专利名称：用于靶向结合髓系白血病细胞的抗cd33的工程抗体及其表达载体和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种工程抗体，尤其是用于靶向结合髓系白血病细胞的抗 CD33的工程抗体及其表达载体和用途。
技术背景白血病是造血系统最常见的--种恶性肿瘤。目前，我国白血病患者发 病率正逐年上升，调査资料表明白血病的总发病率占肿瘤总发病率的第9 位；l- 14岁少年儿童白血病发病及死亡率占同年龄肿瘤发病率及死亡率的 第1位，发病率约为4/10万，约占该时期所有恶性肿瘤的3 5%，我国每 年平均有15000左右l 5岁以下的儿童发生白血病；15—45岁青少年及成 年人白血病发病率占同年龄肿瘤发病率的第3位。降低白血病的病死率， 开展和改善白血病的治疗方法是世界医学正在攻克的一个重点。急性髓系白血病(AML)是成人急性白血病最常见的类型。在美国100 000 成人中每年就有2. 7人患AML，而在年龄超过65岁的成人中则高达14.1。 约60% 80%的初治AML患者可达到完全缓解。目前治疗AML的主要障碍是 肿瘤细胞对化疗产生耐药性，同时传统化疗对正常组织的毒副作用也限制 了药物的应用剂量。近年来，肿瘤的耙向治疗由于其可以特异性杀灭肿瘤 细胞而不影响正常组织，因而成为研究的重要方向。生辆工程类抗体美罗 华的临床应用为肿瘤的生物免疫治疗开创了新的局面,研究表明联合应用 美罗华及化疗可以明显提高B-ALL和B细胞髓系瘤(B-NHL)患者的临床预 后。抗体靶向治疗，必须选择一个合适的靶抗原，靶抗原必须位于所有恶 性细胞或位于恶性细胞中具有自我更新能力的克隆群上。另外，靶抗原的 丧达必须是稳定的，在重要的宿主器官上不含此抗原。在AML中，CD33抗 原是一合适的靶点，研究表明超过90%的AML患者的白血病原始细胞表面表 达CD33，而造血千细胞、髓系细胞及非造血细胞不表达。利用这种特性， 我们可以将该单链抗体与协同剌激因子结合，起到抗原提呈的作用，或者 连接生物毒素起到靶向杀伤癌细胞的作用
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于耙向结合髓系白血病细胞的抗CD33的工程抗体及其表达载体和用途，提供的单克隆抗体HIM3-4 可以有效的结合髓系白血病细胞表面的CD33抗原提供的抗CD33单克隆 抗体轻链可变区基因和重链可变区基因及其表达产物，两者重组后表达产 生的抗CD33单链抗体(抗CD33 ScFv)，能够降低鼠源性抗CD33抗体的免疫 源性。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是 一种用于靶向结 合髓系白血病细胞的抗CD33的工程抗体，由SEQ ID NO. 3重链可变区氨基 酸序列和SEQ ID NO. 4轻链可变区氨基酸序列组成。所述SEQ ID NO. 3重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，所述SEQ :[D NO. 4轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。含有编码权利要求1所述的工程抗体的核苷酸的载体，含有SEQ ID NO. 3 所示的重链可变区基因核苷酸序列和SEQ ID NO. 4所示的轻链可变区基因 核苷酸序列的cDNA的pMD-18T载体。所构建为pET28a(+)载体。所述的抗CD33的工程抗体或所述的载体在制备治疗白血病的药物中的 应用。单克隆抗体HIM3-4可以有效的结合髓系白血病细胞表面的CD33抗原， H.[M3-4是中国医学科学院血液学研究所自行研制、具有自主知识产权的鼠 抗人CD33单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已经作为产品在市场上销售，此细 胞株分泌的CD33单克隆抗体，属于IgGl亚型，识别白细fe分化抗原CD33， CD33是一个67kDI型跨膜糖蛋白。该抗体能有效结合、标记髓系白血病细 胞表面的CD33分子。人体对鼠源性抗体的免疫反应(HAMA反应)是鼠源性 抗体应用于临床治疗的主要障碍，而基因工程抗体较好的解决了这个问题， 它既保留了鼠源单抗的特异亲和力，又大大降低了鼠单抗的异源性，因而 具有广阔的应用前景。我们应用RT-PCR技术，成功的从杂交瘤细胞中克隆到抗CD33抗体的 轻重链可变区基因，并将抗CD33抗体的轻重链可变区塞因克隆到原核表
达载体，构建抗CD33抗体的单链抗体，降低鼠源性抗CD33抗体的免疫原 性，并在大肠杆菌中进行高效农达，从而提高其产量，降低生产成本。单 链抗体的优势在于分子小，其大小仅为完整抗体分子的六分之一，结构 简单，较亲本抗体免疫原性低，但却较好地保持了完整抗体的抗原亲和活 性。用于人体不易产生免疫排斥反应血循环和全身廓清快，组织穿透力 强，半衰期短，肾脏蓄积极少无Fc段，不易与非靶细胞结合，肿瘤/正 常组织分布率高，定位成像时本底低，成像清晰；生产成本低；更重要的 是，ScFv能在细菌中表达，易于基因操作、基因改造以及基因工程大量生 产，并可用基因工程方法构建与其他效应分子连接的抗肿瘤融合蛋白。
图l: PCR扩增VH， VL基因片段电泳图PCR扩增单链抗体(ScFv)基因 片段电泳图。l:marker，2:VL,3:VH，4:CD33-ScFv。图2:抗CD33 ScFv表达载体pET28a(+) ScFv结构示意图。图3: ScFv表达产物的SDS-PAGE (10%)电泳图。1:未诱导菌体蛋白 2 3:诱导后菌体蛋白。图4:纯化后抗CD33-ScFv蛋白的SDS-PAGE电泳图。图5:抗CD33 ScFv的Western blot分析。图6a:竞争性免疫荧光抑制实验——空白对照(PE标记鼠源IgGl)。 图6b:竞争性免疫荧光抑制实验--一-阳性对照(PE标记HIM3-4)。 图6c:竞争性免疫荧光抑制实验--一阴性对照(CD3单抗+PE标记 画3-4)。图6d:竞争性免疫荧光抑制实验——实验组(抗CD33-ScFv + PE标记 國3-4)。图6e:竞争性免疫荧光抑制实验-一-阳性对照组(2)与实验组(4) 流式图重叠效果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式
对本发明的用于靶向结合髄系细胞白血 病细胞的抗CD33的工程抗体作进一步的详细说明本发明的---种用于靶向结合髓系白血病细胞的抗0033的工程抗体，由 SEQ ID NO. 3重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO. 4轻链可变区氨基酸序列组成。所述SEQ ID NO. 3重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，所述SEQ ID NO. 4轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。含有编码权利要求1所述的工程抗体的核苷酸的载体，含有SEQ ID NO. 3 所示的重链可变区基因核苷酸序列和SEQ ID NO. 4所示的轻链可变区基因 核苷酸序列的cDNA的pMD-18T载体。所构建为pET28a(+)载体。所述的抗CD33的工程抗体或所述的载体在制备治疗白血病的药物中的应用。实施例l:抗CD33单克隆抗体的轻重链可变区基因克隆应用RT-PCR方法从抗CD33单克隆抗体HIM3-4杂交瘤细胞中扩增抗 CD33抗体的轻重链可变区基因-(1) RNA提取采用Trizol --歩法，1)取杂交瘤细胞约10B，加入lml Trizol,吹打混匀，室温静置5分钟。2)加入0. 2ml氯仿，剧烈振荡15秒， 室温静置2-3分钟。3) 12000rpm， 4°C，离心15分钟。4)取上清，加入 0. 5ml异丙醇室温静置15分钟。5) 12000rpm, 4。C，离心15分钟。6)弃 上清，加入hnl 75%的乙醇洗，7500rpm， 4。C，离心5分钟。7)弃上清， 沉淀晾千，加入30nL DEPC处理的水溶解RNA。(2) 逆转录为cDNA (40ul):取2.5mMdNTP4ul， 5xfirst strand buffer 8ul ， DTT4ul， OligodT 2u.1.， 水16.6ul，混匀后加入RNA 约2ug， 65。C水浴5分钟，快速冰浴2-3分钟。加入50u/u lRNasin 0.4 "l.， Superscript II (200u/ u :1 ) 1 u 1混匀后37°C水浴>1小时。取出后70。C 水浴10分钟。一20。C保存。(3) PCR扩增抗CD33单克隆抗体的轻重链可变区基因 轻链可变区基因PCR扩增反应体系(50ii 1):设计引用通用简并引物，上游引物5， -GAC ATT CAG CTG ACC CAG WCT SMH-3，:下游引物5， 一CCG TTA GAT CTC CAR BTT KGT SCS —3，。以cDNA为模板，高保真pyrobest 聚合酶扩增。PCR循环程序为94。C 5min; 94。C 50s， 55。Clmin， 72。Clmin;
最后72"C延伸10 min，共33个循环。反应结束后加入lu普通Taq酶(购 自大连宝生物公司)72'C延伸10 min后立即进行酚氯仿抽提。重链可变区基因PCR扩增反应体系(50yl):上游引物5' —CAGGTS MAK CT(; CAG SAG TCW GG—3，；下游引物5， 一TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC—3'。以cDNA为模板，高保真pyrobest聚合酶扩增。 PCR循环程序为94°C 5min; 94。C，30s， 55°C， lmin， 72°C, lmin;最后72 'C延伸10 min，共33个循环。反应结束后加入lu普通Taq酶(购自大连 宝生物公司)72-C延伸10 min后立即进行酚氯仿抽提。PCR结果见图1。(4)测序载体的构建pMD-18T载体购自大连宝生物公司。将轻重链 可变区基因PCK产物回收，与pMD-18T载体连接，连接反应按试剂盒要求 进行。取连接产物5ul，转化以氯化钙方法制备的大肠杆菌(DH5 )感受 态，以蓝/白斑方法挑选阳性克隆，轻重链各挑取10个克隆送测序，测序 证实轻、重链各个克隆的基因序列完全一致，分别为320bp及360bp,且该 基因序列完全符合蛋白数据库中抗体所具有的若干保守的框架氨基酸的特 点，该序列为抗体基因序列。分别命名为pMD-18T33-VHkpMD-18T33-VL。实施例2:单链抗体基因表达载体pET28a ScFv的构建..根据轻、重链可变区的基因序列设计并合成了用于VH，VL基因扩增和 拼接的引物。轻链上游CGC GGATCC GACATTGTGATGACCCAGTCTc轻链下游:ACC AGA TCC ACC TCC ACC CGA GCC ACC GCC ACC CCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC重链上游TCG GGT GGA GGT GGA TCT GGT GGT GGC GGT TCG GAGGTGAAGCTTCAGCAATCAGGA重链下游CCG CTCGAG TGAAGAGACAGTGACCGTGGT在轻链上游的5'端加上BamHI酶切位点，引物4的3'端加上XhoI 酶切位点。从所构建的pMD-18T19-VH及pMD-18T19-VL载体，应用PCR扩
增VH、 VL片段，回收后，经重叠延伸拼接法通过PCR扩增抗CD33 ScFv基 因片段(图1)。纯化后的PCR产物经BamH I +Xho I处理后再与经BainH 1 +XhoI处理后的携带有(His),i标签的pET28a(+)载体连接(16'C连接过夜)。 组成pET28a ( + )的抗CD33-ScFv的表达载体(图2)。测序表明，抗CD33 S(:Fv基因片段为741bp，按氨基酸序列推测ScFv约为27KD的蛋白。测序 正确的克隆用于蛋白表达。实施例3:抗CD33 ScFv抗体片段的表达、纯化及复性(1) 以构建成功的表达载体PET-28a(+)转化大肠杆菌Rosseta，挑取单 个菌落接种于5mL含34fXg/mL氯霉素和50^g/mL卡那霉素LB培养基中，于37 "C以200 r /min振荡培养过夜，转天以l: IOO稀释已过夜的菌液，继续振 荡至0Dsa在0.6-0.8之间，加入诱导剂IPTG至终浓度为O. 5mmol/L， 37"C摇床 振摇5h，停止诱导。取100ul菌液，离心后弃上清，留约20ul，然后用20 Ul 2XSDS上样buffer重悬，100。C煮沸5min。取20ul上样，薩DS-PAGE 检测表达蛋白，考马斯亮蓝染色。实验证明重组质粒pET28a(+)ScFv在大肠 杆菌中经IPTG诱导有重组蛋白表达，741bp片段表达出约30Kd的带(His) 的重组蛋白，见图3。(2) 包涵体蛋白的变性、纯化和复性将表达的菌体沉淀重悬于预冷 的50聽l/LTris-HCl、 10O鹏ol/L NaCl 、 1訓1/L EDTA(pH7.0)中溶解， 先反复冻融3次然后超声破碎细菌(超声30秒/冷却1分钟/200瓦/10次),4 。C，30000g离心30min。沉淀用3mol/L尿素和5Ommol/L Tris-HCl (pH7. 0) 洗涤，30000g ，4 。C离心30min收集包涵体。6mol/L盐酸胍和 0. linol/LTris-HCl(pH710)，于4 。C摇动过夜溶解包涵体。4 。C， 30000g离 心30min去除沉淀,上清用于纯化。t样于镍金属亲和层析柱,用6mol/L尿 素、50mmol/L Tris-HC1和50,1/L咪唑(pH7. O)洗柱，用含有250,1/L 咪唑、6mol/L尿素和50mmol/L Tris-HC1洗脱结合在镍柱上的ScFv。 (3) SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定纯化产物经10%SDS-PAGE,考马斯亮 蓝R250染色，证实纯化后得到分子量为约30Kd的单一条带。进一步用 Western blot验证，具体方法参考分子克隆，其中以抗His-tag抗体(IgG) 为一抗与抗CD33-ScFv融合蛋白上的(His)4示签结合，进行Western blot
反应。结果证实纯化条带为目的蛋白表达产物(图4、图5)。(4) CD33ScFv的复性将洗脱液加到透析袋中，用TEA (O.掘精氨酸 -HCL， 0.1 MTris-HCl， 2mmol/L EDTA，pH7.0)缓冲液充分复性24h，中间 换液一次，继续用PBS透析24h。超滤浓縮样品至适当体积,BCA法测定蛋白 含量-20 'C分装保存。实施例4: BCA法测定蛋白质的浓度用BCA试剂盒测浓縮蛋白浓度，复性后所得活性蛋白产量为200n g/mL ， 浓縮后达到1175u g/mL实施例5:抗CD33 ScFv抗体活性测定——竞争试验取CD33表达阳性的人类白血病Meg-01细胞系，lXl(f细胞/管。阴性对 照组加20"LCD3单克隆抗体工作液，4 'C孵育lh ，再加PE标记的CD33单克隆 抗体20 " L，室温孵育20min， PBS洗细胞2次；阳性对照组加入PE标记抗CD33 单克隆抗体20nL，室温孵育20min,PBS洗细胞2次；空白对照加入20uLPE 标记羊抗鼠IgGl二抗；实验组加单链抗体100uL， 4。C孵育l h，再加PE标记 抗CD33单克隆抗体20 u L，常温孵育20min， PBS洗细胞2次。三组细胞分别重 悬于300u L19&多聚甲醛中固定，用于流式检测。结果表明复性后的表达产物 能够与抗CD33单克隆抗体竞争性结合细胞表面的CD33抗原。结果见图6a、 6b、 6c、 6d、 6e，细胞系亦有竞争抑制现象，此处无显示。SEQUENCE LISTING (序列表) <H0>中国医学科学院血液学研究所<120>用于靶向结合髓系白血病细胞的抗CD33的工程抗体及其表达载体和用途 <160> 4<170> PatenUn version 3.3 〈210〉 1 <211.〉 366 <212〉 画<2J3〉 人类(Homo sapiens)<221> CD33-VH V一segment <222> (1),,(366)<■〉 1gciggtgaagc ttcagcaatc aggacctgag ctggtgaagc ctgggacttc agtgaaggta 60tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact gactacaaca tgtactgggt gaagcagagc 120catggaaaga gccttgagtg gattggatat attgatcctt acaaaggtgg tactatttac 180aaccagaagt ttaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag cacagccttc 240atgcatctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagagatg 300attacggcgt actactttga ctactggggc caaggcacca cggtcactgt ctcttcactc :!60gagcgg 366<210> 2《2U〉 330<212> DNA<213> 人类(Homo sapiens)<220><221> CD33-VL V—segment 〈222〉 (1)..(330)
<4()()> 2cg(:ggaU:cg fciGattgtgat gacccagU:i. C(:ctcac tgtctgcatc Lctgggagge 60aatigtcacca tcacttgcaa ggcaagccaa gacat.taacEi agtatatagc ttggtaccaa J2()(:fictmgcct,g gaaaaggtcc taggctgcU: atacattaca catctacatt acagccaggc 180tit(:ccatcaa ggttcagtgg aagtgggtct gggagagatt attccttcag catcagcaac 240ctggagcctg aagatattgc aacttattat tgtctacagt atgataatct tctcacgttc 300ggtgctggga ccaagctgga gctgaaacgg 330<210> 3<211〉 122<212> PRT<213> 人类(Homo sapiens)<22()><221〉 CD33-VH PEPTIDE <222> (1)..(122)<40()> 3GJu Va丄Lys Leu Gin Gin Ser Gly l〕ro Giu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 'Hir Asp Tyr 20 25 30Asn Met Tyr Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45(;Jy Tyrle八sp Pro Tyr Lys Gly (;]y Thr lie Tyr Asn (;l.n Lys Phe 50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80Met His Leu Asn Ser Uu Thr Ser Asp Ser A丄a Val Tyr Tyr Cys 85 90 95Ala Arg (;].u Met lie Thr Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gy 100 105 110Ser Ser VaJ Thr Val Ser Ser Leu (;].u A.rg 115 120<210> 4<211> 110<212> PRT<213> 人类(Homo sapiens)<220〉<221> CD33-VL PEPTIDE〈222> (l)..(UO)<40()〉 4
Arg Gly Ser Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala I 5 l() 15Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr lie Thr Cys Lys A]a Ser Gin Asp lie 20 25 30Asn Lys Tyr lie Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg 35 40 45Leu Leu Tie His Tyr Thr Ser Thr Leu Gin Pto G.ly lie Pro Ser Arg 50 55 60Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser lie Ser Asn 65 70 75 80Leu Glu Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp Asn 85 90 95Leij Leu Th.r Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 110
权利要求
1. 一种用于靶向结合髓系白血病细胞的抗CD33的工程抗体，其特征是由SEQ ID NO.3重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO.4轻链可变区氨基酸序列组成。
2、 根据权利要求1所述的用于靶向结合髓系白血病细胞的抗CD33的 工程抗体，其特征是所述SEQ ID NO. 3重链可变区氨基酸序列的核苷酸序 列如SEQ 11) NO. 1所示，所述SKQ [D N0.4轻链可变区氨基酸序列的核苷 酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3、 含有编码权利要求l所述的工程抗体的核苷酸的载体，其特征是含 有SEQ ID NO. 3所示的重链可变区基因核苷酸序列和SEQ ID N()M所示的 轻链可变区基因核苷酸序列的cDNA的pMD-18T载体。
4、 根据权利要求3所述的载体，其特征是所构建为pET28a(+)载体。
5、 根据权利要求1、 2中任一项所述的抗CD33的工程抗体或3、 4中 任一项所述的载体在制备治疗白血病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于靶向结合髓系白血病细胞的抗CD33的工程抗体及其表达载体和用途，由SEQ ID NO.3重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO.4轻链可变区氨基酸序列组成。应用RT-PCR技术，成功的从杂交瘤细胞中克隆到抗CD33抗体的轻重链可变区基因，并将抗CD33抗体的轻重链可变区基因克隆到原核表达载体，构建抗CD33抗体的单链抗体，降低鼠源性抗CD33抗体的免疫原性，并在大肠杆菌中进行高效表达，从而提高其产量，降低生产成本。
文档编号C07K16/18GK101210048SQ200610130688
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月29日 优先权日2006年12月29日
发明者浩 屈, 左玉丰, 廖晓龙, 敏 王, 洋 王, 王建祥, 葛新顺, 郭桂庆, 陈小军, 韩忠朝 申请人:中国医学科学院血液学研究所