，且缀合的抗原结合片段保持血清白蛋白结合活性。此外，由于生物素-抗生蛋白链菌素的稳定性和强度，结果显示出可以制备共价键合的和非共价键合的缀合物保持结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段的结合血清白蛋白活性。实施例8.抗-SAdAb/荧光素缀合物荧光素异硫氰酸盐(FITC)可以与蛋白质上的氨基、巯基、咪唑基、酪氨酰或羰基交联。其具有389Da的分子量，这在大小上与许多小分子药物是相容的。用该缀合物获得的结果证明了抗-sadAb结合小化学部分时保持了血清白蛋白结合特征，并表示小分子药物可以缀合抗國SAdAb。按照实施例7中所述的制备浓缩的DOM7h-8cys。使用NAP5脱盐柱(CEHealthcare/AmershamBiosciences,NJ)将浓缩的dAb緩冲交换至50mMpH8硼酸盐中(结合緩冲剂)，然后使用2mlCENTRICO浓缩器浓缩至2.3mg/ml(MilliporeCorp.,MA)。根据制造商的说明将FITC(PierceBiotechnologyInc.)稀释于二曱基曱酰胺(DMF)中至10mg/ml，然后与dAb在结合緩冲剂中以24:1FITC:dAb的摩尔比混合。使反应进行30分钟。在这点上，使用PBS预先平衡的PD10脱盐柱(GEHealthcare/AmershamBioscinces,NJ)从反应中除去过量的未反应FITC，并用PBS洗脱DOM7h-8cys/FITC缀合物。为了证实FITC/dAb结合反应是成功的，使用夹层ELISA来检测结合的dAb。以每孔lOOjil体积的10pg/ml将人血清白蛋白(HAS)覆盖在ELISA平板(Nunc,NY)的一半孔上过夜。过夜孵育后，用PBS、0.05%吐温将整个平板洗涤3次，然后用2%吐温PBS将全部孔阻断2小时。阻断后，用PBS、0.05%吐温将平板洗涤3次，然后用稀释于2%吐温PBS中至ljiM的DOM7h-8cys/FITC孵育1小时。作为相同ELISA平板上的对照，在2%吐温PBS中孵育1jiM的对照FITC结合的抗体和ljiM的未结合的DOM7h-8。另外的对照是未覆盖HAS并用2%吐温阻断的ELISA平板的孔上孵育的相同三种稀释的蛋白质。孵育后，用PBS、0.05°/吐温将平板洗涤3次，然后用稀释于2%吐温PBS中的l/500稀释度的大鼠FITC抗体(Serotec)孵育1小时。孵育后，用PBS、0.05%吐温将平板洗涤3次，然后用稀释于2%吐温PBSzhong的检测二抗(1/5000抗大鼠IgHRP缀合物)孵育1小时。孵育后，用PBS、0.05%吐温将平板洗涤3次，用PBS洗涤一次，在纸上扣干。用lOOfil3，3，，5，5，-四甲基联苯胺作为底物来il1M盐酸停止反应。通过比较缀合物和任一个未缀合部分的OD600来证实DOM7h-8和saporin的非共价缀合物的存在。表7DOM7h-8/FITCDOM7h-8单独缀合FITC的抗体(阴性对照)OD600(覆盖HAS的平板)0.3800.0420.049OD600(用2%吐温PBS阻断的平板)0.0410.0410.045实施例9.抗-SAdAb/肽缀合物许多肽具有治疗效果。将具有N或C-端半胱氨酸的模型肽结合抗血清白蛋白dAb。在这种情况中，使用四种不同的肽肽1YPYDVPDYAKKKKKKC(SEQIDNO:64);肽2CKKKKKKYPYDVPDYA(SEQIDNO:65);肽3HHHHHHKKKKKKC(SEQIDNO:66)和肽4:CKKKKKKHHHHHH(SEQIDNO:67)。肽1和2包括血球凝集素标记(HA标记)的序列，肽3和4包括His标记的序列。按照实施例7中所述的制备浓缩的DOM7h-8cys。用5mM二硫苏糖醇还原浓缩的dAb,然后使用NAP5脱盐柱(GEHealthcare/AmershamBiosciences,NJ)将緩冲交换至结合緩冲剂(20mMBisTrispH6.5，5mMEDTA，10%甘油)。寸吏用终浓度为5mM二硫代二吡啶阻断半胱氨酸(来防止dAb与其自身二聚)，将其加入dAb溶液形成DMSO中lOOmM二硫代二吡啶的储液。使dAb和二硫代二吡啶来结合20-30分钟。然后使用PD10脱盐柱来除去未反应的二硫代二吡啶，并将dAb洗脱于结合緩冲剂(20mMBisTrispH6.5，5mMEDTA，10%甘油)中。然后将所得到的蛋白质冷冻直至需要。将肽1-4以200nM的浓度分别溶解于水中，使用5mMDTT来还原，然后使用NAP5脱盐柱(GEHealthcare/AmershamBiosciences,NJ)来脱盐。然后以20:1的比例将每种肽加入还原和阻断的dAb的溶液中，用于产生肽-dAb结合。为了证实肽、dAb结合反应的成功，使用夹层ELISA来检测抗-SAdAb/肽缀合物。以每孔lOOpl体积的10[ig/ml将人血清白蛋白涂覆于ELISA平板(Nunc,NY)上过夜。过夜孵育后，用PBS、0.05%吐温将平板洗涤3次，然后用4%MarvelPBS阻断2小时。阻断后，用PBS、0.05%吐温将平板洗涤3次，然后用稀释于4%MarvelPBS中至ljiM的DOM7h-8/肽孵育1小时。作为相同ELISA平板上的对照，在4。/。MPBS中孵育20pM未结合的肽和lfiM未结合的DOM"7h-8。孵育后，用PBS、0.05%吐温将平板洗涤3次，然后用1/2000稀释度的用于肽1和2的山羊抗HA抗体(Abcam)，和稀释于4%MarvelPBS中的1/2000稀释度的NiNTA-HRP(用于肽3和4)孵育1小时。孵育后，用PBS、0.05%吐温将平板洗涤3次，并稀释于4%MPBS中1/2000的抗山羊HRP二抗将含有山羊抗HA抗体的孔孵育lh(其他孔阻断lh)。孵育后，用PBS、0.05%吐温将平板洗涤3次，用PBS洗涤一次，然后在纸上扣干。用100fil3，3，，S，S，-四甲基联苯胺作为底物来发展ELISA，并用1M盐酸停止反应。通过比较缀合物和任一个未缀合部分的OD600来证实DOM7h-8/肽缀合物的缀合物的存在。实施例10该预测实施例描述了用于生产、纯化和表征蛋白融合体的核实合适方法，该融合体包括人PLAD功能域和结合血清白蛋白的免疫球蛋白可变区。将产生融合蛋白质，其中将人TNFR1(PLAD功能域)的配体结合前聚集域与结合血清白蛋白的免疫球蛋白可变区(DOM7h-8)融合(产生PLAD-DOM7h-8)，或其中将PLAD与结合血清白蛋白的免疫球蛋白可变区的C-端相融合(产生DOM7h-8-PLAD)。PLAD的氨基酸序列源自从人文库分离的cDNA序列，并且是SEQIDNO:85的氨基酸残基1-51。DOM7h-8的氨基酸序列是SEQIDNO:24。将在三种不同的表达生物体中表达这些蛋白质大肠杆菌(五c/iw/c似fl"//)、曱醇酵母(尸/cA/fl/7flW0r&)和哺乳动物细胞如HEK293细胞，在各种体外测定和体内研究中纯化和测试的。以下核苷酸序列编码SEQIDNO:85的氨基酸残基1-51:cctc八cctaggggac;agqgagaagagagata。tototgtccccaaggaaaatatatccaccctcaaaataattcoatttgctgtaccaagtqccacaaax3oaacctaotgtacaatgactqtccag0cccgc3ggcaggatacggactgcagg(seqidno!9s〉以下核苷酸序列编码DOM7h-8:gacatccagatoaccc人gtctcc八tcctccctgtctgcatctotaggagacc。TGTCACCATCACTTGCCOCK3CAAGTCA(3A(3CATTAOCAGCT八tttaaattggtatcagcagaaaccago。aaagcccctaagctcctgatctatcggaattcccctttgcaaa(3TGQGGTCCCATCACGTTTC入gtggcagtwatCraQGACA。ATTTCAC丁CTCACCATCAGCAOTCTGCAACCTGAA。ATTTTGCrACGTACTACTGTCAACAGACOrATAGQGT0CCTCCTACGTTCGGCCAagqgaccaaggtgoaaatcaaacgg(seq]dno:99)融合基因构建、克隆和表达通过聚合酶链式反应(PCR)产生融合基因产物，其中在两个分开的反应中扩增两个基因，是用含有重叠序列的一对引物。还使用重叠序列来引入各种长度的多肽连接序列和组合物(例如，弹性的六氨基酸肽，如Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser(SEQIDNO:100)。通过称为SOE-PCR("重叠延伸拼接PCR")的方法将这样形成的两种PCR产物融合在一起，其中将两个模板混合在一起(1:1比例)并在引物不存在下接受几轮PCR扩增。然后将新形成的融合的PCR产物进一步通过PCR扩增，使用包括至少完整融合基因的一对外部引物。用反应位点特异性的限制性内切酶消化基因融合产物、纯化并随后连接用于表达系统的合适载体的多个克隆位点，与载体中任何所需的氨基端分泌和加工序列融合。表9中给出了用于每个反应来产生融合基因的引物，融合基因编码具有编码6氨基酸连接体(ThrValAlaAlaProSer(SEQIDNO:100))的插入DNA片段的融合蛋白。表io种给出了引物的序列。将使用的载体是用于五."/Z的pUC119:在框内作为氨基-端前导序列来克隆酵母锚定的表面蛋白分泌信号(GAS)以瞄准融合产物对周质(半胱氨酸氧化形成二硫键的合适环境)的表达。通过E.coli信号肽酶除去前导序列来留下PLAD-DOM7h-8或DOM7h-8-PLAD融合产物的天然氨基端。通过P^启动子来驱动该系统中的表达并通过将0.05至lmM终浓度的异丙基-硫代-(3-半乳糖苷(IPTG)加入指数生长培养物中来诱导表达。用于哺乳动物细胞(如HEK293T细胞)中表达的pDOM32:克隆PLAD-DOM7h-8(或DOM7h-8-PLAD)，使得融合产物在框内具有V-J2-C分泌信号序列。通过HEK-293细胞中pDOM32的CMV启动子在组成型上驱动表达。分泌时，除去信号肽来产生完整融合蛋白，在氨基端不具有另外的氨基酸。用于五.co//的pET23:PLAD國DOM7h-8(或DOM7h國8-PLAD)作为可溶性蛋白在五.co//细胞质中表达，在IPTG诱导时没有使用任何前导。蛋白质在融合产物的N-端具有另外的氨基端曱硫氨酸残基。通过将0.05至lmM终浓度的异丙基-硫代-P-半乳糖苷(IPTG)加入指数生长培养物中来诱导该系统中的表达。用于甲醇酵母中表达的pPICZa:在框内克隆PLAD-DOM7h-8(或DOM7h-8-PLAD)，使用酵母a交配型因子前导序列来指导分泌至培养上清液。在分泌时通过Kex2和Stel3蛋白酶除去前导序列来留下蛋白质，在氨基-端不具有另外的氨基酸。通过将100%曱醇加入培养基中(0.5%至2.5%终体积)来诱导该系统中的表达。使用5Vi//和7VW/将重组融合基因克隆至pUC119的多克隆位点中，使用5flw好/和好/wrf///克隆至pDOM32中，和使用ATi0/和iVW/克隆至pPICZa中。首先将含有插入片段的质粒转化至五.co//细胞中。然后除去质粒并将目标基因测序来证实正确基因序列的存在。然后大量制备质粒并用于转化至合适的细胞中用于蛋白质表达。用于使用pUC119载体表达的合适细胞选自以下TG1、TB1、HB2151、XL-lBlue、DH5、UT5600、W3110等。用于使用pDOM32栽体表达的合适细胞选自以下HEK293T细胞、NS1、COS、CHO等。用于使用pET23载体表达的合适细胞选自一下BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、PL21(DE3)pLysE、BL21Tuner、Origami、Rosetta等。用于使用pPICZa载体表达的合适细胞选自以下KM71H、X33。使用基于pUC119-、pDOM32-和pPICZa的表达，在培养物上清液中分泌融合产物。因此，表达后，将培养物离心来沉淀细胞。收集上清液，过滤来除去剩余细胞并直接处理用于纯化。使用基于pET-23的表达，将融合产物作为包含体累积至周质中。根据本领域公知的方法制备包含体，包括细胞裂解步骤和几次洗涤步骤来清洗包含体。通过加入高浓度的变性剂(例如，脲、盐酸胍)和还原剂(例如，DTT、p-巯基乙醇、TCEP)。根据本领域公知的方法进行融合产物的再折叠，通过在緩冲剂中使用递减含量的变性剂的緩慢渗析，或通过再折叠緩冲剂中的快速渗析。可以将添加剂如L-精氨酸、甘油、蛋白酶抑制剂如PMSF和氧化-还原剂如GSH和GSSG加入再折叠緩冲剂中来提高再折叠产量。融合蛋白的纯化在尸e/^Wf印^coccfl/蛋白质L琼脂糖柱上亲和纯化融合蛋白质。这利用了PLAD-DOM7h-8(或DOM7h-8-PLAD)融合蛋白的免疫球蛋白可变区成分和蛋白质L之间的特异性高亲和性相互作用。通常，将样品装载于中性PH的蛋白质L柱上。然后在中性pH用高盐洗涤柱子，通过加入低pH緩冲剂来洗脱样品。收集洗脱的样品并中和pH。通过阳离子-或阴离子-交换、大小排阻色谱、疏水性相互作用色谱或其他合适方法来除去任何剩余污染物。通过氨基端测序和MALDI-质谱分析来证实纯化融合蛋白质的同一性，使得获得的序列和质量与基于DNA序列预测的那些。融合蛋白质的活性然后测定具有任何连接体的融合产物的生物活性。PIAD话遂用纯化的PLAD陽DOM7h國8(或DOM7h画8-PLAD)融合蛋白预先孵育人MRC-5细胞，使得PLAD功能域可以在细胞表面上形成与TNFR1的抑制复合物。然后用人TNF-a处理细胞，并在37TC孵育。然后使用IL-8ELISA测量应答TNF刺激分泌MRC-5的IL-8含量。通过剂量应答性的IL-8分泌抑制来表示融合蛋白质的PLAD活性。戎j&^-f对于PLAD-DOM7h-8(或DOM7h-8-PLAD)融合蛋白对血清白蛋白亲和性的分析，将CM-5BIAcore芯片在pH5.5结合约500共振单位的白蛋白并通过将稀释于BIAcoreHBS-EP緩沖剂中的纯化融合蛋白质以5nM至5jiM流过BIAcore芯片来产生结合曲线。通过将on-rate和off-rate曲线式和美中融合蛋白1^范围内产生的痕迹来计算亲和性(KD)，并与融合伴侣(作为分开的分子实体)不存在下的DOM7h-8的亲和性相比较(Kd:人血清白蛋白为70nM)。秀參^力夢^^&:将几组4只一组的大鼠给予静脉内快速浓注1.5mg/kg融合蛋白或结合血清白蛋白的对照免疫球蛋白可变区(两者都用^H-NSP放射性标记)，并在7天的时间段内从尾静脉获得血清样品用于放射活性分析。使用WinNonlin软件将血清浓度vs时间缺陷适合1或2区室模型。对于融合蛋白期望的末期半衰期是15小时的阶数，只要PLAD部分没有影响结合血清白蛋白的免疫球蛋白可变区的末期半衰期。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>表10<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>尽管已经参照其优选实施方案特别地显示并描述了本发明，本领域技术人员将理解其中可以形成各种形式上和详细内容的改变，而没有脱离所附权利要求包括的本发明的范围。权利要求1.一种药物融合体，其包括X’和Y’部分，其中X’是PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体；且Y’是具有能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合部分。2.权利要求1的药物融合体，其中所述多肽结合部分特异性结合血清白蛋白。3.权利要求1的药物融合体，其中所述多肽结合部分是特异性结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段。4.权利要求1-3中任何一项的药物融合体，其中所述的PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体包括一个至少大约10个连续氨基酸的区域，所述氨基酸与选自TNFR1、TNFR2、FAS、LT|3R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40和DR4的PLAD功能域的PLAD功能域的氨基酸序列中的氨基酸相同。5.权利要求4的药物融合体，其中PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的氨基酸序列与选自TNFR1、TNFR2、FAS、LT卩R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40和DR4的PLAD功能域的PLAD功能域的氨基酸序列具有至少大约90%的氨基酸序列同一性。6.权利要求5的药物融合体，其中所述的PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的氨基酸序列与选自SEQIDNO:87、SEQIDNO:88、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDNO:91、SEQIDNO:92、SEQIDNO:93、SEQIDNO:94、SEQIDNQ:95、SEQIDNO:96和SEQIDNO:97的氨基酸序列具有至少大约90%的氨基酸序列同一性。7.—种药物融合体，其包括X，和Y，部分，其中X，是PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体；且Y，是特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白重链可变区，或特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白轻链可变区。8.权利要求7的药物融合体，其中X，位于Y，的氨基端。9.权利要求7的药物融合体，其中Y，位于X，的氨基端。10.权利要求7-9中任何一项的药物融合体，其中重链可变区和轻链可变区能特异性结合人血清白蛋白。11.权利要求10的药物融合体，其中Y，包括选自SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的氨基酸序列。12.权利要求10的药物融合体，其中Y，包括选自SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22和SEQIDNO:23的氨基酸序列。13.权利要求7-12中任意一项的药物融合体，其中所述的PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体包括一个至少大约10个连续氨基酸的区域，所述氨基酸与选自TNFR1、TNFR2、FAS、LT(3R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40和DR4的PLAD功能域的PLAD功能域的氨基酸序列中的氨基酸相同。14.权利要求13的药物融合体，其中PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的氨基酸序列与选自TNFR1、TNFR2、FAS、LT|3R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40和DR4的PLAD功能域的PLAD功能域的氨基酸序列具有至少大约90%的氨基酸序列同一性。15.权利要求14的药物融合体，其中所述的PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的氨基酸序列与选自SEQIDNO:87、SEQIDNO:88、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDNO:91、SEQIDNO:92、SEQIDNO:93、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96和SEQIDNO:97的氨基酸序列具有至少大约卯％的氨基酸序列同一性。16.—种药物缀合物，其包括特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白重链可变区，或特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白轻链可变区，和与所述免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区共价键合的PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体。17.权利要求16的药物缀合物，其中PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体与所述免疫球蛋白重链可变区或免疫球蛋白轻链可变区通过连接体部分共价键合。18.权利要求16或17的药物缀合物，其中特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白重链可变区，或特异性结合血清白蛋白的免疫球蛋白轻链可变区，包括选自SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQEDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22和SEQIDNO:23的氨基酸序列。19.权利要求16-18中任意一项的药物缀合物，其中所述的PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体包括一个至少大约10个连续氨基酸的区域，所述氨基酸与选自TNFR1、TNFR2、FAS、LT卩R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40和DR4的PLAD功能域的PLAD功能域的氨基酸序列中的氨基酸相同。20.权利要求19的药物缀合物，其中PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的氨基酸序列与选自TNFR1、TNFR2、FAS、LT卩R、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40和DR4的PLAD功能域的PLAD功能域的氨基酸序列具有至少大约90%的氨基酸序列同一性。21.权利要求20的药物缀合物，其中所述的PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的氨基酸序列与选自SEQIDNO:87、SEQIDNO:88、SEQIDNO:89、SEQIDNO:卯、SEQIDNO:91、SEQIDNO:92、SEQIDNO:93、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96和SEQIDNO:97的氨基酸序列具有至少大约90%的氨基酸序列同一性。22.—种分离的或重组的核酸，其编码权利要求1-15中任意一项的药物融合体。23.—种核酸构建体，其包括权利要求22的重组核酸。24.—种宿主细胞，其包括权利要求22的重组核酸或权利要求23的构建体。25.—种生产药物融合体的方法，所述包括在适于表达所述的重组核酸的条件下保持权利要求24的宿主细胞，借此生产药物融合体。26.—种药物组合物，其包括权利要求1-21中任意一项的药物融合体或药物缀合物与生理学上可接受的载体。27.—种治疗患有炎性疾病的个体的方法，所述方法包括对所述个体给药治疗有效量的权利要求1-21中任意一项的药物缀合物或药物融合体。28.权利要求27的方法，其中所述炎性疾病是关节炎。29.用于治疗、诊断或预防的权利要求1-21中任意一项的药物缀合物或药物融合体。30.权利要求1-21中任意一项的药物缀合物或药物融合体在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途。31.权利要求30的用途，其中所述炎性疾病是关节炎。32.权利要求1-21中任意一项的药物缀合物或药物融合体在制备用于治疗肺炎症或呼吸道疾病的药物中的用途。33.—种药物组合物，其包括与多肽结合部分键合的PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体，该多肽结合部分具有能特异性结合增加体内血清半衰期的多肽的结合位点，其中相对于所述的PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体，所述药物组合物具有较长的体内血清半衰期，而且具有所述PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的至少大约90%的活性。34.—种药物融合体，其包括第一部分和第二部分，其中笫一部分是PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体，笫二部分是延长体内血清半衰期的多肽。35.—种药物缀合物，其包括与延长体内血清半衰期的多肽缀合的PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体。全文摘要提供了含有PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的药物组合物，融合体和缀合物。含有PLAD功能域或PLAD功能域的功能性变体的药物融合体和缀合物与结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段缀合连接。与未缀合的或未融合的治疗或诊断剂相比，药物组合物，融合体和缀合物具有较长的体内半衰期。文档编号C07K16/46GK101111522SQ200580047682公开日2008年1月23日申请日期2005年12月1日优先权日2004年12月2日发明者I·M·汤林森申请人:杜门蒂斯有限公司