控制水稻绒毡层降解的蛋白编码序列的制作方法

专利名称：控制水稻绒毡层降解的蛋白编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种蛋白编码序列，特别是一种控制水稻绒毡层降解的蛋白编码序列，属于基因工程领域。
背景技术：
水稻(Oryza sativa L.)是一种重要的粮食作物，同时因为它具有较小的基因组(389Mb)，和其它禾本科植物有很高的共线性，因此水稻已经成为研究植物功能基因的一种重要的单子叶模式生物。水稻雄性不育在农业生产上具有十分重要的意义，可以用来生产杂交种子，开展轮回选择和创造基因库。雄性不育遗传机制一直是发育生物学的一个重要课题，同时雄性不育突变也是研究植物雄配子体发育的合适材料。近年来，对于水稻雄性不育进行了遗传学、细胞学和解剖学以及生理生化等多方面的研究，取得了一定进展。从20世纪有学者对水稻雄性不育的遗传特点作了大量研究工作，按遗传特点可分为核不育型、质核互作不育型。从生理学角度上讲，水稻雄性不育是属于功能性不育，小孢子在发生过程中出现败育，不能形成有活力的花粉。
在高等开花植物中，花粉发育是个复杂的过程，涉及到花粉囊组织的分化，在花粉囊里，小孢子母细胞通过减数分裂产生小孢子，小孢子进一步发育成花粉粒。人们一般将水稻花粉发育分为八个时期，正常的花粉发育涉及减数分裂、有丝分裂、绒毡层细胞的发育等。在水稻花粉发育过程中影响水稻雄性不育的因素非常多，其中一个重要因素就是花药的绒毡层细胞对花粉发育过程的影响。许多实验证据显示，绒毡层细胞对花粉发育过程起到十分重要的作用，绒毡层是花粉囊壁的最内层细胞层，与花粉母细胞间接接触。这层分泌组织产生花粉成熟所必需的一些营养物质，随后在花粉成熟时完全退化。绒毡层的缺失将直接导致花粉母细胞的破碎，从而导致雄性不育。
经检索发现，(1)中国专利公开文献CN02823020．5一种利用水稻BT-雄性不育细胞质的育性恢复基因来赋予或控制育性的方法及鉴定育性恢复基因存在的方法；该专利提供一种利用BT型雄性不育细胞质来使水稻具备育性或控制其育性的方法，以及鉴定恢复基因是否存在的方法。该专利利用了具有SEQ ID N0.27所示碱基序列的核酸或与SEQ ID NO.27所示碱基序列有至少70％同一性的核酸，其具有恢复育性的功能。或者，可以利用具有SEQ ID NO.27的第38538至54123位碱基序列的核酸，或与SEQ ID NO.27的第38538至54123位碱基序列有至少70％同一性的核酸，它们也具有恢复育性的功能。(2)中国专利公开文献CN01816569.9针对水稻BT型雄性不育胞质中育性恢复基因座基因型的推定方法；该专利涉及针对杂交水稻育种中的Rf-1基因恢复BT型细胞质雄性不育基因的检测方法。具体地说，该专利涉及利用Rf-1基因座附近存在的数个PCR标记座与Rf-1基因座连锁的特性，来检测Rf-1基因的方法。更具体地说，该专利涉及通过Rf-1基因座位于水稻第10号染色体上的新型PCR标记座S12564 Tsp509I座和C1361 MwoI座之间，检测其附近存在的数个PCR标记座基因型，该方法既简便又准确地能够检查Rf-1基因的存在以及筛选Rf-1基因纯合型个体。(3)CN03820910.1水稻BT型细胞质雄性不育的水稻恢复基因。该专利提供水稻BT型细胞质雄性不育的不育恢复基因。该专利的基因包括编码SEQ ID NO75的氨基酸序列，或与SEQ ID NO75的氨基酸序列至少70％相同，且具有恢复育性功能的氨基酸序列的核酸。优选地，该专利的基因具有SEQ ID NO69-74、80-85的碱基序列或SEQ ID NO27的第43907-46279位的碱基。至今没有发现与本发明相关的OsTDR基因的描述和报道。

发明内容
本发明的目的在于提供一种新的控制水稻绒毡层降解蛋白编码序列OsTDR并可以利用该蛋白产生新的水稻雄性不育系，可以用来生产杂交种子，开展轮回选择和创造基因库，在农业生产上具有十分重要的应用。本发明公开了与水稻绒毡层降解有关的蛋白基因、以及水稻OsTDR蛋白序列及其核酸序列，及其在利用转基因技术控制水稻雄性不育上的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明所提供的一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有水稻OsTDR蛋白质活性的多肽的核苷酸序列。
所述的序列具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
所述的序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1659位的核苷酸序列。
本发明所分离出的控制水稻绒毡层降解的蛋白质活性的多肽，它包括具有SEQID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
在本发明还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞，它是真核细胞。在实例中该宿主细胞是水稻。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“控制水稻绒毡层降解蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有控制水稻绒毡层降解蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1-1659位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框第1-1659位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中第1-1659位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.1所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1659位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1659位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的控制水稻绒毡层降解的相同功能的蛋白的SEQ ID NO.2中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，术语“控制水稻绒毡层降解蛋白或多肽”指具有控制水稻绒毡层降解蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与天然控制水稻绒毡层降解蛋白相关相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括控制水稻绒毡层降解蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的控制水稻绒毡层降解蛋白的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与水稻绒毡层发育相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗水稻绒毡层发育相关多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“控制水稻绒毡层降解蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
发明还包括控制水稻绒毡层降解蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然控制水稻绒毡层降解相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的水稻绒毡层发育相关多肽时，可以将控制水稻绒毡层降解蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成控制水稻绒毡层降解相关蛋白表达载体。
如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、水稻细胞和其它植物细胞。
还可用Northern印迹法技术分析控制水稻绒毡层降解基因产物的表达，即分析控制水稻绒毡层降解的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有控制水稻绒毡层降解基因的核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码控制水稻绒毡层降解相关的核酸分子。
本发明还提供了检测样品中是否存在控制水稻绒毡层降解相关核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于控制水稻绒毡层降解相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
此外，根据本发明的控制水稻绒毡层降解基因的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选控制水稻绒毡层降解相关同源基因或同源蛋白。
本发明的控制水稻绒毡层降解相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
本发明是利用γ射线对粳稻9522品系进行处理，种植后在F2代挑选花药发育异常的突变体，挑选分离比为3∶1的隐性单基因突变体为研究对象。获得一新的水稻隐性雄性不育突变体Ostdr。通过遗传定位方法，首先将突变基因座位定位在水稻第2染色体SSR标记RM109和RM7562之间。进一步精细定位，我们在RM109和RM7562之间发展了11对有多态性InDel分子标记，将该基因座位定位在LHS12和LHS3之间，物理距离为52kb。对在这一范围内NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)和tigr(http//www.tigr.org)都预测分析有10个基因.其中根据以前报道的花药发育相关基因预测，bHLH和锌指蛋白2个转录因子有可能是引发该性状的突变基因，另外GTP酶和蛋白激酶可能在信号转导途径中起作用，也可能会引起雄性不育现象。对这些基因分别进行克隆测序分析，发现突变体中含bHLH结构域的蛋白基因缺失了第7外显子中的一个碱基C，从而造成突变。通过对花药不育突变体Ostdr花器官发育各时期进行组织切片、扫描电镜、染色体观察，发现OsTDR基因的突变会导致水稻在小孢子时期绒毡层不退化，小孢子不能发育成花粉粒，花粉发育后期绒毡层异常增大，小孢子破碎从而导致雄性不育。因为该基因会导致绒毡层降解延迟，所以我们命名为OsTDR(Oryza sativa L TapetumDegradation Retardation)基因。通过原位杂交分析表明OsTDR基因在绒毡层中特异表达。定量RT-PCR表明OsTDR基因只在水稻花器官中特异性表达，在根、茎、叶中均不表达，且在小孢子母细胞和减数分裂时期表达量最高，在花粉发育后期表达量下降直至消失。互补实验显示OsTDR基因可以部分恢复突变体的表型。说明该基因功能确实是影响到水稻的花粉发育。
利用本发明的控制水稻绒毡层降解蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与控制水稻绒毡层降解蛋白相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。本发明在控制水稻绒毡层降解方面具有明显的作用，可以产生新的水稻雄性不育系，用来生产杂交种子，开展轮回选择和创造基因库，在农业生产上具有十分重要的应用。


图1 Ostdr突变体植株的形态学观察示意2 OsTDR座位定位示意3 OsTDR基因组序列示意图其中箭头表示突变位点图4 OsTDR基因与AMS基因的同源性比对示意5 Ostdr突变体恢复表型的成熟花粉切片示意6花药不育突变体Ostdr和9522野生型花器官发育各时期进行组织切片示意图具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1Ostdr突变体植株的获得和形态学的观察该突变体是本实验室用60Co射线诱变粳稻9522种子，处理剂量为280Gy.对诱变的F2代中一雄性不育突变体三代回交，获得隐性单基因控制的稳定遗传的突变体Ostdr。所有植物材料种植于上海市农业科学院试验基地。Ostdr突变体与与粳稻9522回交，F1代全部为可育，自交F2代中出现分离，其中正常植株为189，突变株为55，正常植株与突变植株比例接近3∶1(χ2＝0.79 χ0.053.84)，表明该雄性不育突变体表型由一个单核基因突变造成。
对Ostdr突变体植株的形态学观察。如图1，野生型和突变型Ostdr的表型对比显示Ostdr突变型(右)和野生型(左)具有相同的株高和穗长。但野生型(左)显示为黄色花药，突变型Ostdr(右)显示白色花药。且突变型Ostdr(右)的白色花药比野生型(左)黄色花药偏小。
实施例2OsTDR基因的定位和克隆(1)定位群体。将Ostdr与籼稻品系龙特甫B杂交，自交获得F2代，选择其中为雄性不育植株为定位群体。
(2)水稻DNA提取。采用改进的CTAB法。简单步骤如下取叶片0.1-0.2克(约半片)放到小研钵中，加入适量的液氮，立刻研磨至粉状，装入2ml离心管，加入700ul100℃预热的1.5xCTAB溶液于离心管中，小心混匀后放入56℃水浴，20分钟后取出离心管，加入等体积氯仿/异戊醇，猛烈混匀，离心(13000rpm)10分钟，取上清于新管中，加入900ul无水乙醇混匀后-20℃放半小时以上。将析出的DNA离心，14000rpm(10分钟)。去掉上清，将沉淀用1ml70％乙醇清洗一次，离心干燥，溶于200ul 1/10TE或水中，4℃冰箱保存。
(3)InDel分子标记分析。SSR引物根据已发表的序列合成(http//www.gramene.org/microsat/ssr.html)，其他InDel分子标记设计是根据比较粳稻日本晴籼稻9311两品系的已公布的核苷酸序列，对差异的部分设计引物，验证2个亲本粳稻9522和籼稻龙特甫B之间的多态性，PCR扩增程序为10ul体系中，1ul模板，1ul 10pmol/ul Primerl，1ul 10pmol/ul Primer2，1ul 10×Buffer(Mg2+)，1ul 2mM dNTP，0.1ul Taq，3.9ul水。通过6％的PAGE胶电泳，银染方法检测。
(4)群体分离分析(bulked segregant analysis)初定位方法。用132对标记进行扩增反应，发现2号染色体上的标记RM109与OsTDR座位相联锁，选取附近的标记RM7562，RM3730和RM3732，在194个F2代分离群体进行进一步验证，都与OsTDR有连锁关系，并且初步将OsTDR定在RM1097和RM7562之间。为进一步定位OsTDR座位，我们扩大F2代群体到5826，从中得到用于定为突变体1411株，在RM109和RM7562之间发展了11个标记，其中OSR17，RM6938和RM110为根据已经公布的序列合成的SSR标记，经验证，其在粳稻9522和籼稻龙特甫B中存在多态性，距OsTDR座位分别为1.8，0.9和1.4cM(图2)标记LHS5是根据已公布的粳稻日本晴的序列，通过gramene网站(http//www.gramene.org/db/searches/ssrtool)上的软件SSRIT(Simple Sequence Repeat Identification Tool)软件寻找到SSR位点，设计的SSR标记(表1)，并在两亲本之间验证存在很好的多态性，距OsTDR座位为0.7cM(图2).为进一步定位OsTDR位点，用粳稻日本晴与网上公布的籼稻9311序列做比对分析，发展了7对InDel标记LHS10，LHS12，LHS13，LHS15，LHS16，LHS3和LHS6(表1)，经分析LHS12，LHS13，LHS15，LHS16，LHS3和OsTDR共分离，最终将OsTDR座位定位在LHS12和LHS3之间，距离这2个标记都是0.4cM(图2)，通过在网上(http//www.tigr.org)下载的粳稻日本晴第2号染色体拼接的序列，分析LHS12和LHS3两标记之间分别位于克隆AP004084和AP005851上，物理距离为52kb(图2)。用分子标记对定位群体中的雄性不育单株进行基因型分析，利用MapDrawV2.1构建目标基因区域的分子标记的连锁图谱。表1如下

(5)OsTDR基因的克隆。对52kb范围内的10个基因分别测序，分析发现是其中一个bHLH结构的转录因子基因在1120bp处发生一个C碱基缺失，从而造成突变(图3)。最终我们从克隆AK106761上(由Rice Genome Resource Center(RGRC)提供)分离到OsTDR基因全长cDNA(详见OsTDR基因的全长cDNA序列)。PCR引物OsTDR--1F5’-ATGGGAAGAGGAGACCACCTGCTGATGAAG-3’OsTDR-1R5’-ATCAATCATCATCATCAATCAAACGCGAGG-3’。PCR反应程序94℃ 5min；1次；94℃ 30sec，55℃ 30sec；72℃ 30sec；34次，72℃ 5min，1次。
OsTDR基因的全长cDNA序列如下atgggaagaggagaccacctgctgatgaagaacagcaatgctgctgcagctgcagctgctgtcaatggaggtggcaccagtttggatgctgcattgaggcctctagttggttcagatggctgggattactgcatctactggaggctctctcctgatcagaggttcttggagatgacaggattctgctgcagcagtgagcttgaagcacaggtctcagcactgctggacctgccttcttcaatcccactggactcctcctccatagggatgcatgcgcaggcattgctgtcgaaccagccgatctggcagagcagcagtgaggaggaggaggctgatggcggcggtggcgccaagacgcggctgctggtccccgtcgccggcggcctcgtcgagctcttcgcgtcgagatatatggcggaggagcagcagatggcggagcttgtcatggcgcagtgcggcggcggcggcgccggggacgacggtggggggcaggcgtggccgccgccggagacgcccagcttccagtgggacggaggcgccgacgcgcagaggctgatgtacggcggctcgtcgctgaacctgttcgacgccgccgccgccgacgacgacccgttcttgggtggtggtggtggtgacgccgtgggcgacgaggcggcggcggcgggcgcgtggccgtacgcggggatggcggtgagcgagccgtcggtggcggtggcgcaggagcagatgcagcacgcggcgggcggcggcgtggcggagtccgggtcggaggggaggaagctgcatggcggtgacccggaggacgacggcgacggcgaggggcgctccggcggcgccaagaggcagcagtgcaagaacctcgaggcggagaggaagcggaggaagaagctcaatggccacctctacaagctccgctcgctcgtcccaaacatcaccaagatggatcgcgcgtcgattcttggagacgcgatcgactacatcgtggggttgcagaagcaggtgaaggagctgcaggacgagctggaagacaaccatgtccaccataagccgcccgacgtgctcatcgaccacccgccgccggcgagcctcgtcgggctcgacaacgacgacgcctcgccgcccaacagccaccaacagcagccgccgctcgccgtttccggcagcagcagcaggaggagtaacaaggacccagcaatgaccgacgacaaggtcggcggcggcggcggcggtgggcaccggatggagccgcagctggaggtgcgtcaggtgcaggggaacgagctgttcgtccaggtgctctgggagcacaagcccggcgggttcgtccgcctcatggacgccatgaacgcgctcggcctcgaggtcatcaacgtcaacgtcaccacctacaagaccctcgtcctcaacgtcttccgcgtcatggtgagggacagcgaggtggcggtgcaggcggacagggtgagggactcgctgctggaggtgacgcgggagacgtaccccggcgtgtggccgtcgccgcaggaggaggacgacgccaagttcgacggcggcgacggcgggcaggctgcggcggcggcggcggcggccggtggagagcactaccacgacgaagtcggcggcggataccatcagcacctgcattacctcgcgtttgattga实施例3OsTDR基因的功能分析将克隆得到的序列OsTDR基因进行网上序列分析，与OsTDR基因的氨基酸序列同源性很高的拟南芥中的AMS基因功能刚被报道，控制花粉绒毡层的发育。这与Ostdr突变体的表型有相似之处，暗示着OsTDR基因也有类似功能(图4)。为了进一步确定所克隆的OsTDR基因是引起Ostdr突变体表型的基因，本发明将BAC克隆AP005851(包含2391bp的ORF，2430bp上游区和1857bp下游区)用BamHI和SalI酶切，构建了一个6.6kb的pCAMBIA1301质粒，转化Agrobacteriumtumefaciens EHA105，使用遗传手段转化到Ostdr突变体中，以观察是否会引起植株恢复野生型性状。图5显示Ostdr突变体恢复表型的成熟花粉切片图，其表型与野生型相似。可见所克隆的OsTDR基因是引起Ostdr突变体表型的基因。通过对花药不育突变体Ostdr花器官发育各时期进行组织切片、扫描电镜、染色体观察，发现OsTDR基因的突变会导致水稻在小孢子时期绒毡层不退化，小孢子不能发育成花粉粒(图6)，花粉发育后期绒毡层异常增大，小孢子破碎从而导致雄性不育。说明OsTDR基因是控制绒毡层降解的基因。
实施例4OsTDR蛋白纯化和分析在该实施例中，以实施例2中的PCR扩增产物为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得水稻OsTDR cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为5’-GAATTCCCATGGGATATCATGGGAAGAGGAGACCACCTGCTGATGAAG-3’该引物含有EcoRI、NcoI、EcoRV限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的部分编码序列；
3’端引物序列为5’-GGATCCGTCGACATCAATCATCATCATCAATCAAACGCGAGG-3’，该引物含有BamHI、SalI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是翻译终止子和水稻OsTDR的部分编码序列。
水稻OsTDR蛋白cDNA PCR产物纯化后经与质粒T载体按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌DH5a，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪)。将正确序列的水稻OsTDR蛋白cDNANcoI和BamHI酶切片段克隆至表达载体pET30a，形成载体pET32a-OsTDR，然后转化BL21。经测序证实，已插入了完整的OsTDR编码序列。
挑表达OsTDR的阳性BL21克隆接种于5ml LB培养基中，37℃ 300rpm振荡培养过夜，1∶100稀释于LB培养基继续振荡培养1.5hr，加IPTG至1mM后诱导6hr，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用10ml PBS(0.14M NaCl，2.7mMKCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重悬，超声破碎后再加入20％TritonX-100至1％轻摇30min，然后12,000g 4℃离心10min，取上清装入透析袋中，50倍体积透析液I中透析10hr，换100倍透析液II中透析10hr，换100倍透析液III中透析10hr，换100倍透析液IV中透析10hr，吸出蛋白液，过Ni-NTA柱，50ml washing buffer过柱，然后20ml elution buffer过柱，收集液体，检测蛋白浓度。得到水稻OsTDR蛋白。测得蛋白分子量为58271.28Da。
总之，本发明通过一新的水稻隐性雄性不育突变体Ostdr，通过遗传定位方法，分离到一个新的控制水稻绒毡层降解蛋白及其基因序列，该蛋白在控制水稻绒毡层降解方面具有明显的作用，可以利用该基因通过遗传工程的手段产生新的水稻雄性不育系，用来生产杂交种子，开展轮回选择和创造基因库，在农业生产上具有十分重要的应用潜力。
本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息<110>上海交通大学<120>控制水稻绒毡层降解的蛋白编码序列<130>无<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1659<212>DNA<213>Oryza sativa<400>1atgggaagag gagaccacct gctgatgaag aacagcaatg ctgctgcagc tgcagctgct 60gtcaatggag gtggcaccag tttggatgct gcattgaggc ctctagttgg ttcagatggc120tgggattact gcatctactg gaggctctct cctgatcaga ggttcttgga gatgacagga180ttctgctgca gcagtgagct tgaagcacag gtctcagcac tgctggacct gccttcttca240atcccactgg actcctcctc catagggatg catgcgcagg cattgctgtc gaaccagccg300atctggcaga gcagcagtga ggaggaggag gctgatggcg gcggtggcgc caagacgcgg360ctgctggtcc ccgtcgccgg cggcctcgtc gagctcttcg cgtcgagata tatggcggag420gagcagcaga tggcggagct tgtcatggcg cagtgcggcg gcggcggcgc cggggacgac480ggtggggggc aggcgtggcc gccgccggag acgcccagct tccagtggga cggaggcgcc540gacgcgcaga ggctgatgta cggcggctcg tcgctgaacc tgttcgacgc cgccgccgcc600gacgacgacc cgttcttggg tggtggtggt ggtgacgccg tgggcgacga ggcggcggcg660gcgggcgcgt ggccgtacgc ggggatggcg gtgagcgagc cgtcggtggc ggtggcgcag720gagcagatgc agcacgcggc gggcggcggc gtggcggagt ccgggtcgga ggggaggaag780ctgcatggcg gtgacccgga ggacgacggc gacggcgagg ggcgctccgg cggcgccaag840aggcagcagt gcaagaacct cgaggcggag aggaagcgga ggaagaagct caatggccac900ctctacaagc tccgctcgct cgtcccaaac atcaccaaga tggatcgcgc gtcgattctt960ggagacgcga tcgactacat cgtggggttg cagaagcagg tgaaggagct gcaggacgag 1020
ctggaagaca accatgtcca ccataagccg cccgacgtgc tcatcgacca cccgccgccg 1080gcgagcctcg tcgggctcga caacgacgac gcctcgccgc ccaacagcca ccaacagcag 1140ccgccgctcg ccgtttccgg cagcagcagc aggaggagta acaaggaccc agcaatgacc 1200gacgacaagg tcggcggcgg cggcggcggt gggcaccgga tggagccgca gctggaggtg 1260cgtcaggtgc aggggaacga gctgttcgtc caggtgctct gggagcacaa gcccggcggg 1320ttcgtccgcc tcatggacgc catgaacgcg ctcggcctcg aggtcatcaa cgtcaacgtc 1380accacctaca agaccctcgt cctcaacgtc ttccgcgtca tggtgaggga cagcgaggtg 1440gcggtgcagg cggacagggt gagggactcg ctgctggagg tgacgcggga gacgtacccc 1500ggcgtgtggc cgtcgccgca ggaggaggac gacgccaagt tcgacggcgg cgacggcggg 1560caggctgcgg cggcggcggc ggcggccggt ggagagcact accacgacga agtcggcggc 1620ggataccatc agcacctgca ttacctcgcg tttgattga 1659(2)SEQ ID NO.2的信息<110>上海交通大学<120>控制水稻绒毡层降解的蛋白编码序列<130>无<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>552<212>PRT<213>Oryza sativa<400>1MGRGDHLLMK NSNAAAAAAA VNGGGTSLDA ALRPLVGSDG WDYCIYWRLS PDQRFLEMTG 60FCCSSELEAQ VSALLDLPSS IPLDSSSIGM HAQALLSNQP IWQSSSEEEE ADGGGGAKTR120LLVPVAGGLV ELFASRYMAE EQQMAELVMA QCGGGGAGDD GGGQAWPPPE TPSFQWDGGA180DAQRLMYGGS SLNLFDAAAA DDDPFLGGGG GDAVGDEAAA AGAWPYAGMA VSEPSVAVAQ240
EQMQHAAGGG VAESGSEGRK LHGGDPEDDG DGEGRSGGAK RQQCKNLEAE RKRRKKLNGH300LYKLRSLVPN ITKMDRASIL GDAIDYIVGL QKQVKELQDE LEDNHVHHKP PDVLIDHPPP360ASLVGLDNDD ASPPNSHQQQ PPLAVSGSSS RRSNKDPAMT DDKVGGGGGG GHRMEPQLEV420RQVQGNELFV QVLWEHKPGG FVRLMDAMNA LGLEVINVNV TTYKTLVLNV FRVMVRDSEV480AVQADRVRDS LLEVTRETYP GVWPSPQEED DAKFDGGDGG QAAAAAAAAG GEHYHDEVGG540GYHQHLHYLA FD55权利要求
1.一种控制水稻绒毡层降解蛋白编码序列，其特征在于，所提供的一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有水稻OsTDR蛋白质活性的多肽的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的控制水稻绒毡层降解蛋白编码序列，其特征是，所述的序列具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
3.根据权利要求1或2所述的控制水稻绒毡层降解蛋白编码序列，其特征是，所述的序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1659位的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的控制水稻绒毡层降解蛋白编码序列，其特征是，所分离出的控制水稻绒毡层降解的蛋白质活性的多肽，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.根据权利要求1所述的控制水稻绒毡层降解蛋白编码序列，其特征是，所述的的DNA分子是一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
全文摘要
一种控制水稻绒毡层降解蛋白编码序列，属于基因工程领域。本发明所提供的一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有水稻OsTDR蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的序列具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽，所述的序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第1－1659位的核苷酸序列。利用本发明的控制水稻绒毡层降解蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与控制水稻绒毡层降解蛋白相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。本发明在控制水稻绒毡层降解方面具有明显的作用，可以产生新的水稻雄性不育系，用来生产杂交种子，开展轮回选择和创造基因库，在农业生产上具有十分重要的应用。
文档编号C07K14/415GK1884541SQ200610027399
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月8日 优先权日2006年6月8日
发明者张大兵, 李娜, 刘海生, 张大生, 袁政, 梁婉琪 申请人:上海交通大学