专利名称：胃癌新生血管导向性肽gx1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、基因突变、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白质的纯化、胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白。
背景技术：
肿瘤血管抑制治疗相关研究及存在的问题肿瘤血管生成是肿瘤迅速增殖的前提条件，抑制肿瘤血管生成是肿瘤治疗的一种重要途径。目前肿瘤血管抑制治疗主要分为以下途径①阻断促进血管生成的调节因子。血管生长刺激因子VEGF等是肿瘤细胞中最常发现的促血管生长因子，也是血管治疗中的主要靶分子。②增强抑制血管生长的调节因子。如增强抑制性细胞因子、生长因子拮抗剂等是肿瘤血管治疗中最直接的手段，目前已有多种抑制调节因子进入临床前期试验阶段。③已形成血管的阻断疗法。诱导肿瘤组织中已存在的血管急性损伤能够有效抑制肿瘤的增殖。④肿瘤血管抑制基因治疗。由于基因治疗的目标是核酸，具有设计简单、特异性强和毒性小等优点，目前已广泛用于实验研究中。
尽管目前在肿瘤血管生成方面的研究取得了很大的突破，但仍存在不足之处。首先，肿瘤血管针对性治疗不强。由于检测肿瘤血管特异性的分子标志物存在着很多困难这些分子只存在于肿瘤血管，正常血管中并不存在；表达的量较小、难以检测、更无法纯化。找出肿瘤血管特异性标志物是对肿瘤血管进行靶向治疗的关键。其次，目前进入临床实验多数血管生成抑制分子进入体内表达效率低，不能在肿瘤血管局部维持治疗浓度。只有当这些抑制血管或者肿瘤生成的药物具有靶向性的时候，才能使药物在体内表达效率增高，治疗浓度增大，达到有效治疗。
特异性结合多肽的研究现状针对以上的不足，噬菌体随机肽库的应用成功的解决了这一难题并为人们大规模发展和筛选新型抗肿瘤药物提供了强有力的手段。随着噬菌体展示多肽库技术的发展，应用小肽模拟抗原抗体反应已成为发展的趋势。这是因为(1)含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的抗原决定簇；(2)多数情况下，几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分，即蛋白质之间的相互作用是通过局部肽段间的相互作用实现的。这类导向性药物，不仅具有结合特异性和高效性，还克服了单抗效应剂分子量较大，穿透能力弱的缺点。目前，基于导向药物中导向分子小型化的发展趋势，利用噬菌体展示多肽库技术筛选出能够与目的分子结合的短肽，在体外合成编码这一短肽的核苷酸序列，与弹头分子基因融合，表达出具有导向作用的多肽—弹头分子，由短肽发挥导向作用，弹头分子可以是细菌毒素、细胞因子、化疗药物等，这一药物设计策略已显示出良好的应用前景。
采用噬菌体随机肽库技术，可以在欲筛选的靶标分子结构不明确的情况下，无需事先知道它们之间相互作用的区域及相互作用的性质来进行筛选，从而筛选出一些能与靶分子结合的特异性多肽。如Arap等成功的采用该技术筛选出能够与整合素所特异相结合的小肽“RGD”基序，为肿瘤靶向治疗提供依据。近几年又出现了以活细胞、病毒及组织器官等复杂生物体系，代替纯化的抗原、抗体或受体分子等作为筛选靶标的方法。筛选出的分子不一定和天然已知分子有相同的结构，其功能是存在的。Farrell FX等从噬菌体表面随机短肽库中筛选出的环状小肽，虽然其与天然促红细胞生成素(EPO)的序列亦无相似之处，但是它的确能够与EPO受体高亲合力结合，并且模拟EPO的功能。
已有研究显示各种组织器官都存在着组织器官特异性亲和蛋白，因此不同种类的肿瘤血管也会有不同的特异性亲和蛋白，即“异质性”(Molecular heterogeneity)。Pasqualini等人也通过噬菌体随机肽库体内淘洗法并获得了包括脑、肾、肺、胰、皮肤等多种正常组织器官血管内皮结合的不同的噬菌体短肽。Wadih Arap等采用噬菌体随机肽库技术发现能够与前列腺肿瘤血管特异性结合的小肽“SMSIARL”。
Angelo Coni等利用基因工程手段，将从噬菌体展示肽库中筛选出的能特异性与氨肽酶(CD13)结合的五肽CNGRC通过一个甘氨酸连到天然人肿瘤坏死因子的氨基端，实验证明，改建后的融合蛋白在体外肿瘤细胞杀伤实验中具有与天然肿瘤坏死因子相近的活性，在体内实验中，与天然肿瘤坏死因子相比，改建后的融合蛋白具有更高的量效比，更低的毒副反应，虽然没有直接的组织学证据证明改建后的融合蛋白能在肿瘤血管部位富集，但是以下实验证明了改建后的融合蛋白活性提高与CNGRC的关系同时注射游离的CNGRC肽能有效的抑制融合蛋白的体内抑瘤活性，使之达到与天然肿瘤坏因子相近的水平，而对天然肿瘤坏死因子的体内抑瘤活性无影响；用胰蛋白酶消化CNGRC-TNF和TNF，得到并分离消化产物TNF3-156片断，CNGRC-TNF和TNF的消化产物具有相同的体内抑瘤活性。抗CD13的单克隆抗体能显著抑制CNGRC-TNF的体内抑瘤活性，使之达到与天然肿瘤坏死因子相同水平；而对天然肿瘤坏死因子无明显抑制作用。在移植肿瘤生长12天以后，CNGRC-TNF和TNF二者的杀伤活性才出现明显差别，说明CNGRC-TNF可能通过作用于肿瘤的新生血管而具有较高的量效比。证实了特异性结合多肽作为导向分子的合理性和可行性。目前筛选多肽的方法有体内筛选和体外筛选两种，体外筛选主要针对目的肿瘤或组织的细胞系进行筛选，方法比较简单，但是无法准确模拟体内环境，筛选出的多肽在应用到体内时靶向效果不好。体内筛选就弥补了这个不足，体内筛选要建出合适的动物模型，方法上比较复杂，但是其来源于体内环境，应用于体内时效果较好。
肿瘤坏死因子是一种多功能的细胞因子，参与机体的免疫代谢调节，对某些癌细胞具有增殖抑制和细胞毒作用。肿瘤坏死因子还是一种感染性介导因子，在机体的炎症中起重要作用。
肿瘤坏死因子的生物效应抗肿瘤及抑瘤作用肿瘤坏死因子对多种肿瘤均有杀伤或抑制作用，敏感性因肿瘤细胞类型而异。肿瘤坏死因子的抑瘤机制尚不完全清楚，可能包括①、肿瘤坏死因子为激发性细胞因子，可启动广泛的免疫炎性反应，介导自然杀伤细胞、单核细胞和巨噬细胞对癌细胞的杀伤作用；②、肿瘤坏死因子可作用于血管内皮细胞，使肿瘤的血管变形受损或形成血栓，导致肿瘤发生出血性坏死或营养缺乏而消退；③、肿瘤坏死因子可通过诱导某些肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤细胞增生。
抗病毒作用肿瘤坏死因子呈剂量依赖性地抑制病毒介导的细胞病变的发展，对DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用。肿瘤坏死因子可以诱导未感染细胞产生抗病毒能力，还可选择性的杀伤病毒感染的细胞。现已证实，多种病毒等也可刺激肿瘤坏死因子的产生。
免疫调节作用肿瘤坏死因子能够增强T细胞产生以IL-2为主的淋巴因子，提高IL-2的表达水平，从而促进T细胞的增殖；还能促进B细胞的增殖、分化和产生抗体。此外，肿瘤坏死因子还能诱导单核-巨噬细胞系统的前体细胞分化，增强其吞噬能力和氧化代谢水平，提高巨噬细胞抗原提呈能力。并可促进骨髓基质细胞和巨噬细胞产生CSF，特别是GM-CSF，可促使骨髓释放中性粒细胞和巨噬细胞。肿瘤坏死因子还可以诱发炎症反应，是一种急性期反应的强力诱导剂。
对结缔组织的作用可诱导破骨细胞吸收骨质、促进软骨细胞进行软骨更新，抑制新骨形成。肿瘤坏死因子还可以刺激成纤维细胞和滑膜细胞的增生，引起关节组织的纤维化和增生。
肿瘤坏死因子的应用现状由于肿瘤坏死因子的抗肿瘤作用和多种免疫调节作用，肿瘤坏死因子疗法的临床研究已在许多国家开展。动物实验和临床研究均表明肿瘤坏死因子对某些肿瘤具有明显的抑制作用，但是由于副作用较大，限制了它的临床应用。肿瘤坏死因子的副作用包括发热、头痛、恶心、呕吐、全身倦怠、肌肉酸痛等；高剂量时可导致休克、肾功能不全和DIC形成等。建立合理的用药方案及治疗措施，可望降低用量，减轻副作用，达到最佳治疗效果。
静脉注射rhTNF可使部分肿瘤缩小，但是副作用大，人体很难耐受。瘤内注射可在局部出现坏死，且副作用较轻，对某些肿瘤的治疗效果优于静脉注射。已报告的有效病例包括肾癌、胃癌、肝癌等，并使转移性大肠癌腹水减少。
肿瘤坏死因子与其他药物的联合应用单独使用TNF用量大，不容易获得好的效果，患者常因不能耐受其副作用而中止用药。将其它具有肿瘤抑制作用的细胞因子(如IL-2、IFN等)或某些抗肿瘤药物(如ADM、MMC、DDP)与TNF联合应用，既可减少各种药物的用量、降低毒副作用，又可提高疗效，不失为肿瘤治疗的一种可行方法。
肿瘤坏死因子的定位基因突变根据对TNF结构与功能关系的研究结果，对TNF的核苷酸的置换、插入或删除来定向改变基因的序列，从而达到使TNF增效减毒的目的。用该法已获得了大量的TNF衍生物。
尽管对肿瘤坏死因子的改构或者与其他药物联用可在一定程度上降低其全身毒副作用，但其仍然是作用于全身各个脏器，对正常的组织器官仍有毒性。将其靶向定位于某种肿瘤组织或肿瘤新生血管中的研究还较少，特别是针对中国癌症发生率第二位的胃癌新生血管仍然是空白。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白，制备出肿瘤新生血管特异性结合多肽(GX1)与新型重组人肿瘤坏死因子融合蛋白，使其既具有新型重组人肿瘤坏死因子高效低毒的优点，又能在胃癌组织新生血管处富集，从而进一步降低新型重组人肿瘤坏死因子的临床用药量，提高量效比，降低胃癌治疗中的毒副作用。
本发明的技术方案是胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于应用噬菌体肽库体内筛选技术，得到了能与胃癌血管特异性结合的噬菌体小肽，将其与新型人肿瘤坏死因子α融合在大肠杆菌中获得高效表达，利用硫酸铵盐析和阴阳离子交换的方法对目的蛋白进行纯化，将得到的目的蛋白进行了活性测试。
所述的胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白，其基因的序列如下ATG TGT GGT ATT TAA CCT AGT GTG GGA CCC AAA GTA CCTTAG CCA GTT TAG AAA CCT AAG TGA GGG AGC CCA TGG CTG AAC CGCCGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AACCAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTCCTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CACACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTCTCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCTGAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAGCTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TATCTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC TTCTGA所述的胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白，其制备方法是1)利用噬菌体肽库体内筛选技术，获得能与胃癌血管特异结合的噬菌体小肽CGNSNPKSC(GX1)；2)GX1-nrhTNF融合蛋白基因的克隆及构建；3)重组蛋白的诱导表达；4)重组蛋白的纯化；5)重组蛋白的体外生物学活性检测；6)重组蛋白的体内生物学活性检测。
所述的GX1-nrhTNF融合蛋白基因的克隆及构建中pBV220-nrhTNF质粒由第四军医大学生物技术中心赠送，它的克隆位点是EcoR1，BamH1和Pst1；按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码GX1导向肽的核酸片断5′AAT TCA TGT GTG GTAATT CTA ATC CTA AGT CGT GCG3′将合成的片断于95℃变性5min，退火，再与用EcoR1和BamH1处理过的pBV220连接。
所述的原核表达载体pBV220中含有编码胃癌新生血管导向性肽GX1与新型重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的基因，该载体经30℃振荡培养过夜、活化后，经升高温度至42℃诱导，可高效表达新的肿瘤新生血管特异性结合多肽GX1与肿瘤坏死因子融合蛋白。
所述的重组蛋白的纯化，按1克菌体加5ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，4℃搅拌均匀后，用超声细胞破碎器裂解菌体，12000rpm，离心15min，收集上清，加固休硫酸铵至60％饱和度，4℃静置1h，12000rpm，离心15min，收集沉淀；用50倍体积的A液20mM PB pH6.5，1mM EDTA透析18小时，中间换液三到四次；透析后的上清用A液充分平衡的Q-Sepharose Fast Flow层析纯化，洗脱B液为0.2MNaCl，20mM PB pH6.5，1mMEDTA，连续梯度洗脱10个柱床体积，收集各个洗脱峰，测定活性，取活性峰对50倍体积的C液20mM Tris Cl pH8.5透析过夜，中间换液三到四次；透析后上清用C液充分平衡的SP-sepharose Fast Flow层析纯化，洗脱D液为20mM Tris·Cl pH8.5，1M NaCl，连续梯度洗脱4-5个柱床体积，收集洗脱峰，进行活性测定和电泳检测。
所述的重组蛋白的诱导表达，将重组好的质粒转化感受态工程菌大肠杆菌DH5α细胞，随机挑选克隆，以EcoR1和Pst1双酶切鉴定，筛选；正确的克隆于LB中30℃活化振摇培养12小时，次日以1∶100比例接种LB (含Amp 100μg/ml)培养基，30℃继续培养至OD650nm＝0.6时，迅速升高温度至42℃，培养4h；3000rpm离心15min收集菌体。
所述工程菌大肠杆菌DH5α细胞，基因型为supE44ΔlacU169(Φ80lacZΔM15)hsdRl7recAl endAl gyrA96thi-l relAl，其中含有编码新的肿瘤新生血管特异性结合多肽GX1与肿瘤坏死因子融合蛋白的基因的原核表达载体pBV220。
重组蛋白的体外生物学活性检测，按经典的L929细胞毒法进行；
重组蛋白的体内生物学活性检测，按建立BALB/C裸鼠SGC7901皮下成瘤模型，以GX1-nrhTNF为受试药物，nrhTNF、注射用生理盐水为对照药物，以实验结束时瘤体重量为检测指标，计算抑瘤率，确定受试药物的抑瘤效果；以实验前后裸鼠体重为检测指标，计算体重变化率，确定受试药物的毒副反应。
所述的L929细胞毒法测定方法如下L929细胞用加有10％小牛血清的DMEM培养基培养，用胰酶消化细胞后，在显微镜下计数，调整细胞浓度为1.0×105细胞/ml，并将细胞接种于96孔培养板中，每孔100μl(1.0×104细胞/孔)，37℃，5％CO2培养过夜至细胞贴满板壁80％-90％；TNF标准品每个剂量各测两个孔，每孔加0.1ml，以后各孔用含3％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液做4倍梯度稀释，即标准品起始浓度为100IU/ml，以后依次为25IU/ml，6.25IU/ml，1.56IU/ml，0.39IU/ml，0.1IU/ml，0.025IU/ml，0.00625IU/ml；样品则根据实际情况预稀释至起始浓度为100IU/ml，再做4倍梯度稀释终体积均为100μl/孔；置于37℃，5％CO2孵箱中，培养16h；用结晶紫法染色，测OD570nm值。
本发明的特点是选择了首次在动物模型体内筛选到能够与胃癌新生血管特异高效结合的多肽GX1，它应用基因克隆技术，构建了新的胃癌新生血管特异性结合多肽(GX1)与新型重组人肿瘤坏死因子的融合基因，重组人肿瘤坏死因子为第四军医大学的专利产品，(专利号是CN1405285A)，将胃癌血管特异结合的肽段与该新型肿瘤坏死因子相结合并在大肠杆菌中获得高效表达。制备出肿瘤新生血管特异性结合多肽(GX1)与新型重组人肿瘤坏死因子融合蛋白，使其既具有新型重组人肿瘤坏死因子高效低毒的优点，又能在胃癌组织新生血管处富集，从而进一步降低新型重组人肿瘤坏死因子的临床用药量，提高量效比，降低胃癌治疗中的毒副作用。
图1是实施例重组蛋白体内抑瘤试验中的肿瘤标本图片；图2是实施例重组蛋白体内抑瘤试验中动物给药后体重变化趋势图。
具体实施例方式
以下结合实施例附图对本发明作进一步的详细描述。
实施例新的胃癌新生血管特异性结合多肽(GX1)与新型重组人肿瘤坏死因子融合基因的全序列测定，PBV-GX1-nrhTNF测序结果为ATG TGT GGT ATT TAACCT AGT GTG GGA CCC AAA GTA CCT TAG CCA GTT TAG AAA CCT AAG TGAGGG AGC CCA TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AATGGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGCCTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCCTCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCCTAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAGAGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCCATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGCGCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAGGTC TAC TTT GGGATC ATT GCC TTC TGA图2是本发明重组蛋白体内抑瘤试验中的肿瘤标本图片。图2中从上至下依次为生理盐水组，GX1-nrhTNF组，nrhTNF组。
制备如上所述的肿瘤血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白的方法按以下步骤1)利用噬菌体肽库体内筛选技术，获得能与胃癌血管特异结合的噬菌体小肽CGNSNPKSC(GX1)。
2)GX1-nrhTNF融合蛋白基因的克隆及构建。
pBV220-nrhTNF质粒由第四军医大学生物技术中心赠送，它的克隆位点是EcoR1，BamH1和Pst1。
按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码GX1导向肽的核酸片断5′AAT TCA TGT GTG GTA ATT CTA ATC CTA AGT CGT GCG3′将合成的片断于95℃变性5min，退火，再与用EcoR1和BamH1处理过的pBV220连接。
3)重组蛋白的诱导表达将重组好的质粒转化感受态大肠杆菌DH5α细胞，随机挑选克隆，以EcoR1和Pst1双酶切鉴定，筛选；正确的克隆于LB中30℃活化振摇培养12小时后，以1∶100比例接种LB(含Amp 100μg/ml)培养基，30℃继续培养至OD650nm＝0.6时，迅速升高温度至42℃，培养4h。3000rpm离心15min收集菌体。
4)重组蛋白的纯化按1克菌体加5ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，4℃搅拌均匀后，用超声细胞破碎器裂解菌体，12000rpm，离心15min，收集上清，加固休硫酸铵至60％饱和度，4℃静置1h，12000rpm，离心15min，收集沉淀。用50倍体积的A液20mMPB pH6.5，1mM EDTA透析18小时，中间换液三到四次。透析后的上清用A液充分平衡的Q-Sepharose Fast Flow层析纯化，洗脱B液为0.2MNaCl，20mM PB pH6.5，1mMEDTA，连续梯度洗脱10个柱床体积，收集各个洗脱峰，测定活性，取活性峰对50倍体积的C液20mM Tris·Cl pH8.5透析18小时，中间换液三到四次。透析后上清用C液充分平衡的SP-sepharose Fast Flow层析纯化，洗脱D液为20mMTris·Cl pH8.5，1M NaCl，连续梯度洗脱4-5个柱床体积，收集洗脱峰，进行活性测定和电泳检测。
5)重组蛋白的体外生物学活性检测新的肿瘤新生血管特异性结合多肽与新型重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的生物活性检测按经典的L929细胞毒法进行。
6)重组蛋白的体内生物学活性检测建立BALB/C裸鼠SGC7901皮下成瘤模型，以GX1-nrhTNF为受试药物，nrhTNF、注射用生理盐水为对照药物，以实验结束时小鼠移植瘤瘤体重量为检测指标，计算抑瘤率，确定受试药物的抑瘤效果。以实验前后小鼠体重为检测指标，计算体重变化率，确定受试药物的毒副反应。
制备如上所述的肿瘤血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白的方法按以下步骤1)用噬菌体肽库体内筛选技术，获得能与胃癌血管特异结合的噬菌体小肽CGNSNPKSC(GX1)。
2)1-nrhTNF融合蛋白基因的克隆及构建pBV220-nrhTNF质粒由第四军医大学生物技术中心赠送，它的克隆位点是EcoR1，BamH1和Pst1。
按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码GX1导向肽的核酸片断5′AAT TCATGT GTG GTA ATT CTA ATC CTA AGT CGT GCG3′将合成的片断于95℃变性5min，退火，再与用EcoR1和BamH1处理过的pBV220连接。
3)组蛋白的诱导表达将重组好的质粒转化感受态大肠杆菌DH5α细胞，随机挑选克隆，以EcoR1和Pst1双酶切鉴定，筛选；正确的克隆于LB中30℃活化振摇培养12小时后，以1∶100比例接种LB(含Amp 100μg/ml)培养基，30℃继续培养至OD650nm＝0.6时，迅速升高温度至42℃，培养4h。3000rpm离心15min收集菌体。经SDS-PAGE分析，发现诱导后在分子量大约18,000Dalton处有一条新生蛋白带，用鼠抗人TNF抗体为一抗，酶标兔抗鼠IgG为二抗，进行Westem blot分析，证实了该新生蛋白带能够与抗TNF抗体发生特异性结合。
4)重组蛋白的纯化按1克菌体加5ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，4℃搅拌均匀后，用超声细胞破碎器裂解菌体，12000rpm，离心15min，收集上清，加固休硫酸铵至60％饱和度，4℃静置1h，12000rpm，离心15min，收集沉淀。用50倍体积的A液20mM PB pH6.5，1mM EDTA透析18小时，中间换液三到四次。透析后的上清用A液充分平衡的Q-Sepharose Fast Flow层析纯化，洗脱B液为0.2MNaCl，20mM PB pH6.5，1mMEDTA，连续梯度洗脱10个柱床体积，收集各个洗脱峰，测定活性，取活性峰对50倍体积的C液20mM Tris·Cl pH8.5透析18小时，中间换液三到四次。透析后上清用C液充分平衡的SP-sepharose Fast Flow层析纯化，洗脱D液为20mMTris·Cl pH8.5，1M NaCl，连续梯度洗脱4-5个柱床体积，收集洗脱峰，进行活性测定和电泳检测。SDS-PAGE凝胶电泳检测并经凝胶成像系统分析，纯度大于95％。
5)重组蛋白的体外生物学活性检测新的肿瘤新生血管特异性结合多肽与新型重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的生物活性检测按经典的L929细胞毒法进行。测定方法如下L929细胞用加有10％小牛血清的DMEM培养基培养，用胰酶消化细胞后，在显微镜下计数，调整细胞浓度为1.0X105细胞/ml，并将细胞接种于96孔培养板中，每孔100μl(1.0X104细胞/孔)，37℃，5％CO2培养过夜至细胞贴满板壁80％，或至细胞贴满板壁85％％及90％都可以。
TNF标准品每个剂量各测两个孔，每孔加0.1ml，以后各孔用含3％小牛血清(FBS)的DMEM培养液做4倍梯度稀释，即标准品起始浓度为1001U/ml，以后依次为251U/ml，6.251U/ml，1.561U/ml，0.391U/ml，0.11U/ml，0.0251U/ml，0.006251U/ml。样品则根据实际情况预稀释至起始浓度约为1001U/ml，再做4倍梯度稀释，终体积均为100μl/孔(以上操作均在96孔板中操作)。置于37℃，5％C02孵箱中，培养16h。用结晶紫染色，测OD570mn值，(双孔加样测两点值的平均)以稀释倍数的对数值为横坐标，OD570nm为纵坐标做图，以标准品的最低OD570nm和最高OD570nm之平均值做一平行于X轴的直线交于曲线，以样品对应曲线与该直线交点在X轴上读出半效量的稀释度，按下式计算效价样品活性(1U/ml)标准晶效价×(样品预稀释倍数/标准晶预稀释倍数)×(标准晶半效量稀释度/样品相当于标准品半效量的稀释度)。
体外活性实验显示nrhTNF对L929细胞杀伤活性达到1.0×1091U/ml，GX1-nrhTNF融合蛋白对L929细胞有明显的杀伤活性，活性为5.0×1061U/ml。
6)重组蛋白的体内生物学活性检测的具体步骤为a)将20只体重介于18-20克之间的裸鼠在无菌操作条件下，于右侧背部皮下接2×106/0.1ml的SGC7901胃癌细胞；随后将接种后的动物随机分成3组，即GX1-nrhTNF 1.2×107U/kg实验组，nrhTNF 1.2×107U/kg阳性对照组，生理盐水阴性对照组；b)于治疗前称体重；接种瘤株后第15天分别按上述各组动物给药剂量和给药方法进行治疗，均于尾静脉注射GX1-nrhTNF，nrhTNF和生理盐水，连续治疗6次12天；
c)末次给药后24小时，再次称量体重，然后用颈椎脱臼法处死动物，迅速分离出肿瘤组织称其湿重，根据公式计算出肿瘤生长抑制率，并进行统计分析。
具体操作如下建立BALB/C裸鼠SGC7901皮下成瘤模型，以GX1-nrhTNF为受试药物，nrhTNF、注射用生理盐水为对照药物，以实验结束时小鼠移植瘤瘤体重量为检测指标，计算抑瘤率，确定受试药物的抑瘤效果。以实验前后小鼠体重为检测指标，计算体重变化率，确定受试药物的毒副反应。
实验内容1、受试药物GX1-nrhTNF为冻干粉剂，保存于-20℃冰箱备用。根据用药剂量临用前于无菌条件下用生理盐水溶解、稀释。
对照药物①、注射用新型重组人肿瘤坏死因子半成品，使用时稀释至所需剂量。
②、阿霉素选用浙江海正药业股份有限公司生产的注射用盐酸多柔比星(阿霉素)，配制成2mg/ml，4℃冰箱备用。
③、注射用生理盐水2、实验动物由第四军医大学实验动物中心购买BALB/C裸鼠，体重18-20克，共25只，，在无菌饲养观察条件下进行试验。
3、实验瘤株系本室定期传代的胃癌细胞株SGC7901，供动物体内抑瘤实验用。
4、实验分组将20只小鼠随机分为4组，即导向性肿瘤坏死因子GX1-nrhTNF1×107U/kg实验组(5只)，新型人肿瘤坏死因子nrhTNF 1×107U/kg组(5只)，阿霉素2mg/kg阳性对照组(5只)，生理盐水阴性对照组(5只)。
5、无菌操作在小鼠右侧背部皮下接种2×106/0.1ml的SGC7901胃癌细胞次日将接种后的动物随机分成4组，于治疗前称体重。接种瘤株后第15天分别按上述各组动物给药剂量和给药方法进行治疗，均于尾静脉注射阿霉素、导向性肿瘤坏死因子，新型重组人肿瘤坏死因子和生理盐水，连续隔日给药治疗12天。末次给药后24小时，再次称量体重，然后用颈椎脱臼法处死动物，迅速分离出肿瘤组，称其湿重，根据公式计算出肿瘤生长抑制率，并进行统计分析。
肿瘤生长抑制率可按下列公式计算 同时计算小鼠治疗前后体重变化，作为衡量治疗药物毒副作用的指标。
图2是实施例重组蛋白体内抑瘤试验中动物给药后体重变化趋势图。纵坐标是动物体重，横坐标是给药的时间。
体内试验显示GX1-nrhTNF对裸鼠移植瘤SGC7901的生长具有明显的抑制作用。GX1-nrhTNF组抑瘤率达到53.10％，与生理盐水组(NS)对比有明显差异(P＜0.05)。并且给药后GX1-nrhTNF组(GX1-TNF)与对照药物nrhTNF组(TNF)相比，体重(animal weight)减轻明显小于对照药物组，说明其全身毒副作用低于nrhTNF如图2所示。
表1是重组蛋白的抑瘤效果。
*P＜0.05本发明选用了能特异性与肿瘤新生血管结合的多肽GX1，应用基因重组的方法，将其与nrhTNF氨基端融合，并在大肠杆菌中获得表达。在成功构建、表达融合基因的基础上，参照nrhTNF的纯化方法，建立了成本低廉的纯化工艺，融合蛋白的条件，利用两步硫酸铵沉淀，阴阳离子交换层析的方法，纯化出该融合蛋白，其纯度大于95％。
在体外杀伤试验中，该融合蛋白GX1-nrhTNF对L929细胞具有剂量依赖性的、明显的杀伤作用，活性达到5×1061U/ml。在动物肿瘤模型中，该融合蛋白GX1-nrhTNF对裸鼠移植瘤SGC7901有显著的抑制作用(肿瘤抑制率为53.10％)，明显高于阴性对照组。并且毒副作用低于nrhTNF。
经实验证明，本发明的效果如下1)利用基因工程方法将人工合成的编码GX1的寡核苷酸片段与nrhTNF5’端连接，构建了GX1-nrhTNF融合基因的克隆载体，DNA序列测定证实完全正确。
2)构建的GX1-nrhTNF融合基因的原核表达载体，经温度诱导，在大肠杆菌中获得高效表达。经免疫印迹证实该融合蛋白与抗TNF抗体有特异性结合能力。
3)纯化了GX1-nrhTNF融合蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳检测纯度大于95％。
4)体外活性实验显示GX1-nrhTNF融合蛋白对L929细胞有明显的杀伤活性，活性达到5×1061U/ml。体内试验显示GX1-nrhTNF对裸鼠移植瘤SGC7901的生长具有明显的抑制作用。GX1-nrhTNF组抑瘤率达到53.10％，与生理盐水组对比有明显差异(P＜0.05)。并且给药后GX1-nrhTNF组与对照药物nrhTNF组相比，体重减轻明显小于对照药物组，说明其全身毒副作用低于nrhTNF本发明采用改进的噬菌体随机肽库体内筛选技术成功在体内筛选出能够与胃癌血管特异性相结合的环状小肽GX1，将它作为导向分子抑制肿瘤血管的生长，从而抑制肿瘤生长。
权利要求
1.胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于应用噬菌体肽库体内筛选技术，得到了能与胃癌血管特异性结合的噬菌体小肽，将其与新型人肿瘤坏死因子α融合在大肠杆菌中获得高效表达，利用硫酸铵盐析和阴阳离子交换的方法对目的蛋白进行纯化，将得到的目的蛋白进行了活性测试。
2.根据权利要求1所述的胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白，其基因的序列如下ATG TGT GGT ATT TAA CCT AGT GTG GGA CCCAAA GTA CCT TAG CCA GTT TAG AAA CCT AAG TGA GGG AGC CCA TGG CTGAAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGAGAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCCCAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTCACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AACCTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAGGGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTCTTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGGCCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATCATT GCC TTC TGA
3.根据权利要求1所述的胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白，其制备方法是1)利用噬菌体肽库体内筛选技术，获得能与胃癌血管特异结合的噬菌体小肽CGNSNPKSC(GX1)；2)GX1-nrhTNF融合蛋白基因的克隆及构建；3)重组蛋白的诱导表达；4)重组蛋白的纯化；5)重组蛋白的体外生物学活性检测；6)重组蛋白的体内生物学活性检测。
4.根据权利要求3所述的胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于所述的GX1-nrhTNF融合蛋白基因的克隆及构建中pBV220-nrhTNF质粒由第四军医大学生物技术中心赠送，它的克隆位点是EcoR1，BamH1和Pst1；按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码GX1导向肽的核酸片断5′AAT TCA TGT GTG GTA ATT CTA ATC CTA AGT CGT GCG3′将合成的片断于95℃变性5min，退火，再与用EcoR1和BamH1处理过的pBV220连接。
5.根据权利要求4所述的胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于所述的原核表达载体pBV220中含有编码胃癌新生血管导向性肽GX1与新型重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的基因，该载体经30℃振荡培养过夜、活化后，经升高温度至42℃诱导，可高效表达新的肿瘤新生血管特异性结合多肽GX1与肿瘤坏死因子融合蛋白。
6.根据权利要求3所述的胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于所述的重组蛋白的纯化，按1克菌体加5ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，4℃搅拌均匀后，用超声细胞破碎器裂解菌体，12000rpm，离心15min，收集上清，加固休硫酸铵至60％饱和度，4℃静置1h，12000rpm，离心15min，收集沉淀；用50倍体积的A液20mM PB pH6.5，1mM EDTA透析18小时，中间换液三到四次；透析后的上清用A液充分平衡的Q-Sepharose Fast Flow层析纯化，洗脱B液为0.2MNaCl，20mM PB pH6.5，1mMEDTA，连续梯度洗脱10个柱床体积，收集各个洗脱峰，测定活性；取活性峰对50倍体积的C液20mM TrisCl pH8.5透析过夜，中间换液三到四次；透析后上清用C液充分平衡的SP-sepharoseFast Flow层析纯化，洗脱D液为20mM Tris·Cl pH8.5，1M NaCl，连续梯度洗脱4-5个柱床体积，收集洗脱峰，进行活性测定和电泳检测。
7.根据权利要求3所述的胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于所述的重组蛋白的诱导表达，将重组好的质粒转化感受态工程菌大肠杆菌DH5α细胞，随机挑选克隆，以EcoR1和Pst1双酶切鉴定，筛选；正确的克隆于LB中30℃活化振摇培养12小时，次日以1∶100比例接种LB(含Amp 100μg/ml)培养基，30℃继续培养至OD650nm＝0.6时，迅速升高温度至42℃，培养4h；3000rpm离心15min收集菌体。
8.根据权利要求7所述的肿瘤新生血管特异性结合多肽GX1与新型重组人肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于所述工程菌大肠杆菌DH5α细胞，基因型为supE44ΔlacU169(Φ80 lacZΔM15)hsdR17 recAl endAl gyrA96 thi-l relAl，其中含有编码新的肿瘤新生血管特异性结合多肽GX1与肿瘤坏死因子融合蛋白的基因的原核表达载体pBV220。
9.根据权利要求3所述的胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于重组蛋白的体外生物学活性检测，按经典的L929细胞毒法进行；重组蛋白的体内生物学活性检测，按建立BALB/C裸鼠SGC7901皮下成瘤模型，以GX1-nrhTNF为受试药物，nrhTNF、注射用生理盐水为对照药物，以实验结束时瘤体重量为检测指标，计算抑瘤率，确定受试药物的抑瘤效果；以实验前后裸鼠体重为检测指标，计算体重变化率，确定受试药物的毒副反应。
10.根据权利要求9所述的胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于所述的L929细胞毒法测定方法如下L929细胞用加有10％小牛血清的DMEM培养基培养，用胰酶消化细胞后，在显微镜下计数，调整细胞浓度为1.0×105细胞/ml，并将细胞接种于96孔培养板中，每孔100μl(1.0×104细胞/孔)，37℃，5％CO2培养过夜至细胞贴满板壁80％-90％；TNF标准品每个剂量各测两个孔，每孔加0.1ml，以后各孔用含3％胎牛血清FBS的DMEM培养液做4倍梯度稀释，即标准品起始浓度为100IU/ml，以后依次为25IU/ml，6.25IU/ml，1.56IU/ml，0.39IU/ml，0.1IU/ml，0.025IU/ml，0.00625IU/ml；样品则根据实际情况预稀释至起始浓度为100IU/ml，再做4倍梯度稀释终体积均为100μl/孔；置于37℃，5％CO2孵箱中，培养16h；用结晶紫法染色，测OD570nm值。
全文摘要
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、基因突变、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白质的纯化、胃癌新生血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于应用噬菌体肽库体内筛选技术，得到了能与胃癌血管特异性结合的噬菌体小肽，将其与新型人肿瘤坏死因子α融合在大肠杆菌中获得高效表达，利用硫酸铵盐析和阴阳离子交换的方法对目的蛋白进行纯化，将得到的目的蛋白进行了活性测试。其既具有新型重组人肿瘤坏死因子高效低毒的优点，又能在胃癌组织新生血管处富集，从而进一步降低新型重组人肿瘤坏死因子的临床用药量，提高量效比，降低胃癌治疗中的毒副作用。
文档编号C07K1/00GK1872880SQ20061004178
公开日2006年12月6日 申请日期2006年2月14日 优先权日2006年2月14日
发明者吴开春, 张英起, 曹珊珊, 郅敏, 颜真, 万一, 丁杰, 樊代明 申请人:中国人民解放军第四军医大学