日本血吸虫的特异性抗原Sj22及其用途的制作方法

专利名称：：日本血吸虫的特异性抗原Sj22及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及日本血吸虫(Schistosomajaponicum)的特异性抗原Sj22、其制备方法和用途。
背景技术：
：日本血吸虫(Schistosomajaponicum)是一种严重威胁人类健康的寄生虫。当前血吸虫病的免疫诊断技术迫切需要的技术关键是可用于检测现症感染及疗效考核的快速简便方法。现有的检测抗体的方法，由于特异性抗体水平在治疗后相当长一段时间仍然维持，因此不能用于疗效考核。血吸虫病免疫学诊断方法的灵敏度与特异性，除与选择实验的方法的不同有关外，主要与所用诊断抗原的特性有关。目前常用粗制的虫卵抗原用于血吸虫病诊断的敏感性虽较高，但由于其常混有宿主抗原及含有其它寄生虫如肝吸虫、肺吸虫的共有抗原成分，易产生交叉反应，特异性较低。此外由于传统抗原多为虫源性，来源较少，耗资大，难以适应大规模査病的需要。随着分子生物学技术的发展，用基因重组方法生产合成抗原用于诊断寄生虫病已成为可能，国内外也有研究证实，使用血吸虫特异性的、纯化的天然或重组的抗原不仅可以提高血吸虫病诊断的敏感性和特异性，而且检测抗某些特异抗原的短程抗体具有一定的疗效考核价值。1983年Cordingley等以PJSC73为载体，成功的从曼氏血吸虫虫卵中克隆出了--个40kDa可与抗SEA兔血清发生强烈反应的多肽。从此，各国研究者对血吸虫重组抗原进行了广泛的研究。1995年0sman从曼氏血吸虫尾蚴cDNA文库中筛选出-与免疫素基因(Immunophilin)同源的1.4kb的基因(Smp50基因)，并在大肠杆菌中进行了表达。表达的重组蛋白分子量为50kDa，可为曼氏血吸虫成虫抗原免疫的多克隆兔血清识别(osmanA，KiangD,LoVerdePT，et.al.Schistosomamansoni:characterizationofp50,ani画unophllin.ExpParas.ltol1995;80(3):550-559)。Myophilin是细粒棘球绦虫的一种肌肉组织特异性蛋白，但与肌肉的结构蛋白并无同源性，而与调节肌肉收缩的蛋白关系密切。该蛋白与果蝇的肌肉蛋白MP20，鸡SM22a,哺乳动物的calpoin(—种钙结合蛋白)有很高的同源性，大小约为22KD。蛋白中心有两个约12个氨基酸的区域，与Ca2+结合蛋白的EF—hand基序相似。1995年Martin从细粒棘球绦虫幼虫cDNA文库中筛选出my叩hilin基因的不完全拷贝(10P1)，全长cDNA则用PCR从成虫的Agt22A文库中获得，并在大肠杆菌中进行了表达。利用表达的GST—10P1蛋白免疫兔子，得到抗体。该抗体能够识别全长表达的GST融合蛋白(分子量约45kDa)，并且该抗体能识别细粒棘球绦虫各个阶段的约22KD的蛋白(MartinRM，GasserRB,JonesMK,etal.Identificationandchar-acterizationofmyophilin，amuscle-specificantigenofEchinococcusgranulosus.MolBiochemParasitol.1995Mar;70(l-2):139-48)。1996年Martin等的研究表明，在体外重组表达的myophilin可被约40%(7/18)的包虫病病人血清血清识别，进一步研究病史发现，阳性病人大多一年内接受过药物或手术治疗。因此，该抗原需在虫体被破坏的情况下，才能释放，进而引起机体的免疫反应(MartinRM，ColebrookAL,GasserRB,etal.AntibodyresponsesofpatientswithcystichydatiddiseasetorecombinantmyophilinofEchinococcusgranulosus.ActaTrop.19%Aug;61(4):307-14)。sj22是日本血吸虫myophilin样蛋白基因，与一个来自细粒棘球绦虫的myophilin样基因序列核苷酸一致性高达100%，且与细粒棘球绦虫的myophiiin抗原氨基酸-致性达到88%，因此，Sj22和my叩hilin抗原很可能具有相似的功能。
发明内容本发明要解决的技术问题之一是提供一种纯化的日本血吸虫特异性抗原sj22蛋白。本发明要解决的技术问题之二是提供一种纯化的日本血吸虫特异性抗原sj22基因的多核苷酸。本发明要解决的技术问题之三是提供一种日本血吸虫特异性抗原sj22蛋白的制备方法。本发明要解决的技术问题之四是提供上述抗原蛋白sj22在诊断H本血吸虫病中的应用。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现-在本发明的一个方面，提供了一种纯化的日本血吸虫特异性抗原sj22蛋白，它包含SEQIDN0:1所示氨基酸序列的蛋白，或其保守性变异蛋白、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，所述蛋白选自下组(a)SEQIDNO:l所示氨基酸序列的蛋白；(b)由(a)的蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失、插入或添加而形成的与(a)蛋白具有相同活性的蛋白。更佳地，所述蛋白是SEQIDNo:l所示的氨基酸序列。在本发明的另一方面，提供了纯化的日本血吸虫特异性抗原sj22基因的多核苷酸，包括(1)SEQIDN0:2所示的核苷酸序列；(2)编码SEQIDNO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列；(3)与SEQIDN0:2的核苷酸序列具有70《以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。较佳地，所述多核苷酸为SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。更佳地，所述序列为SEQIDN0:2中104-676位的核苷酸序列。在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述抗原基因sj22的多核苷酸。在本发明的另一方面，还提供了一种含有上述载体宿主细胞。在本发明的另一方面，还提供了一种日本血吸虫特异性抗原蛋白的制备方法，包括(a)在表达条件下，培养转入表达载体的宿主细胞；(b)从培养物中分离出含有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的蛋白。在本发明的另一方面，还提供日本血吸虫特异性抗原蛋白sj22在诊断日本血吸虫病中的应用。在本发明中，除了包括SEQIDNO:1所示的日本血吸虫特异性抗原蛋白之外，还包括具有与所述的抗原蛋白有相同的抗日本血吸虫的免疫原性、SEQIDNO:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能或免疫原性。又比如，在C木端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的免疫原性。该术语还包括SEQIDNO:l蛋白的活性片段和活性衍生物。在本发明中，多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDN0:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。"简并的变异体"在本发明中是指编码具有SEQIDNO:1的蛋白质，但与SEQIDNO:2所示的编码区(104-676位)序列有差别的核酸序列。本发明的日本血吸虫特异性抗原蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的日本血吸虫抗原Sj22蛋白时，可以将Sj22蛋白的编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成Sj22蛋白表达载体。在本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CH0细胞、C0S细胞等。在本发明中，用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaC12法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgC12。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下迸行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。本发明的日本血吸虫特异性抗原蛋白Sj22作为诊断抗原用于血吸虫抗体的ELISA检测，在动物实验中检测特异性为100%，用于现症血吸虫病人血清中的抗体检测时，Sj22检测的特异性和敏感性分别为93.9《和57.4X。本发明通过基因工程方法制备的日本血吸虫特异性抗原Sj22，不仅可以解决大量诊断抗原的来源，而且有利于检测方法的标准化。图1是本发明的日本血吸虫SJ22基因的PCR扩增电泳图；图2是本发明重组质粒pET22b-Sj22的PCR鉴定图；图3是本发明重组质粒限制性内切酶分析图4是本发明重组质粒pET22b-Sj22在大肠杆菌BL21中表达产物的12%SDS-PAGE分析图5是本发明的经纯化后获得的纯的Sj22重组蛋白PAGE电泳图6是本发明日本血吸虫感染前后兔血清中抗Sj22抗体的检测结果图7是本发明日本血吸虫感染及治疗前后兔血清中抗Sj22抗体检测结果图8是本发明的正常人及现症日本血吸虫病人血清中抗Sj22抗体的检测结果图。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一歩详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1制备各种血清1.H本血吸虫感染兔血清建立日本血吸虫感染动物模型。新西兰白色种兔12只，分笼词养，分别经腹壁接种日本血吸虫尾坳100条。感染后IO周，以吡喹酮200mg/kg胃饲进行药物治疗。隔周自兔耳静脉取血1-2ml，12小时内分离血清，-20°C冻存。2.正常人及血吸虫病人血清病人血清标本来自中国预防医学科学院寄生虫病研究所，中国血吸虫病参考血清库，共计61份。正常人血清标本取自交通大学医学院在校学生，共计33份。实施例2Sj22基因的获得L引物的设计和合成根据Sj22基因序列，经Primerexpress软件分析设计引物，由上海生物工程公司合成二对引物。Sj22F为5'gcgtcagGGATCCgATGGCTAATCAACCTTTAG3，(SEQIDNO:3)，引入BamHI酶切位点GGATCC;Sj22R为5'gcgtctgctcgagATCAAGAATCATACGTTG3'(SEQIDNO:4)，引入Xhol酶切位点CTCGAG;引物贮存浓度lOOpmol/y1、工作浓度为5pmol/ix1。2.Sj22基因的PCR扩增以用常规方法制备的日本血吸虫成虫及虫卵cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系共计80y1，内含模板8u1、F弓l物4u1、R弓l物4u1、dNTP8nL、lOXEx-Taqbuffer8u1、Ex-TaqDNA聚合酶(TAKARA公司)0.8u1、去离子水95.2y1。反应条件为预变性94°C5min;变性94。C50sec;退火56°C50sec;复性72°Clmin;循环30次，最后一个循环复性再延长lOmin后，样后存于4。C。PCR产物用PCR、酶切产物回收纯化试剂盒回收纯化，经1%琼脂糖凝胶电泳显示，有一条Sj22基因约600bp大小的条带，与预计相同(图l)。在图1中，M代表PCR参照分子量SJ22是指Sj22扩增产物。对PCR产物进行测序，结果表明，Sj22基因的核苷酸序列如SEQIDN():2所示，ORF位于104-676位，编码一个全长为190aa的蛋白(SEQIDNO:l)。3.表达载体的构建回收纯化了的Sj22基因和质粒pET22b(购自Novagen公司)分别用限制性内切酶BamHI和XhoI进行酶切。20u1模板加EcoRI1u1、XhoI丄y1、10XHbuffer和去离子水5ul，共计30ul于0.5mlEppendorf管中37°C水浴过夜。酶切后的Sj22基因和质粒pET22b，用PCR、酶切产物回收纯化试剂盒回收纯化。纯化的目的基因片段和载体酶切片段，测定OD值，计算片段和载体片段浓度，目的片段和载体片段按6:1摩尔比进行连接。连接体系中含T4DNA连接酶lul、10x连接缓冲液lU1、去离子水、pET22b(l()0ng)、Sj22基因(70ng)，共计10u1于0.5mlf':ppendorf管中16。C连接过夜，构建成Sj22基因原核表达重组质粒pET22b—Sj22。经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切后的Sj22基因和质粒pET22b连接，构建成重组质粒pET22b—Sj22，转化入大肠杆菌TG1内扩增。以扩增细菌为模板，T7promoter、T7terminatorprimer为引物进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳显示，所获条带与期望条带大小一致(见图2)。在图2中，M是PCR参照分子量，"1"代表以质粒为模板的pET22b-Sj22PCR产物，"2"代表以扩增细菌为模板的产物。4.表达载体的鉴定通过钙转法将重组质粒pET22b-Sj22转化大肠杆菌TG1感受态细胞。10y1连接产物转化80u1感受态细胞，冰上放置30rnin，42。C热激90sec,冰上放置3min。转化后的菌体加入1mlLB培养液，37°C，250rpm振荡培养1hr后，涂布于含氨节青霉素的LB琼脂平板上，培养皿倒置于37°C培养过夜。随机挑取上述平板上的菌落进行PCR鉴定。反应体系共计20u1，内含模板2P1、T7promoterprimerly〗、T7terminatorprimer1w:1、dNTP2yl、10XEx-Taqbuffer2pl、Ex-TaqDNA聚合酶0.1y]、去离子水11.9iU。反应条件为预变性94。C5min;变性94。C50sec;退火56。C50sec;复性72。Cimin;循环30次，最后一个循环复性再延长10min后，样后存于4°C。PCR产物经1%琼脂糖电泳检测。随机挑取Sj22阳性克隆分别加入含60ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基5ml,37°C，300rpm扩增培养过夜。用质粒小量抽提试剂盒抽提并纯化质粒。对所抽质粒进行BamHI和Xhol酶切鉴定。结果经1%琼脂糖凝胶电泳显示，有二条明显的条带(质粒与目的基因，见图3)。实施例3Sj22重组基因在大肠杆菌中的表达通过钙转法将以上抽提的pET22b-Sj22重组质粒转化入大肠杆菌BL21。内含80HiBL21钙转感受态细胞的1.5mlEppendorf管中加入重组质粒lul，冰上放置3()min，42。C热激90sec，冰上放置3min。转化后的菌体加入1mlLB培养液，37°C，250rpm振荡培养1hr后，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，培养皿倒置于37°C培养过夜。随机挑取Sj22阳性克隆接种于3ml含60ng/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37。C摇至0D600=0.6。取2ml加入IPTG至终浓度0.8mM,余1ral不加诱导物作为对照，30°C，250rpm，培养4hours。4°C10000g离心5rain沉淀菌体。诱导管加入300u1预冷的PBS,超声裂解细菌(每次5sec，间隔10sec，共计5次),4°C以13，200rpm离心30min，取上清液28n1和沉淀。分别加入5XSDS-PAGE样品缓冲液7ul和30iU1XSDS-PAGE样品缓冲液；对照管则加入50u11XSDS-PAGE样品缓冲液，混匀菌体沉淀。100'C水浴5min,13200g离心lOmin,取10u1上清作SDS-PAGE电泳，浓縮胶4%，分离胶12%。电泳条件浓縮胶80V,分离胶120V。电泳结束后，胶于考马氏亮蓝R250染液中固定、染色，在乙醇-冰醋酸液中脱色。结果显示pET22b-Sj22转化的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后，与诱导前比较出现一分子量约为24kDa的条带，即为Sj22基因产物与多聚组氨酸及其氨基端约30个氨基酸的pelB引导序列的融合体(图4)。在图4中，M代表标准分子量蛋白，T代表诱导表达前的pET22b-Sj22，"2"代表诱导表达后的pET22b-Sj22上清，"3"代表诱导表达后的pET22b-Sj22沉淀。实施例4pelB—sj22—His融合蛋白的大规模制备和纯化1.融合蛋白的大规模制备选取可表达融合蛋白pelB—sj22—His的细菌克隆接种于10ml含60pg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C培养过夜。第2天分别将其接种到800ml含60ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基。37°C摇至0D600=0.6后，每瓶加入IPTG至浓度为().8mM，30。C继续培养4hr。4°C,10000rpm离心10min收获细菌存于-20°C。在收获的细菌沉淀中，加入30ml预冷的PBS、30u11MDTT，搅匀后10000rpm离心10min，如此两次洗去菌体外的杂质。沉淀加入30ml缓冲液A(0.5raMTHs-Hcl，0.5Mrnedta,50mMNaCl，5%甘油，0.5mM二硫苏糖醇)，搅匀，超声裂解细菌(每次5sec，间隔10sec，共计40次)。超声后加入脱氧胆酸钠(DOC)至终浓度为2%，室温放置10min。4°C以8000卬m离心60ndn，沉淀重复上一歩一次，弃去上清液，得包涵体沉淀。包涵体沉淀用30ml预冷的PBS、30ullMDTT洗涤两次，沉淀称重后按10ral/g加入6M盐酸胍，搅匀后4t:溶解过夜。第二天4°C，8000rpm离心30min后，上清经0.45um虑膜过滤待用。2.pe!B—sj22—His的纯化将过滤后的上清中缓缓加到2ml已鳌合了镍离子的S印harose凝胶柱(ChelatingS印haroseFastFlow)上，让上清慢慢流出柱体。用大量的洗柱缓冲液(PBS，50mMNaCl，10mM左旋咪唑，lmMDTT)洗脱未结合的杂蛋白。利用含梯度浓度咪唑的洗脱缓冲液(PBS，50mMNaCl，20-500mM左旋咪唑，lmMDTT，6MUrea)洗脱，得到目的蛋白。选取高纯度的收集管，经脱盐、超滤管浓縮，测定0D260、0D280值，计算蛋白浓度。结果表明表达的融合蛋白经亲和层析(ChelatingS印haroseFastFlow)后获得了较纯的融合蛋白(图5)。在图5中，M指标准分子量蛋白，"l"指纯化后的蛋白。实施例5酶联免疫吸附试验1.方法以0.5ug/ml100nlsj22蛋白包被96孔酶标板，4T过夜。稀释的0.1%Tween-20-PBS洗涤后，用5%的BSA每孔200u137°C封闭lhour。洗涤3次后加入1:100稀释的人或兔血清样本100y1，37。C孵育1小时。洗涤后加入2000稀释的羊抗人IgG过氧化物酶结合物或羊抗兔过氧化物酶结合物100w1每孔，37°C孵育1小时。洗涤后，每孔加入腦u1底物0PD37。C显色15分钟后，加2mol/LH2S04终止反应。在自动酶标仪上以492nra波段读取0D值。判断标准每一受检标本的0D值等于或大于阴性对照OD值均值加2个标准差(x+2SD)定为阳性阈值。2.血吸虫感染病兔血清中的特异性抗体的检测以纯化的Sj22融合蛋白为诊断抗原，共有9只兔子感染前与感染后9一21周兔血清中的抗Sj22抗体被检测。图6显示了兔血清中Sj22抗体检测的结果。感染前所有兔子呈阴性反应，检测的特异性为100%。在感染后9周，兔血清中的抗Sj22抗体较感染前有显著升高(P=0.0009),其中8只兔子体内抗Sj22抗体阳性，阳性率88.9%(表1)。表1H本血吸虫感染前与感染后兔血清抗Sj22抗体检测结果感染周数()D值(X士SD)阳性阈值(X+2*SD)样本数阳性数(阳性率％)P值(配对t检验)感染前o周感染后9周0.4196±0.10221.1353±0.42700.642090(0,0%)8(88.9%)0.0009图7显示了感染前后及用药前后兔血清中抗Sj22抗体动态变化。兔血清中抗Sj22抗体水平在治疗后12周(21周)与治疗前(9周)相比显著性下降(P〈O.O])，与感染前(O周)抗体水平相比无显著性差异(P>0.05)(表2)。表2R本血吸虫感染兔血清中抗Sj22抗体的动态变化<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3.现症血吸虫病人血清中特异性抗体的检测将Sj22抗原用于血吸虫病人血清中抗体的检测，结果见图8和表3。33份正常人血清标本中有2份标本呈阳性反应，假阳性率6.06%。对于61名现症血吸虫病人血清的检测结果显示，在34名患者体内查见抗Sj22抗体，阳性率为55.7%。对检测结果进行统计学分析后，本发明以Sj22为诊断抗原，正常人与现症血吸虫病人抗体检测结果间有显著性差异(P<0.0001)。表3正常人及现症日本血吸虫病人血清中抗Sj22抗体检測结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>序列表〈110〉上海生物芯片有限公司中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所国家人类基因组南方研究中心〈120>日本血吸虫的特异性抗原Sj22及其用途<130>NP-10919〈160〉4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>190<212>PRT〈213〉日本血吸虫(Schistosomajaponicum)〈400〉1MetAlaAsnGinProLeuAlaSerGlyLeuSerA丄aGinVa丄LysLys151015L,ysLeu(;〗uGlyLysArgAspArgAspGinGluGinSerVal.LeuAsp202530TrplieAspAlaValLeuGlyThrLysValAspArgSerLysProTyr354045GluGluValLeuLysAspGlyValLeuLeuCysLysVallieAsnLys505560LeuLysProGlySerValLysLyslieAsnGluAsnSerThrMetPro65707580PheLyslieMetGluAsnlit'AsnAlaPheGin(;luAialieLysAla859095TyrGlyValProThrSerAspValPheGinThrValAspLeuPheGlu100105110Lysl,ysAsplieAlaGinVa]ThrGinCyslieTyrAlaLeuGlyArg115120ThrCysG]nThrHisProGluTyrAsnGlyPro130135LeuAlaGinGluAsnLysArgGluPheSerG丄u145150155GlyAlaAsnVallieSerLeuGinTyrGlyThr165170GinAlaGlyMetThrMetGlyLysGinArgMet180185125ThrLeuG]yProLys140GluGinLeuArgGlu160AsnLysGlyAlaSer175lieLeuAsp190〈210>2〈211〉1104〈212〉DNA〈213〉日本血吸虫(Schistosomajaponicum)〈220〉<221〉CDS〈222〉(104)..(676)<400〉2gcgcgccattgtgttggtacccgggaattcggccattatggttaaccgatagaaaaagtg60ttttcagtaactaattcgatttttttgtgccaatatcggatttatggetaatcaa115MetAlaAsnGin1cctttagetagtggacttagtgetcaagtgaaaaagaagcttgaaggt163ProLeuA丄aSerGlyLeuSerAlaGinVaiLysLysLysLeuGluGly5101520aaaagagacagagatcaaga.acaaagtgtacttgattggatagatget211LysArgAspArgAspGinGluGinSerValLeuAspTrplieAspAla253035gtacttggtactaaggtggatcgttctaaaccatatgaagaagtatta259ValLeuGlyThrLysValAspArgSerLysProTyrGluGluVaiLeu404550aaagatggtgtgttgctttgcaaagttattaacaaattgaaacctggt307LysAspGlyValLeuLeuCysLysVallieAsnLysLeuLysProGly556065agtgtt肪g朋gateaatgaaeiatagtsecatgccatttaaaattatg355SerValLysLyslieAsnGluAsnSerThrMetProPheLyslieMet707580gagaatattaatgcatttcaagaagccattaaagcctatggtgttcca403GluAsnlieAsnAlaPheGinGluAlalieLysAiaTyrGlyValPro859095100actteagatgttttccaaacagttgatttatttgaaaagaaagatatt451ThrSerAspValPheGinThrValAspLeuPheGluLysLysAsplie105110115gcacaagtaacacaatgtat[tatgcacttggaagaacatgtcaaaca499AlaGinValThrGinCyslieTyrAlaLeuGlyArgThr.CysGinThr120125130catccagaatataatggtccaactttaggtccaaaattagcacaagag547HisProGluTyrAsnGlyProThrLeuGlyProLysLeuAlaGinGlu35140145aa.taaacgtgaattcagtgaagaacastttacgtgaaggtgcaaatgtg595AsnLysArgGluPheSerGluGluGinLeuArgGiuGlyAlaAsnVal150155160attagtttacaatatggtactaataaaggtgcateacaagetggtatg643lieSerLeuGinTyrGlyThrAsnLysGlyAlaSerGinAlaGlyMett65170175180actatgggt.aaacaacgtatga"cttgattaaattgacaaatUataa卿a696ThrMetGlyLysGinArgMetlieLeuAsp185190tacaactacattcattatcattttettttgaagtaaactgatcaactgatt756gttattatttg幼gtaatggg犯ttg组g816tctgtttccttgtgctttgtttttttttcacaaatgttttcttttctttctgcgcttacc876tatgtcttgtctgcctgacggttgcattgcattcatcatttgtttactctt:ct犯tcaac936aagaacttcctcatttaatttcattcatgttaactaaaattggtaatgtt996aaac犯tttgtttgcctgtttttaccgctt1056ttctgctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaail(M<210>3〈211〉33<212>DM<213>人工序列〈220〉<221>misc一feature<223>引物〈400〉3gcgtcagggatccgatggctaatcaacctttag33<210>4〈211>31〈212〉腿〈213>人工序列〈220>〈221>misc—feature<223>引物〈400>4gcgtctgctcgagatca卿atcatacgttg权利要求1.一种纯化的日本血吸虫特异性抗原Sj22蛋白，其特征在于，它包含SEQIDNO1所示氨基酸序列的蛋白，或其保守性变异蛋白、或其活性片段，或其活性衍生物。2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，选自下组-(a)SEQIDN0:1所示氨基酸序列的蛋白；(b)由(a)的蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失、插入或添加而形成的与(a)蛋白具有相同活性的蛋白。3.如权利要求1或2所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白是SEQIDNO:l所示的氨基酸序列。4.一种纯化的多核苷酸，它是日本血吸虫特异性抗原Sj22基因，其特征在于，包括(1)SEQIDN0:2所示的核苷酸序列；(2)编码SEQIDN0:1所示氨基酸序列的核苷酸序列；(3)与SEQIDN0:2的核苷酸序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸为SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。6.如权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述序列为SEQIDNO:2中104-676位的核苷酸序列。7.—种载体，其特征在于，它包含权利要求4所述的多核苷酸。8.—种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求7所述的载体。9.一种日本血吸虫特异性抗原Sj22蛋白的制备方法，其特征在于，包括(a)在表达条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出含有SEQIDNO:l所示氨基酸序列的蛋白。10.权利要求1所述的抗原蛋白在诊断闩本血吸虫病中的应用。全文摘要本发明公开了一种日本血吸虫(Schistosomajaponicum)特异性抗原Sj22的蛋白、基因、以及重组表达并分离该蛋白的方法，本发明还公开了Sj22抗原蛋白在诊断日本血吸虫病中的应用。本发明的Sj22抗原蛋白能高敏感性与特异性地检测血吸虫抗体，且本发明制备的Sj22抗原，可解决大量诊断抗原的来源，具有广阔的应用前景。文档编号C07K14/435GK101200495SQ20061014733公开日2008年6月18日申请日期2006年12月15日优先权日2006年12月15日发明者正冯,锋刘,赛叶,凯宋,张庆华,彭海林,斌徐,薇胡,韩泽广申请人:上海生物芯片有限公司;中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所;国家人类基因组南方研究中心