专利名称：：秦皮香豆素提取方法
技术领域：
：本发明为中药提取的方法，主要涉及中药有效组分提取的方法，尤其涉及秦皮香豆素的提取方法。
背景技术：
：秦皮本品为木犀科植物苦枥白蜡树Fra^m^^y"c/zc;p/^〃"Hance、白蜡树Fm;dm/51c/'wms/sRoxb、尖叶白蜡树Fraxz'w"ssza6oawaLingelsh.或宿柱白蜡树Frax/m^^0^w"Lingelsh.的干燥枝皮或干皮。春、秋二季剥取.晒干。尖叶白蜡树Frax/"ussza6oawaLingelsh.或宿柱白蜡树Frax/"wss(y/o犯Lingelsh.皮主产于陕西渭南、华县、华阴、长武；苦枥白蜡树Frax/"船A3;nc;2o/;2_y//aHance皮主产于辽宁抚顺、本溪、丹东，吉林浑江。秦皮味苦，性寒，具有清热燥湿，收涩，明目的功能，适用于热痢，泻泄，赤白带下，目赤肿痛，目生翳膜等症。秦皮所含主要成分秦皮甲素、秦皮苷具有多种生物活性，抗菌消炎为其主要作用之一。药效学实验提示秦皮总香豆素对微晶型尿酸钠诱导大鼠足跖肿胀有抑制作用,有一定量效趋势。体外试验表明，秦皮对金黄色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、宋内氏痢疾杆菌有显著的抑制作用，对伤寒杆菌、副伤寒杆菌也有一定程度的敏感性，但对大肠杆菌无效。体内试验显示，秦皮可降低由伤寒杆菌引起的小鼠急性腹腔感染的死亡率。秦皮LD.w,为14.60gkg—'，表明其毒性较低。由秦皮等中药材提取制备而成眼用制剂，在临床应用多年，对病毒性和细菌性眼部疾病有较好的疗效，尤其对浅层点状角膜炎效果最好。80年代中期开始设计制备了滴眼液应用于临床。秦皮中主要含香豆素类等化合物。此外，还含有少量酚性成分、皂苷和鞣质等。现有的秦皮香豆素提取方法，一般采用水提取，浓縮，干躁，即得，这种方法提取的香豆素含量低，用本发明可以克服此缺点。
发明内容本发明的目的是提供一种秦皮香豆素大孔树脂纯化方法，是以水加热回流提取秦皮，用乙醇醇沉，滤过，滤液浓縮，将浓縮液吸附在大孔树脂上、洗脱、收集洗脱液、浓縮、千燥，获得秦皮香豆素。本发明提供的秦皮香豆素大孔树脂纯化方法，将秦皮以用水回流提取14次，最优选为3次。本发明提供的秦皮香豆素大孔树脂纯化方法，每次提取秦皮质量与乙醇溶液的体积比为1~14倍，优选提取体积为4~12倍，最优选提取体积为8倍。本发明提供的秦皮香豆素大孔树脂纯化方法，每次提取的时间为0.5~2h，最优选时间为lh。本发明提供的秦皮香豆素大孔树脂纯化方法，乙醇醇沉的浓度为20%~90%，优选60%~90%，最优选为70%。本发明提供的秦皮香豆素大孔树脂纯化方法，大孔树脂选用日本三菱公司HP20、SP825、SP850、SP700、SP70，优选大孔树脂SP825、SP700、SP70，最优选SP70。本发明提供的秦皮香豆素大孔树脂纯化方法，秦皮提取液的上样量(秦皮质量树脂体积)为0.5:18:1，优选1:14:1，最优选1.5:1。本发明提供的秦皮香豆素大孔树脂纯化方法，洗脱流速为洗脱液流速为lBV/h~5BV/h，最优选为2BV/h。本发明提供的秦皮香豆素大孔树脂纯化方法，洗脱剂为有机醇，优选项为乙醇。本发明提供的秦皮香豆素大孔树脂纯化方法，洗脱剂的洗脱浓度为，最优选浓度为10%~40%。本发明提供的秦皮香豆素大孔树脂纯化方法，大孔树脂洗脱剂的洗脱体积为110倍柱体积，最佳洗脱体积为5倍柱体积。本发明提供的秦皮香豆素大孔树脂纯化方法，获得纯化的秦皮香豆素含量大于55%。本发明具有以下优点1、本发明涉及的秦皮香豆素树脂纯化的方法是一种操作简便、快捷的方法。2、所选用的大孔树脂具有吸附量大，解吸率大的特点。3、本发明方法以乙醇为溶剂，既价廉又无毒。4、用本发明方法纯化秦皮提取物，香豆素含量可达55%以上，且重现性好，树脂可重复使用。图1.秦皮静态吸附与解吸率曲线图2.秦皮动态吸附泄漏曲线图3.秦皮动态解吸曲线图4秦皮比上柱量曲线图5.秦皮洗脱终点曲线具体实施例方式本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。说明秦皮香豆素含量测定方法①仪器与试药仪器北京普析通用仪器有限公司TU-1901型紫外可见分光光度仪，联想数字处理中心。日本岛津LIBRORAEL-200万分之一电子分析天平，上海亚荣2000A型旋转蒸发仪，日本三菱公司SP70、SP700、SP825、SP850、HP20型大孔树脂。试药秦皮甲素对照品(供含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供，批号110740-200405)，使用前置五氧化二磷减压干燥器中干燥24小时，使之恒重。水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。②检测波长334nm空白对照甲醇。③对照品溶液的制备精密称取秦皮甲素对照品9.1mg，置25ml量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。④工作曲线制作精确吸取O.l、0.5、1.0、1.5、2.0ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。于334nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，秦皮甲素对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程为Y=37，X-0.0196，R2=0.9996。秦皮甲素在3.64|ag/ml72.80|^g/ml范围内呈良好线性关系。⑤供试品溶液的制备取秦皮提取物适量，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密移取1.0ml至25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。(D含量测定取样品溶液置334nm处测定吸光度，记录吸光度值，代入工作曲线计算香豆素含量。实施例l本发明的一种纯化方法(1)秦皮提取秦皮以8倍体积水加热回流提取三次，每次lh，合并三次滤液，减压浓縮至比重为1.133-1.137(50-60°C),加95%乙醇使醇浓度至80%，静置过夜。醇沉液减压浓縮至无醇味后加水稀释使溶液体积达到生药重量的2倍，过滤，备用。(2)上柱将秦皮提取液上柱，控制流出液流速为0.5BV/h，上样量为药材重量树脂体积为1.5:1,至提取液全部进入树脂床。(3)洗脱以5BV体积的10%乙醇冲洗树脂床，控制流出液流速为2BV/h，以除去杂质。然后以5BV体积的40%乙醇，控制流速为2BV/h，收集洗脱液，减压浓縮至一定体积，进行喷雾干燥，即得纯化产物。实施例2选用不同条件进行提取采用本发明提供的方法，选用不同条件进行秦皮香豆素提取实验。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>称取秦皮药材50g，共9份，按表l的因素水平，表2的提取条件分别进行正交试验，提取后滤液合并，减压浓縮至干，精密称取适量干膏，以甲醇溶于10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，再移取l.Oml至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按上述方法测定总香豆素的含量。并对结果进行方差分析，结果见表2、3。表3正交试验方差分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>结果方差分析结果表明以提取总香豆素量为指标，因素A、B、C有显著性差异，影响大小顺序为OA〉B，收率最佳为A3BgC3组合，从省时节能，降低成本角度考虑A,B2C3，为最佳方案。故确定秦皮的提取条件8倍量水，提取3次，每次1小时。结论加8倍量水，提取3次，每次1小时。验证优选水提工艺称取秦皮药材50g，加8倍水煎煮3次，每次1小时(A^2C3)，滤过，滤液合并，减压浓縮至干，精密称取干膏适量，以甲醇溶于10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，再移取1.0ml至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，重复3次。另取秦皮药材50g，加入12倍水煎煮3次，每次1.5小时(A3B3C3),提取后滤液合并，减压浓縮至干，精密称取适量干膏，以甲醇溶于25ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，再移取l.Oml至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，重复3次。按上述方法测定总香豆素的含量，结果见表4。表4验证优选秦皮水提工艺结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>结果从表4可以看出，A3B3C3比A,B2C3工艺收率只高约4.6%，A,B2C具有良好的重现性。结论优选水提工艺具有良好的重现性。秦皮醇沉正交试验为了进一步提高总香豆素的含量和纯度，需将秦皮水提浸膏醇沉。取270g秦皮药材，按上述方法提取，将提取液合并，平均分成9份，其中3份减压浓缩到比重为1.133-1.137(50-60°C)，其中3份浓縮至比重为1.203-1.209(50-60°C)，其中3份浓縮至比重为1.102-1.108(50-60°C)。按表5的因素水平进行试验，醇沉后分别浓縮至无醇味，减压浓縮至干，精密称取干膏适量，以甲醇溶于10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，再移取l.Oml至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。按上述方法测定其中总香豆素含量。结果见表6、7。表5秦皮醇沉因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表6<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表7秦皮醇沉实验方差分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结果由表30可知，浓縮液液比重对醇沉的影响显著，乙醇浓度对醇沉的影响较为显著，最佳组合为A,B2，即浓縮至比重为1.13-1.17(50-60°C)，醇沉浓度为70%。结论醇沉条件为浓縮至比重为1.13-U7(50-60°C)，醇沉浓度为70%。验证优选醇沉工艺称取秦皮药材lOOg，加8倍水煎煮3次，每次1小时，滤过，合并滤液，减压浓縮至比重为1.135(55°C)，加入70ml950/。乙醇，搅匀，静置过夜，滤过，减压浓縮至干，精密称取干膏适量，以甲醇溶于10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，再移取l.Oml至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，重复3次。按上述方法测定其中总香豆素含量。结果见表8。表8验证优选秦皮醇沉工艺结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>结论从表8可以看出，优选醇提工艺具有良好的重现性。实施例3确定大孔树脂提取最佳工艺选取树脂种类、药液浓度、吸附速率、上样量、乙醇洗脱浓度、洗脱速率、洗脱终点6因素分别进行单因素试验，确定各因素的最佳值。①上柱液制备称取秦皮药材500g，按上述优选提取工艺提取，8倍量水煮三次每次1小时，合并滤液，减压浓縮至约125ml，比重为1.138(55°C)，加95%乙醇，使醇浓度为80%，静置过夜，滤过，减压回收乙醇至无醇味，以去离子水稀释至500ml，滤过，上清备用，测得总香豆素含量为18.7mgmr1。②静态吸附取5种处理好的大孔树脂各10g，分别加入秦皮水溶液30ml(有效组分浓度为6.24mg，mr1)，每5min振摇一次，2h后分别取各树脂吸附后的溶液0.4ml于10ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀。于334nm处测定吸光度，计算各树脂对秦皮总香豆素的吸附率。见表9、图l。③静态解吸将静态吸附的树脂过滤抽干，加30ml40%乙醇解吸，每5min振摇一次，2h后分别取各树脂吸附后的溶液O.lml于10ml量瓶中，甲醇稀释至刻度。按上述方法测定总香豆素浓度，计算各树脂对秦皮总香豆素的解吸率。见表9、图1。表95种大孔树脂对秦皮总香豆素的吸附与解吸附率树脂类型吸附率解吸率HP2092.0741.89SP82595.8863.12SP85096.2342.93SP70097.6562.30SP7094.3665.14结果从图1可以看出，5种树脂的吸附率都较大(大于90%)，而HP20和SP850的解吸率都较小。结论选取SP70、SP700、SP825树脂做动态吸附试验。表103种大孔树脂动态吸附结果滅貝g床优禾口各树脂接收液中总香豆素浓度(mgml")SP70SP700SP82530.010.010.0140.020.020.025—0.020.020.0260.030,030.0370.030.040.0480.050.080.0790.070.170.10100.100.280.14110.130.440.25120.220.840.40130,301.430.67140.392.25Ul150.683.071.97161.143.692.79171.753.863.34182.243.973.61192.683.86203.143.94213.524.00223.77233.93243.98逸动态吸附取处理好的静态吸附优选3种树脂各20ml于柱内(lcmX13cm)，加秦皮水溶液(总香豆素浓度为6.24mg"ml")于柱顶，以0.5BV/h的流速进行动态吸附，收集流出液，按树脂床体积收集，于334nm处测定吸光度，计算各总香豆素的含量，绘制各树脂的泄漏曲线，结果见表10、图2。结果从图2可以看出，SP70与SP825达到吸附饱和时，所吸附的总香豆素的量较大，SP70较SP825大。结论选取SP70和SP825做动态解吸试验。②动态解吸取处理好的SP70和SP825树脂各20ml于柱内(lcmX13cm)将总香豆素浓度为6.24mgml'1的秦皮水溶液30ml加于柱顶，以0.5BV/h的流速进行吸附后，用40%乙醇以2BV/h的流速进行洗脱，按树脂床体积收集洗脱液，于334nm处测定吸光度，计算乙醇洗脱液总香豆素的含量，结果见表ll、图3。表11秦皮动态解吸结果^匕^来洗脱液体积数(BV)及浓度(mg'ml勺SP700.112.180.740.280.140.090.080.06SP8250.132.010.920.460.180.090.080.06结果从图3可以看出，SP70较SP825的解吸效果好，因此选择SP70作为最佳树脂。结论选择SP70树脂。愈药液浓度考察取秦皮水溶液(总香豆素浓度为18.7mg'mr1)10ml，分别稀释至溶液体积(ml):生药重(g)为l:1、1.5:1、2:1、4:1、、10:1，加入20ml(lcmX13cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附后，以40%乙醇洗脱，收集洗脱液至100ml，于334nrn处测定吸光度，计算总香豆素的含量。结果见表12。表12秦皮药液浓度考察结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>结果从表35可以看出，当药液稀释4倍时，解析率最高，稀释1.5倍与稀释2倍相当，且比不稀释要高约2%，综合考虑生产时效因素，选择稀释1.5倍，即溶液体积(ml):生药重(g)=1.5:1。结论:上柱液浓度为溶液体积达到生药重的1.5倍。(Z)吸附速率考察取秦皮水溶液(总香豆素浓度为18.7mg'mr1)10ml，加于20ml(lcmX13cm)，分别以0.5BV/h、lBV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、的流速进行吸附后，用5BV40%以2BV/h的流速进行洗脱，于334nm处测定吸光度，计算乙醇洗脱液总香豆素的含量。结果见表13。表13秦皮吸附速率考察结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结果从表13可看出，当吸附速率为0.5BVh"时，吸附效果最好。结论吸附速率为0.5BV'h—1。⑧上样量考察取秦皮水溶液(总香豆素浓度为18.7mg.mr1)加于20ml(lcmX13cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附，按树脂床体积收集流出液，于334nm处测定吸光度，计算总香豆素的含量。结果见表14、图4。表14秦皮上样量考察结果树脂床体积数(BV)1234567流出液浓度(mg/ml)0.040.100.390.963.0012.5714.75结果从图4可以看出，上样量为4倍树脂床体积(BV)时开始泄漏，7倍倍树脂床体积(BV)时达到吸附饱和，因此实际工艺中选择1.5倍树脂床体积(BV)上样量，即生药重(g):树脂体积(ml)=1.5:1。结论上样量为生药重(g):树脂体积(ml)=1.5:1。②乙醇浓度考察取秦皮水溶液(总香豆素浓度为18.7mgnnr')150ml，加去离子水稀释至225ml(总香豆素浓度为12.47mg，mr1)，加于100ml(2.5cmX23cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附，分别用5BV水、5%、10%、20%、30%、40%、60°/。、80%乙醇以2BV/h流速进行洗脱，收集洗脱液至500ml，于334rnn处测定吸光度，计算总香豆素的含量。结果见表15。表15秦皮乙醇洗脱浓度考察结果乙醇浓度(％)干膏重(g)得率(％)有效组分含量(％)水0.2410.164.6450.1230.0824.29100.2150.1452.11200.2250.1561.91300.3380.2369.85401.7741.1864.22600.1380.0921.53800.1130.089.69结果从表15可以看出，当乙醇浓度为10%-40%时，总香豆素的含量最高(大于50%)，因此选择先以10%乙醇洗脱，再以40%乙醇洗脱，收集40%乙醇洗脱液。结论选择先以10%及40%乙醇洗脱，收集40%乙醇洗脱液。洗脱速率考察取秦皮水溶液(总香豆素浓度为18.7mg，mr1)10ml，加于20ml(lcmX13cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附后，以40%乙醇洗脱，流速分别为lBV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h、收集洗脱液至100ml，于334nm处测定吸光度，计算总香豆素的含量。结果见表16。表16秦皮脱速率考察结果流速BV/h12345上柱后总香豆素量(mg)解吸率(％)172.592.22171.091.37160.785.89151.080.68135.772.52结果从表16看出，流速为lBV/h洗脱时解吸率最高，但与2BV/h洗脱相差不大，为提高效率用2BV/h流速洗脱。结论洗脱速率为2BV/h。G洗脱终点考察将吸附饱和的树脂40%乙醇以2BV/h流速进行洗脱，按树脂床体积收集洗脱液(20ml)，于334nm处测定吸光度，计算总香豆素的含量。结果见表17，图5。结果从图5可以看出，当洗脱液为5倍树脂床体积时，已基本将总香豆素洗净。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结果从表41可以看出，经SP70大孔树脂处理处理过的秦皮水溶液，总香豆素含量可达60%左右，得率约1.7%,且具有良好的重现性。结论优选工艺具有良好的重现性。实施例4SP70大孔树脂反复使用稳定性考察称取秦皮药材lkg，按上述优选水煮及醇沉工艺提取，提取液定容至1000ml。取秦皮水溶液150ml，加水稀释至225ml，加于画ml(2.5cmX23cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附后先以500ml10%乙醇2BV速率洗脱，再以500ml40。/。乙醇2BV/h速率洗脱，收集40%乙醇洗脱液至500ml,再以500ml75。/。乙醇洗柱，40%乙醇洗脱液减压浓縮至干，75。C真空干燥至恒重，测定总香豆素的含量，计算得率，在同一树脂柱上按上述歩骤重复5次。结果见表19。表19SP70大孔树脂反复使用5个周期稳定性考察实验次数12345干膏重(g)2.5642.5812.5312.4872.516得率(g)1.711.721.691,661.68总香豆素含量(％)63.9563.7164.1564.3063.54结果从表42可以看出上述树脂工艺在5个周期内产品得率及总香豆素含量较稳定，SP70树脂可以反复使用。结论使用SP70树脂产品得率及总香豆素含量在5个周期内较稳定。本发明涉及的参考文献1.刘丽梅,陈琳，王瑞海，等.秦皮的化学成分研究.中草药,2001,32(12):1073.2.刘丽梅應琳,王瑞海,等.秦皮的化学成分研究.中草药，2003，34(10):8893.卢艳花.中药有效成分提取分离技术.北京化学工业出版社，2005.228-229.4.郭希圣，章育中.秦皮中有效成分的高效液相层析分离和测定.药学学报,1983，18(7):525.5.王曙，徐小平，李涛.湿痹清中秦皮甲素的提取工艺.华西药学杂志,2002,17(1):30-316.江苏新医学院.中药大辞典(下册).上海:上海科技出版社，1977:20087.中华人民共和国药典2005年版(一部).北京化学工业出版社，2005.218，191.权利要求1、秦皮香豆素提取方法，具体方法是将秦皮经水提取，经乙醇醇沉，滤过，滤液浓缩，浓缩液吸附到大孔树脂上、洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥，获得秦皮香豆素。2、如权利要求1所述的秦皮香豆素提取方法，其特征是将秦皮以水回流提取14次，最优选为3次3、如权利要求1所述的秦皮香豆素提取方法，其特征是每次提取秦皮质量与水的体积比为114倍，优选提取体积为6~12倍，最优选提取体积为8倍。4、如权利要求1所述的秦皮香豆素提取方法，其特征是每次提取的时间为0.52小时，最优选时间为l小时。5、如权利要求1所述的秦皮香豆素提取方法，其特征是乙醇醇沉的浓度为20%~90%，优选60%90%，最优选为70%。6、如权利要求1所述的秦皮香豆素提取方法，其特征是大孔树脂选用日本三菱公司HP20、SP825、SP850、SP700、SP70，优选大孔树脂SP825、SP700、SP70，最优选SP70。7、如权利要求1所述的秦皮香豆素提取方法，其特征是秦皮提取液大孔树脂的上样量(秦皮质量树脂体积)为0.5:18:1，优选1:14:1，最优选1.5:1。8、如权利要求1所述的秦皮香豆素提取方法，其特征是大孔树脂洗脱剂为有机醇，优选项为乙醇。9、如权利要求1所述的秦皮香豆素提取方法，其特征是大孔树脂洗脱液流速为1倍柱体积/小时(BV/h)5BV/h，最优选为2BV/h。10、如权利要求1所述的秦皮香豆素提取方法，其特征是大孔树脂洗脱剂乙醇溶液的洗脱浓度为5%至95%,最佳的洗脱浓度为10%至40%。11、如权利要求1述的秦皮香豆素提取方法，其特征是大孔树脂洗脱剂的洗脱体积为110倍柱体积。最佳的洗脱体积为5倍柱体积。12、如权利要求1所述的秦皮香豆素提取方法，其特征是获得纯化的秦皮香豆素含量大于55%。全文摘要本发明公开了一种秦皮香豆素提取方法，该方法是将秦皮水提醇沉后，滤过，滤液回收乙醇，浓缩，浓缩液吸附到大孔树脂吸附法上、洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥，获得秦皮香豆素的方法。本发明涉及的秦皮香豆素提取方法是一种操作简便、快捷的方法。所选用的大孔树脂具有吸附量大，解吸率大的特点。本发明方法以乙醇为溶剂，既价廉又无毒。用本发明方法提取秦皮香豆素含量可达55％以上，且重现性好，树脂可重复使用。文档编号C07D311/06GK101168540SQ20061013770公开日2008年4月30日申请日期2006年10月27日优先权日2006年10月27日发明者颂郭申请人:颂郭