一种获得具有独立结构/功能蛋白片段的方法

专利名称：一种获得具有独立结构/功能蛋白片段的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物领域中一种获得具有独立结构/功能蛋白片段的方法。
背景技术：
普遍认为蛋白质的多肽骨架是由具有一定结构、功能的小片段组成的。序列和结构分析表明，这些小片段的集合能够折叠成相对独立的结构域(domain)(Doolittle，R.F.，The multiplicity of domains in proteins.Annu.Rev.Biochem.1995，64287-314；Thornton，J.M.，Orengo，C.A.，Todd，A.E.&Pearl，F.M.，Protein folds，functions and evolution.J.Mol.Biol.1999，293333-342；Apic，G.，Gough，J.&Teichmann，S.A.，Domain combinations in archaeal，eubacterialand eukaryotic proteomes.J.Mol.Biol.2001，310311-325.)。在某特定位点对蛋白质(酶)进行操作，如将其分为两部分、环状排列蛋白序列(circularpermutation)或者插入外源蛋白片段等，蛋白质(酶)依然能够保持活性，上述结果也表明蛋白质是小多肽的集合(Regan，L.，Protein redesign.Curr.Opin.Struct.Biol.1999，9494-499.)。这些研究引起了人们寻找这些特殊位点，即寻找具有一定结构、功能蛋白片段的关注，因为这对研究蛋白质的结构功能关系以及蛋白质的折叠机理等具有重要意义。在此基础上，甚至可以构建出自然界不存在的新的功能酶。对HIV等病毒的表面抗原蛋白的研究表明，一些抗原决定位点包裹于蛋白内部，从而逃脱了免疫细胞的攻击。因此找到这些决定位点并且暴露出来，将会极大地促进病毒疫苗的研究。由此可见获得能够独立表达的蛋白片段是非常必要和有意义的。
目前，蛋白质切割的方法主要有蛋白质水解法、化学裂解法、以及利用蛋白质及基因工程的方法合成相应蛋白片断等方法，如对大肠杆菌(Escherichia.coli)的色氨酸合成酶的α亚基(tryptophan synthase αsubunitTSα)进行蛋白酶处理，获得两个结构域(1-188a.a和189-268a.a)(Higgins，W.，Fairwell，T.&Miles，E.W.，An active proteolytic derivative of the subunit of tryptophan synthase.Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.Biochemistry，1979，184827-4835.)。Hiraga K.等人利用色氨酸合成酶α亚基的N端和C端的功能互补以及通过色氨酸合成酶的酶活选择方法，获得该蛋白的结构功能单元(Hiraga，K.，Yamagishi，A.，and Oshima，T.，Mapping of unit boundariesof a proteinexhaustive search for permissive sites for duplication bycomplementation analysis of random fragment libraries of tryptophan synthaseαsubunit.J.Mol.Biol.2004，3351093-1104)。基于蛋白质的结构信息分析，设计相应的蛋白片断来研究其折叠性能的方法(Zitzewitz，J.A.，Gualfetti，P.J.，Perkons，I.A.，Wasta，S.A.&Matthews，C.R.，Identifying the structuralboundaries of independent folding domains in the alpha subunit of tryptophansynthase，a beta/alpha barrel protein.Protein Sci.，1999.8(6)1200-1209)，以及结合PDB蛋白数据库发展起来的结构模型预测方法(Fischer KF，Marqusee S.，A rapid test for identification of autonomous folding units in proteins.J.Mol.Biol.2000，302(3)701-712)等也有报道。
但这些现有的研究方法需要对蛋白质的结构或者功能具有比较清楚的了解(蛋白结构被解析或者确定的酶活检测方法)，且利用蛋白酶水解法或化学裂解法只能对特殊位点进行操作，因而能够获得的数据非常有限。由于人们对蛋白质结构和功能间的关系了解有限，另外由于现有方法的筛选库比较小、且操作复杂、耗时费力，因此现有方法都存在一定的局限性，很难广泛应用并且达到快速筛选具有独立结构/功能的蛋白片段的目的。
在宿主细胞(尤其是大肠杆菌)内，蛋白质大量表达经常会引起蛋白质的错误折叠甚至聚集沉淀。尽管在蛋白质体外复性方面已经进行了大量的研究工作，但目前还没有行之有效的方法。Geoffrey等人(Geoffrey S.W.，Blake M.S.，Joel B.，ThomasC.T.，Rapid protein-folding assay using green fluorescent protein，NatureBiotechnology，1999，17691-695)构建了含有蛋白质正确折叠报告蛋白的载体，即在GFP基因的N-端通过linker与测试蛋白相连。通过测试20种外源蛋白表明，大肠杆菌的荧光表达与GFP基因上游的外源蛋白区域能够独立、大量的表达相互依赖。该方法具有检测方便，不需要对目的蛋白进行结构分析即能有效的判断外源蛋白的功能表达特性的特点，但是由于该方法是基于筛选(Screening)来获得目的片断的，存在工作量大，费时费力的缺点；同时GFP是比较大的蛋白(28kD)，对于融合蛋白的大小存在一定的限制。Maxwell等人以提高蛋白的可溶性构建了一个含有氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyl transferase，CAT)的载体(Maxwell，K.，et al.，A simplein vivo assay for increased protein solubility.Protein Science，1999.8(9)1908-1911.)，而F.H.Arnold等用CAT来进行预筛选以方便的获得的含有杂交蛋白的变种(Sieber，V.，C.Martinez，and F.Arnold，Libraries of hybrid proteins fromdistantly related sequences.Nature Biotechnology，2001，19(5)456-460.)。

发明内容
本发明的目的是提供一种获得具有独立结构/功能蛋白片段的方法。
本发明所提供的获得具有独立结构/功能蛋白片段的方法，包括以下步骤1)切割编码蛋白的多核苷酸序列，然后再进行重组，得到不同长度的多核苷酸随机片段；2)将步骤1)获得的多核苷酸随机片段连接入含有编码具有选择功能的报告蛋白基因(选择标记基因)的载体中，再将所述重组载体导入宿主，培养宿主，得到具有独立结构/功能的蛋白片段。
在上述方法中，步骤1)中编码蛋白的多核苷酸序列为DNA或RNA，优选为双链DNA；切割编码蛋白的多核苷酸序列的方法为酶法、物理法(如利用超声波等)或化学法，其中酶法采用的酶可为DNase、RNase或内切酶等，优选为DNase I；所述蛋白的选择是任意的，如色氨酸合成酶α亚基(tryptophan synthaseαsubunit，TSα)、gp120、二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)或胰凝乳蛋白酶抑制剂(chemotrypsin inhibitor)等；可用自身引导(self-priming)的聚合酶反应(polymerase reaction)对经随机切割的编码蛋白的多核苷酸序列进行重组。
在所述步骤2)中的表达载体中，多核苷酸随机片段与编码具有选择功能的报告蛋白基因可由连接肽编码序列相连，且多核苷酸随机片段位于报告蛋白基因的上游；所述连接肽可具有序列表中序列1的氨基酸残基序列；所述编码具有选择功能的报告蛋白基因可为氯霉素乙酰转移酶基因、卡那霉素基因或lacZα基因等；用于构建含有编码具有选择功能的报告蛋白基因及连接肽编码序列的重组载体的出发载体可为任意一种可在大肠杆菌中表达外源基因的原核表达载体，如pUC18、pUC19或pET系列载体，所述pET系列载体包括pET30(a)、pET-22b等，优选为pET30(a)。其中，以pET30(a)为出发载体，构建的含有氯霉素乙酰转移酶基因及连接肽编码序列的重组载体为pET30(a)-linker-CAT，该载体可作为筛选能够独立折叠的蛋白片段的通用载体使用。
将含有报告蛋白基因及双链DNA片段的融合表达载体转化宿主菌的方法可为生物工程领域中常用的转化方法，如热激法、电转化法、接合转化法、PEG介导的原生质体转化法等。所述宿主菌可为适于蛋白表达的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞，优选为大肠杆菌，如E.coliBL21(DE3)、E.coliXL-1blue或E.coliDH5α等，尤其优选为E.coli BL21(DE3)。
本发明提供了一种基于基因随机切割技术获得具有独立结构/功能的蛋白片段的方法。该方法不具有基因/蛋白的特异性，适用范围广，由于CAT蛋白比GFP更小，并且可以利用氯霉素抗性进行选择性筛选(selection)，因此该筛选方法更加方便快速，是寻找具有独立结构/功能的蛋白片段简单、有效的通用方法。还可用于蛋白质结构和折叠机理的研究和新的功能酶的构建。此外，用该方法获得的具有独立结构/功能的蛋白片段可作为抗原用于制备病毒(如禽流感H5N1等)抗体和病毒疫苗。本发明将在具有独立结构/功能的蛋白片段的筛选中发挥巨大作用。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。


图1为pET30(a)-linker-CAT的部分物理图谱图2为筛选到的TSα片段与全长序列的位置比较结果图3A为TScat-1多肽基因的表达产物的SDS-PAGE检测结果图3B为TScat-2多肽基因的表达产物的SDS-PAGE检测结果图3C为TScat-5多肽基因的表达产物的SDS-PAGE检测结果图4A为TScat-1的镍柱亲和纯化的洗脱曲线图4B为TScat-2的镍柱亲和纯化的洗脱曲线图4C为TScat-5的镍柱亲和纯化的洗脱曲线图5A为TScat-1纯化产物的SDS-PAGE检测结果图5B为TScat-2纯化产物的SDS-PAGE检测结果图5C为TScat-5纯化产物的SDS-PAGE检测结果图6为经纯化的TScat-1、TScat-2和TScat-5多肽的园二色光谱图具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有引物合成及测序工作均由大连宝生物(TakaRa)或上海生工生物工程公司完成，测序工作由大连宝生物(TakaRa)或北京三博远志公司完成，所有百分比浓度均为质量百分比浓度。
实施例1、具有独立结构/功能的蛋白片段的获得现以色氨酸合成酶α亚基(tryptophan synthase αsubunit，TSα)为例，用本发明的方法得到具有独立结构/功能的蛋白片段，具体过程包括以下步骤一、构建含有氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因及linker编码序列的重组载体1、氯霉素乙酰转移酶基因的扩增以含有CAT基因的质粒pACYC184(New England Biolabs)为模板，在两对引物P1和P2的引导下，用重叠延伸PCR法(overlap PCR)扩增CAT基因，并在CAT基因的上游引入连接肽(linker)编码序列(编码序列表中序列1的氨基酸残基序列)，两端引入限制性内切酶BamH I和Hind III识别位点，同时将CAT基因中的限制性内切酶EcoR I的识别位点进行无义突变(GAATTC->GAATTT)，引物序列如下P1(用于扩增CAT基因的约前220bp序列)F1(正向引物)5’-CCAAGGATCCATGGAGAAAAAAATCACTGGATATAC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点)R1(反向引物)5’-TTCATTGCCATACGAAATTC-3’；P2(用于扩增CAT基因的约后500bp序列)F2(正向引物)5’-CCGGAATTTCGTATGGCAATG-3’R2(反向引物)5’-AGACCAAGCTTTTACGCCCCGCCCTGCCACTC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点)先分别在引物对P1和P2的引导下，用常规的PCR方法扩增出CAT基因的两个片段，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出长度约为220bp和500bp的DNA片段，与预期结果相符。各取少量的扩增出的CAT基因的两个片段，再在正向引物F1和反向引物R2的引导下，用重叠延伸PCR法获得全长的CAT基因。
2、含有氯霉素乙酰转移酶基因及linker编码序列的重组载体的获得用限制性内切酶BamH I和Hind III分别对重组质粒pET30(a)-linker-GFP(Shuang Li，Zhen Cai，Yong Chen & Zhanglin Lin，Dissectionof SARS coronavirus spike protein into discrete folded fragments，TsinghuaScience and Technology，received)和步骤1扩增的CAT基因进行双酶切后，将两种酶切产物用T4DNA连接酶连接，再将连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性重组子，提质粒，得到含有CAT基因及linker编码序列的重组质粒，命名为pET30(a)-linker-CAT，其部分物理图谱如图1所示(其余部分与pET30(a)相同)，该载体可作为筛选能够独立折叠的蛋白片段的通用载体使用。
二、TSα基因的扩增以TSα基因的cDNA(GenBank号946204)为模板，在正向引物P35’-CTATGGAACGCTACGAATCTCT-3’和反向引物P45’-AACTGCGCGTCGCCGCTTTCATC-3’的引导下，用常规的PCR方法扩增TSα基因，该PCR反应的退火温度(AnnealingTemperature)为45℃，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收约800bp的目的片段，用Qiagen公司的DNA片段纯化试剂盒对其进行纯化。
三、TSα基因的随机切割1)取步骤二中纯化的TSα基因0.1-5μg，加入反应管中，再向反应管中添加以下试剂1M Tris-Cl(pH7.5)2.5μl，50mM MnCl210μl，用双蒸水补充反应体系至50μl。然后15℃保温10min，再加入1.5μl DNaseI(5U/μl，使用前用50mMTris-ClpH7.5按1∶100比例进行稀释)到反应管中，15℃反应4min；2)加入EDTA至终浓度为50mM用以终止反应；3)加热至90℃，保温10min使DNase I失活；4)用颇尔公司(Pall Ltd.)Nanosep系列纯化柱回收并纯化长度为50-100bp的双链DNA片段。
四、TSα基因的重组采用自身引导(self-priming)的聚合酶反应(polymerase reaction)，即不加入引物的聚合酶反应对步骤三获得的TSα基因随机切割片段进行重组，具体步骤如下取TSα基因随机切割片段0.1-5μg，先加热到94-95℃，再冷却到45-55℃，然后在60-72℃下用1-50U/μg Taq聚合酶进行聚合酶反应0.5-2分钟，用颇尔公司Nanosep系列纯化柱回收并纯化长度为50-1000bp的双链DNA片段。
五、含有氯霉素乙酰转移酶基因及50-1000bp双链DNA片段的融合表达载体的构建1)用限制性内切酶EcoR I对质粒pET30(a)-linker-CAT进行酶切；2)按常规方法对步骤四经重组的长度为50-1000bp的TSα基因随机切割片段和经单酶切后的线性质粒进行平末端化处理，具体方法为加入T4DNA聚合酶(2U酶/μgDNA)，12℃保温10-40min，然后加热至75℃20min使酶失活；3)将经平末端化处理的长度为50-1000bp的TSα基因随机切割片段和经单酶切后的线性质粒用T4DNA连接酶连接，再将连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性重组子，提质粒，得到含有氯霉素乙酰转移酶基因及经重组的50-1000bp TSα基因随机切割片段的融合表达载体。
六、E.coli BL21(DE3)的转化及表达将融合表达载体用热激法转化E.coli BL21(DE3)，将转化细胞涂于卡那霉素(Kanamycine)LB抗性平板(每升培养基含胰蛋白胨10.0g，酵母浸膏粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g，pH7.0，50μg/mL卡那霉素)上，筛选阳性转化子，将其接种于含0.5mM IPTG和40μg/mL氯霉素的LB平板上，在30℃下诱导氯霉素乙酰转移酶基因及50-1000bp双链DNA片段融合基因表达。
七、大规模(large-scale)筛选能够独立表达的TSα蛋白片段1、菌落PCR检测以步骤六获得的表达有乙酰转移酶基因及50-1000bp双链DNA片段融合基因的重组菌为模板，在引物P55’-TAAGAAGGAGATATACATAATG-3’和引物P65’-CTAGGAGAACCAGCAGCACTCGAGCCA-3’的引导下，按常规的菌落PCR方法检测插入的TSα基因片段，挑选具有不同大小的插入片段的菌株，测序、分析插入片段的氨基酸结构、功能特征。通过表达、筛选到的TSα多肽片段与全长序列的比较结果如图2所示(多肽片段相应名称标示于多肽片段上方，相对于原始全长基因的起始终点位置标在相应片段的下方；其中F73，G170和R189表示文献报道可能的切割位点)，根据文献报道(Higgins，W.，Fairwell，T.&Miles，E.W.An active proteolytic derivativeof the a subunit of tryptophan synthase.Identification of the site of cleavageand characterization of the fragments.Biochemistry，1979，184827-4835)，TSα蛋白能够在R189处断开，也有文献报道(Hiraga，K.，Yamagishi，A.，and Oshima，T.，Mapping of unit boundaries of a proteinexhaustive search for permissivesites for duplication by complementation analysis of random fragment librariesof tryptophans α subunit J.Mol.Biol.2004，3351093-1104)在F73和G170两个位置断开。另外来自对TSα蛋白的N端一系列递增的大于100个氨基酸的片段研究表明，这些片段都存在典型的二级结构，随着其氨基酸的个数的增加，其结构趋于稳定，其中蛋白片段1-188a.a是一个稳定且能独立表达的蛋白片段(Zitzewitz，J.A.，Gualfetti，P.J.，Perkons，I.A.，Wasta，S.A.&Matthews，C.R.，Identifyingthe structural boundaries of independent folding domains in the alpha subunitof tryptophan synthase，a beta/alpha barrel protein.Protein Sci.，1999.8(6)1200-1209)。
2、氯霉素抗性分析对步骤1获得的重组菌(其中含有的TSα片段名称见表1)进行氯霉素抗性分析，具体方法为将培养12-24小时的含有目的TSα片段的菌液按1∶50的比例接种到新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，培养至OD600达到1时，再按1∶50的比例稀释到含有0.5mM IPTG和不同氯霉素浓度(40、80、120μg/mL)的LB液体培养基中继续培养，不同时间测定菌液的OD600值，与不含氯霉素的对照组比较，结果如表1所示，表明重组菌中的CAT基因获得表达，具有较高的氯霉素抗性，而不同的重组菌对氯霉素具有的抗性有一定差异。
表1筛选获得的TSα片段与CAT的融合蛋白的氯霉素抗性分析结果a


√表示含有氯霉素的样品的OD值至少大于对照组的20％。-表示没有测定该点数据。
八、TSα蛋白片段TScat-1、TScat-2和TScat-5的进一步表征分析现用下述方法对步骤八筛选到的蛋白片段TScat-1(序列表中的序列2)、TScat-2(序列表中的序列3)和TScat-5(序列表中的序列4)做进一步表征分析1、不含CAT基因的TSα多肽TScat-1、TScat-2和TScat-5基因的表达1)PCR扩增TScat-1、TScat-2和TScat-5多肽基因以含有TScat-1多肽基因的重组质粒为模板，在通用正向引物PF5’-CGAATAACAATTCCCCTCTAGAAAT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Xba I识别位点)和TScat-1的反向引物TScat-1R5’-ATGCAAGCTTGTCGTCATCGGCATTTGGC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点)的引导下，PCR扩增不含CAT基因的TScat-1多肽基因片段；以含有TScat-2多肽基因的重组菌的基因组DNA为模板，在通用正向引物PF和TScat-2的反向引物TScat-2R5’-CCCCAAGCTTGGTCACGCCTGCTCGTGACA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点)的引导下，PCR扩增不含CAT基因的TScat-2多肽基因片段；以含有TScat-5多肽基因的重组菌的基因组DNA为模板，在通用正向引物PF和TScat-5的反向引物TScat-5R5’-CCCCAAGCTTGGTCACGCCTGCTCGTGACA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点)的引导下，PCR扩增不含CAT基因的TScat-5多肽基因片段。反应结束后，对三种PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR扩增分别获得了约350bp、500bp和550bp的DNA片段，与预期结果相符。
2)构建TScat-1、TScat-2和TScat-5多肽基因的重组表达载体用限制性内切酶Xba I和Hind III对载体pET30(a)和步骤1)的三种PCR扩增产物进行双酶切，回收三种酶切产物并用Qiagen公司的DNA片段纯化试剂盒对其进行纯化，然后将经酶切的TScat-1、TScat-2和TScat-5多肽基因分别与线性化的pET30(a)质粒连接，将连接产物转化E.coli BL21(DE3)，筛选阳性重组子，提质粒，得到含有TScat-1基因的重组表达载体，命名为pET30(a)/TScat-1，含有TScat-2基因的重组表达载体，命名为pET30(a)/TScat-2，以及含有TScat-5基因的重组表达载体，命名为pET30(a)/TScat-5。
3)TScat-1、TScat-2和TScat-5多肽基因的表达将pET30(a)/TScat-1、pET30(a)/TScat-2和pET30(a)/TScat-5分别用热激法转化E.coli BL21(DE3)，将转化细胞涂于含50μg/mL卡那霉素的LB抗性平板上，筛选阳性转化子，将其接种于含0.5mM IPTG的LB液体培养基中，在30℃下诱导TScat-1、TScat-2和TScat-5多肽基因的表达，以转化有pET30(a)空载体的重组菌BL21(DE3)/pET30a为对照。表达结束后，对三种表达产物进行12％SDS-PAGE检测，检测结果如图3A-图3C所示(泳道1不可溶蛋白；泳道2可溶蛋白；泳道3BL21(DE3)/pET30a对照组；泳道4蛋白分子量标准(NEB))，表明TScat-2和TScat-5蛋白片段在没有CAT蛋白作为融合蛋白的情况下，其可溶表达比例大大提高。
4)TScat-1、TScat-2和TScat-5的镍柱亲和纯化经过上述克隆操作后，TScat-1、TScat-2和TScat-5三种多肽片段的C端均添加了组氨酸标签(His-tag)，因此可采用镍柱亲和纯化法对其进行纯化，具体方法为用安玛西亚(Amersham Biosciences)公司的HitrapTMChelating HP 1mL柱子，采用镍离子作为亲和离子，用含不同咪唑浓度的缓冲液A(0.02M磷酸缓冲溶液，0.5MNaCl，0.03M咪唑，pH7.4)和缓冲液B(0.02M磷酸缓冲溶液，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH7.4)洗脱目的蛋白，其中，TScat-5的洗脱曲线如图4C所示(标号为收集管号)，洗脱后，对纯化产物进行12％SDS-PAGE检验，TScat-5纯化产物的检测结果如图5C所示(标号为收集管号，“un”为未纯化样品，M为蛋白分子量标准)，表明经纯化获得了纯度较高的TScat-5。对于可溶蛋白表达量不高的TScat-1和可溶蛋白表达量较高但纯度不够的TScat-2用复性包涵体的办法进行纯化，同样使用安玛西亚(Amersham Biosciences)公司的HitrapTMChelating HP 1mL柱子进行蛋白的复性，(复性缓冲液A0.02M磷酸缓冲溶液，0.5M NaCl，0.03M咪唑，1mM DTT pH7.4；变性缓冲液B10.02M磷酸缓冲溶液，0.5M NaCl，0.03M咪唑，8M尿素，1mM DTT，pH7.4；洗脱缓冲液B20.02M磷酸缓冲溶液，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH7.4)，TScat-1、TScat-2的洗脱曲线分别如图4A和图4B所示，洗脱后，对纯化产物进行12％SDS-PAGE检验，TScat-1、TScat-2纯化产物的检测结果分别如图5A和图5B所示(标号为收集管号，“in”为提取物不可溶部分，“soluble”为提取物可溶部分，“8M Sample”为经8M尿素变性的包涵体样品，“Flow Through”为未与纯化柱结合的收集物，M为蛋白分子量标准)，表明经纯化获得了纯度较高的TScat-1和TScat-2。
5)经纯化的TScat-1、TScat-2和TScat-5多肽的园二色光谱(CD spectrum)检测先将经纯化后的TScat-1、TScat-2和TScat-5的多肽置于20mM磷酸缓冲溶液(pH7.4)中，然后按常规方法测定园二色光谱，光谱图如图6所示，表明TScat-1、TScat-2和TScat-5具有稳定的二级结构，证明用本发明的方法可得到具有独立结构/功能的蛋白片段。
序列表<160>4<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Gly Asn Ser Ala Gly Ser Ser Ala Ala Gly1 5 10<210>2<211>98<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Ile Gln Asn Ala Thr Leu Arg Ala Phe Ala Ala Gly Val Thr Pro Ala1 5 10 15Gln Cys Phe Glu Met Leu Ala Leu Ile Arg Gln Lys His Pro Thr Ile20 25 30Pro Ile Gly Leu Leu Met Tyr Ala Asn Leu Val Phe Asn Lys Gly Ile35 40 45Asp Glu Phe Tyr Ala Gln Cys Glu Lys Val Gly Val Asp Ser Val Leu
50 55 60Val Ala Asp Val Pro Val Glu Glu Ser Ala Pro Phe Arg Gln Ala Ala65 70 75 80Leu Arg His Asn Val Ala Pro Ile Phe Ile Cys Pro Pro Asn Ala Asp85 90 95Asp Asp<210>3<211>144<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>3Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asp Ala Leu Glu Leu Gly Ile Pro Phe Ser1 5 10 15Asp Pro Leu Ala Asp Gly Pro Thr Ile Gln Asn Ala Thr Leu Arg Ala20 25 30Phe Ala Ala Gly Val Thr Pro Ala Gln Cys Phe Glu Met Leu Ala Leu35 40 45Ile Arg Gln Lys His Pro Thr Ile Pro Ile Gly Leu Leu Met Tyr Ala50 55 60Asn Leu Val Phe Asn Lys Gly Ile Asp Glu Phe Tyr Ala Gln Cys Glu65 70 75 80Lys Val Gly Val Asp Ser Val Leu Val Ala Asp Val Pro Val Glu Glu85 90 95Ser Ala Pro Phe Arg Gln Ala Ala Leu Arg His Asn Val Ala Pro Ile100 105 110Phe Ile Cys Pro Pro Asn Ala Asp Asp Asp Leu Leu Arg Gln Ile Ala115 120 125Ser Tyr Gly Arg Gly Tyr Thr Tyr Leu Leu Ser Arg Ala Gly Val Thr
130 135 140<210>4<211>166<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Met Glu Arg Tyr Glu Ser Leu Phe Ala Gln Leu Lys Glu Arg Lys Glu1 5 10 15Gly Ala Phe Val Pro Phe Val Thr Leu Gly Asp Pro Gly Ile Glu Gln20 25 30Ser Leu Lys Ile Ile Asp Thr Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asp Ala Leu35 40 45Glu Leu Gly Ile Pro Phe Ser Asp Pro Leu Ala Asp Gly Pro Thr Ile50 55 60Gln Asn Ala Thr Leu Arg Ala Phe Ala Ala Gly Val Thr Pro Ala Gln65 70 75 80Cys Phe Glu Met Leu Ala Leu Ile Arg Gln Lys His Pro Thr Ile Pro85 90 95Ile Gly Leu Leu Met Tyr Ala Asn Leu Val Phe Asn Lys Gly Ile Asp100 105 110Glu Phe Tyr Ala Gln Cys Glu Lys Val Gly Val Asp Ser Val Leu Val115 120 125Ala Asp Val Pro Val Glu Glu Ser Ala Pro Phe Arg Gln Ala Ala Leu130 135 140Arg His Asn Val Ala Pro Ile Phe Ile Cys Pro Pro Asn Ala Asp Asp145 150 155 160Asp Leu Leu Arg Gln Ile16权利要求
1.一种获得具有独立结构/功能的蛋白片段的方法，包括以下步骤1)切割编码蛋白的多核苷酸序列，然后再进行重组，得到不同长度的多核苷酸随机片段；2)将步骤1)获得的多核苷酸随机片段连接入含有编码具有选择功能的报告蛋白基因的载体中，再将所述重组载体导入宿主，培养宿主，得到具有独立结构/功能的蛋白片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中编码蛋白的多核苷酸序列为DNA或RNA。
3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤1)中切割编码蛋白的多核苷酸序列的方法为酶法、物理法或化学法。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述酶法采用的酶为DNase、RNase或内切酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述酶法采用的酶为DNase I。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的具有选择功能的报告蛋白基因为氯霉素乙酰转移酶基因、卡那霉素基因或lacZα基因。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中用于构建含有具有选择功能的报告蛋白基因的载体为pUC18、pUC19或pET。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述具有选择功能的报告蛋白基因为氯霉素乙酰转移酶基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述重组载体为pET30(a)-linker-CAT。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中的宿主为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述宿主为E.coliBL21(DE3)、E.coli XL-1blue、或E.coliDH5α。
12.用权利要求1-11所述方法得到的具有独立结构/功能的蛋白片段。
13.权利要求12所述的蛋白片段在制备病毒抗原和病毒疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有独立结构/功能蛋白片段的获得方法。该蛋白片段的获得方法，包括以下步骤1)随机切割编码蛋白的多核苷酸序列，然后再进行重组，得到不同长度的多核苷酸随机片段；2)将步骤1)获得的多核苷酸随机片段连接入含有选择标记基因的表达载体中，再将所述重组表达载体导入宿主，培养宿主，得到具有独立结构/功能的蛋白片段。本发明不具有基因/蛋白的特异性，筛选方法简单易行，将在具有独立结构/功能的蛋白片段的筛选中发挥巨大作用。
文档编号C07K16/08GK1821401SQ200610058148
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月8日 优先权日2006年3月8日
发明者林章凛, 陈勇, 李爽 申请人:清华大学