专利名称：一种苦荞麦抗肿瘤蛋白的制备方法
技术领域：
一种苦荞麦抗肿瘤蛋白的制备方法，属于苦荞麦精深加工技术领域。
背景技术：
中国是荞麦的故乡，是世界荞麦第一大生产国，据FAO统计，2005年中国荞麦的种植面积为102万公顷，总产量为130万公吨。荞麦营养价值高，含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素和矿物质，并且还含有其它禾谷类粮食作物所没有的叶绿素和黄酮类物质如芦丁(VP)等。
荞麦蛋白质具有多种生理功能，如降低血液胆固醇，抑制胆结石的形成，抗衰老，对1，2-二甲阱诱发的大肠癌和7，12-二甲苯蒽诱发的乳腺癌具有抑制作用，此外，荞麦蛋白对脂肪的蓄积有良好的抑制作用，还可改善阿托品诱发的便秘，具有减肥功效等。
国外学者通过动物实验证明荞麦蛋白质具有抗肿瘤功能，由于采用的是荞麦蛋白质粗品进行实验，对于其中真正有效的抗肿瘤组分并不清楚，因此有必要筛选出抗肿瘤的有效组分，并对其结构进行深入研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种苦荞麦抗肿瘤蛋白的制备工艺，所得组分对人乳腺癌细胞株Bcap37的生长有显著的增殖抑制活性。
本发明的技术方案以苦荞麦粉为原料，加缓冲液进行搅拌提取，离心分离，收集上清液，加硫酸铵分级沉淀，离心分离，收集沉淀，复溶，透析，冷冻干燥得到苦荞麦水溶性蛋白质(TBWSP)；TBWSP溶解于缓冲液中上DEAE-Sepharose FF离子交换层析柱，分离得到抗肿瘤活性较强的组分TBWSP3；TBWSP3溶解于缓冲液中上Sephadex G-100凝胶过滤层析柱，得到抗肿瘤活性的有效组分TBWSP31。
(1)苦荞麦水溶性蛋白质(TBWSP)的制备苦荞麦粉加入到磷酸盐缓冲液(pH7.2、10mmol/L)中(苦荞麦粉与缓冲液的质量/体积比为1∶10)，室温下搅拌提取2h，然后4℃、10000r/min离心20min，收集上清液，上清液加入固体硫酸铵，至饱和度为70％～90％，再搅拌20min，然后10000r/min、4℃离心20min，收集沉淀加少量水复溶，装入透析袋中，置于4℃去离子水中透析48h，浓缩后冷冻干燥，制得TBWSP。
(2)DEAE-Sepharose FF离子交换层析及各层析组分的抗肿瘤活性检测苦荞麦水溶性蛋白冷冻干燥样品TBWSP溶解于磷酸盐缓冲液(pH7.2、10mmol/L)中，TBWSP的浓度为5～10mg/mL，3000r/min离心10min，取上清液加入到离子交换柱中。依次用磷酸盐缓冲液、0.2、0.5mol/L NaCl(磷酸盐缓冲液配制)为洗脱剂进行洗脱，得到3个组分TBWSP1、TBWSP2和TBWSP3，用280nm紫外检测法逐管检测，蒸馏水透析脱盐，冷冻干燥。
抗肿瘤活性检测采用人肝癌细胞株Bel-7402、人口腔上皮癌细胞株KB、人胃腺癌细胞株SGC-7901、人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人乳腺癌细胞株Bcap37作为受试细胞，测定TBWSP1、TBWSP2和TBWSP3的抗肿瘤活性，经检测可知，TBWSP3对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和Bcap37细胞有较强的增殖抑制活性，因此选择TBWSP3进行下一步的分离。
(3)Sephadex G-100凝胶过滤层析及各层析组分的抗肿瘤活性检测TBWSP3溶解于磷酸盐缓冲液(pH7.2、10mmol/L)中，TBWSP3的浓度为10～15mg/mL，3000r/min离心，取上清液加入到凝胶过滤柱中，然后用磷酸盐缓冲液进行洗脱，依次得到3个组分TBWSP31、TBWSP32和TBWSP33，蒸馏水透析脱盐，冷冻干燥。
抗肿瘤活性检测由于TBWSP3对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和Bcap37细胞有较强的增殖抑制活性，因此TBWSP31、TBWSP32和TBWSP33进行抗肿瘤活性检测时，只采用人乳腺癌细胞株Bcap37作为受试细胞。经检测可知，TBWSP31对人乳腺癌细胞株Bcap37细胞有显著的增殖抑制活性，IC50值为19.75μg/mL。
(4)TBWSP31的纯度鉴定采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)对TBWSP31的纯度进行检测，证明TBWSP31为单一组分。制得的苦荞麦抗肿瘤蛋白TBWSP31为白色粉末，相对分子质量为57000，含有丰富的精氨酸，对人乳腺癌细胞株Bcap37的生长有显著的增殖抑制活性，IC50值为19.75μg/mL。
本发明的有益效果采用本方法制备得到的产品TBWSP31为单一组分，对人乳腺癌细胞株Bcap37细胞有显著的增殖抑制活性，IC50值为19.75μg/mL。该制备方法为苦荞麦的深度开发和利用提供了有效途径。
图1苦荞麦抗肿瘤蛋白的制备工艺流程示意图。
具体实施例方式
实施例1取100克苦荞麦粉，加入1000mL磷酸盐缓冲液(pH7.2、10mmol/L)，室温下搅拌提取2h，4℃离心分离(10000r/min，离心20min)，收集上清液，加入固体硫酸铵470～660g，再搅拌20min，4℃离心分离(10000r/min，离心20min)，收集沉淀加少量水复溶，透析，浓缩后冷冻干燥。取20mg苦荞麦水溶性蛋白冷冻干燥样品(TBWSP)，溶解于4mL磷酸盐缓冲液中，加入到DEAE-SepharoseFF离子交换柱中，依次用磷酸盐缓冲液、0.2、0.5mol/L NaCl(磷酸盐缓冲液配制)为洗脱剂进行洗脱，收集组分3(TBWSP3)，蒸馏水透析脱盐，冷冻干燥。取10mg TBWSP3溶解于1mL磷酸盐缓冲液中，加入到Sephadex G-100凝胶过滤柱中，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集组分1，蒸馏水透析脱盐，冷冻干燥，制备得到TBWSP31。
实施例2取200克苦荞麦粉，加入2000mL磷酸盐缓冲液(pH7.2，10mmol/L)，室温下搅拌提取2h，4℃离心分离(10000r/min，离心20min)，收集上清液，加入固体硫酸铵940～1320g，再搅拌20min，4℃离心分离(10000r/min，离心20min)，收集沉淀加少量水复溶，透析，浓缩后冷冻干燥。取50mg苦荞麦水溶性蛋白冷冻干燥样品(TBWSP)，溶解于5mL磷酸盐缓冲液中，加入到DEAE-SepharoseFF离子交换柱中，依次用磷酸盐缓冲液、0.2、0.5mol/L NaCl(磷酸盐缓冲液配制)为洗脱剂进行洗脱，收集组分3(TBWSP3)，蒸馏水透析脱盐，冷冻干燥。取30mg TBWSP3溶解于2mL磷酸盐缓冲液中，加入到Sephadex G-100凝胶过滤柱中，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集组分1，蒸馏水透析脱盐，冷冻干燥，制备得到TBWSP31。
权利要求
1.一种苦荞麦抗肿瘤蛋白的制备方法，其特征在于以苦荞麦粉为原料，加缓冲液进行搅拌提取，离心分离，收集上清液，加硫酸铵分级沉淀，离心分离，收集沉淀，复溶，透析，冷冻干燥得到苦荞麦水溶性蛋白质TBWSP；TBWSP溶解于缓冲液中上DEAE-Sepharose FF离子交换层析柱，分离得到抗肿瘤活性组分TBWSP3；TBWSP3溶解于缓冲液中上Sephadex G-100凝胶过滤层析柱，得到抗肿瘤活性的有效组分TBWSP31，工艺为(1)苦荞麦水溶性蛋白质TBWSP的制备苦荞麦粉加入到pH7.2，10mmol/L磷酸盐缓冲液中，苦荞麦粉与缓冲液的质量/体积比为1∶10，室温下搅拌提取2h，然后4℃、10000转/分钟离心20分钟，收集上清液，上清液中加入固体硫酸铵，至饱和度为70％～90％，再搅拌20分钟，然后4℃、10000转/分钟离心20分钟，弃去上清液收集沉淀，沉淀加少量水复溶，然后将其装入透析袋中，置于4℃去离子水中透析48h，浓缩后冷冻干燥，制得TBWSP；(2)DEAE-Sepharose FF离子交换层析苦荞麦水溶性蛋白冷冻干燥样品TBWSP溶解于pH7.2、10mmol/L磷酸盐缓冲液中，TBWSP的浓度为5～10mg/mL，3000转/分钟离心10分钟，取上清液加入到DEAE-Sepharose FF离子交换柱中，依次用pH7.2、10mmol/L磷酸盐缓冲液、含0.2mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液和含0.5mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液为洗脱剂进行洗脱，分别收集峰组分，用280nm紫外检测法逐管检测，命名为TBWSP1、TBWSP2和TBWSP3，蒸馏水透析脱盐，冷冻干燥，分离得到抗肿瘤活性组分TBWSP3；(3)ephadex G-100凝胶过滤层析TBWSP3溶解于pH7.2、10mmol/L磷酸盐缓冲液中，TBWSP3的浓度为10～15mg/mL，3000转/分钟离心10分钟，取上清液加入到ephadex G-100凝胶过滤柱中，然后用pH7.2、10mmol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集峰组分，用280nm紫外检测法逐管检测，命名为TBWSP31、TBWSP32和TBWSP33，蒸馏水透析脱盐，冷冻干燥，纯化得到抗肿瘤活性组分TBWSP31。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是制得的苦荞麦抗肿瘤蛋白TBWSP31为白色粉末，相对分子质量为57000，含有丰富的精氨酸，对人乳腺癌细胞株Bcap37的生长有显著的增殖抑制活性，IC50值为19.75μg/mL。
全文摘要
一种苦荞麦抗肿瘤蛋白的制备方法，属于苦荞麦精深加工技术领域。本发明以苦荞麦粉为原料，采用硫酸铵分级沉淀、离子交换色谱和凝胶过滤色谱对苦荞麦水溶性蛋白质(TBWSP)中抗肿瘤活性组分进行筛选、分离及纯化，得到了具有抗肿瘤活性的有效组分TBWSP31。本发明方法设计科学合理，所得组分TBWSP31对人乳腺癌细胞株Bcap37的生长有显著的增殖抑制活性，IC
文档编号C07K2/00GK1944456SQ200610096899
公开日2007年4月11日 申请日期2006年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者郭晓娜, 姚惠源, 张晖, 王立 申请人:江南大学