专利名称：同位素标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同位素标记15N-L-谷氨酰胺的合成方法，具体涉及利用有机合成的方法，制备γ-15N和α-、γ-双15N标记L-谷氨酰胺。
背景技术：
氮-15(简称15N，下同)是氮元素的稳定同位素，可以用作示踪剂，广泛应用于生物化学、医学、药物学、农业科学等领域，尤其对生命科学研究有极为重大的意义。特别是在蛋白质的人工合成方面，氮-15氨基酸起着独特的示踪作用，其应用越来越广泛，市场前景良好。
由于此类产品产量小，对纯度和丰度要求高。目前主要是通过化学合成法或生物发酵法生产。化学合成法设备要求简单，生产的氨基酸是DL型氨基酸，丰度高，但不具有光学活性，需要再经化学或酶法拆分得到L型氨基酸。D型氨基酸大多被废弃，导致氮-15原料利用率降低，增加了生产成本。生物发酵法具有反应步骤少，产品光学纯度高的优点。但需要较大的设备投入，对菌种的要求高，后提取步骤较多。
L-谷氨酰胺是构成蛋白质的主要成分之一，其酶法生产较为困难。目前国内外报导的方法以化学合成法为主。主要以L-谷氨酸同甲醇用盐酸或干燥的HCl气体为催化剂，生成中间体L-谷氨酸-γ-甲酯盐酸盐，再加入过量二硫化碳和氨水后氨解得到L-谷氨酰胺；或由L-谷氨酸-γ-甲酯与水合肼等反应得酰肼，再加氢还原后得到L-谷氨酰胺。以上方法消耗大量氨水或其它有机胺类物质，是常用的L-谷氨酰胺生成方法，不适用同位素标记15N-L-谷氨酰胺的合成。目前尚未看到由化学合成法生成同位素15N标记L-谷氨酰胺的方法。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种工艺简单、15N原料利用率高同位素标记15N-L-谷氨酰胺的合成方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种同位素标记15N-L-谷氨酰胺的合成方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤(1)酯化反应将L-谷氨酸溶解于氢氧化钠溶液，于冰浴和搅拌下缓慢滴加氯代甲酸苄甲酯Z-Cl，经萃取、干燥后得到N-苄氧羰基L-谷氨酸；产物在苯甲醇中与二环己胺和溴苄作用，经脱盐后得到N-苄氧羰基α-苄酯L-谷氨酸；(2)酰氯化将N-苄氧羰基α-苄酯L-谷氨酸、氯化亚砜于回流和搅拌下反应2～10小时，除去溶剂并蒸馏后得到产物N-苄氧羰基α-酯-L-谷氨酰氯固体；(3)酰胺化将N-苄氧羰基α-酯-L-谷氨酰氯的乙醚溶液、氢氧化钠水溶液混合后，加入非标记或15N标记无机氮源，在-10℃～20℃低温下条件下氨解1～10小时，冷却、提取和干燥后，蒸去溶剂得到N-苄氧羰基α-酯-L-谷氨酰胺产品；(4)解保护将15N标记N-苄氧羰基α-酯-L-谷氨酰胺通过皂化或加氢的方法脱除α-酯和N-苄氧羰基，得到同位素标记15N-L-谷氨酰胺。
所述的原料L-谷氨酸包括非标记或15N标记的L-谷氨酸。
所述的解保护工艺得到的产品为γ-15N标记或α-、γ-双15N标记的L-谷氨酰胺。
本发明提供了一套15N标记L-谷氨酰胺的合成方法，该方法在现有的有机合成L-谷氨酰胺技术的基础上，结合15N原料昂贵的特点，对了工艺条件进行改变，使之具有良好的经济性和使用价值。该方法适用于合成γ-和α、γ双15N标记L-谷氨酰胺。本方法过程简单，15N原料利用率高，得到的L-谷氨酰胺产品纯度在99％以上，丰度在98％以上。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种同位素标记15N-L-谷氨酰胺的合成方法，该方法包括以下工艺步骤(1)酯化反应将29.2g(0.2mol)L-谷氨酸悬浮分散在含50克K2CO3的450毫升水中，温水浴溶解后，搅拌下滴加40毫升氯代甲酸苄甲酯，中和后经萃取、酸化、洗涤后得到43.9g N-苄氧羰基L-谷氨酸(收率78％)。将28.1g(0.1mol)N-苄氧羰基L-谷氨酸溶解于40ml DMF溶剂中，于剧烈搅拌下加入0.1mol的二环己胺和0.11mol溴苄，经萃取洗涤后得到得到38.7gN-苄氧羰基α-苄酯L-谷氨酸的二环己胺盐(收率70％)，脱盐后得到N-苄氧羰基α-苄酯L-谷氨酸。
(2)酰氯化反应将3.71g(0.01mol)N-苄氧羰基α-苄酯L-谷氨酸和0.012mol的氯化亚砜于回流和搅拌下反应4小时，除去溶剂并蒸馏后得到3.3gN-苄氧羰基α-苄酯-L-谷氨酰氯固体(收率85％)。
(3)氨解反应取含1.09g15NH4Cl(0.02mol)的10ml水溶液于冰浴下用2ml苯、含氢氧化钠1.2g(0.03mol)的5ml水溶液以及7.8gN-苄氧羰基α-酯-L-谷氨酰氯的70ml苯溶液处理5小时。混合物经冷却、过滤、提取后，最后得到6.7gα-苄酯-L-谷氨酰胺(15N收率91％)。
(4)解保护将6.7gN-苄氧羰基α-苄酯-L-谷氨酰胺溶解于50ml甲醇中，加入6.7g5％Pt/C催化剂，于常压下加氢反应5小时，母液经浓缩、提取后得到2.28gγ-15N标记L-谷氨酰胺(收率85％)，熔点183～185℃，[α]20D＝+32.4°(c＝102N HCl)。
实施例2一种同位素标记15N-L-谷氨酰胺的合成方法，该方法包括以下工艺步骤(1)酯化反应将29.2g(0.2mol)L-谷氨酸悬浮分散在含50克Na2CO3的450毫升水中，温水浴溶解后，搅拌下滴加40毫升氯代甲酸苄甲酯，中和后经萃取、酸化、洗涤后得到42.7g N-苄氧羰基L-谷氨酸(收率75.9％)。将28.1g(0.1mol)N-苄氧羰基L-谷氨酸溶解于40ml DMF溶剂中，于剧烈搅拌下加入0.1mol的二环己胺和0.11mol溴苄，经萃取洗涤后得到得到38.7gN-苄氧羰基α-苄酯L-谷氨酸的二环己胺盐(收率70％)，脱盐后得到N-苄氧羰基α-苄酯L-谷氨酸。
(2)酰氯化反应将3.71g(0.01mol)N-苄氧羰基α-苄酯L-谷氨酸和0.012mol的氯化亚砜于回流和搅拌下反应2小时，除去溶剂并蒸馏后得到2.5gN-苄氧羰基α-苄酯-L-谷氨酰氯固体(收率64.4％)。
(3)氨解反应取含1.09g15NH4Cl(0.02mol)的10ml水溶液于冰浴下用2ml苯、含氢氧化钠1.2g(0.03mol)的5ml水溶液以及7.8gN-苄氧羰基α-酯-L-谷氨酰氯的70ml苯溶液处理10小时。混合物经冷却、过滤、提取后，最后得到6.8gα-苄酯-L-谷氨酰胺(15N收率92.3％)。
(4)解保护将6.8gN-苄氧羰基α-苄酯-L-谷氨酰胺溶解于50ml甲醇中，加入7g 5％Pt/C催化剂，于常压下加氢反应6小时，母液经浓缩、提取后得到2.35gγ-15N标记L-谷氨酰胺(收率86.5％)，熔点183～185℃，[α]20D＝+32.4°(c＝10 2NHCl)。
实施例3一种同位素标记15N-L-谷氨酰胺的制备方法，该方法包括以下工艺步骤(1)酯化反应将29.2g(0.2mol)L-谷氨酸悬浮分散在含50克K2CO3的450毫升水中，温水浴溶解后，搅拌下滴加40毫升氯代甲酸苄甲酯，中和后经萃取、酸化、洗涤后得到43.9g N-苄氧羰基L-谷氨酸(收率78％)。将28.1g(0.1mol)N-苄氧羰基L-谷氨酸溶解于40ml DMF溶剂中，于剧烈搅拌下加入0.1mol的二环己胺和0.11mol溴苄，经萃取洗涤后得到得到38.7gN-苄氧羰基α-苄酯L-谷氨酸的二环己胺盐(收率70％)，脱盐后得到N-苄氧羰基α-苄酯L-谷氨酸。
(2)酰氯化反应将3.71g(0.01mol)N-苄氧羰基α-苄酯L-谷氨酸和0.012mol的氯化亚砜于回流和搅拌下反应10小时，除去溶剂并蒸馏后得到3.1gN-苄氧羰基α-苄酯-L-谷氨酰氯固体(收率79.8％)。
(3)氨解反应取含1.09g15NH4Cl(0.02mol)的10ml水溶液于冰浴下用2ml苯、含氢氧化钠1.2g(0.03mol)的5ml水溶液以及7.8gN-苄氧羰基α-酯-L-谷氨酰氯的70ml苯溶液处理2小时。混合物经冷却、过滤、提取后，最后得到6.3g α-苄酯-L-谷氨酰胺(15N收率85.6％)。
(4)解保护将6.3gN-苄氧羰基α-苄酯-L-谷氨酰胺溶解于50ml甲醇中，加入6.3g 5％Pt/C催化剂，于常压下加氢反应10小时，母液经浓缩、提取后得到2.27gγ-15N标记L-谷氨酰胺(收率90.1％)，熔点182～184℃，[α]20D＝+32.3°(c＝10 2NHCl)。
权利要求
1.一种同位素标记15N-L-谷氨酰胺的合成方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤(1)酯化反应将L-谷氨酸溶解于氢氧化钠溶液，于冰浴和搅拌下缓慢滴加氯代甲酸苄甲酯Z-Cl，经萃取、干燥后得到N-苄氧羰基L-谷氨酸；产物在苯甲醇中与二环己胺和溴苄作用，经脱盐后得到N-苄氧羰基α-苄酯L-谷氨酸；(2)酰氯化将N-苄氧羰基α-苄酯L-谷氨酸、氯化亚砜于回流和搅拌下反应2～10小时，除去溶剂并蒸馏后得到产物N-苄氧羰基α-酯-L-谷氨酰氯固体；(3)酰胺化将N-苄氧羰基α-酯-L-谷氨酰氯的乙醚溶液、氢氧化钠水溶液混合后，加入非标记或15N标记无机氮源，在-10℃～20℃低温下条件下氨解1～10小时，冷却、提取和干燥后，蒸去溶剂得到N-苄氧羰基α-酯-L-谷氨酰胺产品；(4)解保护将15N标记N-苄氧羰基α-酯-L-谷氨酰胺通过皂化或加氢的方法脱除α-酯和N-苄氧羰基，得到同位素标记15N-L-谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述的同位素标记15N-L-谷氨酰胺的合成方法，其特征在于，所述的原料L-谷氨酸包括非标记或15N标记的L-谷氨酸。
3.根据权利要求1所述的同位素标记15N-L-谷氨酰胺的合成方法，其特征在于，所述的解保护工艺得到的产品为γ-15N标记或α-、γ-双15N标记的L-谷氨酰胺。
全文摘要
本发明涉及一种同位素标记
文档编号C07C237/06GK101041627SQ20061002494
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月22日 优先权日2006年3月22日
发明者罗勇, 王博, 强歌, 陆平晔, 李美华 申请人:上海化工研究院