专利名称：抗肿瘤特异性标志蛋白ts/medp的抗体制备及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及多种细胞和分子生物学技术，包括细胞同步化技术、mRNA差 异显示技术、RACE技术、原核表达蛋白质、RT-PCR、 mRNA原位杂交、多克隆 抗体制备、免疫化学、Western blot、流式细胞、RMi和动物实验。 。
背景技术：
世界上与肿瘤相关的疾病中，胃癌占第二位，并且是亚洲人群中最常见的 恶性肿瘤，严重的危害着人类的健康。人们期望能阐明胃癌的发生发展机制， 从而有效的预防和治疗这一恶性肿瘤。尽管大量的研究证实胃癌的发生与多 种因素有关包括寸大食、环境以及细菌或病毒感染，如幽门螺旋杆菌的感染， 近年来分子机制研究发现众多基因参与胃癌的发生发展，如E-cadherin表达 的缺失、p53基因、TGF-0、 c-met、 erbB-2和RUNX3等，这些研究解释了胃 癌部分发病机制，对于胃癌的详细的分子发病机制我们还知之甚少。
与正常细胞相比，肺瘤细胞的最根本的特征之一就是细胞周期调控异常， 正常细胞向恶性细胞转化过程中，多基因变异积累赋予了肿瘤细胞特有的功 能，如肿瘤细胞产生许多自身的生长因子，对于抑止细胞生长的信号不敏感， 逃避凋亡，具有无限的复制潜能，均能归结到变异的基因导致细胞周期调控 异常，特别是细胞周期checkpoint异常，从而赋予肿瘤细胞失控性生长的特 性。尽管Cyclin和CDK的发现已经阐明了细胞周期的基本调控机制，对于 Gl-S期checkpoint也有了较多的了解，如P53、 P21、 GADD45、 TGF-p 、 P27、 P16、 Rb、 E2F参与G1-S期checkpoint的调控，但是距我们对于认识细胞周 期调控的详细分子调控机制还甚远。
发明内容
本发明的目的是综合利用上述技术，需要找到参与与胃癌发生发展，并 且参与细胞周期调控的关键基因，从而阐明胃癌发生发展的分子机制，进一 步筛选到胃癌分子标志物及治疗胃癌的分子耙点。此项研究将mRNA差异显示 技术和细胞同步化技术结合，以胃癌细胞系BGC823为研究对象，获得了一个
周期差异性表达基因，将其全长mRNA克隆并命名为7^/(/a5 ，提交至Genbank， 基因号为DQ150361, r5/M^户基因编码389aa蛋白质，分子量42. 3kd，生物软 件预测包含多个砩酸化位点， 一个可与具有SH3 Domain的蛋白质结合脯氨酸 富集区， 一个与CC结构域，因此推测TS/MDEP基因具有重要的生物学功能。
基因差异性表达提示其具有特定的生物学功能，因此我们采用不同的技 术，在细胞和组织水平验证了 7^/Jffi"尸基因的表达特征，此基因在14/17株 肿瘤细胞中表达，并且呈现周期特异性表达，TS/MEDP蛋白在M期的BGC823 中表达最高，随着细胞分裂的完成，其表达量逐渐降低。更重要的是在配对 的胃癌组织中表达，而正常胃粘膜中未见表达，还证实TS/MEDP基因在多种 细胞增殖旺盛的胚胎组织中表达，因此TS/MEDP基因在组织中具有如下表达 特征TS/MDEP在细胞增值旺盛的胚胎组织高表达，成年后组织细胞中此基 因被关闭，在肿瘤细胞中又出现高表达，符合癌基因的表达规律，因此75/#朋户 基因是一个新的候选癌基因。
特别是在BGC823中RNAi干扰TS/MEDP基因后，细胞形态发生明显的变 化，细胞增殖受到明显抑制，细胞集落形成能力和致瘤性显著降低，并且干 扰后细胞出现G2/M期阻滞。这一结果表明TS/MEDP基因在参与细胞增殖调控 和肿瘤的发生发展中具有重要的生物学功能。并且可能成为预测胃癌生物学 行为的分子标志物。
本发明的技术内容是克隆了周期依赖性表达的新基因r5/yK57 P ( Tumor Specificity and Mitosis Phase-dependent Expression protein),提交到 Genebank接受号为DQ15(B61。通过合成多肽并与大分子蛋白质KLH连接后， 免疫新西兰白兔，ELISA测定抗体滴度后，取兔血清，并用原核表达的TS/MDEP 蛋白质进行亲和层析，细胞周期和肿瘤特异性表达，经过纯化制备了抗 TS/MEDP的特异性多克隆抗体。此抗体可以通过Western blot和免疫组织化学技术，检测到TS/MEDP 蛋白的表达。
通过检测基因的表达，发现其在细胞及组织中的表达规律，在细胞中呈 现周期特异性表达，TS/MEDP蛋白在M期的BGC823中表达最高，随着细胞分 裂的完成，其表达量逐渐降低，在组织中，TS/MDEP在细胞增值旺盛的胚胎 组织高表达，更重要的是，7^/(ffiZ 户基因在胃癌组织中表达，而正常的胃粘
膜不表达。
进一步功能研究表明757^5ZW基因在细胞增殖中具有重要的作用并和细 胞分裂密切相关，在肿瘤肿瘤的发生发展中具有重要的生物学功能。因为细 胞周期调控异常是肿瘤细胞的根本特征，因此r5/^F"户是一个候选癌基因。 利用我们制备的抗TS/MDEP的抗体可以对胃癌进行诊断，并且基于我们阐明 的此基因的功能，7^/1/gZW基因可能成为诊断胃癌的分子标志物或者治疗胃 癌的分子靶点。
采用本发明提供的技术方案，利用分子细胞生物学技术，在胃癌细胞中 克隆出一个新基因，命名为rS/M^户(Tumor Specificity and Mitosis Phase-dependent Expression protein, DQ150361 )。制备了抗T5/M^尸的多 克隆抗体，通过抗体纯化技术获得了高特异性抗体。从mRNA和蛋白质水平验 证了 r5/M^户基因在肺瘤细胞系和组织中的表达特征，确定其在包括胃癌细 胞系在内的14林肿瘤细胞系中表达，并呈现细胞周期依赖性，在胃癌、乳腺 癌和宫颈癌组织中过量表达而相应正常组织不表达，且在多种胚胎组织中表 达。因此，我们证实了 73，/#/^尸在细胞增殖旺盛的胚胎组织中高表达，成年 后此基因被关闭，在肿瘤细胞中又出现高表达。进一步研究发现，7^/#/^户 为周期特异性表达，提示7^/M^户高表达导致细胞周期调控异常和参与肿瘤 的发生发展。我们首次获得的抗TS/MDEP的抗体可用于监测细胞周期进程和 胃肠肿瘤的临床生物学行为。 附困说明
图1是筛选到差异表达cDNA片断A54-3， Northern blot预测其mRNA 全长，并通过RACE技术获得TS/MDEP基因的mRNA全长。
图2是制备的多克隆抗体可与原核表达的TS/MDEP蛋白质特异结合，说 明其具有4艮高的特异性。
图3是r5/M i"户基因在多种肿瘤细胞系中表达，并呈现周期特异性表达。 Gl/M期的mRNA表达水平高于G2/S期；而蛋白质水平在M期表达最高，随着 细胞分裂的完成，表达逐渐降低。
图4是/5ZM^户基因在组织中表达特征75ZM^P基因在mRNA和蛋白质 水平均呈现显著的差异性表达，胃肿瘤组织中表达而正常胃粘膜中不表达； 在多种胚胎组织中75/M7i^基因表达。
图5是抑制73/ytfflfi^基因表达对细胞形态和周期的影响。RNAi抑制 7^/M^户基因表达后，细胞形态发生明显的变化，细胞扁平、变大、出现巨 细胞、有突触样伪足出现，并且细胞出现G2/M期阻滞。
图6是7^/M^ 基因被千扰后抑制了细胞的增殖和成瘤能力。千扰后细 胞比对照增殖明显降低，而且软琼脂和棵鼠成瘤实验证实，千扰后细胞在体 内和体外的致瘤能力均显著降低。
具体实施例方式
下面结合
本发明的具体实施方式
。
材料方法 一'械絲
胃癌细胞系BGC823、 MGC803、 SGC7901 、 PAMC82、 MKN45、 SNU1、 SNU5、 SNU16、 RF1 、 RF48在5。/。胎牛血清DMEM培养基中培养，AGS、 N87和结肠癌 细胞系LOVO在10。/o胎牛血清DMEM培养基中培养，列腺癌细胞系PC-3，肝癌 细胞系BEL7421,乳腺癌细胞系MCF7，食管癌细胞系EC9706在10%胎牛血 清1640培养基中培养，培养基中均还有终浓度为100, 000 units/L青霉素 和100mg/L链霉素，在5%(:02中37。C培养。
二，狄財化
将胃癌细胞系BGC823以20%密度接种于若千个直径IOO咖培朱孤中，37 。C C02培养箱中培养24小时达对数生长期，在细胞密度为40%-80%时换2. 5mM TdR/DMEM条件培养基，继续在5°化02培养箱中培养18小时，然后弃掉 TdR条件培养基，用常规培养基洗一遍，加入常规培养基37"C培养6小时。 其后将培养亚放入本所细胞室自行研制的高压N20罐中，向罐中注入C02 400ml，将盖子密封。打开N20入口开关，放出上层伪气后，緩緩向管中充气， 在30分钟内使其压力达到0. 55MP，然后将&0罐放入37。C培养箱中放置18 小时，满18小时后将N20罐取出并放出N20。倒置显微镜下见大量(90%)变 圓，这些细胞为M期细胞，部分已经漂浮在培养液中，轻轻摇晃培养瓶，使 M期细胞悬浮于培养液中，吸出细胞培养液，离心后弃上清，收集的细胞即 为M期细胞。剩余M期细胞继续培养5小时后可收集G1期细胞。部分G1期 细胞换TdR条件培养基继续培养18小时。18小时后换常规培养基再继续培
养5小时即可收获S期细胞，S期细胞继续培养7小时后可收获G2期细胞。 收获的不同周期细胞用PROFILE n流式细胞仪(COULTER公司)检测。
采用酸性酚-异硫酸氰胍-步法提取Gl和S期的胃癌细胞系BGC823总 RNA，根据用于mRNA差异显示W^ ^Xr尸y^/zw W户ro/7/e( Genomyx Corporation H兌明书进行操作，具体如下，逆转录反应体系20jnl: DEPC-H20 8. 8 m 1， 5 x buffer 4. 0 ji 1，證p(250 ^iM) 2. 0 ji 1， DTT(100mM) 2. 0 p 1 ， DNase处理后的总RNA ( 0. 5 p g/m 1) l.Oy 1,3，锚定引物AP 2. 1， MMLV
(200u/|Lil) 0. 2jal;反应如下RNA加入3，锚定引物AP 70X:粹育5分 钟，立即插冰冷却，然后加入其它成分(DEPC-H20， dNTP， DTT， MMLV， buffer )， 42°C 5分钟，50°C 50分钟，70°C 15分钟，逆转录产物-20。C保存。DD-PCR 反应体系20jnl如下,8.2jil，10xbuffer 2. Opl'MgCh (25Mm) 1.2
jul， dNTP(250jaM) 1.6^1， 3，锚定引物AP(2. 5 nM) 2. 0 p 1， 5，锚定引 物arp (2. 5 m m) 2. 0 y 1， TaqE (5u/ p 1) 0. 2 n 1， rt-Mix 2. 0 n 1， [ cx -35S]Datp(12nci/y 1) 0.8jal， PCR程序95°C 2分钟，92°C 15秒，50°C 30秒，72°C 2分钟，4个循环，92°C 15秒，60°C 30秒，72°C 2分钟，25 个循环，72°C 7分钟，产物-20。C保存。DD-PCR产物6%聚丙烯酰胺凝胶电泳 配制6%聚丙烯酰胺凝胶，聚合过夜，加样前预电泳30分钟，温度55"C，电 压1760v，电流28mA，恒功率50W;样品6 m 1变性后上样，电泳4小时后揭胶， 80X:真空干燥2小时，进行放射自显影。在X光片上找到G1与S期差异表 达的cDNA片断，并切胶回收进行PCR再扩增，之后产物测序鉴定。见图1A， mRNA差异显示获得了 Gl/S期差异表达cDNA片断A54 - 3，此片断在Gl期高表 达。
坊,Ab"Ae/B W/of
提取的细胞系总RNA,依据OD值计算得到的浓度，取20yg总RNA,经 RNA变性胶分离，将电泳RNA胶用蒸馏水沖洗若干次去甲醛，10xSSC 100ml 摇洗l小时解链，用150ml 20xSSC做转移液，利用毛细宏吸作用将RNA转 移到硝酸纤维素膜，80X:于烤箱中烘干2小时；65。C杂交液中预杂交过夜， 杂交前标记探针如下取探针150ng加水(试剂盒提供)至30 n 1，置沸水中
变性5分钟后，迅速插水冷却，约三分钟后，依次加入以下试剂，Labeling 5 xbuffer 10jul， MixdA(G，T)TP 2 n 1 ， 10mg/ml BSA 2 m 1 ， ct-32P dCTP (50 in ci) 5 y 1， Klenow enzyme (5u/ pi) 1 y 1，混匀室温放置2小时，根据纯 化柱说明将探针纯化。标记的探针70。C变性，换新的杂交液10ml后加入变 性的探针，65。C杂交过夜。洗脱液洗脱后-70X:暴光2周显影。见图'1B，在 五林肿瘤细胞系中，证实均有r5/M^尸基因的表达，且其mRNA全长约4. Okb。
按说明TRIZOL提取肿瘤细胞系和组织总RNA，分光光度计定量，分别取5 jag总RM反转录，各加入O. 1 oligodT,加DEPC-treated H20至20 y 1, 70°C ， 10分钟变性，迅速插冰冷却，各加入5 x RT buffer 6 |u 1 ， dNTP 2 ju 1 (2.5raM)， RNase抑制剂0. 5m1 (40u/jh 1)，充分混匀，加入M-MLV逆转录酶 各lyl混匀，37。C孵育l小时，70°C 15分钟灭活，分装后-2(TC保存备用。 然后PCR扩增，所用引物，上游引物序列:5， -TGGCATCTTTACTGGACTGG-3， 下游引物序列5， -TGGCACCTCGTGGATAGAGC-3，，扩增片段长度为385bp， 包含SAGEtag 。PCR反应体系20 m L:歸15. 0 y 1 ， 10 x Buffer (含MgCl》 2.0ml， dNTP (2. 5 mM)0.5^1，上游引物(5mM)0. 5 m 1 ，下游引物(5 juM) 0. 5jil， TaqDNA聚合酶(5U/y L) 0. 5pl， DNA模板(100ng/jnL) 0. 5jul。 PCR扩增条件，^Mt如下95。C预变性2min30sec，循环反应程序为 94。C变性500sec，退火50sec; 72"C延伸50sec， 30 cycles,循环反应结束 后，72°C， 10min充分延伸，4。C保存，PCR产物行1. 2%琼脂糖凝胶鉴定。以 p-actin为内对照，Mock为阴性对照。见图3A和图4A，分别证实了， 75/M^ 基因在多种肿瘤细胞系中表达，并呈现细胞周期依赖性表达，RT-PCR证实 其mRNA表达在Gl/M期高于阿哥、Q/S期；在组织中证实此基因在多种胚胎 组织中表达，如胃、小肠、大肠等，最重要的是在配对的胃癌组织中证实 ri/M^户基因在胃癌组织中表达而配对的正常胃组织表达阴性。
六，
通过软件分析T/MDEP的亲水性区域和抗原表位性区域，参照使用多肽 制备抗体的一般原则，选择出三个肽段，分别位于蛋白质的N末端、中间段
和c末端。因为合成的多肽分子量较小，不能充分引发免疫反应，因此需要 选择合适的载体，增强其免疫原性。我们将合成的多肽连接到KLH上，通过 在新西兰白兔脊柱两側多点注射，第一次免疫，注射500ug多肽，以后剂量 减半，每周注射一次，共免疫四次。最后，取兔的全血，分离血清，分装保 存。釆用抗体纯化技术(CNBr-activated Sepharose 4B)将多抗纯化后，通 过免疫组化和Western blot验证多抗的特异性和检测TS/MDEP蛋白的表达特 征。见图2，原核表达并纯化后获得TS/MDEP蛋白质，并用质谱鉴定，与含 有抗TS/MDEP抗体的血清杂交后，证实我们多肽制备的抗体可与表达的全蛋 白特异性结合，因此，我们进一步采用亲和层析的方法，用原核表达的抗体 纯化血清中的抗体，显著的提高了抗体的特异性。
七，名瘦逸必
采用ABC法，细胞系滴片后2°/。甲醛固定，0. 3% HA甲醇室温IO分钟， PBS洗3次x5分钟。滴加一抗(l: 50)，湿盒4。C过夜，PBS洗3次x 5分 钟，滴加二抗l: 200稀释，室温孵育30分钟，PBS洗3次x5分钟，滴加三 抗l: 400稀释，室温孵育30分钟，PBS洗3次x5分钟，DAB-H202显色，镜 下控制3-5分钟，PBS漂洗，终止显色，苏木素复染45秒，1%盐酸酒精分色， 温热的自来水沖洗反蓝，95%和100%乙醇脱水各5分钟，二甲苯透明，中性 树胶封片。见图4C，使用纯化后的抗体对胃癌及正常组织制备的组织阵列进 行染色，证实，在胃的肿瘤组织中TS/MDEP蛋白表达，而正常胃组织中不表 达，统计数据见表2。
A， ffl^W^设杀Jt
用上述同样的引物，在BGC823中RT-PCR大量扩增TS/MEDP基因片断， 割胶回收纯化后，将此cDNA片断插入pGEM-T Easy载体T/A克隆(Promega )， 转化感受态DH5ot，小量提取质粒，测序鉴定。然后标记探针使用地高辛探 针标记试剂盒(Boehringer Mannheim公司产品)，根据说明书操作，将地高 辛标记在探针上，分别用RNA polymerase Sp6和RNA polymerase T7标记出 正义探针和反义探针，标记好的探针-20。C保存。按如下过程进行mRNA原位 杂交切片脱蜡，逐级乙醇回水，0. 2NHC1平衡切片，切片于2xSSC(预热) 70TC孵育15分钟，用DEPC处理的PBS液洗切片2分钟，切片于4% PFA(预 冷)中4X:平衡5分钟，用DEPC处理的PBS液洗切片2次，每次2分钟。切 片于2xSSC中平衡5分钟，在每张切片上加适量的预杂交液，湿盒7(TC孵 育8分钟再37。C l小时，2xSSC洗切片2次，每次2分钟。逐级乙醇脱水， 将探针加热到70。C加入到水冷的预杂交液中(按10ng/ n 1)，制备单链探针， 加200jnl杂交液在切片上，盖上盖玻片，湿盒43。C孵育过夜，切片滴加2 xSSC移去盖玻片，室温2xSSC洗切片20分钟，lxSSC洗20分钟，43。C 0.5 x SSC洗20分钟，室温0. 5 x SSC洗20分钟。切片于洗涤溶液平衡5分钟， 在每张切片上加封闭溶液稀释的绵羊血清(l:20用封闭溶液配置)，湿盒室 温赙育20分钟，弃去封闭液，在每张切片上加封闭溶液稀释的碱性磷酸酶抗 地高辛抗体(1:500 )，湿盒室温孵育1小时或4X:过夜，，弃去抗体液，切 片于洗涤溶液中洗2次，每次15分钟，切片于底物溶液中平衡5分钟，在每 张切片上加新鲜配制的彩色溶液，湿盒室温孵育，避光半小时，当染色理想 时，用终止溶液终止反应，将终止溶液冲洗后，逐级乙醇脱水、封片(地高 辛核酸检测试剂和亦为Boehringer Mannheim公司产品)。见图4B，在包含 大样本的组织阵列中，采用不同的方法再次证实T5/M^尸基因的mRNA在胃 癌组织中表达，而在正常胃粘膜中表达阴性。以正义探针为对照，证实我们 选择的探针有很好的特异性。统计数据见表l。
使用SMART RACE cDNA Amplification Kit( CL0NTECH)进行5'末端和 3'末端RACE，具体过程按使用说明提取胃癌细胞系BGC823的总RM，变性胶 电泳鉴定，将m飄分别反转录成5'-RACE-Ready c腿和3 -RACE-Ready c應， 均釆用巢式PCR， 5'RACE ^f吏用的引物GSP1: GGATCGGTCCCCTCGTCCACCCG， NGSP1: CCCACGGCGACAATAGCGACTACTT, PCR反应体系50 yl: 5-RACE-Ready cDM 2.5jnl，UPM(10x) 5yl，GSPl(或者NGSPl) lnl,MasterMix 41.5 jliI， PCR反应程序95"C 3分钟充分变性，95°C 2分钟，退火温度梯度62 °C， 63. 4t:， 64. 4°C 50秒，延伸72°C 50秒，共扩增30个循环，充分延 伸72°C IO分钟;3'RACE4吏用的引物:GSP2: TCCCAGCACTTGAGGCCAGGAGT, PCR 反应体系50jnl: 3'-RACE-Ready cDNA 2.5yl， UPM(10x) 5jnl， GSP2 1 jul， Master Mix 41.5jnl， PCR反应程序95°C 2分钟充分变性，95°C 1
分钟30秒，退火温度梯度56°C， 58. 4°C， 60°C 50秒，延伸72°C 50秒，共 扩增30个循环，充分延伸72t: IO分钟。将扩增的片断切胶回收纯化，T/A 克隆后测序验i正。见图1C，D,通过RACE寸支术，得到了 TS/MDEP mRNA的全长 (3877bp)，其包含了 5，端的G-Caping结构，3，端的加尾信号，此mRNA 包含了 一个完整的CDS (编码序列)，并且在翻译起始位点含有Kozak序列。 十一，細f挽
根据s iRNA乾序列设计的共同标准及ps iRNA-hHlneo质粒特征应用软件 s iRNA Wizard v2. 4设计TS/MDEP基因的寻把序列，选择TS/MDEP基因cDNA 上符合条件的3段序列并经BLAST分析排除同源序列，根据质粒说明，设计 合成发夹结构，退火形成双链结构，末端带有BbsI酶切的酶切位点，之后与 BbsI酶切后的ps iRNA-hHlneo质粒连接，转化细菌，抗生素筛选后，挑取克 瘗，测序鉴定后，大提质粒分装-70。C储存。转染胃癌肿瘤细胞系BGC823, 錄小时加选择性培养基(400ng/ml G418)，每3天换液，缔选69天后，挑 取单克隆，每个片断挑取6个扩大培养，然后提取RNA和蛋白质，进行RT-PCR 和Western blot验证，证实3c克隆中TS/MDEP基因被干扰，并且观察细胞 形态，MTT证实TS/MDEP基因被干扰生后细胞生长状况，及细胞流式检测细 胞周期改变，软琼脂集落形成实验观察细胞集落形成能力，以及棵鼠致瘤实 验观察TS/MDEP基因被干扰生后细胞致瘤性的变化。见图5、 6， RNAi抑制 T^/M^户基因表达后，细胞形态发生明显的变化，细胞扁平、变大、出现巨 细胞、有突触样伪足出现，并且细胞出现G2/M期阻滞；ri/M^户基因被干扰 后抑制了细胞的增殖和成瘤能力，干扰后细胞比对照增殖明显降低，而且软 琼脂和棵鼠成瘤实验证实，干扰后细胞在体内和体外的致瘤能力均显著P务低。
附
表1 ，原位杂交证实TS/MDEP基因在胃正常勦膜和胃癌中存在差异表达。
Histology
TS/MDEP expression
Positive
Nafdvc
Total f sises
Tnmor Normal
53 (53%) 0
47(47%) 20 (100°/o)
100 20
X2fe沐p<0.01
表2，免疫组织化学证实TS/MDEP基因在胃正常黏膜和胃癌中存在差异表达。
Histology
IS'^MDEF expression
Positive
N*gtiv
Total c s
Tumor Noinud
20 (48.7%)
0
21(5L3°b)
8 (100%>
41
X 2 test, ps0.0权利要求
1、抗肿瘤特异性标志蛋白TS/MEDP的抗体制备，其特征在于克隆了一个新的肿瘤相关基因TS/MDEP并提交到Genebank，接受号为(DQ150361)，证实为细胞周期和肿瘤特异性表达，并且制备了具有高度特异性的抗体。
2、 抗TS/MDEP的抗体的用途，其特征在于该抗体可以用Western blot和 免疫组织化学检测细胞和组织中TS/MDEP蛋白的表达水平。
3、 根据权利要求2所述的抗TS/MDEP的抗体的用途，其特征在于在多种 细胞系TS/MDEP蛋白质呈现周期依赖性表达，即在M期表达最高，随着细胞 分裂的完成，其表达水平逐渐降低。
4、 根据权利要求2所述抗TS/MDEP的抗体的用途，其特征在于TS/MDEP 蛋白可能成为肿瘤诊治的分子靶标。
全文摘要
本发明公开了抗肿瘤特异性标志蛋白TS/MEDP的抗体制备及用途。利用分子细胞生物学技术，在胃癌细胞中克隆出一个新基因，命名为TS/MDEP。制备了抗TS/MDEP的多克隆抗体，通过抗体纯化技术获得了高特异性抗体。从mRNA和蛋白质水平验证了TS/MDEP基因在肿瘤细胞系和组织中的表达特征，确定其在包括胃癌细胞系在内的14株肿瘤细胞系中表达，并呈现细胞周期依赖性，在胃癌、乳腺癌和宫颈癌组织中过量表达而相应正常组织不表达，且在多种胚胎组织中表达。证实了TS/MDEP在细胞增殖旺盛的胚胎组织中高表达，成年后此基因被关闭，在肿瘤细胞中又出现高表达。TS/MDEP为周期特异性表达，提示TS/MDEP高表达导致细胞周期调控异常和参与肿瘤的发生发展。首次获得的抗TS/MDEP的抗体可用于监测细胞周期进程和胃肠肿瘤的临床生物学行为。
文档编号C07K16/18GK101168566SQ20061015009
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月26日 优先权日2006年10月26日
发明者吕有勇, 李文梅, 梁云燕, 樊晓军, 王代树, 许小青 申请人:北京市肿瘤防治研究所