专利名称：：糖基化干扰素-β的制备方法
技术领域：
：本发明涉及在无血清培养条件下生产重组人干扰素-P(interferon-beta)的方法、重组人干扰素-P的纯化方法、以及一种具有独特的糖基化模式的干扰素-P蛋白。
背景技术：
：蛋白，通常也称"生物制剂"，作为商品已经变得和药物一样重要。一项最大的挑战是开发出一种以商品化规模而又价廉高效地生产重组蛋白的的方法。生物技术产业广泛使用哺乳动物细胞来制造重组糖基化蛋白用于人类的治疗。已经证明，广泛用于生产多肽的适用细胞应是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。CHO细胞是由Puck(1958)首先从雌性中国仓鼠卵巢的活组织检查培养出来的。从这些原始细胞，培养出了多种具有不同特征的亚系。其中一种CHO细胞系CHO-Kl是需脯氨酸的，具有二倍体的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。源于这种细胞系的另外一种细胞系是二氢叶酸还原酶(DHFR)缺失的CHO细胞系(CHODUKB11)(PNAS77，1980，4216-4220)，其特征是由于DHFR基因突变所致的DHFR功能的缺失和相应的其他基因功能缺失。其它常用于生产供人类使用的蛋白的细胞系是人细胞系，例如人纤维瘤细胞系HT1080或者人胚肾细胞系293，人胚成视网膜细胞衍生的细胞系例如PER.C6,或羊膜细胞衍生的细胞系或神经元衍生的细胞系。适用细胞系的细胞用表达载体稳定转染，该表达载体含有欲生成目的蛋白的编码序列，以及调控序列如启动子、增强子、或polyA信号以保证目的蛋白的稳定和正确表达。表达载体上的其他基因通常是标记基因，例如阳性选择标记(如neo基因)，以及从非转染细胞和瞬时转染细胞中选择稳定转染的细胞。可扩增基因如DHFR基因用于编码序列的扩增。表达目标蛋白的克隆一旦建立，就必须确定用该克隆进行大量生产并能满足人类使用所要求的质量的方法。这些生产方法通常在生物反应器中完成。存在着不同的操作模式。如今，流加式培养和灌流培养是两种主要的用于哺乳动物细胞培养的工业化操作模式，这两种方法需要大量的蛋白(Hu&Aunins1997)。不论选择哪种生产技术，开发的目标都在于研究生产方法以低成本获得保证大规模生产的、批次之间一致的同源性产品。选择流加式培养还是灌流培养主要取决于克隆的生物特点和产品的特征，在一种新药产品的开发过程中需要具体问题具体分析(case-by-case)(Kadouri&Spier1997)。如果选择灌流培养，可以选择的培养系统之一是固定填充床(stationarypackedbed)生物反应器，在该反应器中，细胞被固定在固体载体上。该系统易于操作，而且只要选择了适宜的载体和培养条件的话，可以达到很高的细胞密度(107-108细胞/毫升)。高细胞密度的结果就是需要高速的培养基灌流速率(流加和收获)，以维持细胞活力和生产能力。灌流速率似乎是这种方法的核心参数之一它驱动了蛋白体积产率(volumetricproteinproductivity)和蛋白产品质量，对该方法的总体经济学状况有着巨大影响。至于细胞培养方法，以前的培养基都添加血清，血清是一种通用的用于生产生物活性产品的哺乳动物细胞系的生长和维持的营养添加剂。血清含有激素、生长因子、载体蛋白、黏附因子和扩散因子、营养因子和微量元素等。培养基通常包含多达约10%的动物血清，例如胎牛血清(FBS，也称FCS)。血清虽然使用广泛但却有很多的局限性。血清包含许多种高浓度蛋白，干扰有限数量的由细胞生成的所需目标蛋白。必须将这些来源于血清的蛋白在例如纯化目的蛋白的下游处理中分离出来，这样就使制备复杂化并增加了成本。BSE(bovinospongiformencephalopathy,牛绵状脑病)，一种潜伏期/孵化期很长的传染性牛神经退化性疾病，它的出现提高了对使用动物来源的血清生产生物活性产品的监管关注。因此，非常需要开发出在生物活性产品的生产期间，能够支持细胞生长和生存的非动物源的细胞培养基替代品。通常，细胞培养基包含各种类别的多种成分，例如氨基酸、维生素、盐类、脂肪酸和其他化合物-氨基酸例如，US6,048，728(Inlow等)公开了可以用于细胞培养的下列氨基酸丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸、苏氨酸和缬氨酸。-维生素例如US2003/0096414(Ciccarone等)或US5，811,299(Renner等)描述了可以用于细胞培养的下列维生素生物素、泛酸酯、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、维生素B6、核黄素、维生素B12、维生素B1和腐胺。-盐类例如，US6,399,381(Blum等)公开了一种含有CaCl2、KC1、MgCl2、NaCl、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、亚硒酸钠、CuS04和ZnCb的培养基。另一篇文献US2003/0153042(Arnold等)公开了可以用于细胞培养的无机盐类，描述了一种含有CaCl2、KC1、MgCl2、NaCl、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、CuC12'H20和ZnCl2的培养基。-脂肪酸已知能用于培养基的脂肪酸是花生四烯酸、亚油酸、油酸、月桂酸、豆蔻酸和甲基-P-环糊精，例如见US5，045，468(Darfler等)。应该注意环糊精本身不是脂，但具有与脂类形成复合物的能力，因此在细胞培养基中用于稳定脂类。-其它成分，特别是有希望用于无血清细胞培养基中的成分例如葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸钠、胰岛素或乙醇胺(例如EP274445)，或保护剂例如PluronicF68。PluronicF68(也称Poloxamer188，泊洛沙姆188)是一种环氧乙烷(EO)和环氧丙垸(PO)的共聚物。标准"基础培养基"也是本领域技术人员已知的。基础培养基已经包含以上提到的培养基成分中的几种。常用的基础培养基包括Dulbecco'sModifiedEagles'sMedium(DMEM)、RoswellParkMemorialInstituteMedium(RPMI)或Ham's培养基。目的蛋白在生物反应器中生产出来以后，目的蛋白还需要从细胞培养收获物中纯化出来。细胞培养收获物可以是例如对于细胞内蛋白是细胞提取物，对于分泌蛋白是细胞培养上清液。尽管目前有多种方法适用于大规模制备蛋白，但粗产品如细胞培养收获物中，不仅仅含有目的蛋白，还含有很难从目的蛋白中去除的杂质。卫生当局要求给人类使用的蛋白具有较高的纯度。另一难题是，许多纯化方法可能包含需要使用低pH或者高pH、高盐浓度或其它极端条件，这些条件可能会威胁该种蛋白的生物活性。因此，对于任何一种蛋白，建立一种既能保证足够的纯度，又能保持该蛋白生物活性的纯化方法都是一项挑战。离子交换层析系统己经广泛应用于主要基于电荷差异的蛋白的分离。在离子交换层析中，溶质表面带电荷的膜片，在周围的缓冲液离子强度较低的条件下，会吸附到层析基质上。洗脱通常通过提高缓冲液的离子强度(也就是传导率)，来和溶质竞争离子交换基质上的带电荷膜片得以实现。改变pH因而改变溶质的电荷是获得溶质洗脱的另一种方法。传导性或pH的改变可以是梯度的(梯度洗脱)或者分步的(分步洗脱)。在离子交换层析中使用的树脂可以包括不同的官能团即例如二乙基氨基乙基(DEAE)和二乙基-(2-羟基-丙基)氨乙基(QAE)以氯作为对抗离子，而羧甲基(CM)和磺丙基(SP)以钠作为对抗离子。另一种以疏水性固定相作为分离基础的层析系统也在蛋白纯化中被广泛使用。这类层析系统包括疏水作用层析(HIC)和反相液相层析法(RPLC)。HIC和RPLC分离的理化基础是疏水性，蛋白因其疏水性不同而在疏水固定相上得以分离。反相层析是与HIC密切相关的一种层析法，二者都是基于生物分子溶剂可及性表面的非极性基团和基质的疏水性配合体的相互作用。然而，反相层析所用的配合体比HIC所用的配合体被疏水配合体取代程度更高。HIC吸附剂取代度可能是10-50^imols/mlC2-C8芳香基配体基质，而反相层析吸附剂取代度通常为数百pmols/mlC4-C8芳香基配体基质。Source30RPC层析柱是一种多聚反相基质。它基于严格的单一尺寸的30微米直径的聚苯乙烯/联乙烯苯珠。其特征可以总结如下非常宽的pH范围(l-12)、高选择性、高化学耐受性、高流速下的高载容量和高分辨率。分子量排阻层析(SEC)，又称凝胶过滤层析(GPC)，使用多孔微粒来分离不同尺寸的分子，其通常用于分离生物分子或者测定聚合物的分子量或者分子量分布。比孔径小的分子可以进入微粒因而比不能进入微粒的大分子通过更长的路径，传送时间也更长。比孔径大的所有分子都不被保留而是一起洗脱出来。可以进入微孔的分子根据分子尺寸和形状不同有一个平均阻留时间。因此，不同分子会有不同的柱传送时间。蓝色琼脂糖(BlueSepharose)是一种基于颜料-配合体亲和基质的层析树脂。配合体，CibacronBlueF3G-A，是通过二聚氯化氯环耦合到琼脂糖(SepharoseTM)上的(Clonise等，1987)。蓝色琼脂糖(BlueSepharose)己经用于干扰素-(3的纯化(Mory等，1981)。干扰素-p(干扰素-l3或IFN-(3)是一种天然生成的可溶性糖基化蛋白，属于细胞因子家族。干扰素(IFNs)具有很广泛的生物活性，如抗病毒性、抗增殖性和免疫调节性。三种主要的干扰素是IFN-a、IFN-卩和y-IFN-y。干扰素最初是根据其细胞来源(白细胞、纤维原细胞或T细胞)来分类的。然而，已经明确，一种细胞可以产生多种干扰素。因此白细胞干扰素目前称为IFN-a，纤维原细胞干扰素为IFN-P，T细胞干扰素为IFN-y。还有第四种干扰素，淋巴母细胞干扰素，它是由"Namalwa"细胞系(来源于Burkitt，s淋巴瘤)产生，"Namalwa"细胞系似乎能够产生白细胞IFN和纤维原细胞IFN的混合物。人纤维原细胞干扰素(IFN-P)具有抗病毒活性，且已知能抑制细胞繁殖，其为约20,000Da、由病毒和双链RNA诱发的多肽。Derynck等1980年利用来自该纤维原细胞干扰素的基因核苷序列，用重组DNA技术克隆，推出该蛋白的完整氨基酸序列，有166个氨基酸长。干扰素-P已经被克隆。美国专利No.5，326，859描述了人INF-(3的DNA序列和一种它在细菌如大肠杆菌(E.coli.)中重组表达的质粒。欧洲专利No.0287075描述了一种IFN-(3编码序列转染并能产生重组IFN-(3的CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系。该蛋白被描述成是由"二天线"(两个分支)寡糖糖基化，其特点在于单一的岩藻糖配基。干扰素-(3已在几种细胞系进行了表达，例如CHO细胞、BHK21(幼仓鼠肾细胞)和LTK(小鼠胸苷激酶阴性)细胞(Reiser&Hauser，1987)。DHFR缺乏的CHO细胞系也已经用于干扰素-P的表达(Innis&McCormick，1982),(Chemajovsky等，1984)。已知干扰素以不同的糖形被糖基化。例如，干扰素-P的糖结构表明其包括二天线结构，特点在于单一的岩藻糖和末端的半乳糖的唾液酸化(Conradt等，1987)。糖基化作用对于溶解度很重要，因为干扰素-P在用糖肽酶F区糖基化作用后发生沉淀。另外，大肠杆菌E.coli.生产的IFN-P由于细菌表达系统缺乏糖基化作用出现了折叠问题。欧洲专利No.0529300描述了一种有特殊的糖基化特性的重组干扰素-(3，也就每个寡糖单位有一个岩藻糖的糖结构糖基化。这些糖结构是二天线，三天线或者四天线(分别是二、三或者四个分支的)寡糖。PCT申请案No.WO99/15193也描述了一种以二天线，三天线或者四天线寡糖为特征的重组干扰素-(3的糖基化。组成的单糖包括甘露糖、岩藻糖、N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖和唾液酸。多项研究表明，糖基化对于稳定性也是很重要的。例如，重组干扰素-|3的非糖基化形式的稳定性明显较低，生物活性也较低(Runkel等，1988)。其它研究表明重组的和天然的人干扰素-P蛋白有不同的糖基化模式(Kagawa等，1988)。干扰素-p用作治疗性蛋白药物，也称生物制品，来治疗多种疾病例如多发性硬化症、肿瘤、病毒性疾病如SARS或丙型肝炎病毒感染。因此，需要一种高效生产并纯化干扰素-P与大量表达干扰素-(3的细胞系的方法。
发明内容本发明是基于开发一种在无血清培养基中生产重组人干扰素-p的方法。因此，一方面，本发明涉及一种生产糖基化重组体，优选生产人干扰素-P的方法，该方法包括在无血清培养基中培养干扰素-P生产细胞的步骤，该无血清培养基包括-大约10-约30mMHEPES，优选20mMHEPES;-大约0.5-约3mM脯氨酸，优选大约lmM脯氨酸；和-大约5500-约7700mg/L氯化钠，优选大约6100mg/L氯化钠。本发明还基于开发一种从液体特别是从来源于干扰素-(3生产的细胞培养收获物中纯化重组干扰素-(3的方法。因此，本发明的第二方面，涉及一种从流体中纯化重组干扰素-!3的方法，包括以下步骤-使液体经过亲和层析法处理；-使亲和层析的洗脱液经过阳离子交换层析法处理；-使阳离子交换层析的洗脱液经过RP-HPLC进行疏水层析法处理。对本发明的方法生产的干扰素-P的分析表明，它是一种差异糖基化干扰素-|3的组合物，也就是说，一种具有独特的糖基化模式或者形式的干扰素-p。因此，第三方面，本发明涉及一种干扰素-P组合物，该组合物包括含有2个或3个岩藻糖的寡糖结构。本发明的另外一个方面，是根据本发明的方法生产的重组人干扰素-P在制备治疗肿瘤、多发性硬化症和病毒感染的药物中的应用，和使用本发明的无血清培养基来生产干扰素-P。图l是产生干扰素-P生成细胞系的方法的流程图。图2是干扰素-p-la的一种新型纯化方法的流程图。图3是各批干扰素-P-la的ES-MS转换图谱，其中图的上部显示有寡糖结构的示意图。图4是新方法获得的干扰素-(3-la的ES-MS转换图谱，其中P-蛋白(干扰素-卩)；FucBiant:岩藻糖糖基化的二天线复合体型寡糖；FucTriant:岩藻糖糖基化的三天线复合体型寡糖；FucTetrean，岩藻糖糖基化的四天线复合体型寡糖；SA-唾液酸。图5是干扰素-(3-la的寡糖结构；其中图5A是主要寡糖I.二唾液酸化的二天线(NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc)II.单唾液酸化的二天线(NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc)图5B是次要寡糖，其中I.非唾液酸化的二天线结构(Hex5.HexNAc4.Fuc)II.具有N-乙酰半乳糖胺重复结构的单唾液酸化的和二唾液酸化的三天线结构或二唾液酸化的二天线结构(NeuAc2.Hex6.HexNAc5.Fuc)III.具有N-乙酰半乳糖胺重复结构的三唾液酸化的三天线结构或三唾液酸化的四天线结构(NeuAc3.Hex7.HexNAc6.Fuc);图5C是有2个或3个岩藻糖残基的次要寡糖，其中I.具有两个岩藻糖的单唾液酸二天线结构(NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2)II.具有两个岩藻糖的二唾液酸二天线结构(NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2)III.具有三个岩藻糖的二唾液酸化的二天线结构(NeuAc2,Hex6.HexNAc5.Fuc3)图6是具有泛甲基化糖的新的IFN-(5-la的MALDI图谱。具体实施方式本发明的第一方面是基于开发一种在无血清培养条件下生产重组干扰素-|3的方法。根据本发明，该被糖基化的重组干扰素-(3的生产方法包括在无血清培养基中培养产生干扰素-(3细胞的步骤，该无血清培养基包括-约10-约30mMHEPES，优选20mMHEPES;-约0.5-约3mM脯氨酸，优选约lmM脯氨酸；和-约5500-约7700mg/L氯化钠，优选约6100mg/L氯化钠本发明的无血清培养基可能包括，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21mMHEPES(2-(4-(2-羟乙基)-l-哌嗪基)乙磺酸)缓冲液。它可能还包括例如0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3或3.1mM脯氨酸。本发明的无血清培养基中氯化钠的浓度可能是例如大约5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000或7100mg/L。在一个优选的方式中，本发明的无血清培养基还进一步包括约10至约20，优选15mg/mL的酚红。酚红的浓度可以是例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21mg/mL。在本发明的框架中，上述的化合物可以用于任何已知的适宜的无血清培养基。下面列入这些无血清培养基的例子土肯养基生产商货号EX-CEIX302JRH14312-1000MEX-CEIX305了RH14335-1000MCH0-CD3SigmaC-1490CHOIIIPFMGibco96-0334SACHO-S-SFMIIGibco12052-098CHO-DHFRSigmaC-8862ProCHO5CambrexBE12-766Q16SFM4HyCloneSH30549.01UltroCHOCambrex12-724QHyQPFCHOHyCloneSH30220.01HyQSFXCHOHyCloneSH30187.01HyQC画4CHOHyCloneSH30558.01ISCHO匿CDIrvineScientific#91119ISCHO陽VIrvineScientific#9197根据本发明可以培养的干扰素-p生产细胞，可以是任何的经过修饰以表达干扰素-卩的哺乳动物细胞，包括动物细胞和人细胞，优选分泌表达干扰素-(3的动物细胞，例如3T3细胞、COS细胞、人骨肉瘤细胞、MRC-5细胞、BHK细胞、VERO细胞、CHO细胞、CHO-S细胞、HEK293细胞、常人纤维母细胞、基质细胞、肝细胞和PER,C6细胞。用于本发明的方法的细胞优选干扰素-(3表达CHO克隆，例如Reister&hauser(1987)所描述的细胞系或Innis&McCormick(1982)所描述的细胞系。此处所指的"干扰素-P"，又称IFN-p，包括来源于任何物种的干扰素-|3，优选人干扰素-P，它是一种166个氨基酸的糖基化蛋白，分子量大概为22,500道尔顿。此处所指的"干扰素-l3"，还包括IFN-(3的功能衍生物，其突变体、类似物或其片段。"干扰素-卩la"是指糖基化的干扰素-p。干扰素-P的活性可以采用例如根据世界卫生组织天然干扰素-卩标准(第二版干扰素国际标准，人纤维母细胞GB23902531)校准的参考标准进行测定。其单位用每毫克干扰素-P-la的抗病毒活性的国际单位表示(IU)，采用WISH细胞和水疱性口炎病毒进行体外细胞病变效应生物测定。IFN-p的MIU和mcg转换表MIU3121824mcg11446688在本发明的范围内所使用的"变异体"或"突变蛋白"，指的是(HNF的类似物，该类似物中，天然IFN-p中的一个或多个氨基酸残基为不同的氨基酸残基替换，或被去除，或让一个或多个氨基酸残基加入到天然IFN-P序列中，与野生型IFN-p相比，不会太多地减弱产物的活性。这些突变蛋白可由已知的合成技术和/或点突变技术或任何其它适宜的技术制备。根据本发明，"变异体"或"突变蛋白"还包括有核酸例如DNA或RNA编码的蛋白，该DNA或RNA能与例如US4,738,931所公开的编码IFN-卩的DNA或RNA在严格条件下杂交。"严格条件"指杂交和之后的洗涤条件，本
技术领域：
的普通技术人员称之为"严格"的条件。见Ausubel等CurrentProtocolsinMolecularBiology,如上，Interscience，N.Y，§§6.3，6,4(1987,1992)。不限于以下例子，严格条件包括洗涤条件比计算的杂交Tm低12-20°C，在例如2xSCC和0.5y。SDS中5分钟，2xSCC和0.1%SDS中15分钟；O.lxSCC和0.5%SDS中37°C30-60分钟，O.lxSCC和0.5%SDS中68。C30-60分钟。本领域的普通技术人员理解严格条件还依赖于DNA序列的长度、寡核苷酸或混合寡核苷酸探针的长度(例如10-40个碱基)。如果使用混合探针，优选使用氯化四甲铵(TMAC)代替SSC。见如上的Ausubel。一致性反映两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系，通过比较序列确定。通常，一致性指两个多肽序列或者两个核苷酸序列，在比较的长度上，核苷和核苷或氨基酸和氨基酸分别严格一致。对于并非严格一致的序列，可以确定"一致％"。通常，将要比较的两个序列比对出二者最大的相关性。这可能包括一个或两个序列的插入"缺口"，以增加联配度。A%—致可以是将比较的所有序列的全长进行比对(也称全长比对)，全长比对特别适合于长度相同或非常相似的序列或者短序列；A。/。一致可以对较短的确定长度的比对(也称局部比对)，局部比对更适合于长度不等的序列或者短序列。两个或多个序列一致或同源性的比对方法在本
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是己知的。因此，可以使用例如WisconsinSequenceAnalysisPackage,version9.1(DevereuxJetal.,1984)所提供的程序，例如BESTFIT和GAP程序，来确定两个多核苷酸的一致性％，和两个多肽的％同源性。BESTFIT采用Smhh&Waterman(1981)的"局部同源性(localhomology)"算法找到两个相似序列间最单一的区域。其它确定序列间一致性和/或相似度的程序在本
技术领域：
也是已知的，例如BLAST程序族(AltschulSF等，19卯，AltschulSF等，1997，可以通过NCBI主页找到www.ncbi.nlm.nih.gov)和FASTA(PearsonWR，1990)。任何这样的变异体或突变蛋白优选具有和IFN-P足够的重叠序列以便具有和IFN-p足够相似的活性。评价任意的变异体或突变蛋白是否具有和IFN-p相似的活性的功能检测方法是，例如，测定干扰素对WISH细胞中水疱性口炎病毒细胞病变效应活性的方法，例如，参照Youcefi等，1985。因此，通过常规实验就可以确定任意的一种突变蛋白是否本质上具有IFN-p相同的活性。任何这样的变异体或者突变蛋白和IFN-p的序列，例如US4,738,931公开的序列，可以有至少40%的一致性或同源性。更优选，有至少50%、60%、70%或80%，或更优选，有至少90%的一致性或同源性。基于本发明的指示，本
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的普通技术人员不需要进一步的实验就可以常规获得根据本发明可以使用的IFN-(3突变蛋白，或其编码核酸，包括有限组的多肽或多核苷酸替代的本质一致的序列。根据本发明，优选的突变蛋白的改变是所谓的"保守性替换"。IFN-P多肽的保守性氨基酸替换可以包括一组同义氨基酸，在该组氨基酸的替换将会保留该分子的生物学功能(Grantham,1974)。显然，在不改变功能的条件下，上述序列中氨基酸的插入和删除可能也属于上述的改变，特别是如果插入和去除只涉及几个氨基酸，例如，在30以下，优选10以下，并且不去除或替换对于功能构象非常关键的氨基酸，如半胱氨酸残基。由这种去除和/或插入产生的蛋白和突变蛋白包括在本发明的范围。可以获得本发明使用的IFN-P突变蛋白的氨基酸替换包括任何已知的方法步骤，例如US专利4,959,314、4,588,585和4,737,462和Mark等公开的方法步骤；5,116,943到Koths等，4,965，195到Namen等；4,879,111到Chong等；和5,017,691到Lee等；和US专利No.4,904，584公开的赖氨酸替换蛋白(Shaw等)。最近，有人描述了一种特殊类型的干扰素突变体。该所谓的"复合干扰素"是非天然产生的IFN突变体(US6,013，253)。"复合干扰素"也可以根据本发明制备。本文所用IFN-p"功能衍生物"包括发生在侧链残基或N-末端或C-末端基团的功能基团制备的衍生物，可以按照现有技术的方法制备。只要其保持了药学上的可接受性也包括在本发明，即它们没有破坏该蛋白的生物学活性，即和相应受体结合的和激发受体信号的能力，而且不会给含有它的组合物带来毒性。衍生物可以有化学基如糖或磷酸残基，只要该衍生物保留了该蛋白的生物活性并且保持药学可接受性。干扰素-P衍生物例如可以包括聚乙二醇侧链，这将会改善蛋白的其它特性例如稳定性、半衰期、生物利用度，人体耐受性或免疫原性。为了实现这个目的，IFN-卩可以连接例如聚乙二醇(PEG)。PEG化可以按照现有技术实施，例如WO92/13095所描述的技术。特别是，PEG-IFN可以根据WO99/55377的指导制备。干扰素-P的功能衍生物可以包含至少一个连接在一个或多个功能基团上的配基，配基出现于一个或多个氨基酸残基上的侧链。特别优选的一个实施方式是配基为聚乙二醇(PEG)配基。根据本发明，IFN-P可以连接几个PEG配基。其它衍生物包括羧基基团脂族酯，羧基基团与氨或与一级胺或二级胺反应的氨基化合物，由乙酰基配基形成的氨基酸残基游离氨基基团的N-乙酰衍生物(例如垸酰基或碳环芳酰基基团)或游离羟基基团(如丝氨酸残基或苏氨酸残基)与酰基配基形成的O-酰基衍生物。根据本发明的"片段"指IFN-I3亚组，g卩，保留了预想的可测定(例如可以用前述的生物测定方法)的生物活性的短肽。通过去除分子任何一段的氨基酸并测定所得物作为受体竞争物的特性，可以很容易地制备片段。每次从多肽的N-末端或C-末端去除一个氨基酸的蛋白酶是已知的。因此，保留预想的生物学活性的片段可以按照常规实验测定，如按照Youcefi等，1985描述的方法。生产本发明的干扰素-l3的方法可以在恒温下也可以在变温下进行。例如整个过程可以在恒为37'C进行。生产过程中温度也可变化，例如初始温度在生长期为37r，之后降低到35。C、33X:或30。C。在一个优选的实施方式中，本发明的方法包括生长阶段I、生长阶段II和生产阶段。其中，生长阶段I在大约37"C进行，生长阶段II在大约35。C进行，生产阶段在大约3(TC进行。确定阶段的结束在本
技术领域：
技术人员的知识范围内，例如可以根据细胞密度、葡萄糖消耗或其它代谢指征确定。通常，生长阶段I可以是例如10到20天。生长阶段II通常要短些，主要是使细胞适应较低的温度。生长阶段II可以是例如1到2天。本发明的方法，可是是流加式也可以是灌流式。根据本发明，优选灌流式。优选地，本发明的方法是灌流式，稀释率(dilutionrate)在每天大约1到大约IO的范围内，优选为每天大约1.5到大约7。在本文中，"稀释率"指稀释率D，用每天培养基体积的升数比总系统工作体积的升数计算(总体积=填充床+调节池体积)。根据本发明，稀释率的范围可以是例如0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5。更优选地，稀释率在细胞培养最初的2-3周从初始值大约1-2/天增加大约7-10/天，特别是在生产阶段。本发明的方法可以在任何适宜的环境中实施，例如皮氏培养皿(Petridish)、T形瓶或转瓶，优选容量大的容器如生物反应器。如果选择灌流方法，系统可以是例如填充床生物反应器，细胞在其中可以固定在固定的载体上，该系统易于操作，并且采用合适的载体和培养条件可以达到很高的细胞浓度(约107-108细胞/毫升)。根据本发明，可以使用的固定载体可以是例如微载体。微载体是很小的固体颗粒，细胞可以在悬浮培养基中生长于颗粒上。细胞可以在微载体上生长和繁殖。典型地，微载体由直径在90-300nm之间的小液珠组成。微载体可由多种已经证明细胞能成功黏附和增殖的材料制成，例如玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯、右旋糖苷、明胶和纤维素。另外，微载体表面覆盖有能促进细胞黏附和生长的物质，例如二乙基氨基乙基、玻璃、胶原或重组蛋白。既有大孔微载体，又有无孔微载体。大孔表面使细胞在接种后，易于进入微载体内部，一旦进入微载体内部，细胞就可以免受生物反应器中机械搅拌和通气所产生的剪切力的影响。根据本发明可以使用的另一种固体载体，例如圆盘(disk)，如由聚酯无纺纤维固定在聚丙烯网薄片上组成的圆盘(例如见美国专利No.5,266,476)。这种圆盘通常经过电稳定性处理，使悬浮细胞易于吸附在圆盘上并被截留在纤维系统，整个培养过程都停留在该处。在圆盘上生长的细胞，细胞浓度和生产能力都可以达到在微载体上生长的细胞的10倍。糖基化干扰素-P的生产方法优选进一步包含收集含干扰素-|3的细胞培养收获物的步骤。在一个优选的实施方式中，细胞培养收获物还进一步进行纯化处理。纯化方法可以是任何产生所需要纯度的干扰素-|3的方法，并且可以包括任何基于层析或任何纯化技术如盐析或类似纯化技术的步骤的组合。根据本发明的第二个方面，纯化是优先进行的。另一方面，本发明涉及一种从液体中纯化重组干扰素的方法，包括步骤a)使液体经过亲和层析法处理；b)使亲和层析的洗脱液经过阳离子交换层析法处理；c)使阳离子交换层析的洗脱液经过RP-HPLC进行疏水层析法处理。步骤(a)优选在蓝色琼脂糖(BlueSepharose)上进行，例如在蓝色琼脂糖(BlueSepharose)fastflow柱上进行。步骤(b)优选在羧甲基树脂如CM琼脂糖FastFlow上进行。在一个优选的实施方式中，本发明的纯化方法在步骤(a)前进一步包括采用微孔过滤澄清流体的方法。在另一个优选的实施方式中，纯化方法进一步包括步骤d)进行超滤和透析；e)使透析液经过分子排阻色谱；f)使分子排阻色谱的洗脱液经过微孔过滤。步骤(f)可以是微孔过滤或纳米过滤。超滤是用来去除前面层析步骤洗脱液中引入的小分子量的成分。例如超滤可以去除前面步骤的有机溶剂、TFA和盐，使所需缓冲液中的干扰素-(3平衡，或浓縮分子达到所要的浓度。这种超滤可以在例如可以阻止分子量小于5kDa成分的超滤介质上进行。如果根据本发明的方法纯化到的蛋白是对人使用，最好还要包括去除病毒的步骤。去除病毒的过滤步骤例如可以在步骤(d)和(e)之间进行，或在步骤(e)之后进行。更优选地，该方法包括两步病毒去除步骤。根据本发明的方法，得到的纯度优选〉80%，更优选〉90%，最优选〉98%。根据本发明纯化干扰素-P的方法优选进一步包括将纯化的干扰素-P制成药学组合物的步骤，可任选地和一种药学上可接受的载体一起掺合。根据本发明的生产或纯化的干扰素-P，可以在任何细胞系或克隆中表达。然而，优选使用缺乏DHFR(二氢叶酸还原酶)活性的、称之为DUKX-B11的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，作为宿主细胞来制备糖基化的干扰素-p。编码人干扰素-(3的DNA序列可见例如美国专利No.5,326,859。本发明的一个优选的实施方式，涉及一种在能够生产至少大约IOOOOOIU特异细胞生产能力(111/106细胞/24小时)的重组人干扰素-|3的转化细胞中，生产重组人干扰素-|3的方法。优选地，细胞能产生至少大约200000IU，或至少300000IU，或至少400000IU，或至少500000IU，或至少600000IU特异细胞生产能力的重组人干扰素-|3。优选地，干扰素-卩生产细胞是由包括至少一个在功能上连锁到人干扰素-p基因上的启动子/增强子元件的核酸构建物转染的CHO细胞。更优选地，此处的至少一个启动子/增强子元件包括一个SV40启动子/增强子。更优选地，核酸构建物包括至少一个由SV40启动子/增强子功能性连锁到人干扰素-(3基因组成的第一个转录单位，其中人干扰素-l3基因功能性连锁到SV40TAg早期多聚腺苷酸化区。也高度优选，核酸构建物进一步含有由至少第二个由一个SV40启动子/增强子、一个小鼠DHFR基因和一个含SV40TAgpolyA的早期多聚腺苷酸化区组成的转录单位。本发明的另一个实施方式，涉及一种用于转染细胞的核酸构建物，它含有至少一个在功能上连锁到人干扰素-P基因上的启动子/增强子元件，其特征在于被转染的细胞能产生至少约200000IU，或至少300000IU，或至少400000IU，或至少500000IU，或至少600000IU特异细胞生产能力(IU/106细胞/24小时)的重组人干扰素-P。优选地，至少一个启动子/增强子元件含有SV40启动子/增强子。更优选地，核酸构建物包括至少一个由SV40启动子/增强子功能性连锁到人干扰素-P基因组成的第一个转录单位，其中人干扰素-)3基因功能性连锁到SV40TAg早期多聚腺苷酸化区。最优选地，核酸构建物进一步含有由至少第二个由一个SV40启动子/增强子、一个小鼠DHFR基因和含一个SV40TAgpolyA的早期多聚腺苷酸化区组成的转录单位。本发明进一步涉及一种可由本发明的方法得到的干扰素-P。本发明的另一方面涉及一种含有特殊糖基化位点的干扰素-P。这种干扰素-卩优选由本发明的方法生产。在一个实施方式中，该糖基化的干扰素-P包括2或3个岩藻糖的寡糖结构。在一个优选的实施方式中，该寡糖结构进一步含有一个唾液酸二天线三岩藻糖化的糖(NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3)。在一个进一步优选的实施方式中，该特殊糖基化方式进一步包括一个非唾液酸化的二天线结构(Hex5.HexNAc4.Fuc3);具有半乳糖胺重复结构的二唾液酸化的三天线结构或二唾液酸化的二天线结构(NeuAc2.Hex6.HexNAc5.Fuc);三唾液酸化的三天线结构(NeuAc3.Hex6.HexNAc5.Fuc);具有半乳糖胺重复结构的三唾液酸化的三天线结构或三唾液酸化的四天线结构(NeuAc3.Hex7.HexNAc6.Fuc);具有两个岩藻糖单位的单唾液酸化的和二唾液酸化的二天线结构(NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2，NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2)。优选地，该特殊糖基化方式含有N-乙酰神经氨酸N-乙酰神经氨酸，其浓度与天然人蛋白糖基化方式的浓度类似。在一个进一步优选的实施方式中，涉及一种本发明的干扰素-p的组合物，其特征在于唾液酸化包括约1-约5%非唾液酸化的N-糖链，约5-约25%单唾液酸化的糖链，约55-约75%二唾液酸化的N-糖链，和约10-约25%三唾液酸化的N-糖链。在本发明的进一步的另一方面涉及根据本发明的干扰素-P在制备治疗人类疾病，特别是多发性硬化症、癌症和病毒感染的药物中的应用。多发性硬化症选自复发性多发性硬化症、非复发性多发性硬化症和早期发病的多发性硬化症。本发明进一步的一方面，涉及一种用本发明的干扰素-(3治疗有需要的患者的方法，包括把本发明的干扰素-P蛋白给予患者。优选地，该治疗是对多发性硬化症的治疗。更特别地，多发性硬化症选自复发性多发性硬化症、非复发性多发性硬化症和早期发病的多发性硬化症。或者，该治疗是抗肿瘤治疗。再或者，该治疗是抗病毒治疗。本发明的另一方面，涉及一种药物组合物，它包括本文所描述的纯化的重组人干扰素-P作为活性成分，和用来使该药物组合物给药的药学上可接受的载体。优选地，具有抗肿瘤或抗病毒活性或抗多发性硬化症的活性的该药物组合物，包括本文所描述的分离纯化的重组人干扰素-|3作为活性成分，和用来使该药物组合物给药的药学上可接受的载体。本发明的另一方面，涉及一种制品，该制品含有包装材料和治疗有效量的分离纯化的重组干扰素-(3，其中所述的包装材料含有指出重组人干扰素-P可以用于人类治疗的说明标签或药品说明书。此处所述的分离纯化的重组人干扰素-|3蛋白或药物组合物优选用于制备治疗复发性多发性硬化症、非复发性多发性硬化症和早期发病的多发性硬化症的药物。对于本
技术领域：
的技术普通技术人员来讲，给予某一特定对象(患者)的处方很容易确定，因为这种处方是本
技术领域：
熟知的。参考文献引入以下的实施例，结合以上的描述，对本发明以非限制性的方式进行阐述。一般来说，本发明所用的命名法和实验方法包括分子的、生物化学的、微生物学的和重组DNA技术。这些技术在文献中都有详尽解释。例如"分子克隆实验室手册，，("MolecularCloning:AlaboratoryManual"),Sambrooletal.,(1980);"现代分子生物学方法，I-III册"("CurrentProtocolsinMolecularBiology",Volumes)Ausubel，R.M.，ed.(1994);"现代分子生物学方法"("CurrentProtocolsinMolecularBiology",)JohnWiley&Sons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,"分子克隆使用指南，，("APracticalGuidetoMolecularCloning")，JohnWiley&Sons,NewYork(1988);Watsonetal.，"重组DNA，，("RecombinantDNA"),ScientificAmericanBooks,NewYork;Birrenetal.(eds)，"基因组分析实验室手册系列,l-4册，，("GenomeAnalysis:ALaboratoryMannualSeries"Vols.1-4)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998);美国专利U.S.Pat.Nos.4，666,828;4，801，531;5,192,659和5,272,057所提出的方法学；"细胞生物学实验室手册，I-III册"("CellBiology:ALaboratoryHandbook",VolumesI-III)，Cellis,J.E.,ed.(1994),ThirdEdition;"动物细胞培养-技术技术手册"("CultureofAnimalCells一AmanualofBasicTechnique"),Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),ThirdEdition;"千核苷酸合成，，("Oligonucleotidessynthesis"),Gait,M丄,ed.(1984);"核酸杂交"("NucleicAcidHybrization，，)Hames,B.D.,andHigginsS丄，eds.(1985);"转录禾口番羽i畢，，("TranscriptionandTranslation")Hames,B.D.,andHigginsS.J.,eds.(1984);"动物细胞培养"("AnimalCellCulture")Freshney，R丄,ed.(1986);"固定化细胞和酶，，("ImmobilizedCellsandEnzymes")IRLPress,(1986);"分子克隆实用指南"("APracticalGuidetoMolecularCloning")Perbal,B"(1984);禾口"酶学方法，1-317册"("MethodsinEnzymology"Vol.1-317)，AcademicPress,(1986);"PCR方法方法和应用指南，，("PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications"),AcademicPress,SanDiego,CA(1990);Marshaketal.,"蛋白纯化和鉴定策略-实验室孝女程手册，，("StrategiesforProteinPurificationandCharacterization—ALaboratoryCourseManual")CSHLPress(1996);此处提出所有这些都作为参考并入本文。至此本发明已经得到全面描述，本
技术领域：
的技术人员可以理解，不需要过度的实验，在很宽的等效参数、浓度和条件范围内可以实施本发明，而不会偏离本发明的精神和范围。虽然结合具体实施方式对本发明进行描述了，然而可以理解还可以有进一步的改进。总之，本发明旨在涵盖根据本发明的原理作出的任何变化、应用或修改，包括超出本发明公开范围，但属于本
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已知或惯例的和本发明相关的内容或者可能使用前述的实质性特征的内容，都认为落入后附权利要求的范围。本文所引用的全部参考文献，包括期刊文章或摘要，在美国或其他国家公开或未公开的专利申请，授权的美国专利或其它参考文献，包括所引用的文献中出现的所有数据、表格、图片和文字全部并入本文作为参考。另外，本文所引用的全部参考文献全部内容并入本文作为参考。对已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法的引用，不是以任何方式承认相关技术已经公开、教导或提示本发明的任何方面、描述或实施方式。前面对具体实施方式的描述充分揭示了本发明的一般本质，他人能够应用本
技术领域：
的知识(包括本文所引用的参考文献的内容)，不需要过度实验，很容易地对这些具体实施方式进行改动和/或修改，而不会偏离本发明的整体思想。因此，认为这些改动和/或修改基于本文的教育和指导，从而包含在所公开的具体实时方式等效范围的内容。可以理解，本文所用的措辞和术语，都是为了描述而不是限制本发明，因此，本说明书的术语或措辞，技术人员都应根据本文的教育和指导，结合本
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普通技术人员的知识来理解。实施例实施例l-高水平生产IFN-B的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)克隆的制备本实施例描述了一种干扰素-卩生产CHO克隆的生成。Mory等(1981)描述了基本程序，特别是关于表达质粒的制备。生成该克隆的总体过程如图1描述。从人外周血细胞基因组DNA库中分离出含有人干扰素编码区的DNA片段。用既含有人IFN-P编码序列又含有小鼠DHFR基因作为选择和标记基因的重组质粒转染DHFR-缺陷型CHO细胞系。在不含胸苷的培养基中进行选择，用氨甲蝶吟(MTX)进行基因扩增，克隆，分离出高水平生产IFN-P-la的细胞。对细胞的基因型和表型进行鉴定。携带hIFN-P和mDHFR基因的表达质粒的构建构建了既含有基因组人hIFN-P编码序列又含有小鼠DHFR抵抗基因的表达载体。该构建物不必对CHO宿主细胞用两种单独的质粒一种含有IFN-P编码序列，第二种含有含有小鼠DHFR序列，进行共转染(Chernajovsky等，1984)。含有IFN-p编码序列的表达载体缺乏IFN-(33'UTR区，因此也缺乏IFN-卩多腺苷化区域。本发明表达载体因此含有两个转录单位，第一个是IFN-p转录单位，由SV40启动子/增强子、人IFN-(3编码序列和SV40TAg早期多腺苷化区域组成，第二个是DHFR转录单位，由SV40启动子/增强子、小鼠DHFR基因和含SV40TAgpolyA的早期多腺苷化区域组成。这些转录单位之后是pBR322质粒的携带有Co正I细菌复制原点和氨苄青霉素耐药基因。表达载体的结构由全序列限制性图谱分析验证(双链，自动序列测定)。用于构建的片段序列的正确性经过双向确认。宿主细胞的描述采用一种缺乏DHFR(二氢叶酸脱氢酶)活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系DUKX-B11作为宿主细胞。该细胞系是从CH0-K1细胞系中分离出的，因Y放射导致甲硫酸乙酯突变而需脯氨酸。DHFR缺乏突变体可以通过暴露于高活性的[3印-脱氧尿苷进行选择(Urlaub&Chasin，1980)。完全缺陷型的突变体的生长需要甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷。DHFR在核酸前体物质合成中的核心作用，以及DHFR-缺乏细胞对氨甲蝶呤(MTX)类似物的敏感性，显示出两大优势。首先，用含有DHFR基因的质粒转染这种DHFR-缺乏细胞，可以选择在无胸苷培养基中生长的重组细胞。其次，在含有高浓度的MTX选择培养基中培养这些细胞可导致DHFR基因及伴随DNA的扩增(Kaufman&Sharp1982,Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,分子克隆实验室手册。ColdSpringHarborLaboratory出版社，ColdSpringHarbor,纽约，1989)。克隆的产生如图1所示，贴壁的、DHFR-缺乏的CHO细胞用上述含有h-IFN-p编码序列和mDHFR标记基因的质粒采用磷酸钙沉淀法转化(GrahamFL&VanDerEB，1973;Busslinger等，1981)。为了扩增转化基因，采用MTX(氨甲蝶呤)处理选择克隆。在MTX选择后，分离克隆。转染DHFR-缺乏的CHO细胞系DUKX-B11在添加了10%FBS的Ham'sNutrientMixtureF12中37°C5%C02培养。CHODUKX-B11细胞在转染前一天接种，接种浓度5xl()S/9cm培养皿。制备CaPOrDNA共沉淀将溶解于0.45mllOmMTris-HClpH7.9，O.IMmEDTA的载体DNA，禾P0.05ml2.5mMCaCl2溶液混合。然后，加入0.5ml280mMNa2HPO4，50mMHEPESpH7.1，轻轻震荡混合，室温保持30-40分钟产生沉淀。将CaP04-DNA加入细胞30分钟后，加入9ml细胞培养基将细胞放回培养箱培养4小时。之后，去除细胞中的培养基，用10%甘油渗透压冲击细胞，4分钟。尔后细胞胰酶解，按1:4-1:10的分离比例在由不含胸苷但添加了150pg/ml脯氨酸和10%经透析的FBS的DMEM培养基(Dulbecco，sModifiedEaglesMedium)进行亚培养。培养在37°C8%C02条件下进行，每3-4天更换选择培养基。构建的WFN-卩生产细胞系的分离在用3mm胰蛋白酶浸泡的纸圆盘经胰蛋白酶消化作用10-12天后，分离出干扰素-卩生产细胞。共得到43个克隆，每个克隆进行培养，细胞培养上清液通过ELISA进行WFN-p产量检测。选择产量大于30，OOOIFN-(3IU/106细胞/24小时的3个克隆进行基因扩增。每个克隆都进行低浓度的MTX处理。能在该处理中存活的细胞群进行较高浓度的MTX处理。亚克隆和克隆选择仅在最后阶段之后进行。选择高产者(大于40,000IFN-I3IU/106邻胞/24小时)进行稳定性研究。选择相对稳定的高产者克隆进行亚克隆。从得到的克隆中，选择出高产稳定的克隆。ELISA测定表明，扩增使IFN-P-la的产量从30,000IU/106增加到50,000IU/106。在IFN-P-la高产克隆初次分离出来以后进行北方杂交分析(Northernblotanalysis)。根据表达构建体预测，一个单个0.9kb的hIFN-pmRNA得到表达(数据未显示)。对原始克隆总RNA进行北方杂交分析，杂交操作如下从琼脂糖甲醛凝胶电泳分离出20吗总RNA。RNA转移到尼龙膜上与IFN-(3DNA探针杂交。分子尺寸标记物(M)为28S和18SrRNA，分别相当于4700和1900的核苷酸(未显示)。主产虔力细胞生产能力如下测定。组织培养(生长)培养基是DMEM培养基，添加脯氨酸(150mg/l)和10%FBS(胎牛血清)或无血清培养基如JRH的Ex-Cell302。干扰素生产克隆细胞接种在TC80瓶中(2x106细胞/瓶)，30ml生长培养基(含FBS的DMEM或无血清培养基)。通过显微镜观察达到初次汇合后，生长培养基换成20ml新鲜培养基，32'C培养24小时。从每个培养瓶中获得培养基样品。用商业化的ELISA试剂盒(例如，日本Tory公司的TorayELISA试剂盒)用ELISA方法测定培养基中IFN-(5-la的含量。特异细胞生产能力用24小时产生的IU/mlIFN-(3-la乘以每个TC80培养瓶的体积除以每瓶的总细胞数(以百万计)计算。结果和结论干扰素-P生产细胞克隆是稳定的细胞系，有较高的重组人干扰素-(3生产能力，范围大约在100，000IU-600，000IU特异细胞生产能力(IU/l()S细胞/24小时)。新的细胞系的平均生产能力是55,600±119,000。也通过相差显微镜对接种l-4天后的普通细胞形态学进行了考察。形态学通过显微摄像记录(未显示)。结果显示，在低密度时(接种24-48小时后)，细胞表现出圆形的针状形态(结果未显示)。细胞汇合时，形成由细长的、针状的和小的、紧密挤压在一起的上皮样细胞组成的紧密的单层细胞(结果未显示)。这些细胞所表现出的形态学特征是典型的CHO细胞的形态学特征。克燈潘應A,邪參驱游房^份藩定使用来源于hIFN-卩的信使RNA(mRNA)的PCRDNA产物来测定编码区核苷酸序列，因为mRNA能提供RNA转录过程正确的直接证据。潔」方兹cDNA和PCR反应细胞总RNA用生长于T形瓶中的处于指数生长期的细胞制备(Chomczynski&Sacchi,1987)。互补DNA(cDNA)用mRNA样品合成，反应包含2微克(吗)总RNA、0.5|iM随机hemamer、2.5mMMgCl2、IXPCRII缓冲液[IOmMTris-HCl(pH8.3)、50mMKC1]、每种dATP，dCTP,dGTP和dTTP各0.5mM、40单位RNA酶抑制剂、和200单位逆转录酶，最终体积为10(V1。RNA模板、引物和无核酸酶的水混合，65t:孵育10分钟，然后放到冰浴中。加入其它成分，反应在42"C下孵育60分钟，然后在7(TC下孵育15分钟然后在4'C下永久保存。RT产物(cDNAs)保存在2(TC以备将来使用。作为对照，制备了包括除了逆转录酶之外的所有成分的反应物。该"无逆转录酶"(noRT)对照可以排除RNA制备物有DNA污染的可能性。PCR扩增使用SRB1API和AP2作为cDNA模板的引物进行SRB1API:CCTCGGCCTCTGAGCTGAGCTATTC(SEOIDNO:1)S腿AP2:CACAAATAAAGCATTTTTTT〖SEOIDNO:2)PCR反应组成如下4.0(ilcDNA反应混合物，50pmol每种引物对，25|ilHotStarTaqMasterMix,反应体积50W。反应在95。C下加热15分钟，然后进行30-35个循环的下列操作(a)94r下加热30秒，(b)55'C下加热30秒和(c)72。C下加热l分钟。最后的一个循环，和开始的30-35个循环相同，不过之后还有10分钟的72'C孵育。WFN-pPCR产物用低熔点(LMT)琼脂糖凝胶电泳纯化，然后用QIAQuick凝胶提取试剂盒(QIAQuickgelextrationkit)提取。，細餅蕭定PCR产物直接采用BigDyeTMTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit试剂盒，用AmpliTaqDNAPolymerase测序。所有测序反应都用5.75%LongRanger凝胶，在AB1373-S自动DNA测序仪上完成。原始数据用ABDAnalysis软件追踪分析。结果PCR扩增得到预测的大约815bp的片段。在(noRT)对照和阴性对照中没有观察到PCR产物。获得了hIFN-P基因蛋白编码区的全序列数据；所有核苷酸在两个或更多的电泳图中阅读(数据未显示)。将序列与表达载体对比时，未发现差异(数据未显示)。结论测序数据表明，WFN-J3基因融合到克隆的基因组中并正确转录成hIFN如RNA。基因复制数的测定基因复制数用BamHI消化，南方杂交测定(Southernblotanalysis)。制备基因复制数分析的探针的特异性引物如下(i)5，PR221626:ATGACCAACAAGTGTCTCCTCCfSEO:IDNO:3)3，PR231217:ACTTACAGGTTACCTCCGAAAC(SEO:IDNO:3)基像资Z)A^游虔/吝^7^"方伊记"o^/zem说o^^^T兹采用改良的盐析法从处于对数生长期的T形瓶培养细胞中分离基因组DNA(Marinez等，1998)。简言之，细胞在Tris-NaCl-EDTA缓冲液中重悬，然后用Tris-NaCl-EDTA-SDS缓冲液裂解。悬浊液用蛋白酶K过夜处理。加入饱和盐溶液和离心后，在水相中加入异丙醇沉淀基因组DNA。用70%的乙醇洗涤后，DNA重悬于TE/RnaseA溶液(10mMTris-HClpH8.0，lmMEDTA，20h1RnaseA)。所有基因组DNA制备样品分成等份，用AfllII、BbsI、Bgl1、DraI、Hincl1、PstI和XmnI消化。表达载体DNA样品用和基因组同样的限制性内切酶消化制备标准品。DNA在琼脂糖电泳上按尺寸进行分离，然后在10xSSC中通过毛细作用转移到尼龙膜上。基因组DNA的上样量为0.5吗。杂交到采用上文提到的引物从质粒中通过PCR扩增的"P-标记的hlFN-p片段，制备出印记。预杂交和杂交在65'C进行。基于^P放射自显影所显现的条带的转移，测定尺寸。表达载体作为对照。基于在445SIPhospholmagerTM(MolecularDynamiccs;Sunnyvale,CA)上计算的条带的32P相对浓度确定复制数。结果对所有干扰素-P生产细胞克隆产生的消化物的片段的尺寸进行分析测定。从干扰素-P生产细胞克隆提取DNA酶的消化物，产生了和用AflIII、BbsI、BgII、DraI、HincII、PstI和XmnI消化表达载体的预测条带相吻合的主要条带。基因组DNA的BgII消化物还观察到弱带(1.77kb)，很可能是不完全消化的结果。这些限制性酶从两侧切割hINP-卩表达单位，显示完整的、功能性的、全长的单位整合到基因组中。在其余的消化物中，观察到表达载体和基因组DNAs的不同带型。这也不在意料之外，因为环形的载体整合到CHO细胞基因组中时肯定存在重排。所测定的细胞克隆的复制数平均为96-105复制/细胞。例如，对于一个组的细胞(n=3)，平均基因复制数为105，标准偏差为23，CV(y。)为22。从对数生长的干扰素-|3生产细胞和未转染的CHODUKX细胞分离总RNA(Chomczynski&Sacchi，1987)。使用的探针包括32P-标记hIFN-(3探针，制备方法见"基因复制数测定"部分和对照G3PDHcDNA探针(Clontech;PaloAlto,CA)。膽全部RNA，按每道5ng，用含有甲醛作为变性剂的琼脂糖凝胶电泳上分离。样品重复上样。RNA在10xSSC中通过毛细作用转移到尼龙膜上。预杂交和杂交在65°C，"限制性内切核酸酶图谱分析"部分所描述的改良的Church&Gilbert溶液中进行。印记和"P-标记的hlFN-P探针以及对照G3PDHcDNA探针杂交。条带尺寸通过印记的放射自显影估计。结果和结论从细胞中观察到一种主要的hIFN-|3mRNA。该mRNA的尺寸估计为0.9kbmRNA。该尺寸和从SV40转录起始位点开始，产生的尺寸约为800核苷酸(不考虑polyA尾巴)的转录体mRNA吻合。总体结论和总结干扰素-(3生产细胞的基因型和表型研究证实了细胞的一致性和稳定性。原点杂交研究表明MFN-P基因到CHO细胞基因组的染色体整合。限制性内切核酸酶图谱特征的比较、细胞DNA序列和mRNA分析表明没有全部DNA重排或MFN-p基因点突变的证据。根据本发明，从克隆的细胞提取的DNA的南方印记分析检测hlFN-(3复制数量水平。结果显示，对所有细胞，基因复制水平在同一范围内，与细胞群倍增水平无关。从细胞制备的北方印记分析显示尺寸约为0.9kb的单一条带。细胞cDNA序列分析证实mRNA序列的正确性，而hIFN-|3基因5'和3'调控区的基因组DNA序列证实完整IFN-P转录单位的整合。总之，已经表明，干扰素-(3生产细胞合成了带有正确的蛋白编码区序列的IFN-|3转录体，显示干扰素-P生产细胞产生具有正确的一级氨基酸序列的人重组IFN-p(h画-(3-la)。为了进行基因型鉴定，对干扰素-(3生产细胞进行了限制性梅切图谱分析。多酶消化物用琼脂糖凝胶电泳分离，转移到尼龙膜上，杂交到标记的WFN-(3特异性探针上。限制性片段的一致性，显示所有细胞库中完整的功能性的WFN-(3表达单位的整合。采用南方印记分析从干扰素-|3生产细胞中提取的DNA，测定hIFN-(3基因的复制数(数据未显示)。结果显示基因复制数为大约100复制/细胞，比文献描述的克隆高大约4倍(Chernajovsky等，1994)。通过北方印记分析，从该克隆的细胞中鉴定出一种约为0.9kb的编码hIFN-卩基因的mRNA(数据未显示)。从细胞mRNA制备出的cDNA进行了序列测定，结果显示，细胞中序列和预期序列100%—致。因此，hlFN-(3基因正确转录成mRNA。对该克隆细胞的hIFN-P基因5'和3'两侧基因组DNA序列进行了测定，发现和表达载体相应的序列以及公开的MFN-P基因序列100%—致。hlFN-(3基因的单染色体整合也通过荧光原位杂交得以确认(FISH，数据未显示)。以上分析也表明生产细胞系的稳定性。因此可以认为转染基因是稳定整合到干扰素-|3生产细胞系中的。实施例2-干扰素-B的生产方法本实验的总体目标是开发一种在无血清培养条件下用实施例1所述的克隆生产IFN-p-la的方法。无血清培养过程是在内部填充了Fibra-Cel载体的75L规模的生物反应器中开展的。细胞复苏，并在商业购买得到并有以下方面改良的无血清培养基中扩增21天。表l无血清培养基的改良<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>将30"09细胞接种在75L生物反应器中(高密度接种)分成以下几个阶段运行-生长阶段I，37°C(工作2天或4天或工作至葡萄糖消耗率(GCR)S2.0士1.0g丄d)-生长阶段II，35r(工作7天或工作至葡萄糖消耗率(GCR)^8.0士0.5g丄".d)-生产阶段，33°C温度策略造成的结果是生产能力为6.0xl06IU/ml生物/天。该生产能力比文献描述克隆(Chemajovsky等，1984)的无血清培养条件中的的生产能力大约高5倍。对于单独添加N-乙酰-半胱氨酸(NAC)或与Zn—起添加(NAC+Zn)是否对生产能力产生有益影响也进行了考察。添加NAC或NAC+Zn将运行结束时的生产能力提高到大约12xl06IU/ml生物/天。还进一步考察了低于66%的接种(1.3><109细胞)以评价其对生长阶段周期、代谢和生产能力的培养。代谢和生产能力不受低密度接种的影响。低密度接种唯一的影响是生长阶段增加了2天。总之，干扰素-卩的最终生产条件确定为:温度生长生产37。C1^35。C33。C稀释率1.6O7.2/天7.0p0270%实施例3-干扰素蛋白产物的纯化从细胞培养基上清液中纯化IFN-P的方法包括4步层析阶段和4步过滤阶段，如图2所示。纯化阶段按以下顺序进行阶段I:过滤澄清收获物；阶段II:在蓝色琼脂糖(BlueSepharose)6FastFlow(BS6FF)柱上亲和层析;阶段III:超滤；阶段IV:优选使用CM琼脂糖FF柱进行阳离子交换层析；阶段V:用RP-HPLC进行疏水层析；阶段VI:超滤和透析；阶段VII:分子排阻(SE)色谱；阶段VID:微孔过滤。活性成分的纯化从在蓝色琼脂糖(BlueS印harose)6FastFlow(BS6FF)上进行的亲和层析开始，这是主要的纯化阶段。宿主细胞衍生的蛋白和来自破碎CHO细胞的DNA的数量下降了好几个数量级。因此BS6FF洗脱液中IFN-(3-la被大大富集。在上样到下一个柱子前，使洗脱液超滤以减少溶液体积并去除小分子量物质。为了获得高纯度的IFN-(3-la，选择了3种主要的柱子类型分离蛋白。在CM琼脂糖FF树脂上进行阳离子交换层析去除核酸和FBS/CHO衍生的蛋白。反相-HPLC去除热原来源于残余的宿主细胞的蛋白以及IFN-(3-la的降解形式。最后的精细纯化阶段采用琼脂糖S-100HR树脂凝胶过滤。洗脱液经微孔过滤(0.22,)并储存在-7(TC或以下。用于制备缓冲液和清洗溶液的初始物质符合Ph.Eur.和Z或USP或为分析级或试剂级。实施例4-唾液酸化分析纯化的IFN-p经过ES-MS(电喷-质谱)进行唾液酸化分析，结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>实施例5-糖形分析为了进一步分析新方法获得的IFN-p-la，对蛋白的糖形进行了分析。如前所述，糖基化蛋白常常以不同糖形的混合形式出现，或者蛋白糖基化有不同的糖结构。多种技术被应用分析这些糖形，包括电喷质谱、FAB-MS、串联质谱(MS/MS)和GC-MS(连接分析)，下面进行详述。这些不同的技术均表明，在所研究的不同糖结构中，其中有一个结构以新的方式出现在从该克隆获得的IFN-(3-la中。用电喷质谱测定糖形分布方法使该克隆获得的IFN-(3-la混合样品进行电喷质谱(ES-MS)。方法如Fenn等(1989)所述。糖的MS/MS。该技术允许对总样本的糖形分布在分子聚集水平进行快速监测。方法如Domon，B和Costello，CE等所述(1988)。兹菜结果见图3-5。对于所有这些图，不同峰上面显示有不同寡糖的示意图。图3和图4显示从新方法获得的几个批次的干扰素-(3的ES-MS转换图谱。在检查的所有批次中，主要糖形是核心-岩藻糖化的二唾液酸(峰C)和单唾液酸(峰B)二天线糖结构，次要糖形相应为核心-岩藻糖化的非唾液酸化的二天线糖结构(峰A)、核心-岩藻糖化三天线唾液酸化的结构(峰E)和其它核心-岩藻糖化的次要复合结构(峰D和峰F)。对来源于由新方法获得的干扰素-|3的干扰素-(3-la样品进行ES-MS检测，在22524Dai0.0P/。检测到次要信号，归属于二唾液酸二天线二岩藻糖化的糖(NeuAc2.Hex5.HexNAC4.Fuc2)。这种糖形也可以定义为具有唾液酸Lewisx(Lex)天线的二天线糖。应当注意，由Hex.HexNAC.Fuc结构组成的Lewisx(Lex)糖，在淋巴细胞(L-选择因子)和特异化的内皮细胞(Cummings，1999;Dell&Morris,2001)表面都是很常见的。对来源于由新方法获得的干扰素-l3的干扰素-(3-la样品进行ES-MS检测，还检测到另一种分子量平均值在22670Dai0.01。/。附近的、平均量为总糖形4%的次要糖形，归属于一种二唾液酸二天线三岩藻糖化的糖(NeuAc2.Hex5.HexNAC4.Fuc3)。这种次要糖形的平均量为4%，SD为0.90。结论来源于由新方法获得的干扰素-P的IFN-P-la中的糖形特征由ES-MS进行分析。ES-MS检测发现，来源于由新方法获得的干扰素-(3的IFN-p-la中的次要信号归属于二岩藻糖化的糖，由MALDI-MS对其进行检测。由新方法获得的干扰素-卩的IFN-P-la由ES-MS检测还发现另一种次要糖形(平均占总糖形的4%)，归属于一种三岩藻糖化的结构。糖分析采用FAB-MS、MALDI-MS、串联质谱(MS/MS)禾DGC-MS(连接性研究)进行对来源于由新方法获得的干扰素-P的IFN-P-la总样品进行深入的糖特征研究。通过对胰蛋白酶和肽-N-糖苷酶F消化后的泛甲基化的IFN-P-la进行FAB-MS、MALDI-MS、纳喷雾MS/MS分析和连接性研究(GC-MS)，获得了IFN-p-la的糖形组成。通过对预先用胰蛋白酶和肽-N-糖苷酶F消化的糜蛋白酶消化肽进行FAB-MS分析，还确定了糖基化位点。旅胰蛋白酶裂解的IFN-(3-la肽-糖肽混合物用酶肽-N-糖苷酶F处理(如Tarentino等，1985所述)。终止反应后(通过冷冻干燥)，消化产物用C18Sep-pak滤筒纯化。5%乙酸洗脱液部分的糖用NaOH/甲基碘泛甲基化，例如按Costello(1997)描述的方法。泛甲基化糖，一部分用阳离子FAB-MS分析(低质量范围作为片段离子，高质量范围作为分子离子)，如Barker等(1981)和Taylor(1983)所述。MALDI-质谱分析例如可按Hillenkamp等(1991)所述进行。纳喷雾-质谱分析例如可按Wilm&Mann(1996)所述的方法进行。对泛甲基化寡糖的剩余部分，采用气体液体层析/质谱(GC/MS)进行连接分析，如Gray(1990)所述。最后，为了观察含Asn80潜在糖基化位点的多肽，胰蛋白酶消化的肽用肽-糖苷酶F消化，用C18Sep-pak滤筒纯化。C18Sep-pak滤筒的丙醛部分用糜蛋白酶进一步消化，用FAB-MS分析。结果泛甲基化糖的MALDI和FAB-MS对采用新方法获得的干扰素-f3蛋白进行研究。代表性的MALDI图谱见图6。从泛甲基化图谱(MALDI和FAB-MS)中观察到的相应的m/z信号明细见表3。所有批次的结果显示，存在一种主要的组成为NeuAc.Hex5.HexNAC4.Fuc的二唾液酸化的二天线结构，和一种组成为NeuAc2.Hex5.HexNAC4.Fuc的单唾液酸化的二天线结构。没有观察到非-岩藻糖化的糖。在所有批次中，还观察到可能相应于如下寡糖结构的次要信号非唾液酸化的二天线结构(Hex5.HexNAC4.Fuc)-具有N-乙酰半乳糖胺重复结构的二唾液酸化的三天线结构或二天线结构(NeuAc3.Hex6.HexNAC5.Fuc)三唾液酸化的三天线结构(NeuAc3.Hex6.HexNAc6.Fuc)-具有N-乙酰半乳糖胺重复结构的三唾液酸化的三天线结构或.三唾液酸化的四天线结构(NeuAc3.Hex7.HexNAc5.Fuc)-具有两个岩藻糖单位的单唾液酸化的和二唾液酸化的二天线结构(NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2，NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2)在来源于根据本发明的方法获得的干扰素-P中，还观察到少量的三岩藻糖化的结构(NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3)，但在对照IFN-(3-la中没有发现。-少量的N-糖解神经氨酸，成为一部分糖的唾液酸。从在泛甲基N相联聚糖FAB和MALDI-TOF数据中信号的峰高度计算N-糖解神经氨酸相对丰度。正如预测，IFN-p-la糖形主要包括很像人类糖蛋白的N-羟乙酰神经氨酸。纳喷雾MS/MS为了进一步证实微量N-连接多岩藻糖的寡糖结构的结构，对泛甲基化的寡糖信号m/z919、1040禾t]1098，分别对应NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2、NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2禾nNeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc3的三倍的带电离子([M+3H]3+)，进行MS/MS分析，MS/MS图谱发现典型的离子，证实了以下结构特征:表2MS信号(m/z)新方法得到的MS/MS归属INF-p919未观察到'NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc21040+NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc21098+NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3'MALDI发现了相应的信号GC/MS1遂麥藩对于由新方法得到的IFN-P，都获得了所有检测批次的复合GC/MS图谱，包括一些来源于衍生成分的杂质峰。在考虑了含糖峰临时任务的情况下，与部分甲基化的乙酸糖醇的标准混合物在相同的GC条件下运行，比较GC保留时间。所有样品的连接分析结果在本质上是相同的，表明4-连接的N-乙酰氨基葡萄糖(4-GlcNAc)、4,6-连接的N-乙酰氨基葡萄糖(4，6-Glc國NAc)、3,6-连接的N-甘露糖(3,6-Man)、2-连接的甘露糖(2陽Man)、末端半乳糖(t-Gal)、3-连接的半乳糖(3-Gal)和末端岩藻糖(t-Fuc)，有力地支持FAB-MS数据。还观察到了2,6-连接的甘露糖，它是所有样品的次要成分，表明一些三天线结构的存在。在IFN-(3-la大块样品中，观察到的假定主要寡糖结构见图5。这些数据显示主要糖配基是具有一个或两个唾液酸残基的核心岩藻糖化的二天线结构。磁蘑麥A蘑教众激游^^-MS嫁定A^籍基众位i所检测的IFN-(3-la批次，都观察到一個次要i^S-A必信号，它是在肽-N-糖苷酶释放糖之后，由Asn-80转化为天冬氨酸而分配(assign)到钠肽残基80-88。本试验提供了支持证据，证明Asn-80确实是糖基化的。图6显示具有IFN-P-la的泛甲基化糖的MALDI图谱(信号详情见表3)。并且，如下表和附图所示，根据本发明的方法得到的IFN-P-la含有如前所述的三岩藻糖结构，NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3。表3新方法获得的IFN-P-la在胰蛋白酶和肽-N-糖苷酶消化后泛甲基化图谱信号详情<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>结论对由新方法获得的IFN-(3-la样品的泛甲基化N-糖进行MALDI-MS和FAB-MS分析显示有以下核心-岩藻糖化的糖结构(未发现非岩藻糖化的糖结构)主要糖形单唾液酸化的二天线结构(NeuAc.Hex5.HexNAC4.Fuc).二唾液酸化的二天线结构(NeuAc2.Hex5.HexNAC4.Fuc)次要糖形.非唾液酸化的二天线结构(Hex5.HexNAC4.Fuc)-具有N-乙酰半乳糖胺重复结构的二唾液酸化的三天线结构或二天线结构(NeuAc3.Hex6.HexNAC5.Fuc).三唾液酸化的三天线结构(NeuAc3.Hex6.HexNAc6.Fuc)-具有N-乙酰半乳糖胺重复结构的三唾液酸化的三天线结构或三唾液酸化的四天线结构(NeuAc3.Hex7.HexNAc5.Fuc)-具有两个岩藻糖单位的二唾液酸化的和单唾液酸化的二天线结构(NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2，NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2)具有三个岩藻糖单位的二唾液酸化的二天线结构(NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3)泛甲基化糖的纳喷雾MS/MS证实了所有样品中所检测到的微量的NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2寡糖，而NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3只在本发明的方法得到的IFN-P中观察到。连接分析证实了FAB-MS数据检测到的预期单糖。最后，在从新方法获得的IFN-p-la产品中，对胰蛋白酶和糜蛋白酶消化肽的详尽的FAB-MS分析显示，Asn-80上的N-糖键存在。从泛甲基化的N-连接糖FAB-MS和MALDI-MS数据信号的峰高计算出N-糖解神经氨酸的相对丰度。在一个样品中，N-羟乙酰神经氨酸和N-糖解神经氨酸的比例为31.7:1.0，显示3.1M的唾液酸是N-羟乙酰神经氨酸。这些结果和从人纤维母细胞获得的天然人干扰素的相似比例(5%)相一致。正如预测，IFN-P-la糖形和大多数人糖蛋白一样，主要含有N-羟乙酰神经氨酸。权利要求1.一种糖基化重组人干扰素-β的生产方法，包括在无血清培养基中培养人干扰素-β生产细胞的步骤，该无血清培养基包括-大约10-30mMHEPES，优选20mMHEPES；-大约0.5-3mM脯氨酸，优选大约1mM脯氨酸；和-大约5500-7700mg/L氯化钠，优选大约6100mg/L氯化钠。2.根据权利要求1的方法，所述的无血清培养基进一步包括大约10-20mg/L酚红，优选大约15mg/L酚红。3.根据前述任一权利要求的方法，该方法包括生长阶段I、生长阶段II和生产阶段，其中，生长阶段I在大约37t:进行，生长阶段II在大约35'C进行，生产阶段在大约33'C进行。4.根据前述任一权利要求的方法，其中该方法是灌流式方法，稀释率大约为l-10/天，优选为大约1.5-7/天。5.根据权利要求4的方法，其中稀释率在细胞培养最初的2-3周从初始值的大约1-2/天增加大约7-10/天。6.—种从液体纯化重组人干扰素-(3的方法，优选液体为细胞培养上清液，该方法包括步骤a)使液体经过亲和层析；b)使亲和层析的洗脱液经过阳离子交换层析；c)使阳离子交换层析的洗脱液经过RP-HPLC进行疏水层析。7.根据权利要求6的方法，包括，在步骤(a)之前，通过过滤使液体澄清的步骤。8.根据权利要求6或7的方法，进一步包括步骤d)进行超滤和透析；e)使透析液经过分子排阻色谱；f)使分子排阻色谱的洗脱液经过微孔过滤。9.根据权利要求6-8的任一权利要求的方法，其中步骤(a)在蓝色琼脂糖上进行，步骤(b)在羧甲基琼脂糖上进行。10.根据权利要求1-5的任一权利要求的方法，还实施根据权利要求6-9的任一权利要求的方法。11.根据权利要求10的方法，进一步包括将纯化的干扰素-p制成药学组合物的步骤，任选地和一种药学上可接受的载体一起掺合。12.—种由前述任一权利要求的方法获得的糖基化的重组干扰素-(3组合物。13.根据权利要求12的干扰素-P组合物，包括含有2个或3个岩藻糖的寡糖结构。14.根据权利要求12或13的干扰素-p组合物，其中所述的寡糖结构含有一个唾液酸二天线三岩藻糖化的糖(NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc3)。15.根据权利要求12-14的任一权利要求的干扰素-(3组合物，进一步包括一个或多个以下的寡糖结构-非唾液酸化的二天线结构(Hex5.HexNAc4.Fuc);-具有N-乙酰半乳糖胺重复结构的二唾液酸化的三天线结构或二唾液酸化的二天线结构(NeuAc2.Hex6.HexNAc5.Fuc);-三唾液酸化的三天线结构(NeuAc3.Hex6.HexNAc5.Fuc);-具有N-乙酰半乳糖胺重复结构的三唾液酸化的三天线结构或三唾液酸化的四天线结构(NeuAc3.Hex7.HexNAc6.Fuc);-具有两个岩藻糖单位的单唾液酸化的和二唾液酸化的二天线结构(NeuAc.Hex5.HexNAc4.Fuc2，NeuAc2.Hex5.HexNAc4.Fuc2)。16.根据权利要求12-15的任一权利要求的干扰素-卩组合物，其特征在于唾液酸化形式包括大约1-5%非唾液酸化的N-糖链，大约5-25%单唾液酸化的糖链，大约55-75%二唾液酸化的N-糖链，和大约10-25%三唾液酸化的N-糖链。17.根据权利要求12-16的任一权利要求的重组人干扰素-(3组合物在制备治疗多发性硬化症的药物中的应用。18.根据权利要求17的应用，其中的多发性硬化症选自复发性多发性硬化症、非复发性多发性硬化症和早期发病的多发性硬化症。19.根据权利要求12-16的任一权利要求的重组人干扰素-l3在制备治疗癌症的药物中的应用。20.根据权利要求12-16的任一权利要求的重组人干扰素-|3在制备治疗病毒感染的药物中的应用。21.含有以下成分-大约10-30mMHEPES，优选20mMHEPES;-大约0.5-3mM脯氨酸，优选大约lmM脯氨酸；和-大约5500-7700mg/L氯化钠，优选大约6100mg/L氯化钠的无血清细胞培养基在培养生产重组人干扰素-(3的细胞中的应用。22.—种制品，所述制品含有包装材料、和根据权利要求12-16的的任一权利要求的治疗有效量的分离纯化的重组干扰素-P或根据权利要求1-11的任一方法获得的治疗有效量的分离纯化的重组干扰素-(3，其中所述的包装材料含有指出重组人干扰素-|3可以用于人类治疗的说明标签或药品说明书。23.—种含有功能性连锁到SV40TAg早期多聚腺苷酸化区的重组人干扰素-卩编码序列的核酸，其中核酸不含干扰素-(3多聚腺苷酸化信号。24.根据权利要求23的核酸，其中人干扰素-(3基因不含干扰素-(33'UTR。25.根据权利要求23或24的核酸，进一步包括功能性连锁到干扰素-P编码序列的SV40启动子/增强子。26.权利要求23-25的任一权利要求的核酸，进一步包括一个小鼠DHFR基因。27.根据权利要求26的核酸，其中小鼠DHFR基因功能性连锁到含SV40TAgpolyA的早期多聚腺苷酸化区。28.根据权利要求26或27的核酸，进一步包括功能性连锁到小鼠DHFR基因的SV40启动子/增强子。29.—种含有权利要求23-28的任一权利要求的核酸的质粒。30.—种用权利要求29的表达载体转化的宿主细胞。31.权利要求30的宿主细胞，该细胞为中国仓鼠卵巢细胞。32.根据权利要求1-11的任一权利要求的方法，其中干扰素-l3生产细胞是根据权利要求30或31的宿主细胞。全文摘要本发明涉及一种干扰素-β的生产方法，以及一种具有独特的糖基化模式的干扰素-β组合物。文档编号C07K1/18GK101282990SQ200580051790公开日2008年10月8日申请日期2005年8月26日优先权日2005年8月26日发明者A·博纳德,D·费希尔,M·罗西,P·杜库姆恩申请人:阿雷斯贸易股份有限公司