分子及其嵌合分子的制作方法

专利名称：分子及其嵌合分子的制作方法
技术领域：
本发明概括地涉及蛋白质学、诊断学、治疗学和营养学。尤其是，本发明提供了分 离的蛋白质分子，该分子属于短链4螺旋束超家族(4helix bundle superfamily)或与短 链4螺旋束超家族相关，如GM-CSF、IL-3、IL-4和IL-5及包含该蛋白质分子的至少一部分 的嵌合分子例如GM-CSF-Fc、IL-3-FC、IL-4-Fc和IL_5_Fc。其中该蛋白质或其嵌合分子具 有可测量的参数特征，其中特征表示、关联于一个或多个药理学特性或形成一个或多个药 理学特性的基础。本发明进一步设想将分离的蛋白质或其嵌合分子用于诊断、预防、治疗、 营养和/或研究应用范围内。
背景技术：
本说明书中涉及的任何现有技术不被，也不应该被理解为是对现有技术形成普遍 的常识的一部分的一种认可或任何形式的提示。细胞因子和生长因子在造血过程中的多种作用。血细胞的增殖、分化及发育都 受到它们的调控。此外，多种因子还在免疫过程中发挥主要作用，如刺激白细胞的吞噬作 用和细胞毒性作用、促进其它细胞因子产生等。参与造血过程的细胞因子和生长因子包括 GM-CSF、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素4(IL-4)及白细胞介素5 (IL-5)。这些细胞因子 均属于短链4螺旋束超家族成员。GM-CSF作为一种糖蛋白可参与造血、细胞迁移及免疫过程。该因子对粒细胞和巨 噬细胞祖细胞的生长和发育有显著影响。在红系祖细胞和巨核细胞祖细胞的分化过程中 GM-CSF与EP0协同作用。GM-CSF可刺激中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及单核细胞系的增殖、 分化与吞噬作用，还可刺激嗜酸性粒细胞的细胞毒性作用。GM-CSF还通过上调MHCII表达 促进抗原递呈细胞的作用并刺激促炎性细胞因子的产生。而目前重组人GM-CSF在临床上 的使用主要是基于其骨髓增生的作用。它主要被用于急性骨髓性白血病及急性淋巴母细胞 型白血病等多种白血病，还与肿瘤化疗药物合用于如白细胞减少症、中性粒细胞减少症等 多种疾病。人IL-3是一种以单体形式存在的、含两个N段糖基化位点的糖蛋白。IL-3主要由 活化T细胞产生，可在单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、肥大细胞、内皮细胞、角化细胞中检测 到。IL-3最早是作为肥大细胞生长因子被克隆。然而，随后的研究发现IL-3具有促进骨髓 系、嗜酸性细胞系及巨核细胞系祖细胞增殖、成熟与存活等多种作用。IL-3是造血干细胞体 内、外作用的主要因子，还可促进其它克隆刺激因子受体的表达。它可通过刺激巨噬细胞和 增加IL-1、IL-6、TNF的分泌促进吞噬作用。IL-3可刺激肥大细胞产生组胺，并诱导嗜碱性 粒细胞表达补体C3a受体。IL-3还被发现能趋化嗜酸性白细胞，使血小板水平和中性粒细 胞水平增加。IL-3在临床上的应用前景主要基于其维持造血干细胞存活、增殖等作用。因 此它可单独或与其它生长因子，如GM-CSF和G-CSF，联合应用于MDS等骨髓功能异常性疾病 以及外周血细胞减少、贫血、白细胞减少症、血小板减少症等。人IL-4是一种结构上与GM-CSF、M-CSF及生长激素相关的糖蛋白。IL_4可促进胸腺细胞的增殖与成熟、上调T细胞抗原(⑶3、⑶5及TCR)的表达。此外，IL-4还可调节 B细胞分化与受到活化刺激后的变构。在非白细胞中，IL-4作为一种纤维母细胞的化学诱 导因子，刺激表皮纤维母细胞分泌胶原、纤连蛋白等细胞外基质蛋白。IL-4还刺激内皮细胞 表达血管细胞粘附分子1 (VCAM-1)，从而增加内皮细胞对T细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒 细胞的粘附。IL-4还可在体外直接抑制多种肿瘤细胞的生长，如结肠癌、人肾癌、恶性黑色 素瘤及乳腺癌。人IL-5是一种同型二聚体糖蛋白，主要由T淋巴细胞和肥大细胞产生，还可由嗜 酸性粒细胞、自然杀伤细胞和内皮细胞较少生成。IL-5体内的主要作用是促进是嗜酸性粒 细胞的生成、存活、分化与活化，并刺激其脱颗粒。这些作用主要发生于对寄生虫感染的免 疫应答和变态反应过程中。有研究表明IL-5具有促进嗜酸性粒细胞的特异性，该研究是 IL-5能中和寄生虫感染后刺激产生的嗜酸性粒细胞抑制性抗体。此外，IL-5还被发现其可 通过膜干扰、延长、颗粒定位及增加氧化代谢等方式激活嗜酸性粒细胞。还有报道称IL-5 具有对嗜酸性粒细胞的趋化作用，还能刺激嗜碱性粒细胞产生组胺。蛋白质通过与它们各自的结合蛋白的相互作用发挥生物效应因子功能，这表明短 链4螺旋聚体超家族各成员以及与之相关的蛋白，与各自的配体及受体具有作为调节生理 学过程的治疗因子的显著的潜力。然而，分子的较小的变化例如一级、二级、三级或四级结 构和共翻译或翻译后修饰模式可能对蛋白的活性、分泌、抗原性和清除产生显著的影响。因 此，可能蛋白可以产生特殊的一级、二级、三级或四级结构，或共翻译或后翻译后结构或装 配，其赋予蛋白独特的或显著的有用特性。因此，有必要评估在不同产生条件下的蛋白的生 理学特性以确定是否其具有有用的生理学特征或其他药理学特性。迄今为止，问题在于商业上可利用的蛋白质的生产是在与人进化远缘的种类来源 的细胞中进行的，细胞例如细菌、酵母、真菌和昆虫。这些细胞表达蛋白质缺乏糖基化作用 或呈现不同于人细胞的糖基化所有组成成分并且其实质上影响了它们在临床上的应用。例 如，在酵母或真菌系统例如曲霉中表达的蛋白质具有高密度甘露糖，造成蛋白在治疗上无 效(Herscovics et al. FASEB J 7 :540_550，1993)。即使在非人哺乳动物表达系统例如中国仓鼠卵巢(CH0)细胞，已经证明在糖基 化模式上与人细胞相比有显著差别。例如，大多数哺乳动物，包括啮齿类，表达酶(al，3) 半乳糖转移酶，其在糖蛋白上产生Gal(a l，3)_Gal(日l，4)_GlcNAc寡糖。然而在人、猿 和旧大陆猴中，该酶的表达通过基因的移码突变灭活。(Larsen et al. JBiol Chem 265 7055-7061，1990)尽管大多数CHO细胞系用于重组蛋白质合成，例如Dux_Bll，已灭活基因 表达(a 1，3)半乳糖转移酶，它们仍缺少功能性(a2，6)唾液酸转移酶以用于在人类细胞 中存在的(a 2，6)-连接末端唾液酸的合成。进一步，表达糖蛋白的CH0细胞中存在唾液酸 基序倾向于被CH0细胞内源的唾液酸酶分解(Gramer etal. Biotechnology 13(7) :692_8， 1995)。结果，由这些非人表达系统生产的蛋白表现出与人细胞衍生蛋白质不同的理化和药 理学特性例如半衰期、抗原性、稳定性和功能性效应。最近的干细胞技术的进步实质上增强了利用干细胞应用于例如移植治疗、药物筛 选、毒理学研究和功能基因组学的潜力。然而，干细胞在包括非人蛋白质的培养基中常规 维持，由于非人传染性物质污染的可能性，因此不适用于临床应用。进一步，在非人衍生介 质中的干细胞培养可能导致引入非人碳水化合物部分因此危害移植应用。(Martin et alNature Medicine 11 (2) =228-232, 2005) 0因此，特殊的人衍生蛋白质在干细胞的维持和/ 或分化中的使用将改善异基因蛋白质的引入并增加干细胞的临床应用。相应地，有必要发展蛋白质和它们的受体，其具有特殊的所期望的理化和药理学 特征以用于诊断、预防、治疗、营养和/或研究应用，并且本发明提供了属于或者相关于短 链4螺旋束超家族的蛋白质用于临床、商业和研究应用。发明概述在整个说明书中，除非特别说明，术语“含有”或其变体例如“具有”或“包含”，将 被理解为暗示包括所述要素或全部、或要素的组或整体的组，但是不排除任何其他的要素 或全部。核苷酸和氨基酸序列表示为序列标识号(SEQ ID NO )。这些SEQ IDN0 在数字上 对应序列标识号<400>1 (SEQ ID NO 1), <400>2 (SEQ IDN0 2)，依此类推。表1显示的是序 列识别号的摘要信息。序列列表在权利要求后给出。本发明概括地涉及具有理化参数特征的属于或相关于短链4螺旋束超家族的分 离的蛋白质或其嵌合分子，其中所述的特征表示、关联于一个或多个特征性的药理学特性 或形成一个或多个特征性的药理学特性的基础。特别是本发明提供的分离的蛋白质或其嵌 合分子选自 GM-CSF、GM-CSF-Fc、IL-3、IL_3_Fc、IL-4、IL_4_Fc、IL-5 和 IL_5_Fc，其具有包 括多个可测量的理化参数的理化特征{[PJi、[PJ2、 [Pjn、}，其中Px表示可测量的理化 参数且“n”是彡1的整数，其中介于并包括在斤丄到[&] 之间的参数各自为不同的可测 量的理化参数，其中任一个或一个以上的可测量的理化特性的值表示、关联于一个特征性 的药理学特性Ty的基础或者一系列特征性的药理学特性{[TyLJTyL、.... [Ty]J或形成一 个特征性的药理学特性Ty的基础或者一系列特征性的药理学特性{[^、[^、.... [Ty]J 的基础，其中Ty表示一个特征性的药理学特性且m是彡1的整数，其中[Ty]jlj [Ty]m为不 同的药理学特征。这里的术语“特征性的”涉及蛋白质或其嵌合分子的药理学特性，在本发明中是指 蛋白质或其嵌合分子的一个或者多个区别于其它特征性的理化特性的药理学特性。具体 地说，分离蛋白或其嵌合分子的一个或者多个药理学特性与在原核细胞或低等真核细胞甚 至非人的高等真核细胞产生的相同蛋白的特性不同或有相对区别。在另外的具体实施方案 中，作为目标的分离的蛋白或其嵌合分子的药理学特征有助于实现某项功能。这里的术语 “可测量的理化参数”或Px表示分离蛋白或其嵌合分子的一个或多个可测定的特性。在本 发明的一个具体实施方案中，作为目标的分离的蛋白或其嵌合分子的可测量的理化特性或 有助于或者产生了药理学特性Ty。本发明的分离的蛋白质或嵌合分子具有理化参数(Px)，该参数用于完整地定义 蛋白质分子蛋白质分子或嵌合分子。该理化参数可以选自表观分子量(PD、等电点(Pi) (P2)、同工型数(p3)、不同同工型数的相对强度(p4)、糖类重量百分数(P5)、N-连接寡糖去 糖基化后的实测分子量(p6)、N-连接的和0-连接的寡糖去糖基化后的实测分子量(P7)、 酸性单糖含量的百分比(P8)、单糖含量(P9)、唾液酸含量(P1C1)、硫酸盐和磷酸盐含量(Pn)、 Ser/Thr :GalNAc比例(P12)、N-连接寡糖的中性百分比(P13)、N-连接寡糖的酸性百分比 (P14)、0-连接寡糖的中性百分比(P15)、0-连接寡糖的酸性百分比(P16)、N-连接寡糖的比 例(P17)、0-连接寡糖的比例(P18)、N-连接寡糖成分的结构(P19)、0-连接寡糖成分的结构(P2。)、N_连接寡糖的位置和构成(P21)、0_连接寡糖的位置和构成(P22)、共翻译修饰(P23)、 翻译后修饰(P24)、酰化(P25)、乙酰化(P26)、酰胺化(P27)、脱酰胺(P28)、生物素酰化(P29)、氨 甲酰化(P30)、羧化(P31)、脱羧(P32)、二硫键形成(P33)、脂肪酸酰化(P34)、十四烷酰化(P35)、 十六烷酰化(P36)、十八烷酰化(P37)、甲酰化(P38)、糖化(P39)、糖基化(P4CI)、糖磷脂酰肌醇锚 定(P41)、羟基化(P42)、硒代半胱氨酸的结合(P43)、脂质(P44)、硫辛酸的加成(P45)、甲基化 (P46)、N或C端封闭(P47)、N或C端移除(P48)、硝化(P49)、甲硫氨酸氧化(P50)、磷酸化(P51)、 蛋白酶酶切(P52)、异戊烯化(P53)、法尼基化(P54)、栊牛儿基化(P55)、磷酸吡哆醛加成(P56)、 唾液酸化(P57)、去唾液酸化(P58)、硫酸盐化(P59)、泛素化(P6。)、泛素样分子的加成(P61)、一 级结构(P62)、二级结构(P63)、三级结构(P64)、四级结构(P65)、化学稳定性(PJ、热稳定性 (P67)。这些参数的特征在表2中提供。 在一个具体的实施方案中，用理化参数(Px)和药理学特性(Ty)的特征来表征本发 明的 GM-CSF，其包括 5-60 的表观分子量(Pi)，如:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、56、57、58、59、60，在一个具体实施方案中 为 16-40kDa。本发明的 GM-CSF 的等电点 pi (P2)为 1-10，如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，并且 在一个具体实施方案中为2-7 ；具有约1到36个同工型(isoform)，如1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36个同工型，在一个具体实施方案中，同工型个数(P3)为10-30。本发明的GM-CSF糖 类重量百分比(P5)为 1 至 99 之间，如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99，在一个具体的实施方案中为0_76%，在其他具体的实施方案中为 0-65%。在去除N-连接寡糖后的实测分子量(P6)为15-30kD，在一个具体的实施方案中为 15-2kD。去除N-连接和0-连接寡糖后的的实测分子量(P7)为14-25kD，在一个具体的实施 方案中为14_20kD。本发明的GM-CSF所含酸性单糖百分比(P8)为2至2 0%如2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20%，在一个具体的实施方案中为 6-11 %。以 GalNAc为标准，本发明的GM-CSF的单糖(P9)及唾液酸(P1C1)的含量百分比为1 0_3海藻 糖，1 1-16 GlcNAc、0. 1 0.1-9 半乳糖、1 0.1-9 甘露糖，及 1 0-5 NeuNAc，在具体 的实施方案中为 1 0.1-1. 5 海藻糖、1 2-12 GlcNAcU 1.0-6. 0 半乳糖，1 1.0-6.0 甘露糖及1 0-3.0 NeuNAc ；用3倍甘露糖为标准，为3 0-5海藻糖，3 0.1-3 GalNAc、 3 2-15 GlcNAc，3 1-6甘露糖，及3 0_4NeuNAc，在具体的实施方案中为3 0.1-2.5 海藻糖、3 0.5-2.5 GalNAc,3 5. 0-10. 0 GlcNAc、3 2. 0-5. 0 甘露糖及 3 0-3.0 NeuNAc。N-连接寡糖的中性百分比(P13)约为 40 至 90%，如 40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90%，在具体的实施方案中为 49 至83%、在具体的实施方案中为54至78%，在具体的实施方案中为59至73 %。N-连接寡 糖的酸性百分比(P14)约为10%至70%，在具体的实施方案中为17%至51%，在进一步具 体的实施方案中为22%至46%，在具体的实施方案中为27至41%。0-连接寡糖的酸性百分比(P15)约为 5 至 90%，如 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、
49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、
74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90%、在一个具体的实施方案中为 9至82%，在具体的实施方案中为29至62%，在具体的实施方案中为34至57%。0-连接 寡糖的酸性百分比(P16)约为10至100%，在具体的实施方案中为18至91%，在具体的实 施方案中为38至71%，在具体的实施方案中为43至66%。本发明的GM-CSF的N-连接糖 基化(P21)包括N-44和N-54 (从信号序列起始处编号)，于PNGase处理后用PMF鉴别。本 发明的GM-CSF在血清/血浆中的稳定性(T1CI)不同于非人细胞中所表达人GM-CSF。尤其 是与E. coli中表达的人GM-CSF相比，用小牛血清孵育24小时后，在TF-1表达的本发明的 GM-CSF表现出更强的促增殖活性。本发明的GM-CSF的增殖能力(T32)不同于非人细胞中表达的人GM-CSF，具体地， 本发明的GM-CSF增殖活性(T32)强于非人细胞中所表达的人GM-CSF。本发明的GM-CSF分 化能力(T33)不同于非人细胞中表达的人GM-CSF，与E. coli中表达的GM-CSF相比，前者具 有更强的诱导TF-1细胞克隆形成的能力。在具体的实施方案中，用一个或多个理化参数(Px)和药理学特性(Ty)的特征来 表征本发明的本发明的IL-3，其包括1至250 kD的表观分子量(PD，如1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、 180、190、200、210、220、230、240、250 kDa，在具体的实施方案中为 15 至 35kDa。IL-3 分子的 pI(P2)为 2 至 14，如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在具体的实施方案中为 3. 5-7. 5， 具有约 2 至 50、如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 个同工型，在具体的实施方案中为5-15个同工型(P3)。IL-3分子的糖类百分比(P5)为
0至 99 %，如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、
50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、
75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%, 在具体的实施方案中为0至60%。N-连接寡糖去除后，本发明的IL-3的实测分子量(P6) 为10和25kDa。当以GalNAc为标准，IL-3寡糖含量(P9)为1 0. 1-8海藻糖，1 0. 1-7 GlcNAc,l 0.1-3半乳糖，1 0.1-3甘露糖及1 0-5 NeuAc ；在一个具体的实施方案中为
1 2-6海藻糖，1 3-5 GlcNAc, 1 0.5-2半乳糖，1 0.5-2甘露糖及 1 0-2 NeuNAc ；当 用 3 倍甘露糖为标准，为 3 2-25 海藻糖，3 0.1-6 GalNAc, 3 4-21 GlcNAc, 3 0.1-9 半乳糖，及3 0-5 NeuAc ；在一个具体的实施方案中为3 5-16海藻糖，3 2-4GalNAc, 3 9-14 GlcNAc,3 3-6半乳糖及3 0.1-2 NeuAc。本发明的IL-3分子唾液酸含量表 示为占单糖的百分比(P1Q)，其为 0 至 50%，如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50%，在一个具体的实施方案中为0至20%。本发明的11^-3 的N连接寡糖中性百分比(P13)为70至100%，在一个具体的实施方案中为75至95%，在 具体的实施方案中为80至90%。本发明的IL-3的N连接IL-3寡糖酸性百分比(P14)为 0至30%，在一个具体的实施方案中为5至25%，在具体的实施方案中为10至20%。本发 明的IL-3的免疫反应特性(T13)与非人细胞中表达的人IL-3不同，尤其是用含有非人细胞 表达的人IL-3的ELISA试剂盒检测时，本发明的IL-3的蛋白浓度被低估。此外，本发明的 IL-3的(T13)与昆虫细胞中表达的人IL-3不同。本发明的IL-3的增殖能力(T32)不同于非 人细胞中表达的人IL-3。本发明的IL-3的增殖能力(T32)强于非人细胞中表达的人IL-3。
在具体的实施方案中，以一个或多个理化参数(Px)和药理学特性(Ty)表征本发明 的 GM-CSF，其包括表观分子量(PD，其值为 5 至 60，如 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、
42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60，在一个具体的实施方案 中为 16-40kDa。本发明的 GM-CSF 的 pi (P2)约为 1 至 10，如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、在一 个具体的实施方案中为2-7，包括至少1至36个同工型如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36，在一 个具体的实施方案中为10-30个同工型(P3)。本发明的GM-CSF糖类百分比(P5)为1至99， 如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、在一个具体的实 施方案中为0-76%，更具体的实施方案中为0-65%。N-连接寡糖去除后，该分子实测分子 量为(P6)10-35kDa，在一个具体的实施方案中为12-30kDa。N-连接和0-连接寡糖去除后 实测分子量(P7)为9-30kDa，在一个具体的实施方案中为11至25kDa。本发明的GM-CSF的 酸性单糖百分比(P8)为 2 至 20%如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20%，在一个具体的实施方案中为6-11%。当以GalNAc为标准，本发明的GM-CSF的单糖 (P9)和唾液酸含量(P1Q)为 1 0-3 海藻糖，1 l-16GlcNAc、0. 1 0.19 半乳糖，1 0.1-9 甘露糖及1 0-5 NeuNAc，在一个具体的实施方案中为1 0. 1-1. 5海藻糖，1 2-12 GlcNAcU 1.0-6. 0 半乳糖、1 1. 0-6. 0 甘露糖，及 1 0-3.0 NeuNAc ；当用 3 倍甘露 糖为标准，则为 3 0-5 海藻糖，3 0.1-3 GalNAc, 3 2-15 GlcNAc、3 1-6 半乳糖， 3 0-4 NeuNAc，在一个具体的实施方案中为3 0.1-2. 5海藻糖、3 0.5-2.5 GalNAc, 3 5.0-10.0 GlcNAc，3 2. 0-5. 0 半乳糖，及 3 0-3. ONeuNAc。N 连接寡糖(P13)中性 百分比为 40 至 90%，如 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、 59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、 84、85、86、87、88、89、90%、在一个具体的实施方案中为49至83%，在具体的实施方案中为 54为78%，更具体的实施方案中为59至73%。N-连接连接的酸性百分比(P14)为10%至 70%，在一个具体的实施方案中为17%至51%，在具体的实施方案中为22%至46%，更具 体的实施方案中为27至41%。0连接的寡糖中性百分比(P15)为5为90%，如5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90%、在一个具体的实施方案中为9至82%，在具体的实施方案中为29至 62%，更具体的实施方案中为34至57%。0-连接寡糖的酸性百分比(P16)约为10至100%， 在一个具体的实施方案中为18至91%，在具体的实施方案中为38至71%，更具体的实施 方案中为43至66%。本发明的GM-CSF N-连接糖基化位点(P21)包括N-44和N-54(由信 号序列起始处开始编号)，这些位点由PNGase处理后PMF识别。本发明的GM-CSF的血清/ 血浆稳定性(T1Q)与非人细胞中表达的人GM-CSF不同，尤其是在用胎牛血清孵育TF-1 24 小时后，前者比E.coli中表达的GM-CSF表现出更强的增殖活性。本发明的GM-CSF增殖 活性(T32)不同于非人细胞中表达的GM-CSF，本发明的GM-CSF增殖活性(T32)强于E. coli 中表达的人GM-CSF约5-12倍。其分化活性(T33)也与非人细胞中表达的GM-CSF不同，与 E. coli表达的GM-CSF相比，前者诱导TF-1克隆形成的能力强1. 5-2倍。
在具体的实施方案中，本发明的IL-3分子以一个或多个理化参数(Px)和药理学 特性(Ty)为特征，包括表观分子量( 1)，其值由1至250、如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、 200、210、220、230、240、250kDa，在具体的实施方案中为 15 至 35kDa。IL-3 的 pi (P2)为 2 至 14，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在具体的实施方案中为3. 5-7. 5，具有约 2 至 50、 如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 个同工型，在 具体的实施方案中为5-15个同工型(P3)。IL-3分子糖类百分比(P5)为0至99%，如0、1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%，在具体的实施方案中 为0至60%。N-连接寡糖去除后，本发明的IL-3的实测分子量为(P6)为8-30kDa，在具体 的实施方案中为10-25kDa。当以GalNAc为标准，IL-3的单糖含量(P9)为1 0. 1_8海藻 糖，1 0.1-7 GlcNAc，l 0.1-3 半乳糖，1 0. 1-3 甘露糖及 1 0-5 NeuAc ；在一个具体 的实施方案中为1 2-6海藻糖，1 3-5GlcNAc,l 0. 5-2半乳糖，1 0. 5-2甘露糖及 1 0-2 NeuNAc ；当用 3 倍甘露糖为标准，为 3 2-2 5 海藻糖，3 0. 1-6 GalNAc, 3 4-21 GlcNAc,3 0.1-9半乳糖，及3 0-5 NeuAc ；在一个具体的实施方案中为3 5_16海藻 糖，3 2-4 GalNAc, 3 9-14 GlcNAc、3 3-6 半乳糖及 3 0.1-2 NeuAc。本发明的 IL-3 分子唾液酸占单糖百分比(P10)为 0 至 50%、如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50%，在一个具体的实施方案中为0至20%<^连接寡糖 中IL-3性百分比(P13)为70至100%，在一个具体的实施方案中为75至95%，在具体的实 施方案中为80至90%。本发明的IL-3分子的N连接寡糖酸性百分比(P14)为0至30%， 在一个具体的实施方案中为5至25%，在具体的实施方案中为10至20%。本发明的IL-3的免疫反应特性(T13)与非人细胞中表达的人IL-3不同，尤其是用含有用非人细胞表达的 人IL-3的ELISA试剂盒检测时，本发明的IL-3的蛋白浓度被低估。此外，本发明的IL-3 的免疫反应特性(T13)与昆虫细胞中表达的人IL-3不同。本发明的IL-3的增殖能力不同 于在非人细胞中表达的人IL-3，本发明的IL-3的增殖能力(T32)较E. coli表达的人IL-3 强 1. 1-2. 5 倍。在具体的实施方案中，本发明的IL-4分子以一个或多个理化参数(Px)和药理学 特性(Ty)为特征，包括表观分子量汜)，其值由1至120、如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、14、105、106、107、108、 109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120kDa，在具体的实施方案中为 12 至 24kDa。IL-4 的 pi (P2)为 2 至 14，如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在具体的实施方 案中为 8-11，具有约 2 至 50、如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、
46、47、48、49、50个同工型，在具体的实施方案中为1_3个同工型(P3)。IL-4分子糖类百分 比(P5)为 0 至 99%，如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、
22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、
47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99%，在具体的实施方案中为0至25%。N-连接寡糖去除后，本发明的IL-4的实测 分子量为(P6)8-24kDa，在具体的实施方案中为10至20kDa。而当0-连接及N-连接寡糖 均去除后，检测到的IL-4分子量(P7)为8-22kDa，在一个具体的实施方案中为10_18kDa。 本发明的IL-4的N连接的寡糖中性百分比(P13)为50%-100%，在一个具体的实施方案 中为65-100%，在具体的实施方案中为70-100%。本发明的IL-4N连接寡糖酸性百分比 (P14)为0-50%，在具体的实施方案中为0-45%，在具体的实施方案中为0-30%。本发明的 IL-4N-连接糖基化位点(P21)包括N-62 (由信号序列起始处开始编号)，用PNGase处理后通 过 PMF 识别。二硫化骨架结构(P33)包括 Cys27-Cysl51、Cys48-Cys89 及 Cys70_Cysl23(由 信号序列起始处开始编号半胱氨酸残基)。在具体的实施方案中，本发明的IL-4的免疫反应特性(T13)与非人细胞中表达的 人IL-4不同，尤其是用含有非人细胞系统表达的人IL-4的ELISA试剂盒检测时，本发明的 IL-4的蛋白浓度被低估。本发明的IL-4的增殖活性(T32)不同于非人细胞系统表达的人 IL-4、与E. coli表达的人IL-4相比，本发明的IL-4增殖活性(T32)高25-54倍；与CH0细 胞表达的人IL-4相比，本发明的IL-4增殖活性(T32)高1.75倍。用升高的温度预孵育后， 本发明的IL-4增殖活性(T32)也与非人细胞系统表达的人IL-4不同。用培养基37°C下预 孵育TF-1细胞4天后，本发明的IL-4的(T32)值较E. coli表达的GM-CSF高13-30倍。在具体的实施方案中，本发明的IL-5分子以一个或多个理化参数(Px)和药理学 特性(Ty)为特征，包括表观分子量(PD，其值由1至250，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、 200、210、220、230、240、250kDa，在具体的实施方案中为 15 至 25kDa。IL-5 的 pI(P2)为 2 至 14，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在具体的实施方案中为4-9，加上约2-50个，如
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、
30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个同工型，在具体 的实施方案中为5-12个同工型(P3)。I L-5分子的糖类百分比(P5)为0至99%，如0、1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、
31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%，在具体的实施方案中 为10-50%。N-连接寡糖去除后，本发明的IL-5实测分子量(P6)为9-30kDa，在具体的实 施方案中为ll_25kDa。而当0-连接及N-连接寡糖均去除后，检测到的IL-5分子量(P7) 为8-27kDa，在一个具体的实施方案中为10-22kDa。当以GalNAc为标准，本发明的IL-5的 单糖含量(P9)为 1 0.1-3 海藻糖，1 0. 5-7GlcNAc，l 0. 05_3 半乳糖，1 0. 1-3 甘露 糖及1 0-5 NeuAc ；在一个具体的实施方案中为1 0-0. 5海藻糖，1 2-4.5 GlcNAc， 1 1-2半乳糖，1 1-2甘露糖及1 0.1-1 NeuNAc ；当用3倍甘露糖为标准，为3 0.1-3 海藻糖，3 0. 1-4 GalNAc, 3 1-17 GlcNAc, 3 1-8 半乳糖，及 3 0-5 NeuAc ；在一个 具体的实施方案中为3 0-1海藻糖，3 2-3 GalNAc, 3 3_12GlcNAc、3 2-5半乳糖及 3 0.2-1 NeuNAc。本发明的IL-5分子唾液酸占单糖百分比(P1Q)为0至50%、如0、1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50%，在一个具体的实 施方案中为2至10%。当以GalNAc为标准，本发明的IL-5硫酸盐含量(Pn)为1 2_14 硫酸盐；在一个具体的实施方案中为1 5-10硫酸盐；当用3倍甘露糖为标准，为3 7-36 硫酸盐，在一个具体的实施方案中为3 12-24硫酸盐。硫酸盐占IL-5单糖百分比(P59) 为5-35%，在一个具体的实施方案中为10-25%。N连接IL-5寡糖中性百分比(P13)为30 至90 %，在一个具体的实施方案中为40至80 %，在具体的实施方案中为50至75 %。N连 接IL-5寡糖酸性百分比(P14)为10至70%，在一个具体的实施方案中为20至60%，在具 体的实施方案中为25至50%。本发明的IL-5的0-连接寡糖中性百分比(P15)为40至 100 %，在一个具体的实施方案中为50至100 %，在具体的实施方案中为60至100 %。本发 明的IL-5的0-连接寡糖酸性百分比(P16)为0至60%，在一个具体的实施方案中为0至 50%，在具体的实施方案中为0至40%。 在一个具体的实施方案中，本发明设想了选自GM-CSF、GM-CSF-Fc、IL-3、IL_3_Fc、 IL-4、IL-4-Fc、IL-5及IL_5_Fc的属于短链4螺旋束超家族或者与短链4螺旋束超家族相 关的蛋白质或其嵌合分子的分离的形式。本发明中的蛋白质或其嵌合分子具有特征性的 药理学特性，包括部分下述特性或由下述特性组成治疗效果0\)、有效治疗剂量(TCID5Q) (T2)、生物利用度(T3)、从给药到维持治疗水平的时间(T4)、吸收速率(T5)、排泄速率(T6)、 特殊的活性(T7)、热稳定性(T8)、冻干稳定性(T9)、血清/血浆稳定性(T1Q)、血清半衰期
12(Tn)、血流中的溶解度(T12)、免疫反应特征(T13)、免疫原性(T14)、中和抗体抑制(T14A)、副作 用(T15)、受体/配体亲合力(T16)、受体/配体激活作用(T17)、组织或细胞种类特异性(T18)、 生物膜或屏障的穿透能力(例如肠、肺、血脑屏障、皮肤等)(T19)、生成血管的能力(T19A)、组 织吸收(TJ、降解的稳定性(T21)、冻融稳定性(T22)、蛋白酶稳定性(T23)、泛素稳定性(T24)、 给药减少(T25)、给药方式(T26)、与其他药学辅料或载体的相容性(T27)、在生物体或环境中 的残留(T28)、保存过程中的稳定性(T29)、在生物体或环境中的毒性等(TJ。另外，本发明的蛋白质或嵌合分子在不同的细胞种类中可以具有不同的生物效应 (T31)、包括但不限于人原代细胞、例如淋巴细胞、红细胞、视网膜细胞、肝细胞、神经原、角质 细胞、内皮细胞、内胚层细胞、外胚层细胞、中胚层细胞、上皮细胞、肾细胞、肝细胞、骨细胞、 骨髓细胞、淋巴结细胞、真皮细胞、成纤维细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、自然杀伤细胞、巨噬 细胞、噬中性粒细胞、粒郎格罕细胞、树突状细胞、噬酸粒细胞、噬碱粒细胞、乳房细胞、小叶 细胞、前列腺细胞、肺细胞、食管细胞、胰细胞、Beta细胞(胰岛素分泌细胞)、成血管细胞、 肌细胞、卵圆细胞(肝细胞)、间充质细胞、脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞、胶质细胞、多 种干细胞包括成体和胚胎干细胞、多种祖细胞；和其他人永久、转化的或癌症细胞系。细胞中的生物效应包括增殖效应(T32)、分化(T33)、凋亡(T34)、细胞大小的生长 (T35)、细胞因子粘着(T36)、细胞粘着(T37)、细胞扩增(T38)、细胞运动性(T39)、迁移和侵入 (T4Q)、趋化性(T41)、细胞吞噬(T42)、信号转导(T43)、富集蛋白到受体/配体(T44)、JAK/STAT 途径的激活(T45)、Ras-erk途径的激活(T46)、AKT途径的激活(T47)、PKC途径的激活(T48)、 PKA 途径的激活(T49)、src 激活(T50)、fas 激活(T51)、TNFR 激活(T52)、NFkB 激活(T53)、 P38MAPK激活(T54)、C-fos激活(T55)、分泌(T56)、受体内陷(T57)、受体交互作用(T58)、表面 标记的上调或下调(T59)、FACS前/旁散射特征的改变(TJ、亚群比值的改变(T61)、差别基 因表达(T62)、细胞坏死(T63)、细胞凝集(T64)、细胞排斥(T65)、与硫酸肝素的结合(T66)、与糖 基化结构的结合(T67)、与硫酸软骨素的结合(T68)、与细胞外基质的结合(例如胶原、纤维 结合素)(T69)、与人造材料的结合(例如支架)(TTO)、与载体的结合(T71)、与辅助因子的结 合(T72)、单独的或在含有其他蛋白质的混合物中对干细胞增殖、分化和/或自我更新的效 应(T73)等。这些特性的特征在表3中提供。本发明进一步提供了包含分离的蛋白或其片断的嵌合分子，比如一个膜结合蛋白 质的胞外功能域通过一个或多个蛋白质连接子结合人免疫球蛋白的不变区(Fc)或框架 区。这样的嵌合分子在这里也表示成蛋白-Fc。本发明设想了这样蛋白-Fc嵌合体的例子 包括 GM-CSF-Fc、IL-3-Fc、IL_4_Fc 及 IL_5_Fc。这样的蛋白质-Fc具有可测量的理化参数的特性，这些特性表示、关联分离的蛋 白-Fc的一个或多个特定药理学特性。本发明设想的其他嵌合分子包括蛋白或蛋白-Fc或 它的一个片断，与一个如多不饱和脂肪酸分子的脂基相连。这里的脂基可以结合分子骨架 中的一个氨基酸残基或侧链中的一个氨基酸残基。本发明进一步提供了包含分离蛋白或其片断的嵌合分子，比如一个膜结合蛋白的 胞外功能域通过一个或多个蛋白质连接子结合人免疫球蛋白的Fc或框架区。在其他方面， 哺乳动物免疫球蛋白的恒定区(Fc)或框架区来源于包含灵长类，包括人类，绒，黑猩猩和 大猩猩，家畜(例如牛，羊，猪，马，驴子)，实验动物(如小鼠，大鼠，豚鼠，仓鼠，兔)，宠物 (如猫，狗)和捕获的野生动物(如啮齿类动物，狐狸，鹿，袋鼠)。在另外的实施方案中，Fc或框架区是人免疫球蛋白。在具体实施方案中哺乳动物为人类。这样的嵌合分子在这里也 表示成蛋白_Fc。本发明设想了其他嵌合分子包括蛋白或蛋白_Fc或它的一个片断，与一 个如多不饱和脂肪酸分子的脂基相连。这里的脂基可能结合分子骨架中的一个氨基酸残基 或侧链中的一个氨基酸残基。本发明中的嵌合分子，包括GM-CSF-Fc、IL-3-Fc、IL-4-Fc和 IL-5-Fc，其具有可测量的理化参数的特性，这些特性表示、关联分离的蛋白-Fc的一个或 多个特定药理学特性。因此，本发明提供了由核苷酸序列编码的分离多肽，所述序列选自SEQ ID NO :25、
27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、51、53、55、57、61、63、65、67，或者与上述序列其中任何 一个有至少65%—致性的核苷酸序列，或者能够与上述序列或其互补形式中的任一个在低 严格条件下杂交的序列。本发明的另一方面提供了分离的多肽，所述多肽由各自对应于下述序列各自的 mRNA经过细胞加工剪接的序列所编码，所述序列选自SEQID NO :69、70、71、72。本发明的另一方面提供了分离的多肽，其包含的氨基酸序列选自SEQ ID N0:26、
28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68，或者与上述序列其中任何 一个具有至少65%相似性的氨基酸序列。本发明进一步设想了包括至少一部分蛋白质或其嵌合体、药理学上可接受的载 体、辅助因子和/或稀释剂结合的药物组合物。在一级结构方面，本发明提供了分离的蛋白质或其嵌合体或其片断，其核苷酸编 码序列选自 SEQ ID NO :25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、51、53、55、57、61、63、65、67， 或者与上述序列其中任何一个有至少60%—致性的核苷酸序列，或者能够与上述序列或其 互补形式中的任一个在低严格条件杂交的序列。另外，本发明的其他方面提供了编码蛋白质或其嵌合分子或其功能区域的分离核 苷酸分子，包含与 SEQ ID NO :25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、51、53、55、57、61、63、 65,67具有至少60%的相似性，或最佳比对后和/或能够与SEQ ID NO :25、27、29、31、35、 37、39、41、43、45、47、51、53、55、57、61、63、65、67或它们的互补形式在低严格条件下杂交的
核苷酸序列。在一个具体实施方案中，本发明指向分离的核苷酸分子，其具有编码下述分子 的核苷酸序列，所属分子为属于短链4螺旋束超家族的或与短链4螺旋束超家族有关的 蛋白质或其嵌合分子，其选自GGM-CSF、GM-CSF-Fc、IL-3、IL_3_Fc、IL-4、IL_4_Fc、IL-5 及 IL-5-Fc 或其片断，基本上具有 SEQ ID NO :26、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、52、 54、56、58、62、64、66、68所示的一个或多个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO :26、28、30、32、 36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68最佳比对后的一个或多个序列有至少 60%相似性的氨基酸序列。在其他方面，本发明提供了分离的核苷酸分子，编码选自属于短链4螺旋束超家 族的或与短链4螺旋束超家族有关的蛋白质或其嵌合分子，前述蛋白质选自GM-CSF、IL-3、 IL-4 及 IL-5 或其片断，包含选自具有 SEQ ID NO :27、29、37、39、41、43、53、55、63 或 65 的核 苷酸序列，其直接或者通过一个或多个本领域上熟知的编码蛋白质连接子的核苷酸序列， 与编码人免疫球蛋白的恒定(Fc)或框架区的核苷酸序列相连，所述的编码人免疫球蛋白 的恒定(Fc)或框架区的核苷酸序基本上如SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17或19的一个或多个所示。在一个具体实施方案中，蛋白质连接子包括IP、GSSNT、TRA或VDGIQWIP。在其他方面，本发明提供了分离的蛋白质，该蛋白质是属于短链4螺旋束超家族 的或与短链4螺旋束超家族有关的蛋白质，其选自GM-CSF、IL-3、IL-4及IL-5或其片断，所 述蛋白质包含选自具有SEQID NO :28、30、38、40、42、44、54、56、64、或66的氨基酸序列，其 直接或者通过一个或多个本领域上熟知的蛋白质连接子，与人免疫球蛋白的恒定(Fc)或 框架区的核苷酸序列相连，所述的编码人免疫球蛋白的恒定(Fc)或框架区的核苷酸序列 基本上如SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18或20的一个或多个所示。本发明进一步提供了分离的蛋白或其嵌合分子或编码它的核苷酸分子在诊断，预 防，治疗，营养和/或研究应用中的应用。尤其应该指出，本发明提供了在被试动物上治疗 或预防疾病或缓解疾病症状的方法，所说的方法包括向所述被试动物给予有效剂量的分离 的蛋白质或其嵌合分子。而且，本发明设想了用本发明的蛋白或其嵌合分子来筛选可能具有不同诊断，预 防，治疗，营养和/或研究应用作用的小分子。本发明进一步设想了可应用分离蛋白或其嵌合分子作为免疫原，来产生用于治疗 和诊断的抗体。本发明进一步设想了可应用分离蛋白或其嵌合分子加入用于培养干细胞或相关 治疗方法的培养基。本发明也提供了含有蛋白或其嵌合分子的药物配方在诊断，预防，治疗，营养和/ 或研究应用中的应用。本发明也提供了人源蛋白或其嵌合分子用做免疫测定或其试剂盒的标准蛋白的 用途。本发明也提供了确定在生物制剂中人细胞表达人蛋白或其嵌合分子水平的方法。表 1序列标识
序列标识序列SEQ ID NO 1人IgGl Fc核苷酸序列SEQ ID NO2人IgGl Fc氨基酸序列SEQ ID NO3人IgGl Fc核苷酸序列(变体)SEQ ID NO4人IgGl Fc氨基酸序列(变体)SEQ ID NO 5人IgG2 Fc核苷酸序列SEQ ID NO6人IgG2 Fc氨基酸序列SEQ ID NO7人IgG3 Fc核苷酸序列SEQ ID NO8人IgG3 Fc氨基酸序列
15 表2:理化参数列表 表3:药理学特性列表 本文常用的简称的列表提供于表4和表5中。表4:简称和别名 表5 氨基酸简称 表6 干细胞列表


图1是编码本发明的蛋白质的cDNA插入pIRESbleo3或pIRESbleo3-Fc载体的克 隆过程的图示。图2显示本发明的GM-CSF与非人细胞体系表达的人GM-CSF对TFl细胞的增殖作 用的比较。图3显示本发明的GM-CSF与非人细胞体系表达的人GM-CSF血清稳定性的比较， 用两者诱导的TF-I细胞增殖作用进行测定。图4显示本发明的GM-CSF与非人细胞体系表达的人GM-CSF分化增殖粒细胞和巨 噬细胞集落的比较。图5显示本发明的IL-3与非人细胞体系表达的人IL-3对M_NFS_60细胞增殖作 用的比较。图6 (a)显示本发明的IL_4(实心圆)与E.coli (三角)和中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)(空心圆)表达的人IL-4对TFl细胞的增殖作用的比较。图6(b)显示用IL-4的培养基于37°C预孵育4天后，本发明的IL_4(圆形)与 E. coli (方形)表达的人IL-4对TFl细胞的增殖作用的比较。图7显示本发明的IL_3(方形)与E.coli (菱形)及昆虫细胞(三角形)表达的 人IL-3的体外免疫反应特性的比较。图8显示本发明的IL_4(三角形)与非人细胞体系(方形)表达的人IL-4的体 外免疫反应特性的比较。
具体实施例方式理解为除非另外指明，本发明不限于特殊的组成、制备方法、诊断方法、分析实验 设计、营养实验记录、或研究实验记录或如此等等的可能的改变。还理解为在此使用的术语 目的只在于描述具体的实施方案并且没有特意限定。应当注意，本说明书使用的，单数形式的不定冠词和定冠词包括复数，除非上下文 已经另外指明。因此，例如，关于“一种蛋白质”、“一种细胞因子”或“一种嵌合分子”或“一 种受体”，包括了单一的参量也包括了两个或多个所述参量。术语“化合物”、“活性因子”、“化学因子”、“药理学活性剂”、“药剂”、“活性物”和“药
物”在此交换使用，涉及一种化合物并且特别地涉及一种诱导所期望的理化和/或药理学效 应的蛋白质或其嵌合分子。该术语还包括这些活性因子的药学可接受的和药理学的活性成 分，在此特别涉及包括但是不限于盐、酯类、酰胺类、前体药物、活性代谢物、类似物等。使用
40术语“化合物”、“活性因子”、“化学因子”、“药理学活性剂”、“药剂”、“活性”和“药物”时，理
解为其包括活性因子本身及药学可接受的，药理学活性盐、酯类、酰胺类、前体药物、活性代 谢物、类似物等。关于“化合物”、“活性因子”、“化学因子”、“药理学活性剂”、“药剂”、“活性物”和
“药物”包括两种或多种活性活性物质的组合物，例如两种或多种细胞因子。“组合物”还包 括多部分例如两部分组合物，其中在配方前，因子被分别提供和给定或分别配制或混合。例如，多部分药包(multi-partpharmaceutical pack)可以具有选自 GM-CSF、 GM-CSF-Fc, IL-3、IL_3_Fc、IL-4、IL_4_Fc、IL-5 及 IL_5_Fc 的属于短链 4 螺旋束超家族的 或与短链4螺旋束超家族相关的2个或更多蛋白质或其嵌合分子，分开地保存。在此使用的试剂的术语“有效量”和“治疗有效量”表示蛋白质或其嵌合分子单独 地或在有其他试剂的组合物中以提供所期望的治疗或生理效应或结果的充分的量。不希望 的效应，例如副作用，有时证明伴随所希望的治疗效果；因此，医生平衡可能的益处与可能 的风险以决定什么是适当的“有效量”。根据受试者的物种、年龄和综合情况、给药模式等， 受试者与受试者之间必需的确切的量会改变。因此，不可能指定一个精确的“有效量”。然 而，对任何个体病例的适当的“有效量”可以通过本领域普通的技术人员使用唯一的例行试 验确定。使用“药学可接受的”载体，赋形剂或稀释剂表示药学载体包含非生物或非不良物 质，即，物质和所选的活性因子一起给药给受试者而不引起任何副作用或实质上的副作用。 载体可以包括辅料和其他添加剂，例如稀释剂、去污剂、着色剂、湿润剂或乳化剂、PH缓冲 剂、防腐剂等。类似地，在此提供的组合物的“药学可接受的”盐、酯类、酰胺类、前体药物或衍生 物是指非生物或非不良的盐、酯类、酰胺类、前体药物或衍生物。在此使用的术语“治疗”和“疗法”涉及被治疗疾病的症状的严重度和/或频率的 减轻，症状和/或潜在原因的消除，疾病和/或它们的潜在原因的症状发生的预防和伴随疾 病的损害的改善或补救或转好。“治疗”受试者可以包括在易感的个体中的疾病或其他不好的生理结果的预防和 通过改善疾病的症状对临床症状个体的治疗。在此使用的“受试者”涉及动物，在特定的具体实施方案中，哺乳动物，和进一步的 具体实施方案中，可以从本发明的药物制剂和方法中受益的人。在此对可以从目前描述的 药物制剂和方法中受益的动物的种类没有限制。受试者不论是人或非人动物可以被称为个 体、患者、动物、宿主或受体。本发明的化合物和方法应用于人类医学，兽医学和一般的，驯 养的或野生的动物饲养业。上面指出的，在特定的具体实施方案中，动物是人或其他灵长类例如猩猩、大猩 猩、猿、家畜动物、实验室试验动物、配对动物或被俘的野生动物和禽类。实验室试验动物举例包括小鼠、鼠、兔、豚鼠和仓鼠。兔和啮齿目动物，例如鼠和小 鼠，提供了方便的试验系统或动物模型。家畜动物包括绵羊、牛、猪、山羊、马和驴。非哺乳 动物例如禽类、鱼、和两栖动物包括非洲蟾蜍属、原核细胞核和非哺乳真核生物。术语“细胞因子”用于它大多数的普遍的意义并包括任何由细胞分泌的各种蛋白 质，其调节免疫系统，调节单个细胞和/或组织的功能活性，和/或诱导一系列生理反应。在
41此使用的术语“细胞因子”应该理解为涉及“完整”的细胞因子和包含一个或多个氨基酸的 增加，缺失或替代，而且基本上保持完整细胞因子的生物学活性的其片段，衍生物或同系物 或嵌合分子。“细胞因子受体”是细胞膜关联的或可溶的蛋白质细胞因子受体，与细胞因子信号 系统或调节有关。在此使用的术语“细胞因子受体”应该理解为涉及“完整”的细胞因子受 体和包含一个或多个氨基酸的增加，缺失或替代，而且基本上保持完整细胞因子受体的生 物学活性的其片段、衍生物或同系物或嵌合分子。术语“蛋白质”用于它大多数的普遍的意义并且包括细胞因子和细胞因子受体。在 此使用的，术语“蛋白质”应当理解为涉及“完整”的蛋白质和包含一个或多个氨基酸的增 加，缺失或替代，而且基本上保持完整蛋白质的生物学活性的其片段、衍生物或同系物或嵌 合分子。本发明设想了分离的蛋白质或其嵌合分子，其具有可测量的理化参数(Px)的特 征，其中该特征表示、关联于一个或多个特征性的药理学特性或形成一个或多个特征性的 药理学特性(Ty)的基础。分离的蛋白质或其嵌合分子是选自GM-CSF、GM-CSF-Fc, IL-3、 IL-3-Fc、IL-4、IL-4-Fc、IL-5及IL_5_Fc的属于短链4螺旋束超家族或与短链4螺旋束超 家族相关的蛋白质。在这里，GM-CSF、GM-CSF-Fc、IL-3、IL-3-Fc、IL-4、IL-4-Fc、IL-5 及 IL-5-Fc包括涉及的整个多肽和其片段。更特别地，本发明提供了一种分离的蛋白质或其嵌合分子，其具有包括一系列可 测量的理化参数的理化特征，([PJ1, [PJ2、· · [P丄、}，其中Px表示可测量的理化参数并 且“η”是彡1的整数，其中[PJ1至[P丄各自是一个不同的可测量的理化参数，其中任何一 个或多个可测量的理化特征的数值表示、关联于一个特征性的药理学特性Ty，或一系列特
征性的药理学特性([^、[TyJ2.....[Ty] J或形成一个特征性的药理学特性Ty，或一系列
特征性的药理学特性([^、[TyJ2.....[Ty] J的基础，其中Ty表示一个特征性的药理学特
征并且“m”是彡1的整数，并且[Ig1至[Ty]m各自是一个不同的药理学特性。在此使用的术语“可测量的理化参数”(Px)涉及一个或多个可测量的分离的蛋白 质或其嵌合分子的特征。代表性的“特殊的可测量的理化参数”包括，但不限于表观分子 量(Pi)、等电点(pi) (p2)、同工型数(P3)、不同同工型数的相对强度(p4)、糖类重量百分数 (P5)、N-连接寡糖去糖基化后的实测分子量(P6)、N-连接的和0-连接的寡糖去糖基化后的 实测分子量(P7)、酸性单糖含量的百分比(P8)、单糖含量(P9)、唾液酸含量(Pltl)、硫酸盐和 磷酸盐含量(P11) >Ser/Thr:GalNAc比例(P12)、N_连接寡糖的中性百分比(P13)、N_连接寡糖 的酸性百分比(P14)、0_连接寡糖的中性百分比(P15)、0_连接寡糖的酸性百分比(P16)、N-连 接寡糖的比例(P17)、0_连接寡糖的比例(P18)、N-连接寡糖成分的结构(P19)、0_连接寡糖成 分的结构(P2tl)、N-连接寡糖的位置和构成(P21)、0_连接寡糖的位置和构成(P22)、共翻译修 饰(P23)、翻译后修饰(P24)、酰化(P25)、乙酰化(P26)、酰胺化(P27)、脱酰胺(P28)、生物素酰化 (P29)、氨甲酰化(P30)、羧化(P31)、脱羧(P32)、二硫键形成(P33)、脂肪酸酰化(P34)、十四烷酰 化(P35)、十六烷酰化(P36)、十八烷酰化(P37)、甲酰化(P38)、糖化(P39)、糖基化(P4tl)、糖磷脂 酰肌醇锚定(P41)、羟基化(P42)、硒代半胱氨酸的结合(P43)、脂质(P44)、硫辛酸的加成(P45)、 甲基化(P46)、N或C端封闭(P47)、N或C端移除(P48)、硝化(P49)、甲硫氨酸氧化(P50)、磷酸 化(P51)、蛋白酶酶切(P52)、异戊烯化(P53)、法尼基化(P54)、栊牛儿基化(P55)、磷酸吡哆醛加成(P56)、唾液酸化(P57)、去唾液酸化(P58)、硫酸盐化(P59)、泛素化(P6tl)、泛素样分子的加成 (P61)、一级结构(P62)、二级结构(P63)、三级结构(P64)、四级结构(P65)、化学稳定性(P66)、热 稳定性(P67)。这些参数的概要在表2中提供。术语“特征性的(distinctive)药理学特性”已经被本领域技术人员理解为包括 本发明的蛋白质或嵌合分子的任何药理学的或临床相关的特性。代表性的“药理学特性” 不仅仅限定为发明包括的治疗效果(T1)、有效治疗剂量(TCID5tl) (T2)、生物利用度(T3)、从 给药到维持治疗水平的时间(T4)、吸收速率(T5)、排泄速率(T6)、特殊的活性(T7)、热稳定性 (T8)、冻干稳定性(T9)、血清/血浆稳定性(Tltl)、血清半衰期(Tn)、血流中的溶解度(T12)、 免疫反应特征(T13)、免疫原性(T14)、中和抗体抑制(T14a)、副作用(T15)、受体/配体亲合力 (T16)、受体/配体激活作用(T17)、组织或细胞种类特异性(T18)、生物膜或屏障的穿透能力 (例如肠，肺，血脑屏障，皮肤等)(τ19)、生成血管的能力(Τ19Α)、组织吸收(TJ、降解的稳定 性(T21)、冻融稳定性(T22)、蛋白酶稳定性(T23)、泛素稳定性(T24)、给药减少(T25)、给药模式 (T26)、与其他药学辅料或载体的相容性(T27)、在生物体或环境中的残留(T28)、保存过程中 的稳定性(T29)、在生物体或环境中的毒性等(T3tl)。另外，本发明的蛋白质或嵌合分子在不同的细胞种类中可以具有不同的生物效应 (T31)、包括但不限于人原代细胞、例如淋巴细胞、红细胞、视网膜细胞、肝细胞、神经原、角质 细胞、内皮细胞、内胚层细胞、外胚层细胞、中胚层细胞、上皮细胞、肾细胞、肝细胞、骨细胞、 骨髓细胞、淋巴结细胞、真皮细胞、成纤维细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、自然杀伤细胞、巨噬 细胞、噬中性粒细胞、粒郎格罕细胞、树突状细胞、噬酸粒细胞、噬碱粒细胞、乳房细胞、小叶 细胞、前列腺细胞、肺细胞、食管细胞、胰细胞、Beta细胞(胰岛素分泌细胞)、成血管细胞、 肌细胞、卵圆细胞(肝细胞)、间充质细胞、脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞、胶质细胞、 多种干细胞包括成体和胚胎干细胞、多种祖细胞；和其他人永久、转化的或癌症细胞系。细 胞中的生物效应包括增殖效应(T32)、分化(T33)、凋亡(T34)、细胞大小的生长(T35)、细胞因 子粘着(T36)、细胞粘着(T37)、细胞扩散(T38)、细胞运动性(T39)、迁移和侵入(T4tl)、趋化性 (T41)、细胞吞噬(T42)、信号转导(T43)、募集蛋白到受体/配体(T44)、JAK/STAT途径的激活 (T45)、Ras-erk途径的激活(T46)、AKT途径的激活(T47)、PKC途径的激活(T48)、PKA途径的 激活(T49)、src 激活(T50)、fas 激活(T51)、TNFR 激活(T52)、NFkB 激活(T53)、p38MAPK 激活 (T54)、C-fos激活(T55)、分泌(T56)、受体内陷(T57)、受体交互作用(T58)、表面标记的上调或 下调(T59)、FACS前/旁散射特征的改变(T6tl)、亚群比值的改变(T61)、差别基因表达(T62)、细 胞坏死(T63)、细胞凝集(T64)、细胞排斥(T65)、与硫酸肝素的结合(T66)、与糖基化结构的结 合(T67)、与硫酸软骨素的结合(T68)、与细胞外基质的结合(例如胶原、纤维结合素)(T69)、 与人造材料的结合(例如支架)(T7tl)、与载体的结合(T71)、与辅助因子的结合(T72)、单独的 或在含有其他蛋白质的混合物中对干细胞增殖、分化和/或自我更新的效应(T73)等。这些 特性的概要在表3中提供。在此使用的术语“特征性的”与本发明的蛋白质或嵌合分子的药理学特性有关，涉 及一种或多种蛋白质或其嵌合分子的药理学特性，其对于特殊的理化特征是特征性的。在 特定的具体实施方案中，分离的蛋白质或其嵌合分子的一个或多个药理学特性不同于，或 是特殊性的相对于，在原核或低等真核细胞或甚至高等非人真核细胞中产生的相同蛋白质 或嵌合分子的形式。在特殊的具体实施方案中，被实验的分离蛋白质或其嵌合分子的药理学特性基本相似于或功能等价于自然生成的蛋白质。在此使用的术语“原核”涉及任何原核细胞，其包括任何细菌细胞(包括放线菌细 胞)或古细菌细胞。在此使用的术语“非人真核生物”的意思是不证自明的。然而，为了清 楚，该术语特别地包括任何非人真核生物，其包括酵母例如酵母属或毕赤酵母属；其他真 菌；昆虫，包括果蝇属和昆虫细胞培养物；鱼，包括鲐属；两栖动物，包括非洲蟾蜍属；植物 和植物细胞培养物。涉及“干细胞”包括胚胎或成体干细胞并且包括在表6中列出的干细胞。本发明 的蛋白质或嵌合分子可以单独被使用或以在cocktail中的蛋白质被使用，以诱导一种或 多种干细胞增殖、分化或自我更新。蛋白质或其嵌合分子的一级结构可以作为氨基酸序列被测定。二级结构可以作为 一个或多个蛋白质二级结构的数量和/或相对位置被测定，例如α-螺旋，平行β-折叠， 反平行折叠或转角。三级结构描述多肽链的折叠，将不同的二级结构元件装配成特殊 的比对。螺旋和折叠是二级结构单元，而结构域是三级结构单元。在多结构域蛋白质中，三 级结构包括结构域相互之间的比对。相应的，三级结构可以对一个或多个蛋白质结构域的 存在，缺失，数量和/或相对位置进行测定。代表性的结构域不仅仅是本发明限制的包括 单螺旋、螺旋-转角-螺旋结构域、四螺旋束、DNA结合域、三螺旋束、希腊钥匙螺旋束、螺 旋-螺旋包装结构域、三明治、桶状、上下反平行折叠、希腊钥匙拓扑结构域、 果酱卷拓扑结构域、β-螺旋桨、β-三叶草、β-螺旋、Rossman折叠、α/β马蹄、α/β 桶、α+β拓扑、富二硫键折叠、丝氨酸蛋白酶抑制结构域、海葵毒素结构域、EGF样结构域、 补体C-组件结构域、小麦植物毒素结构域、眼镜蛇(Cobra)神经毒素结构域、绿树眼镜蛇胆 碱酯酶抑制剂结构域、Kringle结构域、粘蛋白样区、球形区、间隔区。四级结构描述具有蛋 白质结构的不同多肽链的比对，每一条链具有独特的一级，二级和三级结构元件。举例包括 同-或杂-低聚物多聚化(例如二聚体形成或三聚体形成)。对于涉及的一级结构，本发明提供了分离的蛋白质或其嵌合分子，或其片段，由选 自序列表的包括 SEQ ID NO :25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、51、53、55、57、61、63、 65、67，或与上面列举的任一条序列具有至少大约60%同一性的核苷酸序列，或能够与上述 任一条序列或它们的互补形式在低严格条件下杂交的核苷酸序列所编码。本发明另一方面提供了一种分离的多肽，其由通过细胞加工的它们各自的mRNA 的拼接后的核苷酸序列SEQ ID N0:69、70、71、72编码。本发明还在另一方面提供了一种分离的、编码蛋白质或其嵌合分子或其功能性部 分的核苷酸序列分子，所述核苷酸分子包括与选自序列表包括SEQ ID N0:25、27、29、31、 35、37、39、41、43、45、47、51、53、55、57、61、63、65、67 中选择的核苷酸至少有 60% 的序列相 似性，或最佳比对后的和 / 或能够与 SEQ ID No :25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、51、 53、55、57、61、63、65、67或它们的互补形式的一个或多个在低严格条件下杂交的核苷酸序 列。在一个具体实施方案中，本发明指向一种分离的核苷酸分子，所述分子包括编码 一种蛋白质或其嵌合分子，或其片段的核苷酸序列，其具有基本上如SEQ ID N0:26、28、30、 32、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68 的一个所示氨基酸序列或多个，或 与 SEQ ID NO :26、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68 在最佳比对后的一个或多个具有至少大约60%相似性的氨基酸序列。另一方面，本发明提供了一种分离的核苷酸分子，编码蛋白质分子，或其片段，包 括选自SEQ ID NO :27、29、37、39、41、43、53、55、63或65中的核苷酸序列，其直接地或经一 个或多个编码本领域已知的蛋白质连接子的核苷酸序列与基本如SEQ ID N0:l、3、5、7、9、 11、13、15、17或19的一个或多个所示的编码人免疫球蛋白的恒定区(Fe)或框架区的核苷 酸序列连接。另一方面，本发明提供了一种分离的蛋白质分子或其片段，包括选自SEQ ID NO 28、30、38、40、42、44、54、56、64或66的氨基酸序列，其直接地或经本领域已知的一个或多 个蛋白质连接子与基本如SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18或20的一个或多个所示的 人免疫球蛋白的恒定区(Fe)或框架区连接。本发明另一方面提供了一种分离的蛋白质或其嵌合分子或其片段，包括选自序列 表的 SEQ ID NO :26、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68 的氨基 酸序列，或与上述序列的一个或多个具有至少大约65%相似性的氨基酸序列。在具体实施方案中，蛋白相似性百分比或核苷酸同一性水平包括至少大约61%、 或至少大约62%、或至少大约63%、或至少大约64%、或至少大约65%、或至少大约66%、 或至少大约67%、或至少大约68%、或至少大约69%、或至少大约70%、或至少大约71%、 或至少大约72%、或至少大约73%、或至少大约74%、或至少大约75%、或至少大约76%、 或至少大约77%、或至少大约78%、或至少大约79%、或至少大约80%、或至少大约81%、 或至少大约82%、或至少大约83%、或至少大约84%、或至少大约85%、或至少大约86%、 或至少大约87 %、或至少大约88 %、或至少大约89 %、或至少大约90 %、或至少大约91 %、 或至少大约92%、或至少大约93%、或至少大约94%、或至少大约95%、或至少大约96%、 或至少大约97%、或至少大约98%、或至少大约99%的相似性或同一性。本发明的多肽的“衍生物”还包括全长亲本多肽的段或部分，其保留亲本多肽的部 分转录活性并包括变体。这样的“生物学活性片段”包括缺失型突变体和小肽，例如，具有 至少10，在具体实施方案中，具有至少20个和在进一步的具体实施方案中至少30个连续 的氨基酸，所述的连续的氨基酸是展示活性所必需的。这种肽可以通过标准重组核苷酸技 术的应用获得或用常规的液相或固相合成技术合成。例如，参照物可以用所述的溶液合成 或固相合成制备，例如，包括在由Nicholson编辑由Blackwell Scientific Publications 出版的名为“Synthetic Vaccines”的出版物中的第9章由Atherton和Sh印hard命名 为“P印tide Synthesis”。可选的，肽能够通过用蛋白酶例如endoLys-C、endoArg-C、 endoGlu-C和葡萄球菌V8蛋白酶消化本发明的氨基酸序列产生。消化片段可以被纯化，例 如，高效液相色谱(HPLC)技术。任何这样的片段，与产生的方法无关，可以被理解为包括在 此处所用的术语“衍生物”中。因此，术语“变体”涉及，显示为基本上序列与参考核苷酸序列的相同的核苷酸序 列或在下文中定义的在严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。术语“核苷酸序列”、“多核 苷酸”和“核苷酸分子”在此可以交换使用并包括具有一个或多个核苷酸被添加或缺失，或 用不同的核苷酸取代的多核苷酸。在这方面，本领域公知的，一些改变包括可以对参考核苷 酸序列进行突变，添加，缺失和替代，由此改变的多核苷酸保持参考多核苷酸或编码的多肽 的生物学功能或活性。术语“变体”也包括自然产生的等位基因的变体。
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本发明的核苷酸分子可以为载体或其他核苷酸构建体形式。在一个具体实施方案中，载体是DNA并且包含任意的选择性标记。选择性标记的例子包括赋予对化合物例如抗生素抗性的基因，赋予在选择性基质 中生长的能力的基因，编码产生可测信号例如荧光的蛋白质的基因。多种这样的基因是已 知的而且是可得的，包括，例如抗生素抗性基因例如新霉素抗性基因(neo)和潮霉素抗性 基因(hyg)。选择性标记还包括赋予在某些培养基质中生长能力的基因例如tk基因(胸苷 激酶)或hprt基因(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶)其赋予在HAT培养基中生长的能力(次 黄嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶)；和细菌gpt基因(鸟嘌呤/黄嘌呤磷酸核糖转移酶)，其允许 在MAX培养基中生长(霉酚酸，腺嘌呤和黄嘌呤)。其他用于哺乳动物细胞的选择性标记 和携带多种选择性标记的质粒在Sambrook等分子克隆-实验手册，冷泉港，纽约，USA，1990 中有描述。选择性标记可以依靠其自身启动子表达并且标记基因可以从与目的生物体非常 不同的生物体获得(例如用在目的哺乳动物细胞中的原核标记基因)。然而，用受体细胞 中已知功能的转录结构取代原来的启动子是有用的。大量的转录起始区对这样的目的是有 用的，例如，金属硫蛋白启动子、胸腺嘧啶核苷激酶启动子、肌动蛋白启动子、免疫球蛋 白启动子、SV40启动子和人巨细胞病毒启动子。广泛使用的例子是pSV2_ne0质粒，其具有 SV40早期启动子控制下的细菌新霉素磷酸转移酶基因并被赋予哺乳动物细胞抗G418的能 力(一种新霉素相关的抗生素)。大量的其他变种可以用于增强选择标记在动物细胞中的 表达，例如poly(A)序列的添加和合成的翻译起始序列的添加。组成型和诱导型启动子都 可以使用。本发明的遗传构建体还可以包含3’非翻译序列。3’非翻译序列涉及基因的部分， 包含含有多腺苷酸化信号和任何其他能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的DNA片 段。多腺苷酸化信号具有影响多聚腺苷酸链添加到mRNA前体3’末端的特征。多聚腺苷酸 信号通常通过与5' AATAAA-3'范式的同源性的存在被识别，尽管变异并不少见。相应地，包含本发明的核苷酸分子的遗传构建体，有效地与启动子连接，可以克隆 到合适的载体中以递送到调节错误、功能障碍或缺失的细胞或组织中，以修复和/或提供 适当的调节。含有合适的遗传构建体的载体可以通过分子生物学领域的技术人员公知的许 多不同方法递送到目的真核细胞中。在此使用的术语“相似性”包括在核苷酸或氨基酸水平比较的序列之间精确的同 一性。在核苷酸水平存在非同一性，“相似性”包括序列之间的差异，其导致氨基酸的差异， 氨基酸的差异仍然与相互的结构，功能，理化和/或构象水平有关。在氨基酸水平存在非同 一性，“相似性”包括与相互的结构，功能，理化和/或构象水平仍然有关的氨基酸。在特定 的具体实施方案中，核苷酸和序列的比较在同一性水平进行而不是相似性。用于描述两个或多个多聚核苷酸或多肽的序列关系的术语包括"参照序列"、“ 比较框〃、“序列相似性〃、“序列同一性〃、“序列相似性百分比〃、“序列同一性百 分比〃、“基本相似〃和〃基本同一〃.‘‘参照序列〃为至少具有12个，但经常为15至18 个和经常至少为25或以上的、例如30单体单元、包括核苷酸和氨基酸残基、在长度上。因 为两条多核苷酸可以都包含(1)在两条多聚核苷酸之间相似的序列(例如只有完整多核苷 酸序列的部分)，和(2)在两条多聚核苷酸之间不同的序列，两条(或多条)多聚核苷酸之间序列的比较一般通过两条多聚核苷酸的序列比较进行，通过“比较框”去识别并且比较序 列局部区域的相似性。“比较框”涉及一般12个连续残基的概念上的片段，其与参照序列对 比。为了两个序列的最佳比对，比较框可以包含与参照序列(其中含添加或缺失)相比大 约20%或更少的添加或缺失(例如gaps)。为了比对比较框，序列的最佳比对可以通过算 法的计算机化或通过检查和通过多种所选的方法任一种产生的最佳比对(例如在整个比 较框之间最终得到最高百分比同源性)实现。对照还可以由程序的BLAST族得到，例如由 Altschul等公开的(Nucl Acids Res 25 =389,1997)序列分析的详细讨论可以在Ausubel 等的 Unit 19. 3 中找至Ij (In :Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons Inc. 1994-1998)。在此使用的术语“序列相似性”和“序列同一性”涉及序列在比较框上，在核苷酸比 核苷酸基础上或氨基酸比氨基酸基础上同一的或功能或结构相似的范围。因此，例如，“序 列同一性的百分比”的计算是通过在比较框中两个最佳比对的序列进行比较，测定存在于 两个序列中具有相同核苷酸碱基(例如A，T，C，G，I)或相同的氨基酸残基(例如Ala、Pro、 Ser> Thr> Gly、Val> Leu、lie、Phe> Tyr> Trp> Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gin、Cys 禾口 Met) 的位点的数值，以产生配对位点的数值，用配对位点的数值除以比较框中位点的总数(例 如，框的大小)，并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。为了本发明的目的，“序列 同一性”将被理解为表示通过DNASIS计算机程序(Version 2.5 for windows ；available from Hitachi SoftwareEngineering Co. > Ltd. > South San Francisco> California>USA) 用软件所附的比较手册中使用的标准误差计算的“配对百分比”。相似的解释应用与序列相 似性。在此涉及的低严格包括和包含从至少0至至少大约15% ν/ν甲酰胺和从至少IM 至至少大约2Μ盐用于杂交，和至少大约IM至至少大约2Μ盐用于洗涤条件。一般的，低严格 在从大约 25-30°C 至大约 42°C，例如 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40,41和42°C。温度可以改变并且较高的温度用于取代甲酰胺和/或提供可选的严格条 件。可选的严格条件可以在需要的地方使用，例如中度严格，其包括和包含从至少16% ν/ν 到至少大约 30% ν/ν 甲酰胺，例如 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 和 30% 和从至少大约0. 5Μ至至少大约0. 9Μ盐，例如0. 5,0. 6,0. 7,0. 8或0. 9Μ用于洗涤条件，或 高严格，其包括和包含从至少大约31% ν/ν至至少大约50% ν/ν甲酰胺，例如31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 和 50%和从至少大约 0. OlM至至少 大约 0. 15Μ 盐，例如 0. 01,0. 02,0. 03,0. 04,0. 05,0. 06,0. 07,0. 08,0. 09,0. 10,0. 11,0. 12、 0. 13,0. 14和0. 15Μ用于洗涤条件。一般的，洗涤在Tm = 69. 3+0. 41 (G+C) %进行(Marmur and Doty, J Mol Biol 5:109、1962)。然而，双链DNA的Tm每递减1°C错配碱基对的数量增 加(Bonner and Laskey、EurJ Biochem 46:83、1974。甲酰胺在这些杂交条件下是可选 的。相应的，在特殊的具体实施方案中严格水平确定如下低严格为6XSSC缓冲液，0. 1% w/v SDS在25-42°C下；中严格为2 X SSC缓冲液，0. 1 % w/vSDS在温度范围20°C至65°C下； 高严格为ο. IX SSC缓冲液，0. 1% w/vSDS在至少65°C温度下。在此使用的，术语“共翻译修饰或翻译后修饰”涉及在肽链翻译时或翻译之后发生 共价键修饰。共翻译修饰或翻译后修饰包括但不限于酰化(包括乙酰化)、酰胺化或脱酰 胺、生物素酰化、氨甲酰化(或氨甲酰化)、羧化或脱羧、二硫碱形成、脂肪酸酰化(包括十四烷酰化、十六烷酰化和十八烷酰化)、甲酰化、糖化、糖基化、羟化、硒代半胱氨酸结合、脂质、 类脂酸加成、甲基化、N-或C-末端封闭、N-或C-末端移除、硝化、甲硫氨酸氧化、磷酸化、 蛋白酶剪切、异戊烯化(包括法尼基化、栊牛儿基化)、磷酸吡哆醛加成、唾液酸化或去唾液 酸、硫酸盐化、泛素化(或泛素化)或泛素样蛋白质加成。酰化作用包括N-末端起始甲硫氨酸的水解和乙酰基结合到新的N末端氨基酸。乙 酰基Co-A是酰化作用的乙酰基供体。酰胺化是肽的羧基端与酰胺基的共价键并且对于生物活性和蛋白的稳定性通常 是必需的。去酰胺化是酰胺基的水解移除。包含氨基酸残基的酰胺的去酰胺化是少有的变 形，其由生物体完成用以重组3D结构并且改变电荷比率/pi。生物素酰化作用是一项技术由此生物素基结合到分子上，在酶的生物合成过程中 通过羧化全酶合成酶催化或在体外进行，趋向于通过用生物素标记的探针和抗生素蛋白孵 化的可见的特殊底物，或者趋向于连接到受理化分析检验的多种物质的任一种的抗生蛋白
链毒素。氨甲酰化作用(或氨甲酰化)将氨基甲酰从含有氨甲酰的分子(例如氨甲酰磷 酸)转移到受体部分例如氨基。谷氨酸残基的羧化作用是维生素K依赖性反应其导致Y羧基谷氨酸的形成(Gla 残基)。Gla残基存在于凝血级联的几种蛋白质中，其对于蛋白质的生物学功能是必需的。 羧化作用也可以发生于天门冬氨酸残基。二硫键是当两个半胱氨酸的巯基被氧化时形成的二硫化物的共价键。许多哺乳动 物蛋白质包含二硫键，且其对于蛋白质三级结构的产生和维持，和这样的生物学活性是决 定性的。在细菌中的蛋白质合成包括N-末端甲硫氨酸的甲酰化和去甲酰化。这种甲酰化/ 去甲酰化的循环在真核细胞的细胞质中不发生并且是细菌细胞独有的特征。除了发生在甘 氨酸残基的羟基化作为酰胺化过程的一部分以外，羟基化还可以在脯氨酸和赖氨酸羟化酶 催化下发生在脯氨酸和赖氨酸上(Kivirikko et a 1. FASEB Journal 3 1609-1617，1989)。糖化是葡萄糖或其他糖类不受控制的，非酶的结合到蛋白质的氨基酸主链。糖基化是糖单元结合到多肽主链并将进一步在下文中描述。羟化作用是作为辅助因子的维生素C依赖性的反应。羟化作用作为翻译后修饰的 重要性的增加是由于羟化赖氨酸作为糖基化作用的结合位点。含硒蛋白质是含有稀有元素的硒的蛋白质，通过在翻译过程中加入唯一的氨基 酸，硒代半胱氨酸。用于硒代半胱氨酸的tRNA替代丝氨酸并且然后酶硒代以产生硒代半胱 氨酸-tRNA。硒代胱氨酸-tRNA的反义密码子与mRNA (UGA)中的终止密码子相互影响替代 丝氨酸密码子。含硒蛋白质mRNAs的3’非翻译区(UTR)中的一个元件决定了 UGA读作终 止密码子还是硒代半胱氨酸密码子。脂质化是一个包含蛋白质上脂质的共价结合的总称，其包括脂肪酸酰化作用和异 戊烯化。脂肪酸酰化作用包括脂肪酸的共价连接物例如十四肉豆蔻酸(十四烷酰化)， 十六碳棕榈酸(十六烷酰化)和18碳硬脂酸(十八烷酰化)。脂肪酸在前_高尔基区 隔中连接到蛋白质并且可以调节蛋白质对膜的靶向作用(Blenis and Resh Curr OpinCell Biol 5(6) :984_9、1993)。脂肪酸酰化作用因此在蛋白质的功能性活动中是重要的 (BernsteinMethods Mol Biol 237 :195_204、2004)。异戊烯化包括异戊二烯基，即15碳法尼基或20碳栊牛儿_栊牛儿基与受体蛋白 的结合。类异戊二烯化合物，包括法尼基氯喹或栊牛儿基丙酮氯喹，在胆固醇生物合成途径 中获得。类异戊二烯基通过硫醚键附着到契合序列CAAX中的半胱氨酸残基上(其中A是 除丙氨酸以外的任何脂肪族氨基酸)，定位于蛋白质的羧基端。异戊烯化改变蛋白质与类脂 膜联合的能力并且所有已知的GTP-结合水解蛋白质(G蛋白)是以该方法修饰的，使得异 戊烯化对信号传导是决定性的。(RandoBiochim Biophys Acta 1300(1) 5-16,1996 ；Gelb et al. Curr OpinChem Biol 2(1) j :40_8，1998)。类脂酸是维生素样抗氧化剂，作为清除剂的自由基。硫辛酸赖氨酸形成是通过硫 辛酸蛋白连接酶将类脂酸附着到结合酰胺的赖氨酸上。蛋白甲基化是一种通常的修饰可以调节蛋白质的活性或产生新的氨基酸种类。蛋 白甲基转移酶将甲基从S-腺苷-L-甲硫氨酸转移到蛋白中的亲核的氧，氮或硫原子。甲基 化效果分为两种一般的分类。第一，甲基转移酶和甲基酯酶的相对水平在特殊的羧基上可 以控制甲基化程度，其轮流调节蛋白质的活性。这种甲基化是可逆的。蛋白质甲基化反应 的第二组包括蛋白质中硫或氮原子的不可逆的修饰。这种反应产生具有改变的理化特征的 新的氨基酸，其改变蛋白质的活性(Clarke Curr Opin Cell Biol 5:977 983，1993)。蛋白硝化是重要的翻译后修饰，其在氧化亚氮信号传导中进行。蛋白质的硝化调 节催化活性，细胞信号和细胞骨架组构。磷酸化涉及对蛋白激酶的磷酸基加成。丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸残基是被磷酸化 的氨基酸。磷酸化是一种重要的机制，其调节蛋白质的生物活性。大部分蛋白质还被蛋白酶剪切修饰。其可以仅包括起始甲硫氨酸的移除。其他蛋 白质以失活前体形式合成，通过限制性或特异性蛋白酶解而活化。为了分泌或与膜结合的 蛋白(前蛋白)的合成具有12-36个主要疏水氨基酸的信号序列，其在之后经过ER膜时被 切除。磷酸吡哆醛是维生素B6的辅酶衍生物并且参加氨基酸侧链的氨基转移，脱羧，外 消旋作用，和很多修饰。所有的磷酸吡哆醛_需要性酶通过氨基酸与辅酶之间希夫碱的形 成起作用。大多数依赖磷酸吡哆醛基与赖氨酸残基结合的酶是自我激活的。唾液酸化作用涉及通过各种唾液酸转移酶将唾液酸附着于糖蛋白的末端位置；而 去唾液酸化涉及唾液酸的切除。唾液酸包括但不限于，N-乙酰神经氨酸(NeuAc)和N-羟 乙酰神经氨酸(NeuGc)。唾液酸结构由糖蛋白唾液酸化引起，包括唾液酸Lewis结构，例如， 唾液酸Lewisa和唾液酸Lewis x，和唾液酸T结构，例如，唾液酸-TF和唾液酸Τη。硫酸盐化作用在酪氨酸残基发生并通过存在于高尔基外侧网面的酶酪氨酸蛋白 硫转移酶催化。已确定由IfepG2细胞分泌的1至20以内的蛋白和由成纤维细胞分泌的 1至3以内的蛋白至少一个酪氨酸硫酸盐残基。硫酸盐化作用被发现对蛋白的生物活性 有影响。特别感兴趣的是CCR5，主要的HIV共受体，发现被酪氨酸硫酸盐化并且CCR5的 N-末端胞外域中一个或多个酪氨酸残基的硫酸盐化对于MIP-lalpha/CCL3、MIP-I beta/ CCL4、和RANTES/CCL5的最佳附着和最佳的HIV共-受体功能是必须的(Moore J Biol Chem278 (27) :24243_24246，2003)。硫酸盐化作用还可以在糖类上发生。另外，糖蛋白的糖类部分的硫酸盐化能够通过糖硫转移酶例如GalNAc ( β 1-4) GlcNAc ( β 1-2) Man α 4硫转移 酶的活性发生。翻译后修饰可以包含蛋白质_蛋白质键合。泛素是一种76氨基酸蛋白质，在哺乳 动物细胞中其既可以自身结合也可以共价附着于其他蛋白质。通过泛素的C末端与其他蛋 白质中的赖氨酸残基的氨基间的肽键附着。泛素分子的链与靶蛋白的附着靶定趋于被蛋白 酶体蛋白酶解并对于调节调节蛋白质的稳定状态水平，例如与细胞周期有关的蛋白质，是 一种重要的机制(Wilkinson Annu Rev Nutr 15 :161_89、1995)。相反，单遍在蛋白化在蛋 白质功能的直接调节中能够起到重要的作用。泛素样蛋白质还能够共价附着到蛋白质上以 影响它们的功能代谢，包括NEDD-8、SUM0-1和Apgl2。糖基化是糖残基在多肽主链上的附着。糖残基，例如单糖，二糖和寡糖包括但不限 于海藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、氨基半乳糖(GalNAc)、葡萄糖胺(GlcNAc), 甘露糖(Man)、N_乙酰氨基乳糖(IacNAc)、N，N，- 二乙酰氨基乳糖(IacdiNAc)。这些糖单 元可以以至少七种方式附着在多肽主链上，即，(1)通过N-糖苷键结合到共同序列Asn-X-Ser ；Asn-X-Thr ；或Asn-X-Cys中的天 氨酸残基的R-基(N-糖基化)。(2)通过0糖苷键结合到丝氨酸，苏氨酸，羟基脯氨酸，酪氨酸或羟基赖氨酸的 R-基(0-糖基化)。(3)通过酪氨酸的R-基C-连接甘露糖；(4)糖磷脂酰肌醇锚定用于将一些蛋白质固定到细胞膜；(5)连接到丝氨酸或苏氨酸的R-基的GIcNAC作为信号单糖。该连接通常为可逆 的伴有无机磷酸盐附着(Yin-O-Yang)；(6)线性多糖对丝氨酸，苏氨酸或天冬氨酸的附着(蛋白聚糖)；(7)通过S-糖苷键连接到半胱氨酸的R-基。糖基化结构可以包含表7中如下的一个或多个糖抗原决定簇。表 7糖抗原决定簇列表
抗原名称抗原多糖结构血液组H(0)，1型Fuc(α 1-2)Gal(β 1-3)GlcNAc-R血液组H(O)，2型Fuc(α 1-2)Gal(β 1-4)GlcNAc-R血液组A，1型GalNAc ( α 1-3)[Fuc(α 1-2)]Gal(β 1-3)GlcNAc-R血液组A，2型GalNAc(α 1-3)[Fuc(α 1-2)]Gal(β 1-4)GlcNAc-R血液组B，1型Gal ( α 1-3)[Fuc ( α 1-2)]Gal(β 1-3)GlcNAc-R
50 糖类还可以包含一些触角结构，包括单，双，三和四外侧结构。糖基化可以通过N联糖基化，0联糖基化，C联甘露糖结构，和糖磷脂酰肌醇锚定的 存在，缺失或模式；糖类质量百分比；Ser/Thr-GalNAc比例；单，二，三和四糖结构的比例或 通过凝集素或抗体结合测定。蛋白质的唾液酸化作用可以通过蛋白质与抗一种特定的唾液酸结构的抗体的免 疫反应性测定。例如，Lewis χ特殊抗体与由粒细胞表达的CEACAM1反应但不与293细胞表 达的重组人CEACAM1 反应(Luckaet al Glycobiology 15(1) :87_100、2005)。可选的，唾液酸结构在蛋白质中的存在可以通过糖苷酶处理的混合物经适当的测量过程例如质谱(MS)， 高效液相色谱(HPLC)或糖质量指纹图谱(GMF)检测。 蛋白质的表观分子量包括蛋白复合物的所有组成部分(辅助因子和非共价键 域)和所有共翻译修饰或翻译后修饰(共价基团对肽的附着或由肽上切除共价基团)。 表观分子量通常受到共翻译修饰或翻译后修饰影响。蛋白质的表观分子量可以通过 SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定，其在它的双向类似物，2D-PAGE ( 二 维聚丙烯酰胺凝胶电泳)中也是二维的。然而，蛋白质的表观分子量可以通过质谱(MS)-可 以通过产生改变的电子离子的矩阵_辅助的激光解析电离_飞行时间(MALDI-TOF)MS或产 生多个带电荷的峰的更敏感的电喷雾离子化(ESI)MS更精确的确定。蛋白质或其嵌合分子 的表观分子量可以在1至IOOOkDa范围内。相应的，本发明的分离的蛋白质或嵌合分子具 有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、 103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、 122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、 141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、 160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、 179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、 198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、 217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、 236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、 255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、 274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、 293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、 312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、 331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、 350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、 369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、 388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、 407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、 426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、 445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、 464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、 483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、 502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、 521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、 540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、 559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、 597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、 616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、 635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、 654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、 673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、 692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、 711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、 730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、 749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、 768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、 787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、 806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、 825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、 844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、 863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、 882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、 901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、 920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、 939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、 958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、 977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、 996、997、998、999UOOOkDa的表观分子量。蛋白质的分子量或分子质量可以通过任何方便 的方法确定，例如电泳，质谱，梯度离心。 蛋白质的等电点(或pi)是蛋白不携带净电荷时的pH。该属性可以通过等电聚焦 (IEF)测定，其也是2D-PAGE的一维。实验性的确定pi值受共翻译修饰或翻译后修饰的范 围的影响并且因此实验的Pl与理论的Pl之间的区别可以高达5个单位。相应的，本发明的
分离的蛋白质或嵌合分子可以具有0、1 0,1. 1、1· 2、1.3,1..4,1, 5,1. 6,1. 7、1·8,1.9,2.0、2. 1、2,.2,2.3、2· 4、2·5,2.6>2. 7、2·8,2.9、3· 0、3· 1、3·2,3.3,3.4、3· 5、3· 6、3·7,3.8,3.9、4. 0、4,.1,4.2、4· 3、4·4,4.5,4. 6,4.7,4.8、4· 9、5· 0、5·1,5.2,5.3、5· 4、5· 5、5·6,5.7,5.8、5. 9、6· 0、6.,1 >6. 2、6·3,6.4、6· 5、6·6、6·7、6· 8、6· 9、7·0,7.1、7·2,7. 3,7. 4、7·5,7.6,7.7、7. 8、7. 9、8.,0、8· 1、8·2,8.3、8· 4、8.,5、8·6、8· 7、8· 8、8·9,9.0,9.1 > 9 · 2 > 9 · 3、9·4,9.5,9.6、9. 7、9,.8、9·9,10.0,10. 1、10. 2,10.3、10 4,10.5,10. 6、10·‘M0..8,10. 9、11.0-.11. 1>11.2、11. 3、11. 4、11· 5,11..6,11. 7,11. 8、11· ！9,12. 0,12. 1、12. 2、12·3,12. 4,12.5、12. 6、12·7、
12. 8,12. 9,13. 0,13. 1,13. 2,13. 3,13. 4,13. 5,13. 6,13. 7,13. 8,13. 9、或 14. 0 的 pi。 在此使用的术语“同工型”表示一种给定蛋白的多种分子形式，并且包括在下列水 平上不同的蛋白质(1) 一级结构(例如由于变位RNA剪接，或多态性)；(2) 二级结构(例 如由于不同的共翻译修饰或翻译后修饰)；和/或(3)三级或四级结构(例如由于不同的 亚单位相互作用，同_或异-低聚物多聚化)。特殊的，术语“同工型”包括糖型，其包含具有连续一级结构但在二级或三级结构，或共翻译修饰或翻译后修饰，例如不同糖基化形式， 水平上不同的蛋白质或其嵌合分子。蛋白质的化学稳定性可以以特殊溶剂或环境中蛋白质的“半衰期”形式被测量。代 表性的，具有少于50kDa分子量的蛋白质具有大约5至20分钟的半衰期。本发明的蛋白质 或嵌合分子着重于具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98,99或100小时的半衰期。另一种化学稳定性的特别地方便的测量为蛋白质或其抗性分 子对蛋白酶消化作用的抗性，例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化作用。蛋白质或其嵌合分子对它的配体或受体的亲合力可以以平衡分离系数(Kd)或功 能等价测量的形式测量。蛋白质的溶解性可以通过溶于给定的溶剂的蛋白总量和/或其中蛋白质溶解的 比例的测量。进一步，蛋白质或其嵌合分子在不同性质例如极性，PH，温度等的溶剂中溶解 的比例和或水平还可以提供蛋白质或其嵌合分子的可测量的理化特性。任何“可测量的理化参数”可以用对本领域技术人员来说已知的任何方法确定，测 量，量化或限定。下面描述的是可以用于确定，测量，量化或限定一个或多个分离的蛋白质 或其嵌合分子的可测量的理化参数的方法学的范围。然而，其应当理解为本发明决不仅仅 限定为所描述的特殊的方法，或限定为使用这些方法是可测量的可测量的理化参数。糖蛋白可以被描述为具有两个相互作用以产生一个作为整体的分子基本组成部 分_氨基酸序列和糖类或糖侧链。分子的糖类组成部分分别以通过N-或0-键附着在Asn 氨基侧链或Ser/Thr残基的羟基侧链上的单糖或寡糖侧链形式存在。单糖是关于糖类最小 单位的术语，其被认为是一个糖，具有(CH2O)n的基本化学式并且大多数通常形成5或六元 环状结构(分别为戊糖和己糖)。寡糖是具有多种复杂的单糖成型结构的化合物，其可以是 线性的或分支的，但通常不具有串联重复单元的长链(其是一种多糖的形式)。寡糖含有的 分支水平和末端的分支替换明显地影响作为一个整体的糖蛋白的特征，并且在分子的生物 学功能上起到重要的作用。寡糖是在细胞的内质网(ER)和高尔基体中制备并附着到氨基 酸主链上的。不同的生物体和细胞的种类具有不同的糖基转移酶和内切糖苷酶和外切糖苷 酶的比值并且因此产生不同的寡糖结构。身体主要的防御机制之一是发现并破坏异常的同 工型，并且同样的具有正确的糖基化的生物治疗剂不仅对于增强疗效还对于减少被中和抗 体的发现是重要的。聚糖链通常以分支形式表达，并且即使当其为线性时，这样的链通常受到多种修 饰。因此，寡糖的全序列很难通过单一的方法完成并且因此需要物理和化学方法反复的结 合而最终获得所研究的结构的细节。蛋白质的糖基化模式的测定可以通过使用很多不同的方法进行，例如用 SDS-PAGE。这种技术依赖于糖基化蛋白质在SDS-PAGE中通常以不同的扩散带移行的事实。 不同的同工型之间的分化的进行是通过用一系列试剂处理蛋白质。例如，用肽-N4-(N-乙 酰-β-D-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶(PNGase)消化后带宽的显著的减少和移行位置的改 变来考虑N连接的糖基化的辨别。
为了测定N连接的糖基化的组分，N-糖链用从脑膜脓毒性黄杆菌克隆的和在大肠 杆菌中表达的PNGase从蛋白质中切除。切除的N-糖链可以从如Packer et al Glycoconj J 5(8) :737-47、1998 所述的 Alltech Carbograph SPE 碳柱(Deerfield、Illinois、USA) 回收。然后，样品可以用具有GP50泵ED50脉冲安培计或电导检测器和多种pH阴离子交换 柱的Dionex系统进行单糖分析，唾液酸分析或硫酸盐分析。O-连接糖基化的程度可以通过首先经β-消除从目的蛋白质切除O-糖链来测定。 切除的O-糖链可以如Packer et al. (1998、如上)所述的从Alltech Carbograph SPE碳 柱(Deerfield、Illin0iS、USA)回收。然后，样品可以用具有GP50泵ED50脉冲安培计或电 导检测器和多种PH阴离子交换柱的Dionex系统进行单糖分析，唾液酸分析或硫酸盐分析。寡糖的单糖亚单位具有可变的酸敏感性并因此可以在轻度三氟乙酸(TFA)条件， 中度TFA条件，和强盐酸(HCl)条件下从目的蛋白中释放。然后，单糖混合物通过使用多种 柱填充介质的高PH阴离子交换层析(HPAEC)分离，并用脉冲安培电化学检测法(PAD)进行 检测。高pH阴离子交换层析与脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)已经广泛地用于测定单糖 组分。荧光-标记方法已经被引入并且很多以试剂盒形式使用。荧光方法的明显的优势是 敏感性增强(大约50倍)。一个潜在的不足是偶联反应时，水解产物中和外标混合物中，不 同的单糖可以对不同的荧光基团表现出不同的选择性。然而，敏感性的增强和从实际的糖 蛋白的总量的一小部分中鉴别哪些单糖存在的能力，及用激光诱发的荧光的更强的敏感性 的潜力，使得该方法很有吸引力。另外电导检测器可以用于测定硫酸盐和磷酸盐组分。依 照使用规程，峰面积可以计算出存在的每种单糖的总量。这些数据可以表示N-和O-连接 糖基化的水平，唾液酸化的程度，和化合物中氨基酸组成成分，糖基化重量百分比，酸性糖 蛋白重量百分比。蛋白质的少量的单糖组成分析最好在电印记化后用PVDF(PSQ)膜进行，或，较少 的量用点印迹法分析。PVDF是糖类分析理想的基质，因为一旦经过酸或酶水解，单糖和寡糖 都不结合到膜上。目的分子的寡糖含量的测定通过许多技术进行。糖首先从氨基酸主链上被酶的 (例如用PNGase消化)或化学的(例如用氢氧化物β消除)方法切除。糖可以通过还原 稳定或用荧光标记使易于检测。然后，生成的游离寡糖被分离，可以通过高PH阴离子交换 层析和脉冲安培电化学检测法(HPAEC-PAD)，其能够用于已知的标准以测定多种结构的比 值和唾液酸化的水平，或通过荧光辅助糖电泳(FACE)，一种类似于蛋白质SDS-PAGE分离的 方法。在这个过程中，寡糖用荧光基团标记，其影响了电泳迁移率。它们在高百分比的聚丙 烯酰胺凝胶中被分离并且获得的带型提供了目的分子的寡糖含量的特征。通过使用标准样 品，获得存在的实际结构的一些信息或条带可以被切下并用质谱进行分析，可以测定它们 每一个的结构。荧光辅助糖电泳(FACE)是一种聚丙烯酰胺凝胶电泳系统，设计用于分离从糖结 合物释放的单个的寡糖。寡糖通过化学的或酶方法从样品蛋白质中被切除，以这样的方式 保留了还原端。然后，寡糖被消化为单糖或保持完整，并被荧光标记(带电荷的或不带电荷 的)。高百分比聚丙烯酰胺凝胶和多种缓冲系统用于迁移寡糖/单糖，其相对于它们的大 小/组分以与蛋白质几乎相同的方式迁移。糖类通过光密度法可视化并且糖的相对含量可以通过荧光检测被测定。这个过程与MALDI-TOF MS—致，因此该方法可以用于说明实际结 构。石英晶体微量天平和表面等离子共振(分别为QCM和SPR)是通过分子的理化特 性获得生物信息的两种方法。两者通过相互作用导致的预制芯片的物理特征的改变测量蛋 白_蛋白间接相互作用。在QCM中单个的石英晶体片用与目标配体相互作用的受体/抗体 等处理。这种芯片通过微量天平振动并且芯片的频率被记录。目标蛋白质被允许通过芯片 并且与结合的分子相互作用引起薄片的频率改变。通过配体与芯片的相互作用的条件的改 变，可以测定目的分子的结合特性。表观分子量也是一种理化特征，其可以用于测定本发明和那些用可选择地方式产 生的蛋白质或嵌合分子之间的相似性。在此使用的，术语“分子量”定义为分子中组成原子的原子量的总和，有时也涉及 “分子质量”(Mr)。分子量理论上可以通过对分子中组成原子的原子质量合计来确定。术语 “表观分子量”定义为通过一种或多种分析技术例如SDS page或超速离心测定的分子量， 并且依赖于分子和检测系统之间的关系。蛋白质或其嵌合分子的表观分子量可以用一系列 实验方法的任一种进行测定。用于测定蛋白质的分子量的分析方法包括，不限于，排阻色谱 (SEC)、凝胶电泳、瑞利光散射、分析超速离心、和，某种程度上，飞行时间质谱法。凝胶电泳是蛋白质的一些理化特征(特别是表观分子量和DI)的测定方法和关于 将分子分离为同工型的双向电泳，从而提供蛋白产物翻译后修饰的信息。具体地，电泳是 迫使带电分子(例如蛋白质或DNA)移行通过凝胶基质(大多数普通的聚丙烯酰胺或琼脂 糖)的方法，通过穿过胶体的电位的使用。用于蛋白质的最普遍的电泳形式为等电聚焦，非 变性，和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。在等电聚焦中蛋白质置于具有穿过其间的pH梯度的聚 丙烯酰胺凝胶中。蛋白将移行到凝胶中的一个位置，在该处蛋白具有为零的净电荷，从而给 出蛋白的等电点。糖质量指纹(GMF)是一种方法，经该方法，蛋白质或它的同工型之一的寡糖特 征通过电泳和随后的特殊的质谱技术被鉴定。样品蛋白质通过用于总蛋白测定的ID SDS-PAGE或用于特殊同工型特性的2D凝胶电泳被纯化。蛋白条带/斑点从凝胶上切除并 脱色以除去污染物。糖类通过化学或酶法释放并使用nanoflow LC系统除盐/分离并且随 后对存在于样品中的寡糖进行鉴定。LC流可以直接地注射到电子喷雾质谱仪(用于测定质 量并随后鉴别量存在于样品中)其提供了每一种同工型的一个特征或指纹，可以结合定量 技术例如Dionex分析，以测定所测试的分子的总的组分。一级结构可以通过测定本发明的蛋白质或嵌合分子的理化特征评估。蛋白质或其嵌合分子的一级结构可以使用一个或多个下列系统进行分析。蛋白质或其嵌合分子的一级结构的信息可以用质谱(MS)、DNA测序、氨基酸组成、 蛋白质测序和肽质量指纹的结合进行测定。为了测定氨基酸主链的序列，N-末端化学测序、串连质谱测序、或两者的结合都可 以使用。N-末端化学测序利用 Edman 化学(Edman P." Sequence determination" Mol Biol Biochem Biophys 8 :211_55，1970)，其中记载蛋白质N-末端氨基酸和2位的氨基酸 之间的肽键比序列中所有其他的肽键弱。通过使用中度酸性条件，N-末端氨基酸被切除，衍 生为具有荧光基团(FTIC)和测定在反相HPLC柱中的保留时间，并且与标准样品比较以确定是何种氨基酸。该方法可以测定分子实际的一级结构但不是定量的。任选的，nanoflow 液相色谱串连质谱可以被使用(LC-MS/MS)。该方法中，使用特异的内切蛋白酶将蛋白质水 解为肽并且测定肽的分子量。然后用高能碰撞气体例如氮气或氩断裂肽键并且测量获得的 肽的质量。通过计算肽的质量的改变，可以测定每一种肽的序列(每种氨基酸具有唯一的 质量)。然后通过使用不同的蛋白酶，肽可以交叠以测定它们的次序并由此测定蛋白质的全 序列。清楚地，酶消化、化学衍生、液相色谱(LC)/MS和串连MS的结合提供了一种非常 有效的工具，用于AA序列分析。例如，重组可溶性CD4受体的详细结构通过方法的结合 被表征，已经确定超过95 %的该369AA糖蛋白的一级结构并且已经发现N-和C-端的全 部特性，多聚糖的附着位置，多聚糖结构和二硫桥键的正确配置(Carr et al. J BiolChem 264(35) :21286-21295，1989)。质谱(MS)是一种通过真空下带电环境中分子的行为的推断测量分子质量的方 法。MS在稳定性研究和质量控制中非常有用。该方法首先要求用蛋白水解酶进行(胰 蛋白酶，V8蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，和梭菌蛋白酶)的样品消化(Franks et al. Characterization of proteins、Humana Press、Clifton、NJ、1988 ;Hearn et al. Methods in Enzymol 104 :190-212，1984)然后，通过反相色谱法(RPC)的分离消化样 品。用胰蛋白酶消化结合LC-MS，肽图谱可以用于探测遗传稳定性，产物批次的同源性，和发 酵，提纯，剂型制备和贮存过程中蛋白质的稳定性。质量分析前，一些方式用于将HPLC连接到质谱仪1)直接的液体注射；2)超临界 流体；3)传送带系统；4)热喷法。用于Caprioli’ s操作的HPLC/MS连接使用熔融石英毛 细管柱将柱中洗脱液输送到质谱仪的离子化室的样品探针接头。当样品溶液出现在毛细管 接头时，用高能的Xe原子连续轰击探针接头，引起样品溶液溅射。然后质量通过仪器分析 (Caprioli et al. Biochem Biophys Res Communl46 :291_299，1987)。MS/MS和LC/MS连接扩充了 MS潜在的应用。MS/MS允许25AAs以上的肽全序列的 部分、脱酰胺位点和异构化的直接鉴别(Carr et alAnal Chem 63:2802-2824,1991)。RPC 或毛细管电泳(CE)与MS结合可以进行蛋白质的高敏感度分析(Figeys and Aebersold, Electrophoresisl 9 885-892>1998 ；Nguyen et al. J ChromatogrA 705:21-45,1995)。 LC/MS允许在进入MS前分离肽的LC方法，例如与微孔HPLC连接的恒流FAB (Caprioli et al. 1987，如上)。后面的“连接”允许来自复杂混合物的单个的肽的测序所选的肽被第一 次MS断裂，接着经过碰撞室的离子云CID(碰撞诱导解离)。碰撞产生片段的特征性集合， 由此可以推断出序列，而不需要知道其他信息，例如cDNA序列。在单独的MS实验中，肽的 不分级混合物(例如，来自酶消化)注入并且主要离子的质量与通过cDNA序列预计的那些 进行比较。重组人白介素_2的序列通过CNBr的快原子轰击(FAB)-MS分析和蛋白水解已 经被验证(Fukuhara et al. J Biol Chem260 10487-10494，1985)。电喷雾离子化MS (ESI-MS)使用溶解蛋白的气雾剂在高电压下置入针中，产生一 系列具有多种电荷的相同分子的电荷峰。因为每个产生自不同电荷种类的峰产生分子 量的估算，这些估算可以结合以增加分子量估算的总的精确性。基体辅助激光解吸电离 MS(MALDI-MS)使用高浓度发色团。较高强度激光脉冲可以通过基体吸收并且吸收的能量 蒸发部分基体并且几乎完全将蛋白质样品带入气相。然后分析获得的离子的MS飞行时间。中度的离子化可以增强该方法提供四级结构信息的能力。MALDI-MS可以在15以内轻松地 运行。它不需要片段化分子并且当SDS-PAGE凝胶光密度扫描时，结果容易解释，用于质量 范围IOOkDa以上。可以通过测定编码蛋白质或其嵌合分子的DNA来确定氨基酸序列。不过，偶尔实 际上的蛋白质序列可能是不同的。通常，DNA测序反应与复制(DNA变性、复制)DAN的PCR 反应相似。通过DNA克隆技术，可以克隆该基因和确定核苷酸序列。可以使用一种或多种下述的系统分析蛋白质或嵌合分子的氨基酸序列。对蛋白质或其嵌合分子的完整序列的描述通常要求描述该产品。氨基酸测序包 括在凝胶上进行胰蛋白酶消化，用RPC-HPLC对消化的肽进行级分，通过MALDI-TOF MS筛 选具有最对称吸收特征的肽峰，用埃德曼降解第一肽(N-末端)。埃德曼化学地衍生出的 一级序列数据是在分子水平上确定蛋白质的经典方法。可以将MALDI-TOF MS用于N-末端 序列分析。不过，所有的用于HPLC的酶消化和肽测序均推荐先经过MS或MS/MS蛋白质鉴 别以减少耗时和降低成本。在经过原位胰蛋白酶消化或在基质上的Lysyl内肽酶消化来自 SDS-PAGE分离的蛋白质后，用HPLC进行分离可以获得内部的氨基酸序列。推荐将标准肽的内部测序和被分析样品一起运行来使仪器维持在最高性能。超过 80%的真核生物蛋白被报道有封闭氨基酸末端，妨碍直接氨基酸测序。当遇到封闭的真核 生物蛋白时，内部标准的存在能确保仪器操作正常。可以通过化学过程采用埃德曼降解法对N端直接测序，所述方法衍生N末端氨基 酸来释放氨基酸，暴露出下一个氨基酸的氨基末端。埃德曼测序包括1).通过微孔HPLC， 通过埃德曼化学循环反复进行N末端序列分析，每个埃德曼化学循环能够鉴定一个氨基 酸。2).凝胶内或PVDF结合蛋白消化后用HPLC分离消化生成的多肽，通过埃德曼降解化学 法进行内部蛋白序列分析。使用微孔HPLC和毛细管HPLC并使用RPC-HPLC方法来分析和纯化肽混合物。使 用不同的柱子纯化凝胶内样品和PVDF样品。HPLC分段分离后可以采用基质辅助的激光解 吸/电离飞行时间质谱(MALDI-T0FMS)分析进行N末端分析。选择标准为1)HPLC馏份的 表观纯度。2)肽的质量和由此估计的长度。肽质量信息对确证埃德曼测序氨基酸指定有 用，并且对翻译或翻译后修饰的可能的检测有用。在凝胶上的(In-gel)消化适合于高灵敏度HPLC系统中的纯化。内部蛋白序列分 析首先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行酶消化。在SDS-PAGE微凝胶中的蛋白能 可靠的只被胰蛋白酶在凝胶内消化。用RPC-HPLC纯化肽片段，然后用MALDI-TOF MS分析， 筛选适合埃德曼测序分析的肽。凝胶内蛋白只能用内部序列分析法来分析，但是可以获得 非常准确的肽质量，这能提供额外的对氨基酸指定和数据库搜索有用的信息。PVDF结合蛋白适于N末端和内部埃德曼测序分析。PVDF结合蛋白被合适的酶消 化(胰蛋白酶、内蛋白酶Lys-C、内蛋白酶Glu-C、梭菌蛋白酶、内蛋白酶、Asp-N、嗜热菌蛋 白酶)和非离子型去污剂，例如氢化Triton X-100。在PVDF结合蛋白中，用于将消化的肽 从膜中释放的去污剂能够干扰基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱分析。在加入酶之 前，用二硫苏糖醇(DTT)还原胱氨酸(Cys)，并用碘乙酰胺烷基化来生成羧基酰胺甲基化胱 氨酸，能在N末端测序分析中被确认。为了确定蛋白质或它的嵌合分子的氨基酸组成，在气相中用苯酚催化的强盐酸(HCl)酸性条件水解样品。一旦水解完成，用一种荧光基团化合物衍生释放的氨基酸，使结 合的分子带上特异的反相特性。反相高性能液相色谱(RP-HPLC)分离衍生氨基酸，并用荧 光检测器检测。使用外部和内部标准，通过观测到的峰面积来计算样品中每个氨基酸的数 量。这个信息可用于鉴定样品并对样品中的蛋白定量。例如，理论的和实际的结果的偏差 可用于最初确定一个脱酰胺作用部位的可能性。和单糖分析相结合，它可以确定糖基化重 量百分比组成和酸性糖蛋白重量百分数。这个方法的局限在于它能提供因环境污染和氨基 酸的偶然破坏而产生内在变异的骨架实际序列信息。例如这种方法不可能检测出序列的点 突变。肽质量指纹分析(PMF)是另一种能够确认蛋白质或它的嵌合分子的方法。其过程 包括最初用电泳(1维或2维)分离样品，从凝胶中切取点/带并用特殊的内切蛋白酶(典 型的用猪胰蛋白酶)消化。从凝胶碎块中洗提出肽并用质谱分析来确定存在的肽的质量。 随后将产生的肽质量和所有公布的蛋白质的理论质量碎片数据库比较(或构建的设计序 列的理论肽质量)。此技术依赖于蛋白质的“指纹”(即它的肽质量组合)是唯一的这个事 实。可以可靠的鉴定(超过90%的准确度)小到4肽和30%的序列覆盖。在分析的PMF阶 段可以鉴定修饰，例如脂部分和脱酰胺作用。和鉴定的蛋白质不相符的峰通过串联质谱法 (MS-MS)进一步分析，MS-MS技术使用了碰撞气体进行碰撞产生的能量来打断PTM的弱键。 随后对新释放的分子和原先的肽进行质量再分析来鉴定翻译后修饰以及它附着的肽片段。根据大小、电荷、疏水性、功能或目标生物分子的特定成分将HPLC分为不同的模 式。大体上，采用两种或更多种色谱法来纯化一种蛋白质。在选择色谱模式时最重要的是 要考虑蛋白质和样品溶剂的特性可以通过表征本发明的蛋白质或它的嵌合分子的特性来评价它们的二级结构。可以使用下面的一种或多种系统来分析蛋白质或它的嵌合分子的二级结构。为了研究蛋白质的二级结构，应该采用并比较最常用的几种分光镜方法。可以用 辐射连续波形，根据波的大小和形状来确定电磁能。不同的分光镜方法使用不同的电磁能。波长是放射的单个波的长度(两个连续波最大值之间的距离)。当放射能增加时， 波长变短。频率和波数之间的关系为波数(cm1)=频率(s-1)/光速(cm/s)分子对电磁辐射的吸收包括振动和转动跃迁和电子跃迁。用于鉴定二级结构的测 定分子振动能的最常用方法是红外(IR)和拉曼光谱。但是它们的方法和测定分子吸收不 同。散射辐射能量小于斯托克斯谱线入射辐射。散射辐射能量大于反斯托克斯谱线入 射辐射。激发增加或降低的能量和分子的基础电子状态振动能量间隔有关。因此，斯托克 斯和反斯托克斯谱线波数是分子振动能的直接检测量度。在拉曼光谱只观察到斯托克斯位移(Stokes shift)。斯托克斯谱线的波数小于 (或波长大于)激发光。可以使用高能量激发源(例如激光)增强拉曼散射效率。激发源 应该是单色的，因为我们对激发和斯托克斯谱线的能量差异(波数)感兴趣。为了使振动具有红外活性(IR active)，分子的偶极矩必须发生变化。因此，碳 酸酐的对称伸展是不具有红外活性的，因为偶极矩没有发生变化。非对称性伸展有红外活 性的原因是偶极矩发生了变化。为了使振动有拉曼活性(Raman active)，分子的偏振性必须发生振动改变。碳酸酐的对称性伸展是有拉曼活性的，因为分子的偏振性发生了改 变。因此，拉曼光谱补充了红夕卜光谱(Herzberg et al. Infrared andRaman Spectra of Polyatomic Molecules、Van Nostrand ReinholcUNew York、NY、1945)。例如，因为缺乏偶 极矩运动，红外不能检测同核二原子分子，但是拉曼光谱能够检测，因为键伸展和收缩使分 子的偏振性发生了改变，此外电子和核之间的相互作用也发生了改变。对于带有翻转中心的高度对称的多原子分子(例如苯)，有可能在红外光谱中有 谱带活性而在拉曼光谱中没有谱带活性，反之亦然。在对称性低或非对称分子中，有可能在 红外和拉曼光谱中都有活性。红外光谱检测波长和样品红外线吸收强度。红外线能量能使分子振动激发到更高 能量水平。红外和拉曼光谱都检测键长和键角的振动。红外通过检测对应于分子从ν = O到ν = 1 (或更高)状态的振动激发的特定能 量的光吸收来表征分子振动。有一些决定红外光谱检测分子的能力的选择规则，红外线不 能激发所有正常模式的振动(Herzberget al. 1945、如上)。红外光谱能提供蛋白质二级结构的定性和定量信息，例如α螺旋、β折叠、β 转角和不规则结构。蛋白质分析中的最有用的红外谱带是酰胺iaezo-noocnr1)、酰胺 II(1520-1580cm-1)和酰胺III (ΚΖΟ-ΠδΟαιΓ1)。酰胺I是蛋白质的最强吸收带。它包含 C = 0(70-85% )和C-N基团(10-20% )的伸缩振动。确切的谱带位置由骨架构象和氢键 模式决定。酰胺II比酰胺I复杂。酰胺II由平面内N-H弯曲(40-60% ) ,C-N(18-40% ) 和C-C(10% )伸缩振动决定。酰胺III带用处不大(Krimm andBandekar、Adv Protein Chem 38 181-364、1986)。大多数FTIR酰胺I带B折叠结构通常位于1629CHT1左右，最小 1615cm—1，最大1637cm—1，次要部分可能在1696cm—1附近(最低1685cm—1)显示峰，α螺旋主 要在1652cm"1 ο 1680cm"1附近是β转角。拉曼散射的原理与红外吸收不同。拉曼光谱检测分子的非弹性散射光的波长和强 度。拉曼散射，分子振动能量使入射光波长发生改变，产生拉曼散射光。为了有拉曼活性，振动为非弹性散射，其关键是在振动中偏振性发生改变。在对称 伸展中，在最小和最大核间距之间电子结合强度是不同的。因此，振动中偏振性发生变化， 并且这种振动模式散射拉曼光，此振动是有拉曼活性的。在非对称伸展中，伸展的键中的电 子更容易偏振，压缩的键中的电子更难偏振。偏振性总体上没有改变，非对称伸展是没有拉 曼活性的(Herzberg et al. 1945、如上)。圆二色性能被用于检测任何非对称结构，例如蛋白质。旋光发色团吸收不同量的 右旋和左旋光，这种不同的吸收导致阳性和阴性吸收光谱(通常，从左旋偏振光谱中减去 右偏振光谱)。通常，远紫外或酰胺区域(190-250nm)主要由肽键贡献，提供酰胺键羰基 环境的信息，因此提供蛋白质二级结构的信息，α螺旋通常在208、222nm处显示两个负峰 (Holzwarth et al J Am Chem Soc 178 :350，1965)，β 折叠在 196nm显示一个负峰，无规则 卷曲在218nm显示一个负峰。近紫外区域(250_350nm)的峰由芳香发色团(Phe、Tyr、Trp) 的环境贡献。二硫键使250nm附近的最小⑶带增大。圆二色性通常伴随侧链结构紧紧的高度折叠的三维结构。大多数蛋白质变性释放 空间位阻，变性程度增大，圆二色谱减弱。例如，hGH的侧链圆二色谱对加入变性剂引起的 部分变性非常敏感。一些可逆的分子化学变化，例如二硫键还原或碱滴定将改变侧链圆二色谱。对于hGH，完全去除生色团或者影响特定的生色团的圆二响应的变化都可以引起这些 谱差，但是变性或构象改变不引起谱差(Aloj et al.J BiolChem 247:1146-1151,1971)。紫外吸收光谱是检测蛋白特性的最有效的方法之一。它能提供蛋白质浓度和发 色团直接环境的信息。蛋白质功能团，例如氨基、醇(或酚)羟基、羰基、羧基或硫氢基能 被转换为强发色团。可见和近紫外光谱被用于监测两种类型的生色团金属蛋白质(大于 400nm)和含有Phe、Trp、Tyr残基的蛋白质(260-280nm)。紫外或荧光信号的改变可以是阴 性的或阳性的，有赖于蛋白质序列和溶液特性。荧光检测分子被辐射到激发状态后发射的能量。许多蛋白质的芳香族氨基酸在 250到300nm内被激发，发射300到400nm范围内的荧光。只有带有Phe、Trp、Tyr残基的 蛋白质能被检测，强度顺序为Trp》Tyr》Phe。荧光光谱能反映受蛋白质折叠影响的微环 境信息。例如，埋入的Trp通常处于疏水环境，在325到330nm范围内发射荧光，但是暴 露的残基或自由氨基酸在350到355nm处发射荧光。一种探测蛋白质伸展的常用试剂是 Bis-ANS0 Bis-ANS的荧光是pH依赖型的。虽然它在水中的信号弱，但是它能通过结合到 蛋白质中伸展的暴露的疏水位点来增加信号(James and Bottomley Arch BiochemBiophy 356 296-300,1998)。折叠蛋白质中Tyr和Trp的有效淬灭造成蛋白质伸展后信号的显著增加。一种简 单的溶质也可以引起这种变化。为了使检测灵敏度最大化，可以使用信号率。例如，在研究 rFXIII 伸展中，使用 350nm 和 330nm 荧光强度的比率(Kurochkin et al.J Mol Biol248 414-430，1995)。可以通过荧光供体和吸收受体之间激发能量转换的方法研究构象改变， 因为转换效率依赖这两种生色团之间的距离(Honroe et al. Biochem J 258:199-204， 1989)。用荧光来探查抗胰蛋白酶构象(K won and Yu, Biophim Biophys Actal335 265-272，1997)，来确定 HAS 的 Tm(Farruggia et al. Int J BiolMacromol 20 :43_51， 1997)，并检测 MerP 伸展相互作用(Aronsson etal. FEBS Lett. 411 :359_364，1997)。在中性pH下，荧光发射光谱强度顺序为Trp > Tyr0在酸性pH下，因为构象改变 破坏了能力转换，Tyr的荧光强于Trp。荧光实验还确证了胍引起的蛋白质伸展转变中的中 间体。本发明的蛋白质或嵌合分子的理化形式的三级和四级结构对查明其功能也是重 要的。可以采用一种或多种下述系统来测定蛋白质或它们的嵌合分子的三级和四级结 构。NMR和X射线衍射晶体分析是研究蛋白质3D结构的最常用技术。其它简述的 探查蛋白质三级结构的方法包括近紫外区域的⑶、紫外光谱二级衍生(Ackland et al.J Chromatogr 540 :187_198，1991)和荧光。NMR是结构生物学中研究分子结构和分子间相互作用的主要的方法之一。除了研 究蛋白质结构以外，NMR还能用于研究本发明中的蛋白质或嵌合分子中的碳水化合物结构。 化学家通常使用简单的一维NMR谱技术研究化学物质的结构。可以使用二维技术测定更复 杂分子的结构。时域NMR被用于探查溶液中分子动力学。固态NMR被用于测定固态分子结 构。NMR能被用于研究蛋白质、核苷酸和多种生物、药理学和医学相关的低分子量化合物的 结构和动力学特性。但是，不是所有的核都具有能被NMR读取的适当的特性，例如不是所有的核都具有自旋，自旋是NMR所需要的。自旋引起核产生NMR信号，发挥小磁场的功能。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它们的嵌合分子的结晶结构。X射线衍射晶体分析是一种实验技术，X射线能被晶体衍射，具有合适波长(在埃 范围里， IO-Scm)的X射线被相当大小的原子的电子云所衍射。根据晶体中周期组合的 分子或原子X射线衍射的衍射模式，电子密度能被重构。可以从衍射数据或补衍射实验中 得到附加相位信息，来完成重构。随后逐步建立实验电子密度模型，根据数据优化，结果得 到非常准确的分子结构。X射线衍射晶体分析已经发展为用任何射线研究所有状态的物质的结构，例如离 子、电子、超热中子和质子，波长和待测原子或分子结构间的距离相似。光散射光谱基于这样一个简单的原则，大粒子比小粒子散射的光多。在310-400nm 区域，基于大粒子散射光是一个倾斜的基线，例如溶液中聚集体Schmid et al. Protein structure> a practicalapproach> Creighton Ed. IRI Press、Oxford、England，1989)。光散射光谱能被用于评估蛋白质分子量，它是一种监测蛋白质四级结构或蛋白质 聚集体的简单工具。蛋白质聚集程度可以用简单的浊度检测表征。最终产生的溶液制剂进 行透明度检查，因为大多数聚集蛋白呈现云雾状和乳色。准弹性光散射光谱(QELSS)，有时 被称为光子相关光谱(PCS)或动态光散射(DLS)，是一种大分子(蛋白质、多糖、合成聚合 物、胶团、胶体颗粒和聚集体)复杂液体扩散的非侵入式探查技术。在多数事例中，光散射 光谱直接产生散射类相互扩散系数。当应用到稀释的单分散溶液时，QELSS得到的扩散系 数能估计大小。在多分散系中，它估计分子量分布的宽度。对于精确测定，使用200-500mW 激光能量，广泛采用常规的Ar+/Kr+气体激光器(Phillies Anal Chem62 1049A-1057A, 1990)。用人类耻骨松弛激素检测了蛋白质聚集体(Liet al. Biochemistry 34 :5162_5772， 1995)。蛋白质或它的嵌合分子的稳定性也是功能的一个重要决定因素。此特性的分析方 法包括DSC、TGA和冷冻干燥低温显微镜，分析冷冻-融化抗性和蛋白酶抗性。本发明的蛋白质或嵌合分子冻干(冷冻干燥)后能更稳定。冻干被用于增加产品 的稳定性和/或贮存期限，因为产品以粉末形式储存，而不是液体形式。其过程包括开始冷 冻样品，随后在真空下通过脱水去除液体。最终结果是一种干燥的蛋白质及辅料(使用的 其它物质成分)的“饼状物”。最终得到的饼状物的一致性对成功重建是关键的。冻干过 程能导致蛋白质发生改变，尤其是通过交联的聚集形式，还有脱酰胺作用和其它修饰。这些 能丢失、降低活性或诱导针对聚集体的免疫反应，从而降低功效。为了检测冻干稳定性，使 用稳定剂(例如甘露醇、海藻糖、吐温80、人血清白蛋白等)将蛋白质按配方冻干。如果蛋 白质的活性能通过合适的生物检测法测定，冻干后用ELISA检测恢复的蛋白质的量。能用 HPLC或蛋白印迹分析检测蛋白质聚集体。在冻干之前，应该确定成分的Tg或Te (定义Tg或Te)，来设置首次干燥中产品的 最大容许温度。同样，成分的结晶度或无定形度信息有助于更合理的设计冻干循环。能使 用差示扫描热量法(DSC)、热重量分析(TGA)或冻干低温显微镜获得这些热学参数产品信 息差示扫描热量法(DSC)是一种物理热分析方法，检测、表征和分析材料的热学特 性并确定热容、融化热函和相应的转变点。DSC以线性比率扫描一个温度范围。根据“功率补偿零点平衡”原理，仪器内的个别的热源分别为样品和参考盘提供热量。在物理转换过程 中，能量吸收或发出引起提供给样品储存器的能量数量的不平衡。依赖样品不同的热学行 为，能量将从样品中被取走或扩散，温度差异将被检出为传给计算机电信号。结果，加热器 的自动调整使样品储存器的温度和参照储存器相等。补偿需要的电能和测热效果相等。能根据形状和DSC融化吸热的温度用DSC估计有机物的纯度。在相同条件下，和 热流DSC相比功率补偿DSC提供非常高的分辨率。功率补偿DSC产生确定性和准确性更 好的融化局部区域，因为融化局部区域不象次解析率热流DSC那样在一个窄温度间隔中模 糊。功率补偿DSC本身就能产生更好的局部融化区域，因此能进行更好的纯度分析。借助 StepScan DSC的帮助，使用传统的和时间证明的方法，功率补偿DSC能提供直接的热容检 测，不需要重叠合法或提取正弦波振幅。热重量分析(TGA)检测样品质量损失和重量损失率，作为温度或时间的函数。在DSC中，冻干低温器能快速达到一个宽温度范围。目前，作为前规划的和规划的 实验工具，在冻干低温器中模拟冻干循环提供了最好的小规模研究蛋白质组分热学参数的 平台。冻干显微镜能预测冷冻和干燥中组分和过程因素的影响。低温实验只需要2_3mL样 品，使此技术成为一个有价值的研究稀有的、难以获得的药物的工具。它是研究冻干循环中 的冷冻效果、比率、干燥率、融化率的一种良好的工具。冻干低温显微镜实验可有助于退火 研究。因为冻干技术的广泛应用，以及对极其昂贵的药物(例如蛋白质和基因治疗药物) 稳定化的大量需求，希望制药工业在不久以后将实现过程中的显微监测。能使用下述系统中的一种或多种来测定蛋白质或它的嵌合分子的冷冻融化抗性。翻译中或翻译后修饰，例如糖基化，可以保护蛋白质经受反复冻/融循环。为了检 测它，可以比较蛋白质或本发明的嵌合分子和大肠杆菌产生的无载体相似物。蛋白质或它 的嵌合分子被稀释到合适的介质中(例如细胞生长培养基，PBS或类似其它物质)，随后用 多种方法冷冻，例如在液氮中立刻冷冻、放置于-70°C缓慢冷冻或在干冰中快速冷冻。虽然 在室温下快速融化或在4°C缓慢融化样品。随后将一些样品再次冷冻，此过程重复一些循 环。用ELISA检测存在的蛋白质量，有经验的工作人员选择合适的生物检测方法测定活性。 活性/残存蛋白质的值和初始材料相比，来确定许多冷冻/融化循环后的抗性。蛋白质或本发明的嵌合分子在溶液中可以改变热学稳定性。在体外可以按如下测 定本发明的热学稳定性。蛋白质或本发明的嵌合分子能混合到缓冲液中，例如含有载体蛋白(例如人血清 白蛋白)磷酸盐缓冲液，并在特定温度下保温特定的时间(例如37°C，7天)。能用ELISA 测定处理后蛋白质或它的嵌合分子的残存数量，并和储存于-70°C的材料想比较。相关领域 有经验的人员进行合适的生物检测测定残存的蛋白质或它的嵌合分子的生物活性。能使用一种或几种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子的蛋白酶抗性。为了比较蛋白酶抗性，含有蛋白质或本发明的嵌合分子的溶液和含有大肠杆菌表 达的相似物的溶液能和选择的蛋白酶孵育(例如未纯化的血清蛋白酶、纯化的蛋白酶、重 组蛋白酶)不同的时间段。采用合适的ELISA(例如捕获和检测抗体的识别表位被蛋白酶 切割位点分割)测定残存的蛋白量，采用有经验的人员选择的合适的生物检测方法测定残 存蛋白质或它的嵌合分子的活性。可以使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子的生物利用度。
生物利用度是给药后一种药物或其它物质被目标组织可利用的程度。生物利用度 依赖于药物的半衰期或它到达目标组织的能力。含有蛋白质或本发明的嵌合分子的混合物采用皮下或肌肉内注射。蛋随后用 ELISA或放射性计数测定血液中蛋白质或它的嵌合分子的水平。或者，用有经验的人员选择 的合适的生物检测方法检测血液样品中的蛋白质活性，例如，刺激特定的靶细胞群体的增 殖。因为样品来自于血浆或血清，因此可能有其它一些分子对检测出的活性有影响。这可 以通过使用待测蛋白质的中和抗体来控制。因此，任何残存的生物活性都是其它血清成分 引起的。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子的稳定性或半衰期。蛋白质或本发明的嵌合分子在血清和血浆中可能具有变化的半衰期。在体外可以 按如下测定本发明的半衰期。含有蛋白质或本发明的嵌合分子的混合物能混合到人血清/ 血浆中并在特定温度下孵育特定时间(例如37°C，4小时，12小时等)。能用ELISA测定处 理后残存的蛋白质或它的嵌合分子的量。采用相关领域有经验的人员选择的合适的生物检 测方法测定残存蛋白质或它的嵌合分子的生物活性。选择的血清可以来自于不同的人血液 组(例如Α、Β、ΑΒ、0等)。也可以在体内测定蛋白质或它的嵌合分子的半衰期。含有蛋白质或本发明的嵌 合分子的混合物，可以用放射性示踪剂或其它方法标记，能被静脉内、皮下、后眼窝、尾部静 脉、肌肉内或腹膜内注射到实验选择的物种中，例如小鼠、大鼠、猪、灵长类动物、人。注射后 不同时间点取得血液样品，分析存在的蛋白质或它的嵌合分子(用ELISA或用TCA沉淀放 射性计数)。用含有大肠杆菌或CHO生产的蛋白质或它的嵌合分子的混合物作为对比的对 照。为了确定蛋白质或本发明的嵌合分子的半衰期，在体内，可以对雄性Wag/Ri j大 鼠或其它合适的动物静脉内注射一种蛋白质或它的嵌合分子。在给予物质之前，取样200 μ 1 EDTA血液作为阴性对照。在注射后不同时间点，采 用相同技术从动物中取样200 μ 1 EDTA血液。在最后一次血液取样后，杀死动物。在收集 后30分钟内样品在室温下离心15分钟。用特殊的ELISA测定每个血浆样品中蛋白质或本 发明的嵌合分子的浓度。蛋白质或本发明的嵌合分子可以穿过血脑屏障。可以采用下述测定法体外检测蛋白质或本发明的嵌合分子是否结合人脑上皮细 胞。能检测放射性标记的蛋白质或本发明的嵌合分子结合人脑毛细管上皮细胞的能 力。采用本领域已知的方法将分离的蛋白质或本发明的嵌合分子人工结合上放射性标记， 实现一定的比放射性，例如氯胺-T方法标记125I或3Η。人脑上皮细胞的原代培养能在平底96孔板中生长，长满后5天用丙酮轻轻固定。 细胞被溶解，转移到玻璃纤维膜上。能用液体闪烁计数器检测放射性标记蛋白或本发明的 嵌合分子。能采用下述测定法在体内检测蛋白质或本发明的嵌合分子结合人脑上皮细胞。使用新鲜冷冻的(没有经过固定)、在恒冷切片机中切片的、放置于玻璃片上并用 丙酮固定的人脑组织切片检测人特异性蛋白质或本发明的嵌合分子和人脑毛细血管的结合。使用定量放射自显影检测脑切片中3H-蛋白质或本发明的嵌合分子的结合。可以在灵长类系统中在体内检测人特异性蛋白质或本发明的嵌合分子的组织分 布和血液清除率。在两只雄性短尾猴或其它合适的灵长类动物中，一个蛋白质或本发明的嵌合分 子被用于确定14C-标记的蛋白或本发明的嵌合分子的组织分布和血液清除，蛋白质或本 发明的嵌合分子和3H标记的对照蛋白质被同时给予带有静脉内导管的动物。在实验过程 中，收集血液样品来测定蛋白质从循环中的清除。在注射后24小时，杀死动物并选择器 官，收集代表性的组织来测定同位素的分布和自然清除。此外，根据Triguero等人(J of Neurochemistry 54:1882-1888 1990)的方法对来自脑不同区域的样品进行毛细管减少 实验。此方法从脑组织勻浆中去除了超过90%的血管系统(Triguero等，上面引用)。放射性标记蛋白质或本发明的嵌合分子从毛细管部分到实质部分的时间依赖型 再分布和蛋白质或本发明的嵌合分子的时间依赖型迁移通过血脑屏障相一致。蛋白质或本发明的嵌合分子可以促进或抑制血管生成。可以使用本领域已知的方法测定蛋白质或本发明的嵌合分子的血管生成的潜在 作用。例如，可以在血管生成模型中通过微血管萌发测定血管生成程度。在这个检测中，按 Sh印herd 等人(Arterioscler ThrombVase Biol 24 :898_904，2004)的方法分离大鼠脂肪 微血管片段(RFMFs)，从处死的动物中收集附睾脂肪垫，切碎并用胶原酶消化。在通过离心 的方法从脂肪和脂肪细胞中分离出RFMFs和单独细胞，并悬浮于0. 1% BSAPBS中。连续过 滤RFMF悬液来去除片段中的组织碎片、单细胞和红细胞。以15，000 RFMF/ml在冷的、pH 中性的大鼠尾1型胶原中悬浮RFMFs，并铺在48孔板中的孔中(例如0. 25ml/孔)进行培 养。在胶原聚合后，每个胶中加入相等体积的含10% FBS的DMEM。在形成凝胶后，血管生 成的血管延长特性在培养第4天逐步出现。因为缺乏粗糙性、平滑肌伴随形态，很容易区分 这些新生成血管和母体血管片段。能用蛋白质或本发明的嵌合分子处理RFMF 3-D培养物， 培养第5和6天测定新生成血管长度。还可以用Guedez等人(Am J Pathol 162 :1431_1439，2003)描述的体内血管生 成检测法测定蛋白质或本发明的嵌合分子的血管生成潜在作用。这个检测方法包括在裸鼠 中皮下移植半闭合(semiclosed)硅酮圆柱体(血管反应器，angioreactor) 0血管反应器 中填充了预混合或未预混合蛋白质或本发明的嵌合分子的细胞外基质。在恢复前静脉注射 异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖来定量血管反应器中的血管化作用，随后进行荧光分光光 度检测。对血管反应器进行荧光分光光度检测能显示不同发育阶段的细胞和侵入的新生血 管。蛋白质或本发明的嵌合分子可以具有不同的可用免疫测定技术测定的免疫反应 性特征，包括和一个或多个直接针对分子的抗体的相互作用。免疫测定技术的例子包括酶 交联免疫吸附检测(ELISA)、斑点印迹和免疫层析检测，例如倾动试验或试验纸检验。可以使用免疫测定过程测定蛋白质或它的嵌合分子的水平，例如，一种商业销售 的ELISA试剂盒。因为免疫试剂盒中提供的抗体的特异性，蛋白质或本发明的嵌合分子可 以对非人细胞表达的蛋白质或它的嵌合分子具有不同的免疫反应性特征。例如，免疫测定 法的捕获和/或检测抗体可以是特异性的直接针对非人细胞表达的人蛋白质或它的嵌合 分子的抗体。
此外，非人细胞表达的人蛋白质或它的嵌合分子的不正确的折叠会导致在正确折 叠的人细胞表达的人蛋白质或它的嵌合分子中不暴露的抗原表位暴露。非正确折叠可以 通过，例如，在非人细胞胞浆中过度产生异性蛋白来产生，例如，大肠杆菌(Baneyx Current Opinion inBiotechnology，70 :411-421，1999)。进一步，非人细胞表达的人蛋白质或它的 嵌合分子可以具有不同的蛋白质或本发明的嵌合分子翻译后修饰形式。例如，非人细胞表 达的人蛋白质或它的嵌合分子可以具有异常的数量和/或类型的糖结构、磷酸根、硫酸根、 脂或其它残基。这可能导致在蛋白质或本发明的嵌合分子中不暴露的抗原表位的暴露。相 反的，翻译后修饰模式的改变可能导致缺乏蛋白质或本发明的嵌合分子中的抗原表位，所 述抗原表位在非人细胞中表达的人蛋白质或它的嵌合分子中暴露。任何一个或组合的上述因素可能导致如下面的非正确的检测(a)在实验室样品或人组织中天然产生的人蛋白质，或(b)在实验室样品、人组织或在人胚胎干细胞(hES)培养基中人细胞表达的重组 人蛋白质或它的嵌合分子使用合适的免疫测定法测定的人细胞表达的人蛋白质或它的嵌合分子的免疫反 应性特征可以提供人体中蛋白质的免疫原性的表征，如下文所述。多数生物产品弓I起某一水平的针对它们的抗体应答。在某些情况下抗体应答能导 致可能的严重副作用和/或损失效果。例如，一些接受非人细胞表达的重组蛋白或它的嵌 合分子治疗的患者可能产生中和抗体，尤其是在长期治疗使用中，并因此减弱蛋白质的效 果和/或促成副作用。人细胞表达的人蛋白质或嵌合分子不太可能产生中和抗体，因此和 非人细胞表达的人蛋白质或它的嵌合分子相比增强了疗效。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子的免疫原性。多数生物产品弓I起某一水平的针对它们的抗体应答。在某些情况下抗体应答能导 致可能的严重副作用和/或损失效果。例如，一些接受重组EPO治疗的患者可能产生中和 抗体，并和患者自身的EPO交叉反应。在这个例子中，他们会发生单纯红细胞再生障碍，并 对EPO治疗产生抗性，导致需要经常的透析。免疫原性是在有机体中能引起免疫应答的能力。免疫原性部分依赖于所述物质的 大小，并且部分依赖于它和宿主分子的不相似程度。因为具有新的生理化学特性，蛋白质 或它的嵌合分子可能具有改变的免疫原性。例如，蛋白质或它的嵌合分子的糖基化结构可 能屏蔽或减弱抗体对抗原表位的识别，因此防止或减弱抗体结合到蛋白质或它的嵌合分子 上。或者，一些抗体可以识别在非糖基化蛋白质中不存在的糖肽表位。可以通过不同的免疫测定方法确定病人样本识别具有特征性的生理化学形式的 蛋白质或它的嵌合分子的能力，如此处所述。设计适当的免疫测定方法包括考虑直接的合 适的检测、定量和表征抗体应答。一些对免疫测定设计和优化的建议被列于Mire-Sluis等 人的J ImmunolMethods 289(1-2) 1_16，2004中，引入本文作为参考文献。能使用一种或多种下述系统测定在治疗性移植中使用的蛋白质或它的嵌合分子。本发明扩展使用蛋白质或它的嵌合分子来操作干细胞。一个主要的干细胞治疗性 应用是组织、软骨或骨头再生。在一个实施例中，在生物相容的3维基质中的细胞有可能被 引入到人体中。移植将包括细胞混合物、骨架、生长因子和必须的成分，例如生物可降解聚 合物、蛋白聚糖等。打算在构建过程中向这些基质中掺入蛋白质或它的嵌合分子来调节细胞的行为。这种移植可以被用于骨头形成、神经从祖细胞生长和其它应用。人细胞衍生的 蛋白质可以减少干细胞培养条件下的异基因蛋白质的数量和/或品种，并因此降低了非人 病原体感染的风险。本发明的蛋白质或嵌合分子可以和用于形成移植物的基质发生不同的相互作用， 并调节的细胞掺入移植物中。预计联合使用本发明的蛋白质或嵌合分子和移植物成分将导 致一种或多种下述药理学性状，例如高增殖、促进分化、希望的分化状态的维持、更强的分 化谱系特异性、增加基质成分的分泌、形成更好的三维结构、增强信号、更好的结构性能、降 低毒性、减少副作用、减少炎症、减少免疫细胞浸润、减少注射、移植物持续时间更长、移植 物功能更长久、对移植物周围细胞更好的刺激、更好的组织再生、更好的器官功能、更好的 组织重塑。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子对不同基因表达的效果。能分析暴露于蛋白质或它的嵌合分子的细胞的基因表达差异。微阵列技术能同时测定一个有机体基因组中几乎所有的基因的mRNA表达。此方 法使用基因“芯片”，对应不同基因序列的寡核苷酸附着在“芯片”中的固体载体上。禾IJ用 从感兴趣的细胞或组织中提取的mRNA得到的标记的CDNA和芯片孵育，让cDNA和附着的互 补序列杂交。还需要使用对照，在随后进行杂交和清洗后比较两者的信号。使用专门的软 件来测定哪些基因上调或下调或哪些表达未改变。每个芯片可以分析数千基因。例如使用 AfTymetrix技术，人基因组U133(HG-U133)集合，包括两个GeneChip (注册商标)阵列，含 有大约45000个探针集合，代表了从大约33、000个被良好证实的人类基因中提取的39000 多个转录子。GeneChip (注册商标)小鼠基因组4302. 0在单张阵列中含有39000多个转录 子。这种类型的分析揭示了总体mRNA表达模式的变化，因此可以发现未知的被特定 刺激物调控的基因的表达变化。因此此技术适合于分析和本发明的蛋白质或嵌合分子相关 的诱导的基因表达。确定受特定刺激物调控的已知的和新基因将有助于确认在特定的本发明的蛋白 质或嵌合分子生物活性中重要的生物化学通路。这些信息将对确定新型治疗靶点有用。该系统还能用于观察和可购买的产品相比本发明的蛋白质或嵌合分子诱导的基 因表达变化。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子的结合能力效果。可以研究本发明的蛋白质或嵌合分子和不同物质的结合能力，所述物质包括细胞 外基质、人造材料、硫酸肝素、载体或辅因子。可以使用下述测定法确定蛋白质或它的嵌合分子中的特定蛋白质结合细胞外基 质的效果。在合适的缓冲液中表面包被细胞外基质蛋白，包括但不限于胶原、玻璃体结合蛋 白、纤维结合蛋白、层粘连蛋白。未结合位点可以用本领域已知的方法包被，例如，和BSA溶 液孵育。清洗表面，例如，用PBS溶液，随后在表面加入含有待检测蛋白(例如本发明的蛋 白质或嵌合分子)的溶液。包被后，清洗表面并和识别蛋白质或它的嵌合分子的抗体孵育。 随后检测结合的抗体，例如，使用一种识别一抗的酶联二抗。通过和合适的物质孵育并观察 颜色变化反应将结合的抗体可视化。和未糖基化的蛋白质相比，糖基化蛋白能更强的粘附
67到细胞外基质蛋白上。或者，将相等数量的(用ELISA浓度或生物测定活性单位指定)本发明的蛋白质 或嵌合分子，或用非人细胞表达的本发明的蛋白质或嵌合分子相似物，和基质包被的小孔 一起孵育，随后清洗小孔，用ELISA检测结合数量。可以通过样品和包被表面孵育后ELISA 反应性的下降间接测定结合数量。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子结合人造材料的能力。为了测定蛋白质或它的嵌合分子结合人造材料的能力，表面在合适的缓冲液中包 被人造材料，包括但不限于金属、支架。清洗表面，例如，用用PBS溶液，随后在表面加入含 有待检测蛋白(例如本发明的蛋白质或嵌合分子)的溶液。包被后，清洗表面并和识别蛋 白质或它的嵌合分子的抗体孵育。随后检测结合的抗体，例如，使用一种识别一抗的酶联二 抗。通过和合适的物质孵育并观察颜色变化反应将结合的抗体可视化。或者，将相等数量的(用ELISA浓度或生物测定活性单位指定)本发明的蛋白质 或嵌合分子，和用非人细胞表达的本发明的蛋白质或嵌合分子相似物，和人造材料包被的 小孔一起孵育，随后清洗小孔，用ELISA检测结合数量。可以通过样品和包被表面孵育后 ELISA反应性的下降间接测定结合数量。结合人造表面的能力可能具有生物学效果，例如在支架包被中。或者，包被有一种 本发明的蛋白质或嵌合分子的支架被用于种植细胞。随后监测细胞的生长和分化，并和未 包被的或包被不同的支架相比较。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子结合硫酸肝素的能力。由于本发明的蛋白质或嵌合分子的理化形式，预计它们和硫酸肝素有不同的相互 作用。预计这些差别在细胞增殖、分化、迁移等实验模型中是明显的。在指定治疗中联合使 用蛋白质或它的嵌合分子和硫酸肝素预计有特征性的药理学性状。可能是血清半衰期延 长、生物利用度增加、减少免疫相关清除、更强的效果、减小剂量降低副作用和相关的优点。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子结合载体或辅因子的能 力。当蛋白质或它的嵌合分子存在于血浆中时，它们将结合其它分子。这些分子可以 被命名为“载体”或“辅因子”，并将影响这些因子的生物利用度或血清半衰期。和纯化的血浆蛋白质孵育并用分子排阻色谱分析所得溶液能测定本发明的蛋白 质或嵌合分子和它们的结合配体的相互作用。如果蛋白质或它的嵌合分子结合一种辅因 子，得到的复合物将具有更大的分子量，导致洗脱时间改变。能比较复合物的生物活性、体 外或体内半衰期和生物利用度。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子对生物测定的效果。可以进行多种生物测定法检测本发明的蛋白质或嵌合分子的活性，包括测定细胞 增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞大小、细胞因子/细胞因子受体粘附、细胞粘附、细胞散布、 细胞运动、迁移和浸润、趋化性、配体受体结合、受体激活、信号传导和同工型比率变化。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子对细胞增殖的效果。细胞，在具体的实施方案中，指数生长的细胞，在含有本发明的蛋白质或嵌合分子 的生长培养基中孵育。这可以在细颈瓶或96孔板中进行。细胞生长一段时间随后用直接 (例如细胞计数)或间接 17、肌3、氚化胸腺嘧啶)的方法计数细胞。和仅含培养基的对
68照相比较测定增殖的增加或减少。在并行系列实验中可以使用不同的浓度的蛋白质或它的 嵌合分子来获得剂量响应特征。可以用它测定ED50和ED100 (产生一半最大的和最大的响 应效果所需要的剂量)。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子对细胞分化或细胞维持 未分化状态的效果。细胞在存在有本发明的蛋白质或嵌合分子的生长培养基中孵育。在合适的一段时 间后，对分化指示物进行细胞分析。它可以是细胞表面特定标志物的表达、胞浆标志物的表 达，细胞尺寸、形状或胞质特征的变化。标志物可能包括蛋白质、糖结构(例如葡萄糖胺聚 糖，例如硫酸肝素、硫酸软骨素等)、脂(糖鞘脂或脂双层成分)。可以使用多种技术检测这 些变化，所述技术包括显微镜、蛋白印记、FACS染色或前向/侧向散射特征。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子对细胞凋亡的效果。凋亡被定义为程序化细胞死亡，和坏死等其它细胞死亡方式不同。它由确定的 细胞变化所表征，例如信号通路的激活(例如Fas、TNFR)导致一个被称为半胱天冬酶 (caspases)的蛋白酶亚群被激活。启动半胱天冬酶的激活导致致死半胱天冬酶的激活，它 切割多种细胞蛋白，导致核断裂，核层纤蛋白断裂，细胞质起泡并破坏细胞。凋亡可被蛋白 质配体诱导，例如FasL、TNFa、淋巴细胞毒素或被信号诱导，例如紫外光和引起DNA损伤的 物质。细胞在含有蛋白质或它的嵌合分子或其它适合检测的试剂的生长培养基中孵育。 例如，可能需要能阻断转录(放线菌素D)或翻译(放线菌酮)的试剂。在孵育合适的一段 时间后，用合适的方法测定细胞数量。细胞数量下降可能意味着凋亡。可以通过细胞染色 获得其它凋亡表征，例如，膜联蛋白或观察特征性的梯形DNA形式。可以通过和细胞渗透半 胱天冬酶抑制剂(例如z-VAD FMK)孵育来防止凋亡标志物的表达，随后检测凋亡标志物， 来进一步证实凋亡。本发明的蛋白质或嵌合分子可能通过细胞生存通路(例如Bcl2或Akt通路)提 供生存信号来防止凋亡。能通过细胞Bcl2表达增加或使用直接针对Akt的磷酸特异性抗 体检测Akt激活形式(磷酸化)增加的蛋白印记证实这些通路的激活。对于这些检测，细胞培养在含有或不含有生存因子(例如IL-3和某种免疫细胞) 条件下。培养在缺乏生存因子条件下的部分细胞在延长培养下凋亡，培养在足够数量生存 因子条件下的细胞将生存下来或增殖。可以通过蛋白印记、免疫细胞化学和FACS分析测定 负责这些效果的细胞通路的激活。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子抑制凋亡的效果。检测了本发明的蛋白质或嵌合分子在体外保护大鼠、小鼠和人皮质神经细胞在含 氧量低和缺乏葡萄糖条件下出现细胞死亡的活性。为此，从大鼠胚胎中提取了细胞培养 物。为了测定本发明的蛋白质或嵌合分子的效果，细胞在含有30mM葡萄糖无血清培养基和 95%潮湿度空气/5% CO2 (含氧量正常)或在不含葡萄糖无血清培养基和95%潮湿度氮气 /5% CO2(低氧和葡萄糖缺乏)条件下，在缺乏或存在本发明的蛋白质或嵌合分子条件下， 在水套培养箱中的模块培养仓中在37°C下维持48小时。细胞培养物暴露于低氧和葡萄糖 缺乏条件下少于24小时并随后恢复到含氧量正常条件下24小时。用Alamar蓝的荧光分 析细胞毒性，该方法通过代谢活性测定细胞活力。
在另一个方法中，神经细胞培养物在含氧量正常条件下，在缺乏或存在不同浓度 的本发明的蛋白质或嵌合分子条件下，暴露于ImM L-谷氨酸或α-氨基-3-羟-5-甲基恶 唑-4-丙酸(AMPA) 24小时。用Alamar蓝的荧光分析细胞毒性，该方法通过代谢活性测定 细胞活力。蛋白质或它的嵌合分子可以影响多种细胞的生长、凋亡、发育或分化。在其它可 检测参数中，这些变化能被细胞内细胞器发育造成的细胞大小变化和胞质复杂度变化所 反映。例如，悬浮培养诱导角质化细胞分化，表现为表面标志物(例如β 1整联蛋白、β integrins)下调，细胞变大，胞质复杂度增加。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它 的嵌合分子对细胞大小或胞质复杂度的效果。FACS测定一束激光入射到细胞上后散射出的光线数量。通常使用提供波长为 488nm的氩激光器。细胞越大，前向光束被阻断的越多，因此前散射水平和细胞大小相关。为 了测定细胞大小的变化，用本发明的蛋白质或嵌合分子处理的细胞被稀释在鞘液(sheath fluid)中并注射进入流式细胞仪(FACSVantage SE,Becton Dickinson)。未处理的细胞作 为对照。细胞通过一束光，光的前向散射数量和细胞大小相关。也可以用FACS测定细胞内细胞器生长和发育的变化(胞质复杂度)。细胞内细胞 器向侧面散射光线。因此，能用上述方法细胞造成的光线侧面散射数量测定胞质复杂度的 变化，并且可以通过测定细胞发出的光线侧面散射水平测定细胞内细胞器的复杂水平和细 胞颗粒度水平。可以使用FACS测定蛋白质或它的嵌合分子对细胞大小或胞质复杂度的效果，来 比较例如20000个处理的细胞发出的信号特征和相等数量的未处理细胞发射的信号。通过 比较不同处理细胞群的信号，能检测细胞大小和胞质复杂度的相对变化。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子对细胞生长、凋亡、发育 或分化的效果。能用染料例如碘化丙啶(propidium iodine)标记处理细胞的DNA来测定蛋白质 诱导的凋亡和细胞生长或细胞周期变化，碘化丙啶的激发波长在488nm区域，发射在620nm 区域。发生凋亡的细胞DNA凝缩，大小和颗粒度也不同。这些因素给出了正向大小散射特征 和荧光信号，并因此将正发生凋亡的细胞群和正常细胞区分开。细胞中的DNA数量也反映 了细胞处于细胞周期的哪个阶段。例如，G2期细胞的DNA数量是Gtl期的两倍。这可以通过 G2期细胞发出两倍的荧光信号得到反映。可以使用FACS比较例如20000个处理的细胞发 出的荧光信号和相等数量的未处理细胞发射的信号，测定蛋白质或它的嵌合分子的效果。本发明的蛋白质或嵌合分子还可以改变多种蛋白质的表达。能使用一种或多种下 述系统测定本发明的蛋白质或嵌合分子对蛋白质表达的效果。为了测定整个细胞中蛋白质表达的增加和降低，可以固定并通透细胞，随后和以 感兴趣蛋白质抗原表位为靶点的荧光素交联的抗体孵育。在氩激光器系统中可以使用很多 种荧光标记。此实验中常使用FITC、Alexa Fluor 488,Cyanine 2,Cyanine 3这些荧光分 子。通过标记细胞表面上只有暴露的表位能被抗体标记的非通透细胞，此方法还能被用于 测定表面标志物和蛋白质的表达变化。可以使用FACS比较例如20000个处理的细胞发出 的荧光信号和相等数量的未处理细胞发射的信号，测定蛋白质或它的嵌合分子的效果。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子对配体/受体粘附的效
70^ ο和那些以前已知理化形式相比，本发明的蛋白质或嵌合分子可能具有更低或更高 粘附性。相互作用可以是和蛋白质受体，因为糖结构(例如选择蛋白，例如L-选择蛋白和 P-选择蛋白)、和细胞外基质成分(例如纤维结合蛋白、胶原、玻璃体结合蛋白和层粘连蛋 白)、或者和非蛋白质成分例如糖分子(硫酸肝素，其它葡萄糖胺聚糖)。蛋白质或它的嵌合分子还可以和非生物材料例如组织培养塑料、医疗器械成分 (例如支架或其它移植物)或牙科材料发生不同的相互作用。对于医疗器械这可能改变移 植物移入率、移植物和特定的细胞类型或和躯体连接类型之间的相互作用可以使用任何合适的蛋白质粘附检测方法。例如，在特定的实施例中，含有本发明 的蛋白质或嵌合分子的溶液和一个固定化表面上的结合配偶体孵育。孵育后，用ELISA检 测溶液中的蛋白质或嵌合分子的数量，残存的和起始材料之间的数量差异是结合到配偶体 上的量。例如，可以用ECM蛋白(例如纤维结合蛋白)第一层包被的96孔板的小孔测定蛋 白质或嵌合分子和细胞外基质蛋白质之间的相互作用。随后和BSA溶液孵育阻止非特异结 合。在清洗后，加入一种已知浓度的蛋白质或它的嵌合分子溶液达确定的时间。随后去除 溶液，测定溶液中残存的蛋白质或它的嵌合分子的量。通过用针对蛋白质或它的嵌合分子 的抗体孵育小孔来测定结合到ECM蛋白上的量，随后用一种合适的系统(或者一种标记的 二抗或者用生物素_亲和素酶复合物例如ELISA所使用的)进行检测。测定结合到其它表面的量的方法可以包括从惰性移植片表面水解蛋白质或它的 嵌合分子，随后测定溶液中的氨基酸。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子对细胞粘附的效果。细胞粘附到基质(例如细胞外基质成分例如纤维结合蛋白、玻璃体结合蛋白、胶 原、层粘连蛋白等)至少部分是通过整联蛋白分子介导的。整联蛋白分子包含α和β-亚 单位，并且α和β-亚单位独特的结合体能增加针对特定配体的结合特异性(例如a2bl 整联蛋白结合胶原、a5bl结合纤维结合蛋白等)。整联蛋白亚单位具有大的细胞外结构域 用于结合配体，和较短的胞浆区结构域用于和细胞骨架相互作用。在存在配体时，胞浆区结 构域负责诱导信号转导事件(外内信号转导)。细胞外信号事件能够调控整联蛋白对它们 的配体的亲和性，随后导致整联蛋白胞质尾区的变化(内外信号转导)。和本发明的蛋白质或嵌合分子孵育可以通过一些方法改变细胞粘附。首先，它能 定性的改变特定整联蛋白亚群的表达，导致结合能力的改变。其次，可以改变特定的整联蛋 白的表达量，导致细胞与其目标基质的结合发生改变。第三，可以在不改变特定的整联蛋白 的表面表达的情况下改变整联蛋白的亲和力(内外信号转导)。所有这些变化都可以改变 细胞对一个谱系配体的结合，或改变对特定的某种配体的结合。可以用通常在96孔板中进行的细胞-ECM粘附检测法检测本发明的蛋白质或嵌合 分子。用基质包被小孔，随后用BSA包被孔中未结合位点。将包被的孔和确定数量的细胞孵 育，随后洗去未结合的细胞，在含有或不含有蛋白质或它的嵌合分子的条件下孵育结合的 细胞。通过间接方法例如MTT/MTS来测定细胞的数量。或者，用放射性标记物(例如51Cr) 标记细胞，在每个孔中加入已知数量的放射活性(即细胞)。测定结合放射活性，计算占加 载数量的比例。细胞还粘附到其它细胞上，例如一群细胞粘附到单层的另一种细胞上。为了检测此情况，悬浮细胞被标记上放射活性并加入到单层细胞上。随后细胞在存在或不存在蛋白 质或它的嵌合分子的条件下孵育。洗去未结合的细胞，溶解残存的细胞混合群体并检测放 射活性。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子对细胞扩展的效果。本发明的蛋白质或嵌合分子对细胞扩展具有不同的效果。细胞开始扩散是细 胞运动性和浸润行为的关键步骤。在体外细胞可以以多种方式开始扩散。将悬浮细胞 铺在ECM成分上将导致通过整联蛋白的粘附和配体结合。这启动了信号转导事件，导致 Cdc42、Rac和Rho小GTPases家族的激活。这些蛋白质的激活导致肌动蛋白聚合和片足 (lamellipodium)延伸，导致细胞逐渐展平并且它们的受体接触到更多的整联蛋白。最终细 胞完全平扁并形成黏着斑(含有整联蛋白和信号蛋白的大结构)。还可以通过用生长因子 刺激粘附的细胞来启动细胞扩展，也导致Cdc42/Rac/Rho蛋白质的激活和黏着斑的形成。可以通过在蛋白质或它的嵌合分子刺激后不同时间点检测大量细胞来对细胞扩 展进行定量。可以使用图像分析软件测定每个细胞的区域，并可以将细胞扩展百分比和细 胞扩展程度和时间进行比较。Cdc42/Rac/Rho通路更强的激活能启动更快速的扩展，此外， 暂时性的，可以在有本发明的蛋白质或嵌合分子时测定它们激活的定性和定量差异。这依 次反映了本发明的蛋白质或嵌合分子诱导的信号事件的变化。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子对细胞运动性、迁移和浸 润的效果。粘附到组织培养皿上的细胞不是静止的保持锚定在一个位点上，而是持续的伸展 和收缩它们的细胞体。当用定时间隔照相观察时，可以观察到细胞在培养板中走来走去，分 离的单个细胞或细胞群体都是如此。这种运动既可以是“随机走动”(即不朝向特定方向)， 也可以是定向的。可以通过加入生长因子增强两种类型的运动。可以使用定时间隔照相在 给定时间段中定量细胞覆盖的总距离和总方向性。在定向迁移中，细胞将通过感受化学梯度并定向它们的迁移机器朝化学弓I诱物的 源头运动。在许多情况下，化学引诱物是生长因子。能通过提供化学引诱物源头(例如通 过长移液管)然后用定时间隔照相对细胞向源头的迁移进行成像，来定量测定定向迁移。测定定向迁移的另一种系统是博伊登室检测。在这个检测中，细胞被置于通过分 割膜中小孔和下室相连的上室中。两个室中都加入生长培养基，但是只在下室中加入化学 引诱物，导致两个室间存在扩散梯度。细胞被生长因子源所吸引并迁移通过分割膜中的小 孔，进入到膜的下表面。数小时后，取走膜并对迁移到膜底部的细胞进行计数测定。细胞浸润过程使用了许多和迁移相同的组件。可以使用细胞浸润多层细胞外基 质来作为细胞浸润模型。例如，基质胶是基底膜成分的混合物(ECM成分，生长因子等)，在 4°C下为液态，但是在37°C迅速形成凝胶。可以利用它来包被博伊登室的上表面，在下层加 入化学引诱物。对于通过到膜下表面的细胞，它们必须使用酶(例如胶原酶和基质金属蛋 白酶(MMP))来降解基质胶并朝化学引诱物进行定向迁移。这个检测模拟了细胞浸润所需 的多种过程。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子对趋化性的效果。在体外可以在博伊登室中测定细胞朝化学引诱物方向的迁移。本发明的蛋白质或 嵌合分子被放置到下室，将合适的靶细胞群放置到上室。可以检测通过一层细胞的迁移，来模拟免疫细胞从血液到炎症部位的迁移的体外过程。用长满的一层细胞包覆博伊登室的孔 的上表面，所述细胞例如上皮、内皮或成纤维细胞，这将阻断免疫细胞直接迁移通过孔中的 洞，免疫细胞将需要粘附到单层细胞上并迁移通过它来到达被检测蛋白处。只在用蛋白质 或它的嵌合分子处理的孔的博伊登室下表面或下孔培养基中存在细胞表明了蛋白质或嵌 合分子的趋化性能力。为了表明此效果是蛋白质或它的嵌合分子特异性的，可以在下室中 让蛋白和中和抗体一起孵育。此外，为了检测一种物质(化学物质、蛋白质、糖)防止趋化性的能力，在博伊登室 的下室中将该物质和含有已知趋化性能力的溶液(可以是特异性趋化因子、细胞来源的或 分泌一系列趋化因子的细胞的条件培养基)一起孵育。随后在上室加入易感细胞群，按上 述进行检测。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子对配体受体_结合的效^ ο本发明的蛋白质或嵌合分子可能具有不同的配体_受体结合能力。可以通过多种 参数测定配体_受体结合，例如，解离常数(Kd)、解离速率常数(k_)、结合速率常数(k+)。配 体-受体结合的差异可能和不同的信号时限和激活有关，导致不同的生物结果。可以通过斯卡恰特作图法或其它方法例如Biacore法来测定和分析配体_受体结
口 O对于斯卡恰特作图法，用例如放射性标记(例如125I)来标记的蛋白质或它的嵌合 分子，在存在不同数量的无放射性的蛋白质或它的嵌合分子的竞争剂的条件下，和表达相 应配体或受体的细胞或其提取物一起孵育。测定特异性结合的标记的蛋白质或它的嵌合分 子的数量，并计算结合参数。对于Biacore法，和蛋白质或它的嵌合分子相对应的重组配体或受体和检测单位 相配对。含有所选蛋白质或它的嵌合分子的溶液随后通过检测细胞，并且通过检测单位特 性的变化来测定结合。通过将含有蛋白质或它的嵌合分子的溶液通过检测细胞直到记录到 一个固定的读数(当所有允许的位点都被占有时)来测定结合速率常数。不含有蛋白质或 嵌合分子的溶液通过细胞，蛋白质从相应配体或受体上解离下来，给出了解离速率常数。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子对受体激活的效果。可以通过细胞内源蛋白诱导的信号事件中的差异来对比蛋白质或它的嵌合分子 和相对应的配体或受体之间的相互作用。可以用蛋白质或它的嵌合分子，用结合/解离速 率常数或解离常数精确的表征相互作用时限。细胞经常内摄激活的受体。随后受体/配体复合物解离(例如，细胞小囊泡中的 低PH导致配体脱离)，并且受体重循环到细胞表面。此外，该复合物也可能成为降解的靶 点。在此过程中，受体将有效下调并且不能产生进一步的信号，但当它们重循环时则能重复 信号过程。不同的受体结合或激活可能导致受体从降解转变为重循环通路，导致更强的生 物响应。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子对信号传导的效果。配体或受体结合到蛋白质或它的嵌合分子上可能通过多种胞浆蛋白发出信号，其 中可能包括反向信号。当膜结合形式的配体通过结合它的可溶性或膜结合形式受体来传导 信号时，反向信号发生。反向信号还可能发生在通过一种抗体结合膜结合配体之后。这些信号事件(包括反向信号事件)导致基因和蛋白质表达的变化。因此，本发明的蛋白质或 嵌合分子能诱导或抑制在不同的通路中的不同的信号传导或其它信号传导事件，例如JAK/ STAT 通路、Ras-erk 通路、AKT 通路的激活，PKC、PKA、Src, Fas, TNFR、NFkB, p38MAPK、c-Fos 的激活，将蛋白质募集到受体，受体磷酸化，受体内摄，受体串扰或分泌。募集到蛋白质或它的嵌合分子上的配体或受体可能对本发明的蛋白质或嵌合分 子是唯一的，因为诱导了配体或受体的不同的构象。测定这些差异的一个方法是用一种交 联到sepahrose小珠上的抗体来免疫沉淀配体或受体。免疫沉淀并清洗后，将蛋白质上样 2D凝胶电源，分析比较点模式。可以切下有差异的点并用质谱鉴定。能使用一种或多种下述系统测定蛋白质或它的嵌合分子对表面标志物的上调和 下调的效果。细胞对本发明的蛋白质或嵌合分子可能具有多种响应。在细胞表面有一系列蛋白 质负责细胞和细胞外基质之间的沟通。通过调控内摄作用和胞吐作用过程，多种蛋白质被 运到和运离细胞表面。在细胞表面发现的典型蛋白质包括受体、结合蛋白、调控蛋白和信号 分子。蛋白质表达和降解率的变化也改变细胞表面蛋白质的水平。一些蛋白质还被储存于 细胞内容器中，特殊信号能诱导蛋白质在这些容器和细胞膜之间的运输。细胞在含有本发明的蛋白质或嵌合分子的培养基中孵育合适的时间，和暴露在相 同的不含有本发明的蛋白质或嵌合分子的培养基中的细胞相比较。能溶解细胞膜上的蛋白 质并通过离心和细胞分离。能用蛋白质印记法测定特定的蛋白质的表达水平。还可以用荧 光素交联的抗体标记细胞，用共聚焦显微镜系统可视化或通过荧光激活细胞分选法(FACS) 计数。这将检测出细胞上蛋白质表达和分布的任何变化。还可以通过使用多个抗体，利用 共聚焦显微镜和免疫沉淀研究蛋白质相关作用的变化。相似的，这些实验可以扩展到体内 动物模型中。可以从用本发明的蛋白质或嵌合分子处理的动物特定部位提取细胞，用相同 的方法进行检测。通过在体外或体内加入本发明的蛋白质或嵌合分子诱导分化的细胞将表达不同 的标志物，该标志物将这些细胞和为处理细胞区分开。一些细胞，例如，祖细胞或干细胞，能 分化为多种同工型，通过它们的表面标志物区分。一个本发明的蛋白质或嵌合分子可能刺 激祖细胞按特定的比例分化为多种同工型。本发明的蛋白质及其嵌合分子有可能对细胞排斥有效。蛋白质或它的嵌合分子在调控细胞和神经元生长和指向的效果是方便的细胞排 斥检测方法。破坏亚单位和蛋白质其它组件之间的相互作用是抑制蛋白质或它的嵌合分子的 生物效果的一种方法。通过多种方法鉴定抑制这种生物效果的化合物。高通量筛选项目使用小化学实体库(化合物或肽)来产生先导化合物用于临床开 发。可以使用一些检测方法来筛选库中的化合物影响生物相关终末点的能力。在一次检测 中的一个单独小孔中检测库中每个有潜力的化合物，确定化合物的效果。下面提供了一些 检测的实施例。对这种检测，细胞被铺到微量板(96孔板、384孔板等)中。细胞将具有蛋白质或 它的嵌合分子激活的读出机制。这可以包括检测细胞生长、检测特定通路的刺激(例如基 于FRET的技术)、检测报告基因的诱导(例如CAT、β -半乳糖苷酶、荧光蛋白)、检测凋亡和检测分化。随后细胞在存在或缺乏特定小分子的条件下暴露于本发明的蛋白质或嵌合分 子中。可以在加入蛋白质或它的嵌合分子之前、之后或之中加入药物。在合适的时间段后， 使用合适的方法对个别孔读数(例如FRET的荧光或荧光蛋白的诱导，MTT中的细胞数量， β-半乳糖苷酶活性等)。不加入任何药物或细胞因子的对照孔作为比较。任何能够抑制 受体/细胞因子复合物的分子将给出和对照不同的读数。还需要进一步的实验来显示抑制 的特异性。此外，药物可能通过非细胞因子、非受体机制来影响检测方法(假阳性)。蛋白质或它的嵌合分子的配体或受体被固定化在固体表面。随后加入蛋白质或它 的嵌合分子和待检测化合物。可以先加入蛋白质或它的嵌合分子，随后加入化合物；先加入 化合物，随后加入蛋白质或它的嵌合分子；或者化合物和蛋白质或它的嵌合分子一起加入。 随后通过合适的检测抗体检测结合的蛋白质或嵌合分子。可以用一种酶(例如用于比色法 检测的碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)或一种用于荧光检测的荧光标签标记检测抗体。此 外，可以用一种合适的技术标记(例如生物素、放射性标记)蛋白质或嵌合分子并用一种 合适的技术(例如，对于生物素标记，抗生物素蛋白链菌素和比色检测系统；对于放射性标 记，溶解复合物并计数)检测。通过和对照孔相比读数的下降来测定蛋白质结合的抑制。蛋白质或它的嵌合分子的可溶性配体或受体结合在小珠上。这种结合反应既可以 是一种吸附过程也可以涉及将它们化学交联到板上。在一个合适的小孔中将小珠和蛋白质 或嵌合分子和一种候选化合物孵育。可以先加入蛋白质或嵌合分子，随后加入化合物；先加 入化合物，随后加入蛋白质或嵌合分子；或者将化合物和蛋白质或嵌合分子一起加入。随后 加入荧光标记的识别一种蛋白质或它的嵌合分子的检测抗体。去除未结合的抗体并将小珠 通过FACS。如果化合物抑制蛋白质或它的嵌合分子和它的受体的相互作用，检测的荧光数 量将会下降。为了筛选蛋白质及其相应配体/受体和一种抑制化合物之间的多个相互作用，需 要使用FACS仪器分析散射特征的能力。更大直径的圆珠将具有和较小圆珠不同的散射特 征，并可以被分离出用于分析(“gating”)。—些不同的蛋白质，其中一种是本发明的蛋白质或嵌合分子，都交联到具有特定 直径的圆珠上。随后在含有一种候选化合物的圆珠混合液中加入上述蛋白质的配体/受 体混合物。随后用一种特异性的荧光标记的二抗检测结合的配体/受体。抗体可以全部 标记上相同的检测荧光基团。随后通过在FACS仪器上运行样品并对每个已知大小的圆珠 gating来测定化合物阻止蛋白质结合它的配体/受体的能力。随后分别分析单独的每个结 合结果。这个分析方法的主要好处是可以用一些蛋白质平行检测筛选的每个化合物，相应 的减少了筛选时间。蛋白质或它的嵌合分子还可以通过其晶体结果进行表征。蛋白质或它的嵌合分子 的理化形式可以提供唯一的3维晶体结构。此外，还可以使用本发明的蛋白质或嵌合分子 产生蛋白质_配体/受体复合物的晶体结构。因为本发明提供了和人天然存在形式基本上 相似的蛋白质或它的嵌合分子，该复合物有可能是天然存在的蛋白质_配体/受体复合物 的体内结构的更合适的代表。一旦获得晶体结构，就能确定蛋白质或它的嵌合分子和潜在 的抑制这种相互作用的化合物之间的相互作用。一旦通过高通量筛选或从蛋白质-配体/受体复合物晶体结构中确定潜在的化合 物，就可以开始进行理性设计药物过程。
在根据具有设计指定特性的化合物进行模拟物设计中通常采用一些步骤。首先， 确定在决定所需特性中关键的和/或重要的化合物特定部位。对于肽来说，可以通过系统 性的改变肽中的氨基酸残基来完成上述工作，例如依次置换每个残基。常使用丙氨酸扫描 来精炼这种肽基序。这些部分或残基构成了化合物的活性部位，所述活性部位被称为它的 药效基团。一旦发现了药效基团，根据它的物理特性使用一系列来源的数据来模型化其结 构，所述物理特性例如立体化学、成键、大小和/或电荷，所述系列来源的数据例如分光镜 技术、X射线衍射数据和核磁共振。在这个建模过程可以使用计算分析、相似性做图(药效 基团的电荷和/或体积模型，而不是原子间的成键)和其它技术。在这个方法的一个变体中，制作配体及其结合伴侣的三维结构模型。这对于配体 和/或结合伴侣在结合时改变构象尤其有用，在设计模拟物中能让建模考虑到这个问题。 可以使用建模来产生和线性序列或一种3维构象发生相互作用的抑制剂。随后选择可以将模拟药效基团的化学基团移植上去的模板分子。可以方便的选择 模板分子和移植上去的化学基团，因此模拟物是容易被合成的，有可能是药理学上可接受 的，并且在体内不降解，保持着先导化合物的生物活性。或者，当模拟物是基于肽时，可以通 过将肽环化来得到进一步的稳定性，增加其刚性。随后可以筛选通过这种方法发现的模拟 物来观察它们是否具有目标特性，或者它们表现出多大程度的目标特性。随后可以进行进 一步的优化或修饰，将一个或多个最终的模拟物进入体内或临床检测。 理性药物设计的目标是产生感兴趣的生物活性多肽或者小分子的结构类似物，它 们和这些多肽或小分子相互作用(例如激动剂、拮抗剂、抑制剂或增强剂)，以便于形成药 物，例如，更有活性或更稳定的多肽形式，或者，例如在体内增强或干扰多肽的功能。见，例 如Hodgson (Bio/Technology 9 19-21，1991)。在一个过程中，首先通过X射线衍射晶体分 析法、通过计算机建模或最典型的、通过多种方法相结合来确定感兴趣的蛋白质的三维结 构。还可以通过基于同源蛋白质的结构建模来获得关于多肽结构的有用信息。一个理性 药物设计的例子是开发HIV蛋白酶抑制剂(Erickson et al. Science249 :527_533，1990)。 此外，可以通过丙氨酸扫描来分析目标分子(Wells、Methods Enzymol 202:2699-2705， 1991)。在这个技术中，一个氨基酸残基被Ala置换，并确定它对肽活性的影响。用这种方 式分析肽的每个氨基酸残基来确定肽的重要区域。还可能分离出靶标特异性抗体，通过功能分析选择，并随后解析它的晶体结构。原 则上，这个方法产生一个药物核心，可以基于它进行后续的药物设计。有可能通过对一个有 功能的、有药理学活性的抗体产生抗独特型抗体来完全省略蛋白质蛋白质晶体学。抗独特 型抗体的结合位点作为镜像图像的镜像图像，因此被期待为原始受体的类似物。因此抗独 特型抗体能被用于从化学或生物产生的肽库中鉴定并分离肽。随后用选择的肽作为药物核 心。在一方面，本发明的蛋白质或嵌合分子被用作免疫源来产生抗体。本发明的蛋白 质或嵌合分子的理化形式能增加针对蛋白质或嵌合分子的抗体；针对本发明的蛋白质或嵌 合分子的糖肽的抗体；或直接针对蛋白质或它的嵌合分子中的另一个翻译中或翻译后修饰 的肽的抗体。本发明的蛋白质或它的嵌合分子可能具有体内正常情况下不易接近(但是有可能存在)的表位。例如，有可能在受体结构域内存在一个在正常情况下和一个异侧受体的 一部分接触的区域。可以用这些表位产生和内源受体交叉应答的单克隆抗体。这种抗体可 以阻断一个受体元件和另一个的相互作用，并因此防止信号传导。这可以在过量表达细胞 因子或受体时用作治疗使用。抗体还可以在受体过量表达并且不需要配体就产生信号时用 作治疗使用。抗体还可以用于在治疗疾病中检测蛋白质或它的嵌合分子的水平(例如，血清水 平来确定半衰期)。此外，抗体可用于诊断测定在特定样品中是否存在本发明的蛋白质或嵌合分子。所提到的“抗体”包括所提到的抗体的所有形式，包括但不限于全抗(例如含 有完整的Fc区域)，包括例如单克隆抗体；抗原结合抗体片段，包括例如Fv、Fab、Fab'和 F(ab' )2片段；人源化抗体；人类抗体(例如，在转基因动物或通过噬菌体展示技术产生的 抗体)；和通过基因工程技术产生的免疫球蛋白衍生肽。和其它的特指的不同，术语“抗体” 和如此处所述包括全抗和它的抗原结合片段。除非另外指出，本发明关于抗体的特异性表示该抗体基本上只结合它的目标抗 原，没有无关蛋白的可感知的结合。但是，有可能一个抗体将被设计或选择为结合两个或更 多的相关蛋白质。相关蛋白质包括不同相同蛋白质或来自于不同物种的同源蛋白的剪接变 体或片段。这种抗体还被认为对那些蛋白质有特异性，并被包括于本发明中。术语“基本 上”意味着在这个背景下对非目标抗原没有高于基底水平的可检测的结合，即非特异性。可以通过熟知的方法制备本发明的抗体。参见，例如，MonoclonalAntibodies, Hybridomas :A New Dimension in BioIogicalAnalyses, Kennet 等人(eds.), Plenum Press, New York(1980)；禾口 Antibodies :A Laboratory Manual, Harlow 禾口 Lane (eds.), ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY, (1988)。产生本发明的抗体的一个方法包括用动物产生的一个本发明的蛋白质或嵌合分 子或它的免疫原性部分(例如，一个包含受体结合结构域的肽，抗体通过受体结合结构域 来结合一个蛋白质或它的嵌合分子中的多肽或免疫原性部分)免疫一个非人动物，例如一 只小鼠或一只转基因小鼠。有多种方法来增加特定蛋白质或它的嵌合分子的抗原性，例如 给予佐剂或共轭抗原，包括针对所需抗体响应的抗原和另一个元件，这些方法都是本领域 所熟知的并且是可以采用的。典型的免疫法包括最初的免疫和随后的一系列增强免疫。可 以对动物取血并分析血清中的抗体滴度。可以对动物进行增强，直到达到滴度的平台期。可 以在重组细胞培养物中用蛋白质融合制备共轭剂。同样，聚集剂例如明矾适用于增强免疫 响应。多克隆和单克隆抗体都可以通过这个方法制备。获得两种类型抗体的方法是本领 域熟知的。多克隆抗体使用较少但相对容易的制备，用有效数量的本发明的蛋白质或嵌合 分子或它的免疫原性部分注射合适的动物，从动物中收集血清并使用任何已知的免疫吸附 技术分离特异性的针对蛋白质或它的嵌合分子的抗体。通过此方法产生的抗体使用相对较 少，因为产品存在潜在的不均一性。使用单克隆抗体被显著偏爱的原因是它们可以大量生产，并且产品具有同质性。 可以通过常规方法生产单克隆抗体。此处使用的术语“单克隆抗体”是指从大量的同质性抗体中获得的抗体，S卩，由除了少量存在的可能的天然产生的突变以外相同的群体组成的单独抗体。单克隆抗体是高特 异性的，直接针对单一的抗原位点。此外，和典型的包括针对不同抗原决定簇(表位)的不 同抗体的多克隆抗体制剂不同，每个单克隆抗体直接针对抗原上单一的抗原决定簇。修饰 语“单克隆”是指抗体的特征是从充分同源抗体群体中获得的，而不是解释为需要通过任何 特定的方法产生抗体。例如，依照本发明所使用的单克隆抗体可以通过Kohler等人Nature 256 =495(1975)首先公布的杂交瘤方法来制备，或可以通过重组DNA方法制备(见，例如美 国专利号4816567)。“单克隆抗体”还可以从噬菌体抗体库中分离，使用例如Clackson等 人 Nature 352 :624_628，1991 和 Marks 等人 J Mol Biol 222 :581_597，1991 所述的方法。本发明设想了一种产生一种杂交瘤细胞系的方法，包括用本发明的蛋白质或嵌合 分子免疫一种非人动物，例如小鼠或转基因小鼠；从免疫的动物中收获脾细胞；将收获的 脾细胞和骨髓瘤细胞系融合来产生杂交瘤细胞；并且鉴定生产能结合一种蛋白质或它的嵌 合分子的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这种杂交瘤细胞系和它们产生的单克隆抗体被包括在本发明中。通过常规技术纯 化杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。可以进一步筛选杂交瘤或它们产生的单克隆抗体来鉴 定出带有所需的特定特性的单克隆抗体，例如通过细胞因子受体抑制其信号的能力。在生产本发明的抗体的最初阶段可以用于免疫动物的蛋白质或它的嵌合分子或 它的免疫原性部分应该来自于人表达来源。可以通过常规方法产生本发明的抗体的抗原结合片段。这种片段的实例包括但 不限于Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段，包括单链Fv片段(命名为sFv或scFv)。通过 遗传工程产生的抗体片段和衍生物，例如二硫化稳定的Fv片段(dsFv)、单链可变区结构域 (Abs)，根据本发明，还设想了微型抗体和双体用于使用。可以通过已知技术制备这种直接针对蛋白质或它的嵌合分子的单克隆抗体的片 段和衍生物并筛选所需特性，所述技术包括此处所述的检测。这些检测提供了鉴定能结合 蛋白质或它的嵌合分子的本发明的抗体的片段和衍生物的方法，并能鉴定那些还保留抑制 蛋白质或它的嵌合分子的信号的活性的片段和衍生物。这些技术必然包括分离编码感兴趣 的mAb中的多肽链(或它的一部分)的DNA，和通过重组DNA技术操作这些DNA。可以通过 将DNA融合到另一个感兴趣的DNA上或其它方法(例如通过诱变或其它常规技术)来增加、 删除或替换一个或多个氨基酸残基。可以从已经用本发明的蛋白质或嵌合分子免疫的小鼠的B细胞中分离编码抗体 多肽的DNA(例如重或轻链、仅可变区或全长)。可以使用常规程序分离DNA。噬菌体展示 是另一个已知技术的例子，通过它可以制备抗体的衍生物。在一种方法中，在任何合适的重 组表达系统中表达作为一种感兴趣抗体的一部分的多肽，并且表达的多肽可以被组装形成 抗体分子。可以通过氨基酸桥(短肽联结子)将重链和轻链可变区(Fv区)片段连接起来 形成单链抗体，形成一个单多肽链。通过在编码两个可变区多肽(VL和VH)的DNA之间融 合编码多肽联结子的DNA来制备这种单链Fvs (scFvs)。根据两个可变结构域之间的灵活 的联接子的长度，所得抗体片段能形成二聚体或三聚体(Kortt等人ProteinEngineering 10 :423，1997)。发展出来的生产单链抗体的技术包括美国专利4946778 ；Bird (Science 242 :423、1988)，Huston 等人(ProcNatl Acad Sci USA 85 :5879，1988)和 Ward 等人
78(Nature334 =544,1989)所述技术。此处提供的从抗体衍生出的单链抗体被包括在本发明中。在一个实施例中，本发明提供了能结合本发明的蛋白质或嵌合分子并抑制蛋白质 或它的嵌合分子的信号的抗体的抗体片段或嵌合分子、重组子或合成形式。已知技术能从感兴趣的抗体中取得不同亚类或同种型的抗体，S卩，亚类转换。因 此，例如可以从IgM单克隆抗体得到IgGl或IgG4单克隆抗体，反之亦然。此技术可以产生 拥有指定抗体(母抗体)的抗原结合特性的新抗体，但还显示和母抗体不同的抗体同种型 或亚类所具有的生物学特性。可以采用重组DNA技术。在此过程中可以使用编码特定抗体多肽的克隆DNA，例如 编码所需同种型抗体的恒定区的DNA。可以在动物中使用上述单克隆生产过程，例如小鼠，来生产单克隆抗体。从这些动 物中得到的平常抗体，例如小鼠抗体，通常被认为不适合用于人体，因为它们会引起免疫应 答。因此，这种抗体可能需要修饰来适用于人体。制备嵌合分子和/或人源化抗体的过程 是本领域所熟知的，将在下面进一步详述。此处的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链可变结构域和来 自于非人物种(例如小鼠)的抗体的相应序列相同或同源，而链中的其余部分和来自于人 体的抗体的相应序列相同或同源，这种抗体的片段也是这样，因此它们表现出所需的生物 学活性(美国专利 4816567 ；和 Morrison 等人.Proc Natl Acad Sci USA81 :6851_6855， 1984)。非人(例如小鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其中含有少量的来自于非人 免疫球蛋白的序列。对于大多数的部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中 接受者抗体的互补决定区(CDRs)被非人物种(供体抗体)相应的CDRs所替换，所述非人 物种例如拥有所需特性(例如特异性和亲和性)的小鼠、大鼠、兔子或非人灵长类动物。在 一些例子中，人免疫球蛋的框架区残基被相应的非人残基替换。并且，人源化抗体可以包含 在接受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰来进一步精炼抗体的性能。总 之，人源化抗体将基本上包含所有至少一个，并且典型是两个的可变结构域，其中所有的或 基本所有的互补决定区对应于非人免疫球蛋白，并且所有的或大体所有的框架区残基是人 免疫球蛋白序列。人源化抗体还将可选的含有至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fe)，典型 的是人免疫球蛋白。进一步的细节参见Jones等人Nature 321 -.522-525,1986 ；Reichmann 等人Nature 332:323-329,1988 ；Presta,Curr Op Struct Biol2 :593_596，1992 ;Liu等人 Proc Natl Acad Sci USA 84 :3439，1987 ;Larrick 等人 Bio/Technology 7 :934，1989 ；和 Winter 和 Harris，TIPS 14:139,1993。在进一步的实施例中，本发明提供了免疫检测试剂盒，能检测一种生物制品中的 人细胞所表达的人蛋白质的水平，所述生物制品包括包含天然产生人蛋白的生物制品。本发明的能使用免疫检测试剂盒检测的生物制品包括但不限于实验室样品、细 胞、组织、血液、血清、血浆、尿、粪便、唾液和痰。本发明的免疫检测试剂盒包含一种固相支持基质，不限于但包括一种膜、浸渍片、 珠、凝胶、管或多孔、平底、圆底或ν形底的微量培养板，例如96孔板；直接针对感兴趣的人 蛋白质的抗体制剂(捕获抗体)；包被溶液制剂(例如BSA或酪蛋白)；二抗制剂(检测抗体)，直接针对感兴趣的人蛋白质并与合适的检测分子(例如碱性磷酸酶)共轭；一种显色 底物溶液(例如硝基四偶氮蓝)；一种添加底物溶液(例如5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐)； 一种底物缓冲液母液(例如0. IM Tris-HCL(pH7. 5)和0. IM NaCl, 50mM MgCl2)；已知浓度 (标准)的本发明的蛋白质或嵌合分子的制剂；和使用说明书。可以从包括酶、染料、荧光分子、化学发光剂、同位素或胶体金等试剂的列表中选 择合适的检测分子结合到包括(但不限于)葡萄球菌蛋白A或链球菌G蛋白等分子上。在一个具体实施方案中，捕获和检测抗体是单克隆抗体，其制备包括用本发明的 蛋白质或嵌合分子免疫非人动物，例如小鼠或转基因小鼠，随后如上文所述进行标准方法。 单克隆抗体还可以二选一的用重组的方法生产，如上文所述，并可以包括人或嵌合抗体部 分或结构域。在另一个实施方案中，捕获和检测抗体是多克隆抗体，其制备包括用本发明的蛋 白质或嵌合分子免疫非人动物，例如小鼠或兔子、羊或马，随后如上文所述进行标准方法。检测试剂盒的组件按预定比例提供，不同试剂的相对数量适当的变化来维持溶液 中的试剂浓度，让检测灵敏度基本上最大化。特别地，可以以干粉的方式提供试剂，通常是 冻干的，包括辅料，溶解后让每个试剂溶液对于待测的生物制品都具有合适的浓度使用说明书可以详细介绍本发明的免疫检测试剂盒的使用方法。例如，使用说明 书可以介绍用配制的捕获抗体溶液在合适的浓度下包被固相支持基质的方法，例如4°C过 夜。使用说明书可以进一步详细介绍用配制的包被溶液包被非特异性蛋白质结合位点的方 法；在合适条件下(例如37°C 1小时或室温2小时)加入系列稀释的含有本发明的蛋白质 或嵌合分子的样品并孵育，随后使用本领域已知的合适的缓冲液进行系列清洗，例如含有 0.05%吐温20的0. IM PBS (pH7. 2)溶液。此外，说明书可以提供，应用检测抗体制剂后在 合适条件下进行孵育，例如，37°C 1小时或室温2小时，随后进行一系列清洗。利用提供的 检测底物和底物缓冲液制备检测缓冲液的工作溶液，随后加入每个孔中，保持在合适的条 件下，从室温5分钟到37°C 1小时。可以通过加入IN NaOH或2N H2SO4终止产色反应。在另一个备选的实施方案中，使用说明书可以提供能够同时按预订比例加入的待 加入的任何或所有上述组分的任何组合，不同试剂的相对数量适当的变化来维持溶液中的 试剂浓度，让复合物形成所产生的可检测信号基本上最大化。可以使用ELISA平板读出器或分光光度计，在合适的光密度(OD)下，或作为激发 光，使用分光光度计、荧光计或流式细胞仪，在合适的波长下，或使用放射性计数器，在合 适的能谱下，或通过光密度计，或通过和图表或指标进行视觉比较，检测有色产物或荧光 或化学发光或放射性或其它通过结合、共轭连接检测试剂产生的信号的水平。和上述样 品平行检测标准制剂的系列稀释溶液。产生标准曲线或图表，根据标准曲线或图表内插 (interpolated)计算样品中蛋白质或它的嵌合分子的水平。本发明还提供了人衍生蛋白或它的嵌合分子，用作免疫检测中的标准蛋白。本发 明还进一步扩展到一种测定在生物制品中人细胞表达的人蛋白或它的嵌合分子的水平的 方法，包括合适的测定人蛋白或嵌合分子的测定法，该检测法包括(a)将生物制品和一种 或多种直接针对人蛋白或它的嵌合分子的抗体相结合，(b)测定该抗体或每个抗体结合生 物制品中人蛋白或嵌合分子的水平；(c)将标准人蛋白或一种嵌合分子样品和一种或多种 之间针对人蛋白或嵌合分子的抗体相结合；(d)测定该抗体或每个抗体的结合生物制品中人蛋白或嵌合分子的水平；(e)比较该抗体或每个抗体结合生物制品中人蛋白或嵌合分子 的水平和该抗体或每个抗体结合标准人蛋白或嵌合分子样品的水平；尤其是，标准人蛋白或嵌合分子样品是一种包含本发明的蛋白质或嵌合分子的制 剂。生物制品包括但不限于实验室样品、细胞、组织、血液、血清、血浆、尿、粪便、唾液 和痰。如上文所述或通过本领域已知的方法，生物制品能结合一种或多种捕获抗体。例如， 首先用制备的捕获抗体溶液在合适的条件下包被固相支持基质(例如，4°C过夜)；随后用 制备的包被溶液封闭非特异性蛋白质的结合位点；随后加入含有本发明的蛋白质或嵌合分 子的系列稀释样品并在合适的条件下孵育(例如37°C 1小时或室温2小时)，随后使用本 领域已知的合适的缓冲液进行系列清洗(例如含有0. 05%吐温20的0. IM PBS (pH7. 2)溶 液)。随后，生物制品和一种或多种结合有如此处所述的合适的检测分子的检测抗体相 结合。例如，应用检测抗体制剂后在合适条件下进行孵育(例如，37°C 1小时或室温2小 时)，随后进行一系列清洗。可以如上文所述或通过本领域已知的方法测定结合水平。例如，利用检测底物和 底物缓冲液制备检测缓冲液的工作溶液，随后加入每个孔中，保持在合适的条件下，从室温 5分钟到37°C 1小时。可以通过加入IN NaOH或2N H2SO4终止产色反应。在一个具体实施方案中，本发明如上文所述设想了一个分离的蛋白质或嵌合分子。在具体的实施方案中，本发明的GM-CSF以多个理化参数(Px)和药理学特性(Ty) 为特征，包括表观分子量(P1),其值为5至60，如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、56、57、58、59、60，在一个具体的实施方案 中为 16-40kDa。本发明的 GM-CSF 的 pi (P2)约为 1 至 10，如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，在一 个具体的实施方案中为2-7，包括至少1至36个同工型，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36 在一个 具体的实施方案中为10-30个同工型(P3)。本发明的GM-CSF糖类百分比(P5)为1至99， 如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99，在一个具体的实 施方案中为0-76%，进一步具体的实施方案中为0-65%。N-连接寡糖去除后，该分子实测 分子量(P6)为10-35kDa，在一个具体的实施方案中为12-30kDa。N-连接和0-连接寡糖去 除后实测分子量(P7)为9-30kDa，在一个具体的实施方案中为11至25kDa。本发明的GM-CSF酸性单糖含量百分比(P8)为2至20%如2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20%，在一个具体的实施方案中为 6_11%。当以 GalNAc 为 标准，本发明的GM-CSF单糖(P9)和唾液酸含量(P10)为1 0-3海藻糖，1 1-16 GlcNAc, 0.1 0.1-9半乳糖，1 0.1-9甘露糖及1 0-5 NeuNAc，在一个具体的实施方案中 为 1 0.1-1. 5 海藻糖，1 2-12 GlcNAc,! 1. 0-6. 0 半乳糖，1 1.0-6. 0 甘露糖，及1 0-3.0 NeuNAc ；当用 3 倍甘露糖为标准，为 3 0-5 海藻糖，3 0. 1-3 GalNAc, 3 2-15 GlcNAc, 3 1-6半乳糖，3 0-4 NeuNAc，在一个具体的实施方案中为3 0.1-2. 5海藻糖， 3 0. 5-2. 5 GalNAc, 3 5. 0-10. 0 GlcNAc, 3 2. 0-5. 半乳糖，及 3 0-3. 0 NeuNAc。 N连接寡糖(P13)中性百分比为 40 至 90%，如 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90%，在一个具体的实施方案中为 49 至 83%，在 具体的实施方案中为54为78 %，进一步具体的实施方案中为59至73%。N-连接连接的酸 性百分比(P14)为10%至70%，在一个具体的实施方案中为17%至51%，在具体的实施方 案中为22%至46%，进一步具体的实施方案中为27至41%。0连接的寡糖中性百分比(P15) 为5为90%，如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90%，在一个具体的实施方案中为 9 至 82%，在 具体的实施方案中为29至62 %，进一步具体的实施方案中为34至57%。0-连接寡糖的酸 性百分比(P16)约为10至100%，在一个具体的实施方案中为18至91%，在具体的实施方 案中为38至71%，进一步具体的实施方案中为43至66%。本发明的GM-CSF N-连接糖基 化位点(P21)包括N-44和N-54 (由信号序列起始处开始编号)，这些位点由PNGase处理后 PMF识别。本发明的GM-CSF的血清/血浆稳定性(Tltl)与非人细胞中表达的人GM-CSF不 同，尤其是在用胎牛血清孵育TF-I 24小时后，前者比E. coli中表达的GM-CSF表现出更强 的增殖活性。本发明的GM-CSF和增殖活性(T32)不同于非人系统表达的人GM-CSF。本发 明的GM-CSF增殖活性(T32)强于E. coli中表达的人GM-CSF约5_12倍。其分化活性(T33) 也与非人细胞中表达的GM-CSF不同，与E. coli表达的GM-CSF相比，前者诱导TF-I克隆形 成的能力强1.5-2倍。 在具体的实施方案中，本发明的IL-3分子以一个或多个理化参数(Px)和药理学 特性(Ty)为特征，包括表观分子量(P1),其值由1至250，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、 200、210、220、230、240、250kDa，在具体的实施方案中为 15 至 35kDa。IL-3 的 pi (P2)为 2 至 14，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在具体的实施方案中为3. 5-7. 5，具有约 2 至 50， 如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、
29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个同工型，在 具体的实施方案中为5-15个同工型(P3)。IL-3分子糖类百分比(P5)为0至99%，如0、1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、
30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%，在具体的实施方 案中为0至60%。N-连接寡糖去除后，本发明的IL-3的实测分子量为(P6)为8-30kDa在
82一个具体的实施方案中为10到25kDa。当以GalNAc为标准，本发明的IL-3单糖含量(P9) 为 1 0.1-8 海藻糖，1 0.1-7 GlcNAc,l 0. 1-3 半乳糖，1 0. 1-3 甘露糖及 1 0-5 NeuAc ；在一个具体的实施方案中为1 2-6海藻糖，1 3-5 GlcNAc, 1 0. 5-2半乳糖， 1 0.5-2甘露糖及1 0-2NeuNAc ；当用3倍甘露糖为标准，为3 2-25海藻糖，3 0.1-6 GalNAc, 3 4-21 GlcNAc, 3 0.1-9 半乳糖，及 3 0-5 NeuAc ；在一个具体的实施方案 中为 3 5-16 海藻糖，3 2-4 GalNAc, 3 9-14 GlcNAc, 3 3-6 半乳糖及 3 0.1-2 NeuAc0本发明的IL-3分子唾液酸表示为单糖含量百分比(Pltl)，其为0至50%，如0，1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50%，在一个具体的实 施方案中为0至20%。本发明的IL-3的N-连接IL-3寡糖中性百分比(P13)为70至100%， 在一个具体的实施方案中为75至95%，在具体的实施方案中为80至90%。本发明的IL-3 的N-连接IL-3寡糖酸性百分比(P14)为0至30%，在一个具体的实施方案中为5至25%， 在具体的实施方案中为10至20%。本发明的IL-3的免疫反应特性(T13)与非人细胞中表 达的人IL-3不同，尤其是用含有用非人细胞表达的人IL-3的ELISA试剂盒检测时，本发明 的IL-3的蛋白浓度被低估。此外，本发明的IL-3(T13)与昆虫细胞中表达的人IL-3不同。 本发明的IL3的增殖能力(T32)不同于在非人系统中表达的IL-3，本发明的IL-3的增殖能 力(T32)较E. coli表达的人IL-3强1. 1-2. 5倍。 在具体的实施方案中，本发明的IL-4分子以一个或多个理化参数(Px)和药理学 特性(Ty)为特征，包括表观分子量(？^，其值由！至口。^^』』、*^』、？^、、^)、^、^、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、 110、lll、112、113、114、115、116、117、118、119、120kDa，在具体的实施方案中为 12 至 24 kDa。IL-4 的 pI(P2)为 2 至 14，如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在具体的实施方案 中为 8-11，具有约 2 至 50、如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、
22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、
47、48、49、50个同工型，在具体的实施方案中为1_3个同工型(P3)。IL-4分子糖类百分比 (P5)为 0 至 99%，如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、
48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99%，在具体的实施方案中为0至25%。^连接寡糖去除后，本发明的仏-4的实测分子 量(P6)为8-24kDa，在具体的实施方案中为10至20kDa。而当0-连接及N-连接寡糖均去 除后，检测到的IL-4分子量(P7)为8-22kDa，在一个具体的实施方案中为10_18kDa。本发 明的IL-4的N-连接的寡糖中性百分比(P13)为50%-100%，在一个具体的实施方案中为 65-100 %，在具体的实施方案中为70-100 %。本发明的IL-4的N连接寡糖酸性百分比(P14) 为0-50%，在具体的实施方案中为0-45%，在具体的实施方案中为0-30%。本发明的IL-4 的N-连接糖基化位点(P21)包括N-62 (由信号序列起始处开始编号)，用PNGase处理后通过 PMF 识别。二硫化骨架结构(P33)包括 Cys27-Cysl51、Cys48-Cys89 及 Cys70-Cysl23(由 信号序列起始处开始编号半胱氨酸残基)。在具体的实施方案中，本发明的IL-4的免疫反应特性(T13)与非人细胞中表达的 人IL-4不同，尤其是用含有在非人细胞系统表达的人IL-4的ELISA试剂盒检测时，本发明 的IL-4的蛋白浓度被低估。本发明的IL-4的增殖活性(T32)不同于非人细胞系统表达的 人IL-4，与E. C0 1 i表达的人IL-4相比，本发明的I L-4增殖活性(T32)高25-54倍；与 CHO细胞表达的人IL-4相比，本发明的IL-4增殖活性(T32)高1. 7 5倍。用提高了的温度 预孵育后，本发明的IL-4的增殖活性(T32)也与非人细胞系统表达的人IL-4不同。用培 养基37°C下预孵育TFl细胞4天后，本发明的IL-4的(T32)值较E. coli表达的GM-CSF高 13-30 倍。在具体的实施方案中，本发明的IL-5分子以一个或多个理化参数(Px)为特征， 包括表观分子量(P1),其值由 1 至 250，如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、 113、114、115、116、117、118、119、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、 240、250kDa，在具体的实施方案中为 15 to 25kDa。IL-5 的 pi (P2)为 2 至 14，如 2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14，在具体的实施方案中为4-9，具有约2-50个，如2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 个同工型，在具体的实施方案 中为5-12个同工型(P3)。IL-5分子的糖类含量百分比(P5)为0至99%，如0、1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%，在具体的实施方案中为 10-50%。N-连接寡糖去除后，本发明的IL-5实测分子量(P6)为9-30kDa，在具体的实施 方案中为ll_25kDa。而当0-连接及N-连接寡糖均去除后，检测到的IL-5分子量(P7)为 8-27kDa，在一个具体的实施方案中为10-22kDa。当以GalNAc为标准，IL-5的单糖含量(P9) 为 1 0.1-3 海藻糖，1 0.5-7 GlcNAc,l 0. 05-3 半乳糖，1 0. 1-3 甘露糖及 1 0-5 NeuNAc ；在一个具体的实施方案中为1 0-0. 5海藻糖，1 2-4.5 GlcNAc, 1 1-2半乳 糖，1 1-2甘露糖及1 0.1-1 NeuNAc ；当用3倍甘露糖为标准，为3 0. 1-3海藻糖， 3 0. 1-4 GalNAc, 3 1-17 GlcNAc, 3 1-8 半乳糖，及 3 0-5 NeuNAc ；在一个具体 的实施方案中为3 0-1海藻糖，3 2-3 GalNAc, 3 3-12 GlcNAc,3 2-5半乳糖及 3 0.2-1 NeuNAc0本发明的IL-5分子唾液酸表示为单糖含量百分比(Pltl)，为0至50%， 如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50%，在一个 具体的实施方案中为2至10%。当以GalNAc为标准，本发明的IL-5硫酸盐含量(P11)为 1 2-14硫酸盐；在一个具体的实施方案中为1 5-10硫酸盐；当用3倍甘露糖为标准，为3 7-36硫酸盐，在一个具体的实施方案中为3 12-24硫酸盐。本发明的IL-5的硫酸 盐占单糖百分比(P59)为5-35%，在一个具体的实施方案中为10-25%。本发明的IL-5的 N连接寡糖中性百分比(P13)为30至90%，在一个具体的实施方案中为40至80%，在具体 的实施方案中为50至75%。本发明的IL-5的N连接寡糖酸性百分比(P14)为10至70%， 在一个具体的实施方案中为20至60%，在具体的实施方案中为25至50%。本发明的IL-5 的0-连接寡糖中性百分比(P15)为40至100%，在一个具体的实施方案中为50至100%， 在具体的实施方案中为60至100%。本发明的IL-5的0-连接寡糖酸性百分比(P16)为0 至60%，在一个具体的实施方案中为0至50%，在具体的实施方案中为0至40%。在一个实施例中，本发明的蛋白质或嵌合分子在N-交联部分(P19)中含有至少一 个下述结构。在这些图表中，“U"或“ ？”表示异头结构为a或者b，和 2、3、4、和 / 或 6。
或交联位置为
Gal ul——u GlcHfic^1
Gal ul—u GlcHficul
anal H
Uu
GlcHflcul-
6
Fuc
Ul
I 6
anbl—4 GlcNflcbl-4 GlcNflc
Gal Ul-u GlcNfii^ll
Gai Ul—u GlcNflcul
al JjMan
)[Gal(？ 1-)[Gal( ？ 1-
)GlcNAc(？ 1- ？)] )GlcNAc ( ？ 1- ？)]+3XGal( ？ 1_ ？ )GlcNAc ( ？ 1_ ？)聚糖结构Gal (？ 1- ？ ) GlcNAc ( ？ 1-Man(a1-3)[Gal( ？ 1- ？ )GlcNAc( ？ 1_ ‘ Man(a1-6)][GlcNAc( ？ 1-4) ]Man(bl-4) GlcNAc (bl-4) [Fuc ( ？ 1-6) ]GlcNAc+" +3 XGal( ？ 1- ？ ) GlcNAc ( ？ 1_ ？)〃
Gal Ui—u GlcNRc
cal Ha
Uu
Gal Ul—u GlcNficul
GlcNflcJl-
6
Ian bl-
Fuc
ul
I 6
I GlcNflcbl-4 GlcNRc
Gal ul——u GlcHfl^jl
·., al HHan
Galul—u GlcHBcul
+3XGal( ？ 1- ？ )GlcNAc ( ？ 1- ？ ) +Fuc ( ？ 1- ？)
85
聚糖结构Gal (？ 1_ ？ ) GlcNAc ( ？ 1_ ？ ) [Gal ( ？ 1_ ？ ) GlcNAc ( ？ 1_ )] Man(a1-3)[Gal( ？ 1- ？ ) GlcNAc ( ？ 1_ ？ ) [Gal ( ？ 1_ ？ ) GlcNAc ( ？ 1_ )] Man(al-6)][G1 cNAc( ？ 1-4) ]Man(bl-4) GlcNAc (bl-4) [Fuc ( ？ 1-6) ]GlcNAc+" +3 XGal( ？ 1- ？ ) GlcNAc ( ？ 1_ ？ ) +Fuc ( ？ 1_ ？)〃
聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) [Gal (bl-4) GlcNAc (bl-4) ]Man (al- ？ ) [Gal (bl-4)GlcNAc(bl-2)[Gal(bl-4)GlcNAc(b1-6)]Man(al- ？ )]Man( bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc+" +3 XGal(bl-4)GlcNAc (bl-3)“
+3XGal(bl-4)GlcNAc(bl-3) 聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) [Gal (bl-4) GlcNAc (bl-4) ]Man (al- ？ ) [Gal (bl-4)GlcNAc(bl-2)[Gal(bl-4)GlcNAc(b1-6)]Man(al- ？ )]Man( bl-4)GlcNAc(bl-4)[Fuc(al_6)]GlcNAc+" +3XGal(bl-4)GlcNAc (bl-3)“

+3 XGal (bl-4) GlcNHc (bl-3) +Gal (bl-3) GlcNAc (bl-3)聚糖结构Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) [Gal (bl-4) GlcNAc (bl-4) ]Man(al_ ？ ) [Gal
(bl-4)GlcNAc(bl-2)[Gal(bl-4)GlcNAc(b1-6)]Man(al- ？ )]Man( bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc+" +3XGal(bl-4)GlcNAc (bl_3) + Gal(bl-3)GlcNAc(bl_3)“
Sal bl-—4 GleNRcy
+3XGal(bl-4)GlcNAc(bl-3)+Gal(bl-3)GlcNAc(bl-3) 聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) [Gal (bl-4) GlcNAc (bl-4) ]Man (al-？ )[Gal(bl-4)GlcNAc(bl-2)[Gal(bl-4)GlcNAc(b1-6)]Man( al- ？ )]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4) [Fuc(al-6)]GlcNAc+〃 +3X Gal(bl-4)GlcNAc(bl-3)+Gal(bl-3)GlcNAc(bl-3)“
Gal ul-u GlcMfl^ll
Gal ul—u GlcNflcul
Uu
ul
GlcNRc ul— 4 备en bl—4 GlcMfic bl—4 GlcNAc
3
Gal ul——u GlcNfl^jl
/
al HMan
Gal ul—u GlcNAcul+4XGal( ？ 1_ )GlcNAc ( ？ 1- ？)聚糖结构Gal (？ 1- ) GlcNAc ( ？ 1_ ？ ) [Gal ( ？ 1_ ？ ) GlcNAc ( ？ 1_ )] Man (al- Man(
anal M
Uu
Ul
I 6
Gal ul—u GlcHncui\
GlcNflcul~ 4 |an bl 一4 GlcHflcbl-4 GlcMHc Gal ul——u GlcNfi^j Man (a 1- )]
Gal ul ——u GlcMHcul
+4XGal( ？ 1- ？ )GlcNAc ( ？ 1- ？ ) +Fuc ( ？ 1- ？) 聚糖结构 Gal (？ 1- ？ ) GlcNAc ( ？ 1- ？ ) [Gal ( ？ 1- ？ ) GlcNAc ( ？ 1_ )]
1-3)[Gal ( ？ 1- ？ )GlcNAc( ？ 1- ？ ) [Gal ( ？ 1- ？ )GlcNAc( ？
Man(a1-6)][GlcNAc( ？ 1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc (？ 1-6)] GlcNAc+" +4 X Gal (？ 1- ？ ) GlcNAc ( ？ 1- ？ ) + Fuc ( ？ 1- ？)‘‘
Gal Ul-u GlcNnc^1
>1
Gai Ul — u GlcHHcui Man (a 1- )]
Gal ul—u GlcHflcul
+5XGal( ？ 1- ？ )GlcNAc ( ？ 1- ？) 聚糖结构 Gal (？ 1- ？ ) GlcNAc ( ？ 1- ？ ) [Gal ( ？ 1- ？ ) GlcNAc ( ？ 1_ )]
1-3)[Gal ( ？ 1- ？ )GlcNAc( ？ 1- ？ ) [Gal ( ？ 1- ？ )GlcNAc( ？
Man(a1-6)][GlcNAc( ？ 1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc (？ 1-6)] GlcNAc+" +5 X Gal( ？ 1- ？ ) GlcNAc ( ？ 1- ？)〃
til一4 CGlclfflcfal~ 3 Gal bl一4 JSlcHfictaJ^- 2 Uanal Where j+k = 14 & j，k > = 1聚糖结构 Gal(bl-4) {GlcNAc(bl-3)Gal(bl-4)}kGl cNAc (bl_2)Man (al_3)[ Gal(bl-4){GlcNAc(bl_3)Gal(bl_4)}jGlcNAc(b1-2)Man(al_6)] Man(bl-4)GlcNAc (bl-4)GlcNAc+" Where j+k = 14 & j、k>= 1' Where j+k = 14 & j，k > = 1
聚糖结构 NeuAc (a2- ？ ) Gal (bl_4) {GlcNAc (bl_3) Gal (bl_4)} jGlcNAc (bl_2 )Man(al- ？ )[Gal(bl-4){GlcNAc(bl_3)Gal(bl_4)}kGlcNAc(bl_2 )Man(al- ？ )]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc+" Where j+k = 14& j、k>=l〃
Heuflc u Gal foj.- ^ tClisWflcbl" 3 GaL 5 jGlcWflcbi * 2 Han站
Di—A SlC flCS>l—4 GlXfWC
BeuBc a2~u Gel bl—^ (KLcHfIcbi~ 3 BaL Bi—UkGlcWBcbt— Z Kanal Where j+k = 14&k，j > = 1
聚糖结构 NeuAc(a2- ) Gal (bl_4) {GlcNAc (bl_3) Gal (bl_4)} kGlcNAc (bl_2 )Man(a1-3)[NeuAc(a2- ？ )Gal (bl-4){GlcNAc(b1-3)Gal(bl-4)}j GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc+" Wher e j+k = 14 & k、j > = 1〃 Where j+k = 14 & j，k > = 1聚糖结构Gal (bl-4) {GlcNAc (bl_3) Gal (bl_4)} kGlcNAc (bl_2)Man (al_3)[Gal(bl-4){GlcNAc(bl_3)Gal(bl-4)}jGlcNAc(b1-2)Man(al_6)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)[Fuc(al-6)JGlcNAc+" Where j+k = 14 &j、k>=l〃 Where j+k = 14 & j，k > = 1聚糖结构NeuAc (a2- ？ ) Gal (bl_4) {GlcNAc (bl_3) Gal (bl_4)} jGlcNAc (bl_2)Man(al- ？ ) [Gal (bl_4) {GlcNAc (bl_3) Gal (bl_4)} kGlcNAc (bl_2
)Man(al- ？ ) ]Man (b 1-4) GlcNAc (bl-4) [Fuc (al-6) ]GlcNAc+" Wherej+k = 14 & j、k >= 1〃
Heirfto a2— u Gal bl—4fGld flcbl— 3 Gal2 Han^1Hherej+k = 14 & j，k > = 1聚糖结构NeuAc(a2_ ) Gal (bl_4) {GlcNAc (bl_3) Gal (bl_4)} kGlcNAc (bl_2)Man(al_3) [NeuAc (a2_ ？ )Gal (bl-4) {GlcNAc (bl_3)Gal (bl_4)} jGIcNAc(bl-2)Man(al-6)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)[Fuc (al_6)]GlcNAc+" Where j+k = 14 & j、k>= 1〃 Where j+k = 14 & j，k > = 1聚糖结构Gal (bl-4) {GlcNAc (bl_3) Gal (bl_4)} kGlcNAc (bl_2)Man (al-3)[Gal(bl-4){GlcNAc(bl_3)Gal(bl_4)}jGlcNAc(bl_2)Man (al-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+〃 Where j+k = 14 & j、k > = 1〃 Where j+k = 14 & j，k > = 1聚糖结构NeuAc(a2_ ) Gal (bl_4) {GlcNAc (bl_3) Gal (bl_4)} jGlcNAc (bl-2)Man(al- ？ )[Gal(bl_4){GlcNAc(bl_3)Gal(bl_4)}kGlcNAc (bl-2)Man (a 1- ？ ) ] [GlcNAc (bl-4) ]Man (bl-4) GlcNAc (bl-4)GlcNAc+〃 Where j+k = 14 & j、k〉= 1〃
90 Where j+k = 14 & j，k > = 1聚糖结构NeuAc (a2- ？ ) Gal (bl_4) {GlcNAc (bl_3) Gal (bl-4)} kGlcNAc (bl-2)Man(al_3) [NeuAc(a2- ) Gal (bl_4) {GlcNAc (bl_3) Gal(bl-4)}jGlcNAc(b1-2)Man(al-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(bl_4)GlcNAc (bl-4)GlcNAc+" Where j+k = 14 & j、k>= 1〃 Where j+k = 14 & j，k > = 1聚糖结构Gal (bl-4) {GlcNAc (bl_3) Gal (bl_4)} kGlcNAc (bl_2)Man (al-3) [Gal (bl-4) {GlcNAc (bl_3) Gal (bl_4)} jGlcNAc (bl_2)Man(al-6)][GlcNAc(b1—4)]Man(b1—4)GlcNAc(b1—4)[Fuc (a1-6) JGlcNAc+" Where j+k = 14 & j、k>= 1〃 Where j+k = 14 & j，k > = 1聚糖结构NeuAc (a2-？ ) Gal (bl-4) {GlcNAc (bl-3) Gal (bl-4)} jGlcNAc(bl-2)Man(al- ？ ) [Gal (bl-4) {GlcNAc (bl-3) Gal (bl-4)}kGlcNAc(bl-2)Man(al- )] [GlcNAc (bl-4) ]Man (bl-4) GlcNAc (bl-4) [Fuc (al-6)]GlcNAc+" Where j+k = 14 & j、k〉= 1"
91
Where j+k一14&J，k>一l
聚糖结构 NeuAc(a2一 )6al(b1-4){GlcNAc(b1-3)6al(b1-4)}kGlcNAc(
bl一2)Man(al一3)[NeuAc(a2一 )6al(bl一4){GlcNAc(bl一3)6al
(bl一4)}jGlcNAc(bl一2)Man(al一6)][GlcNAc(bl一4)]Man(bl一
4)GlcNAc(bl一4)[Fuc(al一6)]GlcNAc+”Where j+k一14&J、
k>一l”
聚糖结构 GlcNAc(b1-2)Man(al一6)[Man(al一3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)
G1 cNAc
聚糖结构 GlcNAc(b1-4)Man(al一3)[Man(al一6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)
G1 cNAc
聚糖结构 GlcNAc(b1-2)Man(al一3)[Man(al一6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)
[Fuc(al一6)]GlcNAc
聚糖结构 GlcNAc(b1-2)Man(al一3)[GlcNAc(b1-2)Man(al一6)]Man(b1-4)
Gl cNAc(b1-4)Gl cNAc
聚糖结构 Man(al一3)[Man(al一6)]Man(b1-4)G1cNAc(b1-4)G1cNAc
聚糖结构 Man(al一3)[Man(al一6)]Man(b1-4)G1cNAc(b1-4)[Fuc(al一6)]G
l cNAc
聚糖结构 G1cNAc(b1-2)Man(al一3)[G1cNAc(b1-4)][Man(al一6)]Man(b1-
4)G1 cNAc(b1-4)G1 cNAc
聚糖结构 Fuc(al一6)[G1cNAc(b1-4)]G1cNAc
聚糖结构 Man(al一6)Man(b1-4)G1cNAc(b1-4)[Fuc(al一6)]G1cNAc
聚糖结构 G1cNAc(b1-2)Man(al一6)Man(b1-4)G1cNAc(b1-4)[Fuc(al一6)]Gl
cNAc
Man al一3 Man al一6 Man bl一4 G1cNAcbl一4 G1cNAc
聚糖结构 Man(al一3)Man(al一6)Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
NeuAca2 一u Gal bl一4 G1cNAcbl一2 Man al一3 Man bl一4 G1cNAC
聚糖结构 NeuAc(a2一 )Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)Man(al一3)Man(b1-4)G1cNA
C
聚糖结构 HS03(一4)GalNAc(b1-4)G1cNAc(b1-2)Man(al一3)[Man(al一6)]Man
(b1-4)G1 cNAc(b1-4)G1 cNAc
聚糖结构 G1cNAc(b1-2)Man(al一3)[G1cNAc(b1-2)Man(al一6)]Man(b1-4)Gl
cNAc(b1-4)[Fuc(al一6)]G1cNAc
聚糖结构 G1cNAc(b1-2)Man(al一3)[G1cNAc(b1-2)Man(al一6)][G1cNAc(b1-4
)]Man(b1-4)G1cNAc(b1-4)G1cNAc
聚糖结构 G1cNAc(b1-2)[G1cNAc(b1-4)]Man(al一3)[G1cNAc(b1-4)][Man(al
一6)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)GlcNAc
聚糖结构 GlcNAc(b1-2)Man(al一3)[GlcNAc(b1-2)Man(al一6)][GlcNAc(b1-4
)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)[Fuc(al一6)]GlcNAc
聚糖结构 GlcNAc(b1-2)[GlcNAc(b1-4)]Man(al一3)[GlcNAc(b1-2)Man(al一
6)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)[Fuc(al一6)]GlcNAc
聚糖结构 GlcNAc(b1-2)[GlcNAc(b1-4)]Man(al一3)[GlcNAc(b1-2)Man(al一
6)][GlcNAc(bl一4)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)GlcNAc
聚糖结构 GlcNAc(b1-2)[GlcNAc(b1-4)]Man(al一3)[GlcNAc(b1-2)[GlcNAc
(bl一6)]Man(al一6)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)GlcNAc
聚糖结构 HS03(一4)GalNAc(b1-4)G1cNAc(b1-2)Man(al一3)[HS03(一4)GalNAc
(bl一4)G1cNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)G1cNAc
聚糖结构 NeuAc(a2一 )Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)Man(al一3)[Man(al一6)]Man
(b1-4)G1cNAc
聚糖结构 Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)Man(al一3)[Man(al一6)]Man(b1-4)G1cNAc
(b1-4)G1cNAc
聚糖结构 Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)Man(al一6)[Man(al一3)]Man(b1-4)G1cNAc
(b1-4)G1 cNAc
聚糖结构 Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)Man(al一3)[Man(al一6)]Man(b1-4)GlcNAc
(b1-4)[Fuc(al一6)]GlcNAc
聚糖结构 Fuc( 1- )[Gal( 1- )]GlcNAc( 1- )Man(al一 )[Man(al一 )]Man
(bl一4)G1cNAc(bl一4)[Fuc( l一6)]G1cNAc
聚糖结构 Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)Man(al一3)[G1cNAc(b1-2)Man(al一6)]Man
(b1-4)G1cNAc(b1-4)G1cNAc
聚糖结构 Man(al一3)Man(al一6)[Man(al一3)]Man(b1-4)G1cNAc(b1-4)G1cNAc
聚糖结构 NeuAc(a 2-6)Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)Man(al一3)[G1cNAc(b1-2)Ma
n(al一6)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)G1cNAc
聚糖结构 Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)Man(al一6)[G1cNAc(b1-2)Man(al一3)]Man
(bl一4)G1cNAc(bl一4)[Fuc(al一6)]GlcNAc
聚糖结构 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(al一3)[GlcNAc(b1-2)Man(al一6)]Man
(bl一4)GlcNAc(bl一4)[Fuc(al一6)]GlcNAc
聚糖结构Gal( 1_ ？ ) GlcNAc ( ？ 1_ ？ )Man(al_ ) [GlcNAc( ？ 1_ ？) Man(al- ？ )]Man(bl-4) GlcNAc (bl-4) [Fuc ( ？ 1- ？ )]GlcNAc 聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2)Man (al-3) [GlcNAc (bl_2)Man (al_6) ] [G1 cNAc(bl-4)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc 聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) Man (al-6) [GlcNAc (bl-2) Man (al-3)] [G1 cNAc(bl-4)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc 聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) Man (al-6) [GlcNAc (bl-2) [GlcNAc (bl-4 )]Man(al-3)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc 聚糖结构 NeuAc (a2-6) GalNAc (bl-4) GlcNAc (bl-2) Man (al-3) [Gal (bl-4) GlcNAc(bl-2)Man(al-6)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc 聚糖结构 HS03 (-4) GalNAc (bl-4) GlcNAc (bl-2) Man (al-3) [NeuAc (a2_3) Gal (b 1 -4) G1 cNAc (b 1 -2) Man (a 1 -6) ] Man (b 1 -4) G1 cNAc (b 1 -4) G1 cNAc
聚糖结构Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2)Man (al-6) [GlcNAc (bl_2)Man (al_3) ] [G1

- ？ )] [Gl
4 SicHficbl——2 Manel8>
‘§ Hanbi—4 eictitetoi—4 &lcf Ro
鼸eute @2—6 (BallBcM.-4 GleNRcIsi— 2 Manal
聚糖结构 NeuAc (a2-3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) Man (al-6) [NeuAc (a2_6) Gal NAc(bl-4)GlcNAc(bl-2)Man(al-3)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)[Fuc (al-6)]GlcNAc
b η
,■6M3
99 聚糖结构 NeuAc(a2—3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(al一6)[NeuAc(a2—6)Gal
NAc(bl一4)GlcNAc(bl一2)Man(al一3)][GlcNAc(bl一4)]Man(bl一4)Gl
cNAc(b1-4)Gl cNAc
+2×Man
聚糖结构 Man(al一3)[Man(al一6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+”+2×
Man”
聚糖结构 NeuAc(a2一 )Ga l(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(al一3)[Man(al一3)Man(
al一6)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)GlcNAc
聚糖结构 NeuAc(a2—3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(al一3)[NeuAc(a2—3)Gal
(bl一4)GlcNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)GlcNAc
聚糖结构 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(al一3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man
(al一6)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)[Fuc(al一6)]GlcNAc
聚糖结构 Fuc (al-2) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2)Man (al-3) [Gal (bl_4) GlcNAc
(b 1 -2) Man (a 1 -6) ] Man (b 1 -4) G1 cNAc (b 1 -4) G1 cNAc
Fucu^
y GlcNftc ul-u Hanal
Salul"Manfel—4 BlcWIcbl-4 Glcliflc
Sal ui—y Glc Nflc ul— u Man^
聚糖结构 Fuc ( 1- ) [Gal ( ？ 1_ ？ )] GlcNAc ( ？ 1_ ？ )Man(al_ ) [Gal ( ？ 1- ？ )GlcN
Ac( ？ 1- ？ )Man(al- ？ )]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc
Fuc al—— 2 Sal bl—4 SlctMcM.-~~ 2 Han
Xfi
I Han bl— 4 fileilflcbl—4 GlcNte
Z
GaiGilcMRobi~^ 2 H al
聚糖结构 Fuc (al-2) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2)Man (al-6) [Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2)Man(al-3)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc
Fuc al-6 Gal bl—4 GlciWcbl~ 2 Hanal
X6
Hen bl—4 GlcHfic bl—4 GlcNfIc
z
Neuflc a2-6 Gal bl—4 GlcMflcbl~ 2 Hanal
聚糖结构 Fuc (al-6) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) Man (al-6) [NeuAc (a2_6) Gal ( bl-4) GlcNAc(bl-2)Man(al-3)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc
§ Gel bl—4 GlcNflc bl~ 2 Hanal
Heuflca^\6
"Han bl—4 GlcMftc bl—4 GlcNflc
NeuRc a2——u Gal bl—4 GlcNflcbl~ 2 Manal
聚糖结构 HS03 (-6) [NeuAc(a2-3)] Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) Man (al-？ ) [Neu Ac(a2- ？ )Gal(bl-4)GlcNAc(bl-2)Man(al- ？ )]Man(bl-4)GlcNAc( bl-4)[Fuc(al-6)]GlcNAc
101 聚糖结构 Fuc(al一3)[Gal(b卜4)]G1cNAc(b卜2)Man(al一6)[Gal(b卜4)G1cNAc
(bl一2)Man(al一3)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)[Fuc(al一6)]G1cNAc
聚糖结构 Fuc(al一3)[Gal(b卜4)]G1cNAc(b卜2)Man(al一6)[Gal(b卜4)G1cNAc
(bl一2)Man(al一3)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)[Fuc(al一6)]G1cNAc
聚糖结构 Fuc(al一3)[Gal(b卜4)]G1cNAc(b卜2)Man(al一3)[Gal(b卜4)G1cNAc
(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)[Fuc(al一6)]G1cNAc
聚糖结构 Fuc(al一2)Gal(b卜4)G1cNAc(b卜2)Man(al一6)[Gal(b卜4)GlcNAc
(bl一2)Man(al一3)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)[Fuc(al一6)]GlcNAc
聚糖结构 NeuAc(a2—6)Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)Man(al一3)[Fuc(al一3)[Gal
(bl一4)]G1cNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)[Fuc(
al一6)]G1cNAc
聚糖结构 NeuAc(a2—6)Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)Man(al一6)[Fuc(al一3)[Gal
(bl一4)]G1cNAc(bl一2)Man(al一3)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)[Fuc(
al一6)]G1cNAc
聚糖结构 Fuc(al一3)[Gal(b1-4)]G1cNAc(b1-2)Man(al一3)[Fuc(al一3)[Gal
(bl一4)]G1cNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)[Fuc(
al一6)]GlcNAc
聚糖结构 NeuAc(a2—6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(al一3)[Gal(b1-4)GlcNAc
(bl一2)Man(al一6)][GlcNAc(bl一4)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)GlcNAc

聚糖结构 NeuAc (a2-6) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2)Man (al-3) [Gal (bl_4) GlcNAc (b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc (al-6)]GlcNAc
Iteuflc 6 Gal tol—4 GlcWUfbl-
‘2 Man al
Fuc
ClcNIIcbl~ 4 Mantol—4 GlcHflcbl-4 GlcNRc
MeuHc
；Gal bl-4 GlcHBebl-
al Hart
聚糖结构 NeuAc (a2-6) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) Man (al-3) [NeuAc (a2_6) Gal (bl-4)GlcNAc(bl-2)Man(al-6)][GlcNAc(bl-4)]Man(bl-4)GlcNAc (bl-4)[Fuc(al-6)]GlcNAc
Fuc al-2 GaI tol—4 GlcIMcbl-
waV
GlcNitebi-
rlen bl——4 filcMBcbl—4 GlcHflc
Fucal-
Z fial bl一4 sXcHllcM.~ 2 Man'
Lal
聚糖结构 Fuc (al-2) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) Man (al-3) [Fuc (al_2) Gal (bl -4)GlcNAc(bl-2)Man(al-6)][GlcNAc(bl-4)]Man(bl-4)GlcNAc( bl-4)GlcNAc
Gal ul-u GlcNRc
GlcNflc
Gal ul-u GlcNflcul— u hen al-
\ul
\ u ftan bl—4 GlcNflc bl—4 GlcNRc
ul
GlcNRc聚糖结构 Gal()GlcNAc( ？ 1- ？ ) [GlcNAc( ？ 1- )]Man(al_ )
105[Gal( 1- )G1cNA
C( l一 )Man(al一 )][G1cNAc( l一4)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)[Fuc
( 1-6)]G1cNAc
+NeuAc
聚糖结构 Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)[Gal(b1-4)G1cNAc(b1-4)]Man(al一3)[Gal
(bl一4)G1cNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)G1cNAc+”+NeuAc”
聚糖结构 Gal(b1-3)Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)Man(al一6)[NeuAc(a2—6)Gal(
bl一4)G1cNAc(bl一2)Man(al一3)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)G1cNAc
+2×NeuAc
聚糖结构 Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(al一3)[Gal
(bl一4)GlcNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)GlcNAc+”+2×NeuAc”
聚糖结构 NeuAc(a2一 )Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[NeuAc(a2一 )Gal(b1-4)G1CNAC
(bl一4)]Man(al一3)[NeuAc(a2一 )Gal(bl一4)G1cNAc(bl一2)Man(al一6)]
Man(b1-4)G1 cNAc
聚糖结构 Fuc(al一2)[Gal(al一3)]Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)Man(al一3)[Gal(
bl一4)G1cNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)[Fuc(al
一6)]G1cNAc
聚糖结构 Fuc(al一2)[Gal(al一3)]Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)Man(al一6)[Gal(
bl一4)G1cNAc(bl一2)Man(al一3)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)[Fuc(al
一6)]G1cNAc
+NeuAc( 2—6)
聚糖结构 Gal(b1-4)G1cNAc(b1-2)[Gal(b1-4)G1cNAc(b1-4)]Man(al一3)[Fuc
(al一6)[Gal(bl一4)]G1 cNAc( l一2)Man( l一6)]Man( l一4)[Fuc(al
一3)Fuc(al一3)]GlcNAc+”+NeuAc( 2-6)”


聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) [Gal (bl-4) GlcNAc (b 1-6) ]Man (al-6) [Gal (bl-4)GlcNAc(bl-2)Man(a1-3)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc
IMan toi—4Glc nebl—4 fil^lfte
Gal bl—4 Slcraicbl~· 2 Mwial Gal bi“-4 filcNflc
fialM—4 SldHflc
聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) [Gal (bl-4) GlcNAc (bl-4) ]Man (al-3) [Gal (b 1 -4) G1 cNAc (b 1 -2) Man (a 1 -6) ] Man (b 1 -4) G1 cNAc (b 1 -4) G1 cNAc
-4 GlcNtetJi~~ 3 GaI bl—- 4 GidNBcbi- 2 Mangl
-<i GlcWfItohi-<161 咖 e
.Z
聚糖结构
GsXtii·—^ GieKflcW" 2 Manal
Gal(bl-4)GlcNAc(bl_3)Gal(bl-4)GlcNAc(bl-2)Man(al-6)[Gal (bl-4)GlcNAc(bl-2)Man(al-3)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc
Hanal


al
Man
Man al-
—A GlcNBcbl—4 elcNRc
Han
聚糖结构 Man(al-3) [Man (al-6)] Man (al-6) [Man (a 1-2) Man (al-3) ] Man (bl -4) GlcNAc (bl-4) GlcNAc
Han^
Han
al
Z.‘
§ Man fei—4 GlcHflc bl—4 Glcmc
Z
Gai M—-4 GlcNflcfti- Z Hanal
聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) Man (al-3) [Man (al-3) [Man (al-6)] Man ( al-6)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc
N
z、
Han bl —4 GlcNflc bl—4 GlcNRc
NeuWe 2— u Gel W—4 GiLc膽Μ·~-Z Iiwal
聚糖结构 NeuAc (a2- ？ ) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) Man (al-3) [Man (al-3) [Man (al-6)]Man(al-6)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc
108 +Fuc(al一3)
聚糖结构 Gal(b1-4)GIcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GIcNAc(b1-4)]Man(al一3)[Gal
(bl一4)GIcNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)GIcNAc(bl一4)GIcNAc
+”+Fuc(al一3)”
聚糖结构 NeuAc(a2一 )Gal(b1-4)GIcNAc(b1-2)Man(al一6)[Gal(b1-4)GIcNAc
(bl一2)[Gal(bl一4)GIcNAc(bl一4)]Man(al一3)]Man(bl一4)GIcNAc(
b1-4)GIcNAc
聚糖结构 NeuAc(a2一 )Gal(b1-4)GIcNAc(b1-4)[Gal(b1-4)GIcNAc(b1-2)]
Man(al一3)[Gal(bl一4)GIcNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)OlcNAc
(b1-4)Ol cNAc
聚糖结构 NeuAc(a2一 )Oal(b1-4)OlcNAc(b1-2)[Oal(b1-4)OlcNAc(b1-4)]
Man(al一3)[Oal(bl一4)OlcNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)OlcNAc
(b1-4)Ol cNAc
+NeuAc(a2—6)
聚糖结构 Gal( 1- )GIcNAc( 1- )[Gal( 1- )GIcNAc( 1- )]Man(al一 )[Gal
( l一 )GIcNAc( l一 )Man(al一 )]Man(bl一4)GIcNAc(bl一4)GICNAC
+”+NeuAc(a2—6)”
聚糖结构 NeuAc(a2—6)Gal(b1-4)GIcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GIcNAc(b1-4)]
Man(al一3)[NeuAc(a2—6)Gal(bl一4)GIcNAc(bl一2)Man(al一6)]Man
(b1-4)GI cNAc(b1-4)GI cNAc
聚糖结构 NeuAc(a2—3)Gal(b1-4)GIcNAc(b1-2)[NeuAc(a2—3)Gal(b1-4)GIcNAc
(bl一4)]Man(al一3)[NeuAc(a2—6)Gal(bl一4)GlcNAc(bl一2)Man(al
一6)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)GlcNAc
+3×NeuAc(a2一 )
聚糖结构 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(al一3)[Gal
(bl一4)GlcNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)GlcNAc
+”+3×NeuAc(a2一 )”


Gal bl—4 GlcHftebl— 2 Man 1
聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) [Gal (bl-4) GlcNAc (b 1-6) ]Man (al-6) [Gal (bl-4)GlcNAc(bl-2)Man(a1-3)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)[Fuc(al -6)]GlcNAc
OaJL bl—4 GlcHHcbl— 2 Man
聚糖结构 Fuc(al-3) [Gal (bl-4)] GlcNAc (bl-4) [Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2)]
Man(al-？ )[Gal(bl-4)GlcNAc(bl-2)Man(al- )]Man(b1-4)GlcNAc (bl-4)GlcNAc
Sal bl—4 eicWflcbl— 2 Hanai
Imm U—4(*lcHfie
Gel fei—A GIcHflcbl- 3 Sal bi4 GlcNflcbi“ 2 Man
聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2)Man (al-3) [Gal (bl-4)GlcNAc(bl-2)Man(al-6)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)[Fuc(al -6)]GlcNAc
SalttL4 Ulcimcfii
聚糖结构 Fuc (al-3) [Gal (bl-4)] GlcNAc (bl-4) [Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2)] Man(al-3)[Gal(bl-4)GlcNAc(bl-2)Man(al-6)]Man(bl-4)GlcNAc (bl-4)GlcNAc +Fuc(al一2)
聚糖结构 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(al一3)[Gal
(bl一4)GlcNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)GlcNAc
+”+Fuc(al一2)”
+Fuc(al一3)
聚糖结构 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(al一3)[Gal
(bl一4)GlcNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)[Fuc(al
一6)]GlcNAc+”+Fuc(al一3)”
聚糖结构 NeuAc(a2—3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)[NeuAc(a2—6)Gal(b1-4)GlcNAc
(bl一2)]Man(al一3)[Gal(bl一4)GlcNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一
4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(al一6)]GlcNAc
聚糖结构 NeuAc(a2—6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]

Man(al-3)[NeuAc(a2_3)Gal(bl_4)GlcNAc(bl_2)Man(a1-6)]Man (bl-4)GlcNAc(bl_4)[Fuc(al_6)]GlcNAc
Heuflc ——3 Gal bl—4 SlciWc bl·2 Han
al
聚糖结构 NeuAc (a2-3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-4) [Gal (bl_4) GlcNAc (bl_2)] Man(al-3)[NeuAc(a2_3)Gal(bl-4)GlcNAc(bl_2)Man(a1-6)]Man (bl-4)GlcNAc(bl-4)[Fuc(al_6)]GlcNAc
Galtol—41
+NeuAc(a2-3)+NeuAc(a2_6) 聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) [Gal (bl-4) GlcNAc (bl-4) ]Man (al-3) [Gal (bl-4)GlcNAc(bl-2)Man(a1-6)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)[Fuc(al -6)]GlcNAc+" +NeuAc(a2_3)+NeuAc (a2_6)“
聚糖结构 NeuAc (a2-6) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) [Fuc (al-3) [Gal (bl-4) ]GlcNA c(bl-4)]Man(al-3)[NeuAc(a2_6)Gal(bl-4)GlcNAc(bl-2)Man(al -6)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc +Fuc+2XNeuAc(a2_ ？)聚糖结构Gal (bl-4) GlcNAc ( ？ 1- ？ ) [Gal (bl_4) GlcNAc ( ？ 1- ？)] Man(al- ？ )[Gal
(bl-4) GlcNAc (？ 1-？ )Man(al_ )]Man (bl-4) GlcNAc (bl-4) GlcNAc + 〃 +Fuc+2XNeuAc(a2- ？)〃
,ai
Gel bl-~-Ifilcdint
FIM;
al
、fi 6
^Mflo 31—4 GlcMic bl— 4 61c flc
al
聚糖结构 NeuAc (a2-3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-4) [NeuAc (a2_6) Gal (bl-4) GlcN Ac(b1-2)]Man(al_3)[NeuAc(a2_6)Gal(bl-4)GlcNAc(bl_2)Man(al -6)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)[Fuc(al-6)]GlcNAc
NeuRc -6 GaX bl-4 IiXciMcbl~ 2 Man
'al
a2— 3 Sal
Fuc
^Man bl——4 GIcIWq bl—4 Glcfiflc
Neuftc a2— 6 Gal bl—4 GlcMHt
聚糖结构 NeuAc (a2-3) Gal (bl-4) [Fuc (al_3) ]GlcNAc (bl_4) [NeuAc (a2_6) Gal(bl-4)GlcNAc(b1-2)]Man(al_3)[NeuAc(a2_6)Gal(bl-4)Glc NAc(b1-2)Man(al-6)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc
Gal bl——4 GlcNRcbl~ 2 Manal
Galbl.
^Hen bl—4 GlcNflcbl-4 GlcNflc
乂 Glc 气、 ，
FucalI Hanal
Gel bl—4 GlcHflti31 + 3 H MeuRc<a2- >
聚糖结构 Fuc(al-3) [Gal (bl-4)] GlcNAc (bl-4) [Gal (bl_4) GlcNAc (bl_2)] Man(al-3)[Gal(bl-4)GlcNAc(b1-2)Man(al-6)]Man(bl-4)GlcNAc (bl-4) GlcNAc+" +3 XNeuAc (a2- ？)〃
114 +HS03(一6)+2×NeuAc(a2—3)+NeuAc(a2—6)
聚糖结构 Gal(b卜4)GlcNAc(b卜2)[Gal(b卜4)GlcNAc(b卜4)]Man(al一3)[Gal
(bl一4)GlcNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)[Fuc(al
一6)]GlcNAc+”+HS03(一6)+2×NeuAc(a2—3)+NeuAc(a2—6)”
+2×HS03(一6)+2×NeuAc(a2—3)+NeuAc(a2—6)
聚糖结构Gal(b卜4)GlcNAc(b卜2)[Gal(b卜4)GlcNAc(b卜4)]Man(al一3)[Gal
(bl一4)GlcNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)[Fuc(al
一6)]Gl cNAc+”+2×HS03(一6)+2×NeuAc(a2—3)+NeuAc(a2
一6)”
聚糖结构 NeuAc(a2—6)Gal(b卜4)GlcNAc(b卜3)Gal(b卜4)GlcNAc(b卜2)Man
(al一3)[Fuc(al一3)[Gal(bl一4)]GlcNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl
一4)GlcNAc(bl一4)[Fuc(al一6)]GlcNAc
+Gal(bl一2)GlcNAc(bl一3)+3×NeuAc
聚糖结构 Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(al一3)[Gal
(bl一4)GlcNAc(bl一2)Man(al一6)]Man(bl一4)GlcNAc+”+Gal(bl一2
)GlcNAc(b1-3)+3×NeuAc”
+NeuAc(a2一 )
聚糖结构 Gal(al一3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(al一6)[Gal(b1-4)GlcNAc
(bl一2)[Gal(bl一4)GlcNAc(bl一4)]Man(al一3)]Man(bl一4)GlcNAc(
bl一4)[Fuc(al一6)]GlcNAc+”+NeuAc(a2一 )”
+NeuAc(a2—3)+NeuAc(a2—6)
聚糖结构 Gal(al一3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(al一6)[Gal(b1-4)GlcNAc
(bl一2)[Gal(bl一4)GlcNAc(bl一4)]Man(al一3)]Man(bl一4)GlcNAc(
bl一4)[Fuc(al一6)]GlcNAc+”+NeuAc(a2—3)+NeuAc(a2—6)”
+HS03(一6)+2×NeuAc(a2一 )
聚糖结构 Gal(al一3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(al一6)[Gal(b1-4)GlcNAc
(bl一2)[Gal(bl一4)GlcNAc(bl一4)]Man(al一3)]Man(bl一4)GlcNAc(
bl一4)[Fuc(al一6)]GlcNAc+”+HS03(一6)+2×NeuAc(a2一 )”

/
SnJL bl~41 Gal bl——4GlcNH
\ /触 bi—4 SleNflcbi-4 Gle 咖
Gal bl—4 GloNftf 1
聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) [Gal (bl_4) GlcNAc (bl_4)]Man(al_3) [Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) [Gal (bl-4) GlcNAc (b 1-6) ]Man (al-6) ]Man ( bl-4) GlcNAc (bl-4) GlcNAc
Gal bi (^aXh
^ Gicim
\Λζ 咖
测多―
pyc； KS
Gal bl——4 filcun^!^^
X
——4 filcHBcM)!— ^ ；
Nj
IaiGmG
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FtK；处
聚糖结构 Fuc(al-3) [Gal (bl-4)] GlcNAc (bl-4) [Gal (bl_4) GlcNAc (bl_6)]
Man(a1-3)[Fuc(al_2)[Gal(bl-4)]GlcNAc(bl-2)[Gal(bl-4)GlcNA c(b1-6)]Man(al-6)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc
Gal bl—4 GlcHfk^j,
Gelbl—4 GlcMfiJ31 Galbl—4 GlcHflCji.
V
a H
VOCvi
-4 Glcmcbl — 4 GlclWc
aln
Gal bl—4 GlcHfltijl
+3 X NeuAc (a2- ？)
聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-2) [Gal (bl-4) GlcNAc (bl-4) ]Man (al-3) [Gal (bl-4)GlcNAc(bl-2)[Gal(bl-4)GlcNAc(b1-6)]Man(al-6)]Man( bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc+" +3XNeuAc (a2- ？)〃
117 聚糖结构Fuc(al_3) [Gal (bl_4) ]GlcNAc (bl_4) [Gal (bl_4) GlcNAc (bl_2)]Man(a1-3)[Gal(bl_4)GlcNAc(bl_2)[Gal(bl-4)GlcNAc(b1-6)]Man(al_6)]Man (bl-4) GlcNAc (bl-4) GlcNAc
聚糖结构 Fuc(al-3) [Gal (bl-4)] GlcNAc (bl-6) [Gal (bl_4) GlcNAc (bl_2)]
Man(a1-6)[Gal(bl_4)GlcNAc(bl_2)[Gal(bl-4)GlcNAc(bl-4)]Man (a1-3)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc
Gsl bl_4 GLcNHe
^iClcNncbi"
2 Mwal
\
hi——
Gal M-
X \
Irtan bl—4GlcHficbl—4 BlcMflc
/
I 3
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■ζηχ-
/
聚糖结构 Fuc(al-3) [Gal (bl-4)] GlcNAc (bl-2) [Gal (bl-4) GlcNAc (bl-6)]
Man(a1-6)[Gal(bl-4)GlcNAc(bl-2)[Gal(bl-4)GlcNAc(bl-4)]Man (a1-3)]Man(bl-4)GlcNAc(bl-4)GlcNAc
118 聚糖结构Gal (？ 1- ？ ) GlcNAc ( ？ 1_ ？ ) [Gal ( ？ 1_ ？ ) GlcNAc ( ？ Man(a1-3)[Gal( ？ 1- ？ )GlcNAc( ？ ？ ) [Gal ( ？ ？ )GlcNAc( ？ Man (a1-6)][GlcNAc +Fuc聚糖结构Gal( 1- ？ ) GlcNAc ( ？ 1_ ？ ) [Gal ( ？ 1_ ？ ) GlcNAc ( ？ Man(a1-3)[Gal( 1- )GlcNAc( ？ 1_ ？ ) [Gal ( ？ 1_ ？ )GlcNAc( ？ Man(a1-6)][GlcNAc( ？ 1-4) ]Man (bl-4) GlcNAc (bl-4) [Fuc ( ？ 1-6) ] GlcNAc+' 聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-4) [Gal (bl-4) GlcNAc (b 1-6) ]Man (al-3) [Gal[10]]](bl一4)G1cNAc(bl一3)Gal(bl一4)G1cNAc(bl一2)[Gal(bl一4)G1cNAc[101 2](bl一6)]Man(al一6)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)G1cNAc[1013] 聚糖结构 Gal(b卜4)G1cNAc(b卜4)[Gal(b卜4)G1cNAc(b卜6)]Man(al一3)[Gal[101 5](bl一4)G1cNAc(bl一2)[Gal(bl一4)G1cNAc(bl一3)Gal(bl一4)G1cNAc[101 6](bl一6)]Man(al一6)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)G1cNAc[10]7] 聚糖结构 Gal(al一3)Gal(b卜4)G1cNAc(b卜2)[NeuAc(a2一 )Gal(b卜4)G1cNAc[101 9](bl一4)]Man(al一3)[Gal(al一3)Gal(bl一4)G1cNAc(bl一2)Man(al一6[1020])]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)[Fuc(al一6)]G1cNAc[1021] 聚糖结构 Gal(al一3)Gal(b卜4)GlcNAc(b卜4)[NeuAc(a2一 )Gal(b卜4)GlcNAc[1023](bl一2)]Man(al一3)[Gal(al一3)Gal(bl一4)GlcNAc(bl一2)Man(al一6[1024])]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)[Fuc(al一6)]GlcNAc[1025] [Ga Man(
+Gal (bl-4)GlcNAc( ？ 1- ？ )+4XNeuAc(a2- ？) 聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (？ 1-？ ) [Gal (bl-4) GlcNAc ( ？ 1-？ )]Man (al-3)
1(bl-4)GlcNAc ( ？ 1-？ )[Gal(bl-4)GlcNAc ( ？ 1-？ )]Man(al_6)]
bl-4)GlcNAc (bl-4)GlcNAc+" +Gal (bl-4)GlcNAc ( ？ 1- ？ )+4X NeuAc(a2- ？)“
Gal bl—4 GlcNRcbl— u Gel bl—4 GIcNfl^1
Gel bl——4 GlcHHc!01
Gal bl—4 GlcNfta^.
Inanai
IHanal
^Man bl—4 GldWcbl—4 GlcNflc
Gal bl—4 GIcNfl^1
+5 X NeuAc (a2- ？)
聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-？ ) Gal (bl_4) GlcNAc (bl_6) [Gal (bl_4) GlcN Ac(bl-2)]Man(al-6)[Gal(bl-4)GlcNAc(bl-2)[Gal(bl-4)GlcNAc (bl-4)]Man(al-3)]Man(bl-4)GIcNAc(bl-4)GlcNAc+" +5XNeuAc (a2- ？)"
123[10]]](bl一4)G1cNAc(bl一3)Gal(bl一4)G1cNAc(bl一2)[Gal(bl一4)G1cNAc[101 2](bl一6)]Man(al一6)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)G1cNAc[1013] 聚糖结构 Gal(b卜4)G1cNAc(b卜4)[Gal(b卜4)G1cNAc(b卜6)]Man(al一3)[Gal[101 5](bl一4)G1cNAc(bl一2)[Gal(bl一4)G1cNAc(bl一3)Gal(bl一4)G1cNAc[101 6](bl一6)]Man(al一6)]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)G1cNAc[10]7] 聚糖结构 Gal(al一3)Gal(b卜4)G1cNAc(b卜2)[NeuAc(a2一 )Gal(b卜4)G1cNAc[101 9](bl一4)]Man(al一3)[Gal(al一3)Gal(bl一4)G1cNAc(bl一2)Man(al一6[1020] )]Man(bl一4)G1cNAc(bl一4)[Fuc(al一6)]G1cNAc[1021] 聚糖结构 Gal(al一3)Gal(b卜4)GlcNAc(b卜4)[NeuAc(a2一 )Gal(b卜4)GlcNAc[1023](bl一2)]Man(al一3)[Gal(al一3)Gal(bl一4)GlcNAc(bl一2)Man(al一6[1024])]Man(bl一4)GlcNAc(bl一4)[Fuc(al一6)]GlcNAc[1025]1060] 1061] 1062]
1063]
1064]
1065]
1066]
1067]
1068]
1069]
1070]
1071]
1072]GalNAc
Gal bl-3 GalNAc Gal(bl-3)GalNAc
Gal
Gal
NeuAc a2-3 Gal NeuAc(a2-3)Gal
Xylul-u Glc Xyl( 1- ？ )Glc
NeuAca2-3 Gal bl_4xyl NeuAc(a2-3)Ga l(bl-4)Xyl
Xyl ul-u Glc Xyl( 1- ？ )Glc
Xyl ul-u Glc +Xyl
Xyl( 1- ？ )Glc+〃 +Xyl"
NeuAca2-3Galbl-3GalNAc NeuAc (a2-3)Gal(bl-3)GalNAc
Neuflc
Galbl
125[1092] 聚糖结构 NeuAc(a2—3)Gal(b1-3)[NeuAc(a2—6)]GalNAc[1093] 聚糖结构 Gal(b1-3)[NeuAc(a2—6)]GalNAc[]095]Fuc al一2 Galb1-3GalNAc[1096] 聚糖结构 Fuc(al一2)Gal(b1-3)GalNAc[1097] 聚糖结构 Fuc(al一2)Gal(b1-3)[NeuAc(a2—6)]GalNAc[1099] 聚糖结构 NeuAc( 2一 )Gal( 1- )[Fuc(al一 )]GalNAc[11011 delta4，5GlcA bl一3 GalNAc bl一4GlcA bl一3 Gal bl一3 Gal bl一4 Xyl[1102] 聚糖结构 delta4，5GlcA(b1-3)GalNAc(b1-4)GlcA(b1-3)Gal(b1-3)G[1103]al(b1-4)Xyl[1104] 聚糖结构 delta4，5GlcA(b1-3)[HSO 3(一4)]GalNAc(b1-4)GlcA(b1-3)[1106]Gal(b1-3)Gal(b1-4)Xyl[1107] 聚糖结构 HS03(一 )[NeuAc(a2一 )]GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2—3)Gal(b[1109]1-3)]GalNAc[1110] [1112] [1119]
聚糖结构 Gal(bl-3) [GlcNAc (bl-6) JGalNAc
Fικ; al—4 GlcMflc
Balw*"
^alMnc
聚糖结构 Fuc (al-4) GlcNAc (bl-6) [Gal (b 1-3) ]GalNAc
Fuc al-4 GlcMHc
^GaifIflc
SlcWlcbl~ 6 GaIci
聚糖结构 Fuc (al-4) GlcNAc (bl-6) [GlcNAc (bl-6) Gal (b3) ]GalNAc
Fuc al~—4 CleKHiy
fuc ai一4 GleMHcteA~ 6 Galbl
3'
:Gallinc
聚糖结构 Fuc (al-4) GlcNAc (bl-6) Gal (bl-3) [Fuc (al-4) GlcNAc (bl-
6)]Gal NAc
Gal bi—4 GXqIIfic^j. [1121] [1122] [1123]
聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-6) [Gal (bl-3) ]GalNAc
Fuc al-2Galbl-3GlcNAcbl-3 GalNAc 聚糖结构 Fuc (al-2) Gal (bl-3) GlcNAc (bl-3) GalNAc
Galbl.
聚糖结构 Fuc(al-3) [Gal (bl-4)] GlcNAc (bl-3) GalNAc
Fuc al-
■2 SaJL
bl
!olcHflcbl—3 GsJLfIfto
al
聚糖结构 Fuc (al-2) Gal (bl-4) [Fuc (al-3) ]GlcNAc (bl-3) GalNAc[1127] [1129]
Gal Wt-4 GXcIincjjl
^almc
3'
/
GJLcUHti*1
聚糖结构
聚糖结构 Gal (bl-3) GlcNAc (bl-3) [GlcNAc (bl-6) ]GalNAc
聚糖结构 Fuc(al-3) [Gal (bl-4)] GlcNAc (bl-6) [GlcNAc (bl-3) ] GalNAc
Gal bl-4 GlcNAcbl-3 Gal bl-3 GalNAc 聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-3) Gal (bl-3) GalNAc
聚糖结构
聚糖结构 GalNAc (bl-4) [NeuAc (a2_3) ]Gal (bl-3) [NeuAc (a2_6) ]GalNAc
聚糖结构聚糖结构 Gal(b1- )GIcNAc(b1-6)[NeuAc(a2—3)Gal(b1-3)]GaINAc[1146] 聚糖结构 NeuAc(a2—3)Gal(b1- )GIcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GaINAc[1148]NeuAc a2一u Gal bl—u GIcNAcbl—u Gal ul—u GalNAc[1149] 聚糖结构 NeuAc(a2一 )Gal(b1- )GIcNAc(b1- )Gal( 1- )GaINAc[1150] 聚糖结构 NeuAc(a2—3)Gal(b1-4)GIcNAc(b1-6)[NeuAc(a2—3)Gal(b1-3)]Ga[1152]lNAC[1153] 聚糖结构 NeuAc(a2—3)Gal(b1-4)GIcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GaINAc[1155] 聚糖结构 Fuc(al一2)Gal(b1-3)[Gal(b1-4)GIcNAc(b1-6)]GaINAc[1157] 聚糖结构 Fuc(al一3)[Gal(b1-4)]GIcNAc(b1-6)[NeuAc(a2—3)Gal(b1-3)]Ga[1159]lNAC[1160] [1162]
聚糖结构 Fuc(al-3) [Gal (bl-4)]GlcNAc (bl-6) [Gal (b 1-3) ]GalNAc
聚糖结构 Fuc(al-2) [Gal(al-3)]Gal(bl-3) [HS03 (-6) GlcNAc (bl-6) ]GalNAc
Gali. [1167]
Neuftc ~· 3 Galbl
聚糖结构 Fuc(al-3) [Gal (bl-4)] GlcNAc (bl-6) [NeuAc (a2-3) Gal (bl-3) ] Gal NAc
聚糖结构 NeuAc (a2-3) Gal (bl-4) [Fuc (al_3) ]GlcNAc (bl_6) [Gal (bl-3) ]Gal NAc
聚糖结构 Fuc (al-2) Gal (bl-3) [Fuc (al-4) ] GlcNAc (bl-6) [Gal (bl-3)] GalNAc 聚糖结构Fuc(al-2)Gal(bl-4) [Fuc (al_3) ]GlcNAc (bl_6) [Gal(bl_3)]GalNAc [1182] [1183]
+Fuc(al-2)
聚糖结构 Fuc(al-3) [Gal(bl-4)]GlcNAc(bl-6) [Gal(bl-3)]GalNAc+〃 +Fuc (al-2)“
Fue al-—- 2 Gal^
Fuc她
/
^GaUIRc
Z
聚糖结构 Fuc (al-2) Gal (bl-4) [Fuc (al_3) ]GlcNAc (bl_6) [NeuAc (a2_3) Gal (b1-3)]GalNAc
Galbl—4Glcllll<
,SalIMc
CidJL bi"■""· 4
聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-3) [Gal (bl-4) GlcNAc (b 1-6) ]GalNAc
Fuc si-2 Gal U—4 GlcWR^.
NeuflcaZ-- 3 Salbl
,3
!Semite
聚糖结构 Fuc (al-2) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-6) [NeuAc (a2_3) Gal (bl_3)] GalNAc
,Glcwncui— 3 Gal ul—3 GalWic
KetMc u2— 3 Oalul
聚糖结构 NeuAc ( ？ 2-3) Gal (？ 1-3) [Fuc ( ？ 1-4) ] GlcNAc ( ？ 1-3) Gal (？ 1-3) GalNAc
131[1194] [1201] [1202] 聚糖结构Fuc(al-2)Gal(bl_4) [Fuc (al_3) ]GlcNAc (bl_3) Gal (bl_3) GalNAc
聚糖结构
聚糖结构
聚糖结构
聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-6) [NeuAc (a2_3) Gal (bl-3)]GalNAc
Selbl-
細 JLMic
Fuc Sl^-2 Qal bl·—GlcHfltebt~ 3 Selei
聚糖结构 Fuc (al-2)Gal(bl-3)GlcNAc (bl-3) Gal (bl-3) [Gal (bl-4) GlcNAc (bl-6)]GalNAc
132 聚糖结构 Fuc(al一2)Gal(b1-3)G1cNAc(b1-3)Gal(b1-4)G1cNAc(b1-6)[Gal[1210](b1-3)]GalNAc[1211] 聚糖结构 Gal(b1-3)G1cNAc(b1-3)Gal(b1-4)[Fuc(al一3)]G1cNAc(b1-6)[Gal[1213](b1-3)]GalNAc[12]4] 聚糖结构 Fuc(al一2)Gal(b1-3)G1cNAc(b1-3)Gal(b1-4)G1cNAc(b1-6)[NeuAc[1216](a2—3)Gal(b1-3)]GalNAc[1217] 聚糖结构 Gal(b1-3)G1cNAc(b1-3)Gal(b1-4)[Fuc(al一3)]G1cNAc(b1-6)[Neu[1219]Ac(a2—3)Gal(b1-3)]GalNAc[1220] 聚糖结构 Gal(b1-4)G1cNAc(b1-3)[Gal(b1-4)G1cNAc(b1-6)]Gal(b1-3)[Gal[1222](b1-4)G1cNAc(b1-6)]GalNAc[1223] 聚糖结构Gal (bl-3) GlcNAc (bl-3) [Gal (bl_4) GlcNAc (bl_6) ]Gal (bl_4) GlcNAc (b 1-6) [NeuAc (a2_3) Gal (b 1-3) ] GalNAc 聚糖结构NeuAc (a2_3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-6) [NeuAc (a2_3) Gal (bl-3)] GalNAc +Fuc聚糖结构NeuAc ( ？ 2-3)Gal ( ？ 1_ ？ )GlcNAc ( ？ 1-3)Gal ( ？ 1-3) [Gal ( ？ 1-4)GlcNAc( ？ 1-6)] GalNAc+" +Fuc “ [Neu
聚糖结构 GaKbl- ？ ) GlcNAc (bl- ？ ) Gal (bl-4) [Fuc (al-3) ] GlcNAc (bl-6)
Ac (a2-3)Gal (bl-3)]GalNAc
Gi 3J1
U Gel tai,一^ [Neu
聚糖结构 Fuc (al- ？ ) [Gal(bl- ？ )]GlcNAc (bl- ？ ) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-6)
Ac (a2-3)Gal (bl-3)]GalNAc
134[1240]聚糖结构Fuc( 1- ？ )Gal( ？ 1- ？ ) [Fuc ( ？ 1- ？ )] GlcNAc ( ？ 1- ？) Gal( ？ 1- ？ )GlcNAc +Fuc聚糖结构 Gal (？ GlcNAc( ？ 1- ？ 聚糖结构Fuc( 1- ？ )Gal( ？ 1- ？ ) [Fuc ( ？ 1- ？ )] GlcNAc ( ？ 1- ？) Gal( ？ 1- ？ ) [Fuc (？ 1- )] GlcNAc ( ？ 1_ ？ ) [NeuAc ( ？ 2- )Ga 1( 1_ ？ ) JGalNAc 聚糖结构Gal (？ 1- ？ )GlcNAc ( ？ 1- ？ )Gal( ？ 1- ？ ) GlcNAc ( ？ 1- ？) Gal( ？ 1- ？ )GlcNAc( ？ 1- ？ ) [NeuAc ( ？ 2_ ？ )Gal( ？ 1_ ？ ) JGalNAc 聚糖结构 GalNAc 聚糖结构Fuc (al-3) [Gal (bl_4) ]GlcNAc (bl-3) [Gal (bl_4) GlcNAc (bl-6)]GalNAc 聚糖结构Fuc (al-2) [Gal (al-3)] Gal (bl-？ ) GlcNAc (bl_3) Gal (bl_3) [NeuAc(a2_6)] GalNAc 聚糖结构Gal (bl_ ) GlcNAc ( ？ 1- ？ ) [Gal (bl- ？ ) GlcNAc ( ？ 1- ？)] Gal(bl- ？ )GlcNA
c(bl-6)[NeuAc(a2_3)Gal(b1-3)]GalNAc Sal bl—4 GicWlcbl~ 3 Gal bl—4 GlcWRcbl— 3 Gai fel—4 6lc Wcbd—6 Galllflte
bl聚糖结构 Gal (bl_4) GlcNAc (bl_3) Gal (bl_4) GlcNAc (bl_3) Gal (bl_4) GlcNAc [1267]
(bl-6)[Gal(b1-3)]GalNActol bl~~-4 GlcHtebl- 3 Cal bl·~~4 GlcMflc
,GalRnc
GMtoi聚糖结构NeuAc (a2-3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-6) [NeuAc (a2_3) Gal (bl-3)] GalNAc
HeuAG -3 Gelbi
^GlcMflcbi~ 3 Oal bi—4 GlcNfta^1 聚糖结构NeuAc (a2_3) Gal (bl-4) [Fuc (al_3) ]GlcNAc (bl_3) Gal (bl_4) GlcNAc (bl-6) [NeuAc(a2_3) Gal (bl-3)] GalNAc 聚糖结构
Neuflc a2-3 Galbi
Fuc(al-3)[Gal(bl—4)]GlcNAc (bl- ？ ) Gal(bl-4)GlcNAc (bl-6)
(a2-3)Gal(bl-3)]GalNAc
Neuflc a2-6 Galbl
聚糖结构 NeuAc (a2_6) Gal (bl-4) [Fuc (al-3) ]GlcNAc (bl- ？ ) Gal (bl-4) GlcNA c (bl-6)[NeuAc(a2_3)Gal(bl-3)]GalNAc
NeuRc a26 Gal bl — 4 GlcNHcbl— u Gal bl—4 GlcHHcbl— u Gel bl——4 GlcNHc bl—6 GalNRc [1281] [1282]
聚糖结构 NeuAc (a2-6) Gal (bl-4) GlcNAc (bl- ) Gal (bl-4) GlcNAc (bl- )Gal (bl-4)GlcNAc(bl-6)[Gal(bl-3)]GalNAc 聚糖结构 Fuc(al一2)Gal(b1-3)G1cNAc(b1-3)[Gal(b1-4)G1cNAc(b1-6)]Gal[1284](bl一3)[Gal(bl一4)G1cNAc(bl一6)]GalNAc[1285] 聚糖结构 Fuc(al一2)Gal(b1-3)[Fuc(al一4)]G1cNAc(b1-3)Gal(b1-4)G1cNAc[1287](bl一3)Gal(bl一4)G1cNAc(bl一6)[NeuAc(a2—3)Gal(bl一3)]GalNAc[1288] 聚糖结构 Fuc(al一4)[Gal(b1-3)]G1cNAc(b1-3)Gal(b1-4)G1cNAc(b1-3)Ga[1290]l(bl一4)[Fuc(al一3)]G1cNAc(bl一6)[NeuAc(a2—3)Gal(bl一3)]Gal[1291]NAC[1292] 聚糖结构 Fuc(al一2)Gal(b1-3)[Fuc(al一4)]G1cNAc(b1-3)[Fuc(al一3)[Gal[1294](bl一4)]G1cNAc(bl一6)]Gal(bl一4)GlcNkc(bl一6)[Neukc(a2—3)6a[1295]l(b1-3)]GalNkc[1296]
聚糖结构 Fuc(al-2)Gal(bl-3) [Fuc (al-4) ]GlcNAc (bl-3) [Gal (bl_4) GlcN Ac (b1-6)]Ga l(bl_4)[Fuc(al_3)]GlcNAc(bl_6)[NeuAc(a2_3)Ga 1(bl-3)]GalNAc
Neuflc a2——3 Gal bl——4 GlcNRcbl— 3 Calbl—4 GlcNflcbl~ 3 Gal bi—4 GlcHR^.
Iterfte a2~ 3 Galbl
Isaimc聚糖结构 NeuAc (a2_3) Gal (bl_4) GlcNAc (bl-3) Gal (bl_4) GlcNAc (bl-3) Gal(bl_4) GlcNAc (bl-6) [NeuAc (a2_3) Gal (b 1-3) ]GalNAc
聚糖结构
聚糖结构 Fuc (al-2) [Gal (al-3)] Gal (bl-？ ) GlcNAc (bl_3) [Fuc (al_2) [Gal (al-3)]Gal(bl- ？ )GlcNAc(bl-6)]Gal(bl-4)GlcNAc(bl-3)Gal(bl -3)Gal(bl-3)[Gal(bl-4)GlcNAc(bl-6)]GalNAc
Fucal
聚糖结构 Fuc (al-2) [Gal (al-3) ]Gal (bl- ？ ) GlcNAc (bl_3) [Fuc (al_2) [Gal (al-3)]Gal (bl- ？ )GlcNAc(b1-6)]Gal(bl_4)GlcNAc(bl_3)Gal(bl -3)Gal(bl-3)[NeuAc(a2_3)Gal(bl_4)GlcNAc(bl—6)]GalNAc 聚糖结构Fuc (al-2) [Gal (al-3) ]Gal (bl- ？ ) GlcNAc (bl-3) [Fuc (al-2) [Gal(al-3)]Gal(bl- ？ )GlcNAc (bl_6) ]Gal (bl_4)GlcNAc (bl_3)Gal (bl-3) [Fuc (al-2) [Gal (al—3) ]Gal (bl_4) GlcNAc (bl—6) ]GalNAc 聚糖结构NeuAc (a2-3) Gal (b 1-4) [Fuc (al-3) ]GlcNAc (bl-3) Gal (bl-4) [Fuc(al-3)]GlcNAc(bl-3)Gal(bl-4)[Fuc(al-3)]GlcNAc(bl-6)[Gal(bl-3)] GalNAc
Gal bl一4 GlsHflsbl~ 3 Gal bl~-4 以clltebl— 3 SaJ bl4 SldHRcbi~ 3 Gal bl— GlcHlteM—β GalIWc[1324]聚糖结构Gal (bl_4) GlcNAc (bl_3) Gal (bl_4) GlcNAc (bl_3) Gal (bl_4) GlcNAc(bl-3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-6) [Gal (b 1-3) ]GalNAc
Sal μ—4 Glcitehl— 3 Galbl—《icBflctd—3 Eal M—4 GlcfWcbi- 3 Gal bl—4Glcllflebl—3 SaltdGlcWtebi-6 lal fte
Gal聚糖结构Gal (bl_4) GlcNAc (bl-3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-3) Gal (bl-4) GlcNAc(bl-3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-6) [Gal(bl-3)] GalNAc
-4 GklcNfIctol-
‘3
bl-
GleflHtebl-- 3 Gal bl-4 SlcWK^1
limbic
Galbl'
+Fuc(al-3)
聚糖结构 Gal (bl-4) GlcNAc (bl-3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-6)[NeuAc(a2-3)Gal(bl-3)]GalNAc+" +Fuc (al-3)“
Gal bl-
GlcNfIctal-
3 Kal bl-
GicMfIcbi-3 GaJL bl
GalMRc
NetMRc a2—+2 X Fuc (al-3)聚糖结构Gal (bl_4) GlcNAc (bl-3) Gal (bl-4) GlcNAc (bl-3) Gal (bl-4) GlcNAc(bl-6) [NeuAc(a2_3) Gal (bl-3)] GalNAc+" +2 X Fuc (al-3)"
Heirflc a2-3 GaItoi-聚糖结构
Fuc(al-3)[Gal(bl-4)]GlcNAc(bl-3)Gal(bl-4)[Fuc(al-3)]GlcNAc (bl-3)Gal (bl-4)[Fuc(al-3)]GlcNAc(bl-6)[NeuAc(a2_3)Gal(bl -3)]Gal NAc
^GlcNDcbi~~ u Gel bl—4 GlcIWcbl~ u Gel bl—4 GlcMflcbl—￡
Gel聚糖结构Fuc (al-3) [Gal (bl-4)]GlcNAc (bl-？ ) Gal (bl_4) GlcNAc (bl- )Ga1 (bl-4) GlcNAc (bl-6) [Gal (b 1-3) ]GalNAc
Neuflc a2——3 Galbl聚糖结构Fuc (al-3) [Gal (bl-4)] GlcNAc (bl- ) Gal (bl-4) GlcNAc (bl- )Gal(bl-4)GlcNAc(bl-6)[NeuAc(a2_3)Gal(b1-3)]GalNAc可以通过本领域已知的多种方法修饰宿主细胞来获得本发明的蛋白质或嵌合分 子的理化形式，包括但不限于向宿主细胞中引入一种或多种编码一种酶或多种酶、产生所 需理化形式的转基因。这种转基因包括多种类型的唾液酸转移酶，例如ST3Gall、ST3Gal2、 ST3Gal3、 ST3Gal4、 ST3Gal5、 ST3Gal6、 ST6Gall、 ST6Gal2、 ST6GalNAcl、 ST6GalNAc2、 ST6GalNAc3、ST6GalNAc4、ST6GalNAc5、ST8Sial、ST8Sia2、ST8Sia3、ST8Sia4、ST8Sia5、 ST8Sia6 ；半乳糖转移酶，例如GalTU GalT2 ；墨角藻糖基转移酶例如FUTU FUT2、FUT3、 FUT4、FUT5、FUT6、FUT7、FUT8、FUT9、FUT10、FUTll ；硫转移酶；GlcNAc 转移酶例如 GNTl、 GNT2、GNT3、GNT4、GNT5 ；天线切割酶(antenna-cleaving enzymes)和内切糖苷酶。例如，N-聚糖结构的无效末端唾液酸化作用导致表达的蛋白质血清半衰期减少， 所述蛋白质例如重组人AchE，可以通过向HEK 293细胞中加入大鼠β -半乳糖苷α-2、 6-唾液酸转移酶转基因改善此情况(JBiochem 336 :647_658，1998 ;J Biochem 363 619-631，2002)。相似地，特定的Lewis χ基团的无效结构例如N-聚糖结构的sialyl Lewis χ结 构导致表达蛋白配体结合的减少，所述表达蛋白例如重组人PSGL-1，可以通过向HEK 293 细胞中加入墨角藻糖基转移酶转基因来改善此情况(Fritz等人PNAS 95 12283-12288， 1998)在一个实施例中，使用转化有α-2，3或α-2，6唾液酸转移或者α-2，3和α-2，6 唾液酸转移酶(“唾液酸化蛋白”)的人细胞系产生蛋白质或它的嵌合分子。唾液酸化蛋白 的例子包括唾液酸化-GM-CSF、唾液酸化-GM-CSF-Fc、唾液酸化-IL-3、唾液酸化-IL-3_Fc、 唾液酸化-IL-4、唾液酸化-IL-4-Fc、唾液酸化-IL-5与唾液酸化-IL-5_Fc。特别地，用理化参数(Px)的特征来表征本发明的唾液酸化蛋白，包括单糖(P9)和 唾液酸含量(Pltl)，当以Ga 1 NAc为标准时为1 0. I-IOONeuNAc ；当以3倍甘露糖为标准时 为3 0. 1-100 NeuNAc0本发明的唾液酸化蛋白的N-连接寡糖中性百分数(P13)为0到9 9%,例如 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、 76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99 V0o 本发明的唾液酸化蛋白的N-连接寡糖酸性百分数(P14)为1到100%，例如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100%。本发明的唾液酸化蛋 白的0-连接寡糖中性百分数(P15)为0到99%，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 or 99%。本发明的唾液酸化蛋白的0-连接寡糖酸性百 分数(P16)为 1 到 100%，例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99 或 100%。和没有转基因的本发明的蛋白质或嵌合分子的半衰期相比，唾液酸化蛋白的体内 半衰期(T11)增加。在一个实施例中，唾液酸化蛋白含有至少一个此处所述结构式，或至少一个此处 所述结构式，其中一个或多个NeuNAc交联是N-交联部分中的α 2，6交联。在一个实施例中，唾液酸化蛋白含有至少一个此处所述结构式，或至少一个此处 所述结构式，其中一个或多个NeuNAc交联是0-交联部分中的α 2，6交联。在一个实施例中，使用转化有FUT3(“海藻糖化蛋白”，“fucosylated-protein”)的 人细胞系产生蛋白质或发明中它的嵌合分子。海藻糖化蛋白的例子包括海藻糖化-GM-CSF、 海藻糖化-GM-CSF-Fc、海藻糖化-IL-3、海藻糖化-IL-3-Fc、海藻糖化-IL-4、海藻糖 化-IL-4-Fc、海藻糖化-IL-5及海藻糖化-IL-5-Fc。特别地，用理化参数(Px)的特征来表征本发明的唾液酸化蛋白，包括单糖(P9)和 唾液酸含量(Pltl)，当和GalNAc归一化时为1到0. 1-100 NeuNAc ；当和3倍甘露糖归一化时 为 3 到 0.1-100 NeuNAc。在一个实施例中，海藻糖化蛋白拥有更多的含有Lewis结构(例如Lewis a.Lewis b、Lewis χ 或 Lewis y)或 sialyl Lewis 结构(例如 sialyl Lewis a 或 sialyl Lewisx) 的结构部分。在一个实施例中，和没有转基因的表达的本发明的蛋白质或嵌合分子的结合亲合 力相比，海藻糖化蛋白拥有改变的配体结合亲合力。使用从GM-CSF、IL_3、IL-4和IL-5中选择的蛋白分子的各自的正向引物和反向 引物，从EST中通过多聚酶链式反应(PCR)采用本领域已知的方法扩增编码相关蛋白的 DNA，例如根据 Invitrogen 公司的 PCRSuper Mix High Fidelity (Cat. No. 10790-020) 消化扩增子并连接到合适载体的相应的限制酶位点上，例如pIRESbleo3、pCMV_SP0RT6、pUMCV3、p0RF、p0RF9、pcDNA 3. l/GS、pCEP4、pIRESpuro3、pIRESpuro4、pcDNA3. 1/Hygro(+), pcDNA3. 1/Hygro (-)、pEF6/V5-His。连接载体转化到合适的大肠杆菌宿主细胞中，例如 XLGold、超感受态细胞(Strategene)、XL-Blue、DH5 α、DHlOB 或其它。对于嵌合分子的产生，从EST中采用合适的正向和反向引物通过PCR扩增免疫球 蛋白的 Fc 结构域的 DNA 序列，例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgGAl、IgGA2、IgGM、IgGE、Ig⑶。 扩展子被克隆到合适的载体的相应的限制酶位点上，例如，PIRESb 1 eo3、pCMV-SP0RT6、 pUMCV3、pORF、p0RF9、pcDNA3. 1/GS、pCEP4、pIRESpuro3、pIRESpuro4、pcDNA3. 1/Hygro (+)、 pcDNA3. 1/Hygro㈠、pEF6/V5_His。相应蛋白的DNA序列被扩增并克隆到各自的以Fc为框 架的Fc-载体的相应的限制酶位点上。在一个具体实施方案中，Fc受体结合区或Fc区域的补体激活区可以被重组修饰， 包括Fc区氨基酸序列的一个或多个氨基酸插入、删除或替换。此外，Fc受体结合区或Fc区 域的补体激活区可以被化学修饰，改变为它的糖基化形式，在氨基酸骨架上或任何关联的 共翻译实体或翻译后实体上加入或去除碳水化物部分、加入多不饱和脂肪酸部分或其它基 于脂的部分。Fc区域还可以是缩短形式，通过一种酶酶切来实现，所述酶包括木瓜蛋白酶、 胃蛋白酶或其它任何位点特异性的蛋白酶。Fc区域可以通过二聚体、三聚体或更高等级的 多聚体的结合相应配体或受体能力更强的嵌合蛋白，促进自发构象形成。使用合适的限制性酶进行鉴别消化来鉴定/分离含有带有相应基因的细菌克隆。 分离阳性克隆并_70°C甘油储存。随后将克隆扩增到750ml含有氨苄青霉素(100 μ g/ml) 的无菌LB液体培养基中37°C摇动培养16小时。根据本领域已知的方法提取质粒，优选的， 根据 QiagenEndofree Plasmid Mega 试剂盒(Qiagen Mega Prep Kit #12381)。适合引入含有本发明的蛋白质或嵌合分子的克隆DNA序列的人宿主细胞包括但 不限于 HEK 293 及其任何衍生体，HEK 293 cl8、HEK293-T、HEK 293 CEN4、HEK 293F、HEK 293FT、HEK 293E、AD-293 (Stratagene 公司)、293A (Invitrogen 公司)、Hela 细胞及其任 何衍生体，H印G2、PA-I Jurkat、THP-1、HL-60、H9、HuT 78、H印_2、H印 G2、MRC-5、PER. C6、 SK0-007、U266、Y2 (Apollo 公司)、WI-38、WI-L2。可以通过本领域已知的多种方法修饰宿主细胞来获得本发明的蛋白质或嵌合分 子的理化形式，包括但不限于向宿主细胞中引入一种或多种编码一种酶或多种酶、产生所 需理化形式的转基因。可以通过引入特殊的DNA序列来优化克隆DNA序列整合到宿主细 胞基因组中，不同类型的整合包括但不限于位点特异性的、靶向性的、直接的或酶介导的整
I=I ο可以通过多种本领域已知的转染方法将蛋白质或它的嵌合分子的DNA引入到合 适的宿主细胞中，例如，使用化学试剂例如二乙氨基乙基葡聚糖(DEAE-dextran)、磷酸钙、 人工脂质体或通过直接微注射、电穿孔、生物颗粒运输或感染或转染病毒结构，如下所述。DEAE-dextran是一种阳离子聚合物，和带负电荷的核酸结合。DNA/聚合体复合物 中聚合体上过多的正电荷能让复合物更接近缔合带有负电荷的细胞膜。据推测复合物的吸 收依靠内吞作用。转染中使用的其它合成的阳离子聚合物包括1，5_ 二甲基-1，5-二氮十一 亚甲基聚甲溴化物(polybrene)、聚乙烯亚胺和dendrimers。多种细胞类型的瞬时和稳定转染可以使用磷酸钙共沉淀。按某种受控的方式将 DNA和氯化钙混合，然后加入到缓冲的碱金属盐的/磷酸盐溶液中，混合液在室温下孵育。产生沉淀并被细胞通过内吞作用或吞噬作用吸收。脂质体介导的基因运输中脂质体的最常用脂成分是在生理学pH下具有净正电荷 的脂成分。通常将阳离子脂和中性脂混合，例如L-dioleoyl磷脂酰乙醇胺(DOPE)。脂分子 的阳离子部分和核酸的负电荷缔合，导致在脂质体/核酸复合物中核酸紧缩。通过内吞作 用吸收复合物。将DNA直接微注射到培养的细胞或细胞核中是一种有效的但是费力的技术，不适 合需要大量转染细胞的情况。电穿孔使用一种电脉冲产生孔隙，让核酸进入细胞，对于使用的每种类型的细胞 此技术都需要对脉冲的持续时间和强度进行细调和优化。可购买的电穿孔设备包括Amaxa Biosystems 公司的 Nucleofector 试剂盒(Amaxa Biosystems, Germany)。此方法依赖于核 酸微粒高速运输到受体细胞中。用病毒或逆转录病毒结构感染或转染包括使用逆转录病毒，例如慢病毒属，或DNA 病毒，例如腺病毒。其过程包括使用一种病毒或逆转录病毒载体来传送外来基因进入到宿 主细胞中。在一些实施方案中，通过瞬时方法或从稳定转染细胞系产生蛋白质或它的嵌合分 子。使用粘附或悬浮细胞系进行瞬时转染。对于粘附细胞系，细胞在含有血清的培养基 (2-10%血清)中生长，所述培养基例如DMEM，DMEM/F12 (JRH)。使用的血清可以是胎牛血清 (FCS)、供体小牛血清(DCS)、新生小牛血清(NBCS)等。通过本领域已知的标准方法将质粒 载体引入到细胞。在一个具体的实施方案中，使用DEAE dextran或磷酸钙沉淀法转染蛋白 质或它的嵌合分子的DNA。转染后，细胞转换到合适的收集培养基(例如无血清DMEM/F12) 中收集表达的蛋白或它的嵌合分子。可以通过使用上面简述方法引入质粒载体进行蛋白质或它的嵌合分子从悬浮细 胞中的瞬时表达。悬浮细胞能在含血清培养基或无血清培养基(例如Freestyle培养基 (Invitrogen), CD293 培养基(Invitrogen)，Excell 培养基(JRH)等)中生长。可以在无 血清条件下进行转染，通过在一种合适的培养基中使用合适的转染方法进行转染，例如， Iipofectamine 在 OptiMEM 培养基中。瞬时表达通常导致转染后2-3天表达高峰。游离型载体在细胞中复制并持续表 达。因此，为了获得大量的产物，将游离表达载体转染到细胞中并扩增细胞。蛋白质或它的 嵌合分子表达到培养基中，在细胞扩增几周后进行收集。表达培养基可以是含血清或无血 清的，细胞可以是粘附的或悬浮的。通过转染表达载体进入细胞获得稳定克隆，随后用合适的试剂进行选择，例如福 来霉素、均霉素、嘌呤霉素、新霉素G418、甲氨喋呤等。稳定克隆将能在选择中生存，因为质 粒中除了编码蛋白质或嵌合分子的基因以外还含有抗性基因。引入基因后1到2天，开始对 全部细胞(稳定池)或对按照克隆密度铺板的细胞进行选择。对非转染细胞群也进行选择 来确定选择试剂的杀细胞效果。对于粘附细胞，让细胞在组织培养板上生长直到获得可见 的分离的克隆。随后用胰酶消化或物理方法将它们从平板中移出并铺到组织培养孔中(96 孔板中每个孔一个克隆)。对于悬浮细胞，选择后进行有限稀释克隆，克隆随后得到扩增，随 后进行表征和/或进行下一轮的有限稀释分析。生长在含有血清的培养基中的稳定克隆能适应逐渐减少血清水平，随后脱落并在低血清下悬浮生长。随后进一步降低血清水平直到无血清状态。一些培养基能使适应更快 (例如，从含有粘附的条件直接替换为无血清悬浮生长)，一个例子是Irwitrogen公司的 ⑶293培养基。在无血清培养基中生长后，克隆可以开始进行培养基优化。在许多不同的培养基 中检测克隆的生产特性，例如，完整有活力细胞数量，直到获得最适成分。这依赖于生产的 生产方法。例如，在一个培养基中细胞可能扩增，随后在产物收集前加入增强表达的添加 剂。过量表达的蛋白或嵌合分子可能在宿主细胞中积累。细胞内蛋白的回收包括用 裂解缓冲液处理宿主细胞，所述裂解缓冲液包括但不限于含有如下成分的缓冲液NP40， Triton X-100, Triton X-114，十二烷基硫酸钠(SDS)，牛胆酸钠，去氧胆酸钠，CHAPS， CHAPS0，Brij-35，Brij-58，Tween-20，Tween-80，辛基葡糖苷和 octylthioglucoside。另一 种裂解宿主细胞方法可以包括声裂法、勻浆、弗氏细胞压碎和反复冻融和用低渗溶液处理 细胞。可以在多种不同生物反应器中生产最终产物，经由非限定性的例子，包括搅拌池、 气升式(airlift)、填充床灌流、微载体、中空纤维、袋技术、细胞工厂。其方法可以是连续培 养、批次、流加培养(fed batch)或诱导。可以在低血清培养基中加入胨类来增加容积蛋白 质产物。使用特别为本发明的蛋白质或嵌合分子定制的纯化策略纯化本发明的蛋白质 或嵌合分子。纯化方法包括但不限于正切流动过滤(TFF)；硫酸铵沉淀；分子筛析色 谱(SEC)；凝胶过滤色谱(GFC)；亲合色谱(AFC) ；A蛋白亲和提纯；受体介导的配位色谱 (RMLC)；染料配位色谱(DLC)；离子交换色谱(IEC)，包括阴离子或阳离子交换色谱(AEC或 CEC)；反相色谱(RPC)；疏水作用色谱(HIC)；金属螯合层析(MCC)。TFF是一种快速和有效的生物分子分离方法，用于浓缩、脱盐或分馏样品。TFF能 浓缩数百升样品为10毫升。和合适的分子量截留膜相结合，TFF能分离不同大小和分子量 的生物分子(额定分子量截留(NMWC)为5KDa，lOKDa，30KDa，IOOKDa)。透析过滤过程包括 稀释样品随后再浓缩，能被用于脱盐或替换样品缓冲液。盐析或硫酸铵沉淀能用于浓缩蛋白质稀释溶液。还用于分馏蛋白质混合物。增加 含蛋白质的溶液的离子强度引起蛋白质分子之间相似电荷排斥效果减弱。它还降低维持蛋 白质分子周围溶剂壳层的力。当这些力减小到足够程度时，蛋白质将沉淀；和亲水蛋白相 比，疏水蛋白在较低盐浓度下沉淀。通过逐步增加离子强度并进行离心进行蛋白质化合物 的分级分离是一种非常有效的部分纯化蛋白质的方法。SEC根据样品流经多孔基质，通过大小分离蛋白质。SEC和GFC原理相同，它被用 于分离液相系统中的分子。在SEC中，比填充材料中的孔大的分子和溶剂前沿一起首先流 出，是完全排除在外的。中间大小的分子，介于完全排除和保留之间，根据其大小通过基质 材料中的孔。自由进出孔的小分子被保留。因此，不同大小的蛋白质有不同的洗脱体积和 保留时间。对于结构相似的分子，分子大小越大，它们流程的越早。在运行任何样品之前， 应该建立标准曲线来确定工作限度和参考保留时间。当蛋白质形状相同时，可以根据柱中不同孔径的填充物，通过紫外吸收、荧光或光 散射快速筛选柱洗脱物的分子量。光子相关光谱(PCS)通常用于静态样品和液相色谱检测中。低角度激光散射也被偶联到色谱检测中，直接检测分子量，和蛋白质的形状无关(Carr 等人 AnalBiochem 175:492-499,1988)。SEC-HPLC 被用于检测 hGH 降解和聚集(Pikal 等人Pharm Res 8 :427_436，1991)。它还被用于估计研究的β -半乳糖苷酶的污染情况 (Yoshioka et a1. Pharm Res 10 103—108，1993)。AFC根据生物分子之间的化学结构间的特异性的相互作用和合适的亲和配体纯化 生物分子。通过互补的固定化的配体特异性的并且可逆的吸附目标分子。配体可以是一种 抑制剂、底物、模拟物或辅因子，或者一种能特异性识别目标分子的抗体。随后，通过竞争性 置换将吸附的分子洗脱掉，或者通过PH或离子强度转换让构象改变。A蛋白亲和纯化是使用某种细菌蛋白的亲和力的一个亲和纯化例子，所述细菌蛋 白能广泛结合抗体，不管抗体对抗原的特异性。A蛋白、G蛋白、L蛋白都具有了解清楚的抗 体结合特性。这三种蛋白已经重组生产并常规用于从多种中亲和纯化关键抗体类型。A蛋 白、G蛋白的遗传工程重组形式被称为蛋白A/G，也是可以使用的。这些抗体结合蛋白能被 固定化在支持基质上。此方法已经被修改用于纯化目标蛋白上连接有抗体A蛋白结合区域 (Fe区域)的重组蛋白中。在生理条件下结合到固定化的A蛋白分子上，通过改变pH或离 子强度洗脱。RMLC是一种特殊类型的AFC，使用了受体对其相关目标分子的固有亲和性。受体 分子通过活性氨基、活性氢、羰基、羧基或巯基基团被固定化在合适的色谱支持基质上。在 一个RMLC例子中，受体-Fc嵌合分子分子通过受体Fc部分对A蛋白的亲和力被固定在A 蛋白琼脂糖凝胶珠上。此方法具有定向固定受体，向其对应的细胞因子暴露出其配体结合 位点的优势。在生理条件下让目标分子吸附到受体上，通过改变PH或离子强度洗脱。DLC是一种ALC，使用了活性染料选择性和可逆的结合蛋白能力。染料通常是一 氯磺酰胺化合物。活性氯基团能人三嗪染料容易的固定化在支持基质上，例如琼脂糖凝胶 (Sepharose)或琼脂糖，并且最近能固定化在尼龙膜上。这些染料结合蛋白的最初发现来自于观察到用作凝胶过滤柱外水体积标志物的 葡聚糖蓝(Cibacron蓝re-3A的共轭化合物)能延缓某些蛋白质的洗脱。于是进行了染料 对特定蛋白的特异性的一些研究，多数使用原型Cibacron蓝染料。这些染料在结合使用核 苷酸作为辅因子的蛋白质和酶方面显示出最有效的结合特性，所述蛋白和酶例如激酶和脱 氢酶，虽然其它蛋白例如血清清蛋白也能紧密结合。人们认为芳香族三嗪染料结构和烟酰 胺腺嘌呤(NAD)的核苷酸结构相似，并且染料和这些蛋白中的烟酰胺腺嘌呤折叠发生相关 作用。在许多情况下，通过底物或核苷酸辅因子在竞争形式下能将结合蛋白洗脱下来，并且 染料已经显示出在自由溶液中竞争底物结合位点的特性。看来似乎这些染料能通过静电的 和疏水的相互作用和更特异性的和配体结合位点的“伪亲和”相互作用结合蛋白。通过修 饰增加染料配体的特异性来进一步模拟配体(拟生态染料)已经被成功用于纯化许多脱氢 酶和蛋白酶中(McGettrick等人)。离子交换色谱(IEC)使用了蛋白因离子交换柱基质和蛋白质之间的静电相互作 用在柱子中的滞留来纯化蛋白。当流动相PH超过目标蛋白的pi时，目标蛋白带负电，并将 和阴离子交换柱(AEC)发生相互作用。当流动相pH低于目标蛋白的pi时，目标蛋白带正 电，应使用阳离子交换柱(CEC)。通过使用和目标分子相同的电荷来增加平衡离子的浓度来 洗脱目标蛋白。[1392]RPC根据分子和色谱支持基质之间的疏水相互作用分离生物分子。通过控制分离 中的PH，在可电离的化合物的中性形式下，它们最容易分析。流动相添加剂，例如三氟乙酸， 通过形成离子对增加蛋白疏水性，强烈吸附到固定相。通过改变固定相的极性，生物分子从 色谱的支持基质上洗脱下来。HIC和RPC相似，但是具有更大的额定孔径。在HIC中，洗脱溶剂使用水相盐溶液， 代替RPC中使用的水相或有机相流动相。并且，样品洗脱顺序和RPC相比是相反的。蛋白 表面包含亲水残基和疏水“片”，后者通常位于折叠蛋白的内部来稳定蛋白质。当疏水片变 为暴露到水相环境中时，它们将破坏蛋白的正常溶剂特性，变为热力学不利的。在水相流动 相中，无机盐(例如硫酸铵)浓度越高，表面张力越大，因此增加HIC树脂疏水基团和蛋白 之间的疏水相互作用的强度，发生吸附。但是，当梯度降低盐浓度时，水相流动相的表面张 力下降，因此导致疏水性相互作用降低，导致蛋白从柱子疏水基团上解吸附。MCC是一种根据蛋白质对螯合金属离子的亲和力分离蛋白的技术。不同的金属离 子包括但不限于通过共价结合的螯合配体(例如亚氨二醋酸)固定在色谱支撑物固定相的 Cu2+，Co2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+或Ni2+。金属离子的自由配位点被用于结合不同的蛋白质和多肽。 通过用竞争性分子置换蛋白或者通过改变PH来洗脱。例如，降低缓冲液pH导致蛋白质-金 属离子复合物的结合亲和力降低，蛋白质解吸附。或者，使用梯度降低PH(采用不连续梯度 或线性梯度形式)从柱子上洗脱结合的蛋白质。可以通过本领域已知的多种方法修饰宿主细胞来获得本发明的蛋白质或嵌合分 子的理化形式。本发明设想了在蛋白质或嵌合分子表达和纯化之后，将碳水化合物化学或酶偶联 到蛋白质或嵌合分子的肽链上。可以使用化学和/或酶偶联过程来修饰、增加或降低数量 或碳水化合物取得的数量或特征。依赖所使用的偶联模式，糖可以附加到(a)精氨酸的酰 胺基，(b)自由羧基基团，(c)巯基基团，例如半胱氨酸中的那些，(d)羟基基团例如丝氨酸、 苏氨酸、羟基赖氨酸中的那些，(e)芳香族残基例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的那些， (f)谷氨酰胺的酰胺基团，或(g)氨基例如组氨酸、精氨酸或赖氨酸中的那些。可以通过化 学或酶学方法进行附加。例如，可以使用合适的重组糖基转移酶在蛋白质或它的嵌合分子 上连续附加糖单位。还可以使用糖基转移酶增加共价连接有取代基的糖。例如，可以通过 唾液酸转移酶将带有共价附加的聚乙二醇(PEG)的唾液酸转移到末端半乳糖残基来增加 分子大小和血清半衰期。还可以化学或酶法修饰蛋白质或嵌合分子的碳水化合物侧链来掺入多种功能团， 包括磷酸根、硫酸根、羟基、羧酸根、0-硫酸根和N-乙酰基团。还可以化学或酶法去除蛋白质或它的嵌合分子中的碳水化合物。可以使用三氟甲 磺酸或一种相当的化合物进行化学去糖基化。这种处理会导致大多数或所有糖的割裂，除 了结合糖，并且保持多肽完整。和可以通过多种内切糖苷酶和糖苷外切酶从蛋白质或它的 嵌合分子中去除个别的糖或整个链。可以通过用唾液酸酶来修饰蛋白质或嵌合分子的聚糖成分，或用中等程度的酸处 理来去除残留的唾液酸；用外切_或内切_糖苷酶来裁剪N-交联低聚糖天线或缩短0-连 接寡糖。还可以用岩藻糖苷酶或硫酸酯酶处理来去除侧基，例如海藻糖和硫酸根。可以化 学法向氨基酸骨架上添加伪聚糖结构例如聚乙二醇或葡聚糖，或者可以使用带有糖-dUDP前体的甘油转移酶鸡尾酒来向聚糖合成的增加糖亚单位。本发明设想了化学或酶法偶联蛋白质或它的嵌合分子到放射性核素上。这种蛋 白质或嵌合分子可以从含有 GM-CSF、GM-CSF-Fc, IL-3、IL-3-Fc、IL-4、IL-4-Fc、IL-5 和 IL-5-Fc的列表中选择。可以使用碘化作用向蛋白质或它的嵌合分子的肽链附加碘同位素(例如123I)。尤 其是，同位素可以附加到蛋白质或它的嵌合分子的肽链的(a)酪氨酸的酚环上，或(b)组氨 酸的咪唑环上。可以使用氯胺-T(Chloramine-T)、一氯化碘、三碘化物、电解质的、酶的、结 合、去金属化、非水溶性碘化试剂或碘珠的方法进行碘化作用。可以使用锝标记方法使用本领域已知的方法将99mTc附加到本发明的蛋白质或嵌 合分子上，例如通过用还原试剂(例如氯化亚锡)还原99mTcO4-,随后通过双功能螯合剂(例 如二亚乙三胺五乙酸(DTPA))进行99mTc标记蛋白质或嵌合分子。本发明设想了蛋白质或它的嵌合分子化学或酶法偶联到化学治疗剂上。可以使用 本领域已知的方法将合适的试剂(例如唑来膦酸)结合到蛋白质或它的嵌合分子上，例如， 通过N-hydroxysulfosuccinimide增强的碳化二亚胺介导的偶联反应。本发明设想了蛋白质或它的嵌合分子化学或酶法偶联到毒素上。可以使用本领域 已知的方法将合适的毒素(包括蜂毒素、vanous毒素、缩短的假单胞菌外毒素、蓖麻毒素、 白树毒素和diptheria毒素)结合到蛋白质或嵌合分子上，所述方法例如通过马来酰亚胺 或碳化二亚胺偶联化学作用。可以通过让分离的蛋白质或嵌合分子和患者中的目标受体或配体发生接触的方 法将此处所述的分离的蛋白质或它的嵌合分子运输到患者体内。在一个具体的实施方案 中，蛋白质或它的嵌合分子作为“药物组合物”被运输的患者中。另一方面，本发明设想了一种含有上文所述的分离的一种或多种蛋白质或嵌合分 子和药学可接受的载体或稀释剂的药物组合物。适用于注射使用的组合物形式包括无菌水溶液(水可溶的)和无菌粉末用于临时 制备无菌注射溶液。在生产和储存条件下它必须是稳定的，并且必须保持避免微生物(例 如细菌和真菌)的污染。载体可以是一种溶剂或稀释剂包括，例如，水、乙醇、多元醇(例 如，丙三醇、丙二醇、液态聚乙二醇等)、它们的合适的混合物和植物油。可以维持合适的流 动性，例如，通过使用表面活性剂。可以通过多种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、三 氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、thirmerosal等，来防止微生物的活动。在许多情况下，优选等渗 试剂，例如，糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延缓吸收试剂来延长可注射组合物的吸 收，例如，单硬脂酸铝和凝胶。通过在所需数量的合适的带有所需活性成分和可选的其它活性成分的溶剂中掺 入活性化合物，来制备无菌注射溶液，随后过滤灭菌或采用其它合适的灭菌方法。对于用于 制备无菌注射溶液的无菌粉末，合适的制备方法包括真空干燥和冻干，所述方法产生活性 成分粉末加任意添加的所需成分。当活性剂被合适的保护时，可以口服给药，例如，和无活性的稀释剂或和可同化的 可食载体，或者可以封装在硬的或软壳胶囊中，或者可以压缩为片剂，或者可以直接掺入到 日常饮食的食物中或通过母乳给药。对于口服治疗给药，活性成分可以掺入辅料并以可吸 收片剂、含片、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、薄脆饼等形式使用。这种组合物和制剂应该含有至少重量的活性成分。组合物和制剂的百分比可以，当然，是变化的并且可以合宜的介 于单位重量的5%到大约80%之间。在这种治疗用的组合物中活性试剂的数量为将获取的 合适的剂量。在一个具体的实施方案中，制备根据本发明的组合物或制剂，口服剂量单位形 式含有大约0. 1 μ g和200mg之间的调节剂。其它剂量包括从大约1 μ g到大约lOOOmg，从 大约IOyg到大约500mg。这些剂量可以是每个个体或每公斤体重。可以每小时、每天、每 周、每月或每年给药。片剂、含片、丸剂、胶囊等还可以含有下述列表的组合物。可以加入粘合剂例如树 脂、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶；辅料例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐 藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精，或者加入增香剂例如薄荷、 冬青油或樱桃调味料。当剂量单位形式是胶囊时，它可以含有上述类型的材料和液体载体。 多种其它材料可以用于包被或另外修饰剂量单位的物理形式。例如，可以用虫胶、蔗糖或两 者一起包被片剂、丸剂或胶囊。糖浆或酏剂可以含有活性化合物，蔗糖作为甜味剂，甲醇和 对羟苯甲酸丙酯作为防腐剂，染料和调味料例如樱桃或柑橘调味料。当然，在配制任何剂量 单位形式中使用的任何材料应该是药物纯的并且对于使用的数量基本是无毒的。此外，活 性化合物可以掺入缓释制剂和剂型中。本发明还设想了局部给药剂型。在局部给药剂型中，活性试剂可以是在乳膏或洗 剂或蜡制剂或其它液体溶液中悬浮的，因此局部应用乳膏或洗剂或蜡制剂或液体溶液导致 活性试剂被引入患者的生物表面。此处使用的词汇“生物表面”，设想了机体上或内部的任 何表面。本发明的局部合剂可以应用的“生物表面”的例子包括任何上皮表面，例如皮肤、 呼吸道、胃肠道和生殖泌尿道。除了传统乳膏、乳剂、贴片或喷雾剂以外，本发明的试剂还可以被局部的和/或透 皮的运输，使用一系列基于离子电渗疗法或电穿孔(poration)的方法。“离子电渗疗法”基于电流引起带电粒子运动的能力。置于皮肤上的一对靠近的电 极在皮肤和下面的毛细血管之间建立了一个电势。在正极，带正电荷的药物分子被驱离皮 肤表面到毛细血管。相反的，在负极带负电的药物分子将被推动透过皮肤。因为电流能关 闭和改变，离子电渗疗法装置能快速启动并关闭，药物运输是高度可控的并且是程序化的。电穿孔技术使用了高频脉冲能量，以多种形式(例如射频辐射、激光、热或光)来 短暂打破角质层，角质层是阻止多数药物进入到血流中的皮肤层。重要的是注意和离子电 渗不同，电穿孔技术使用的能量不用于运输药物通过皮肤，只是方便它的移动。电穿孔提供 了一个“窗口 ”，和正常情况相比药物底物能更容易和快速的通过。药学可接受的载体和/或稀释剂包括任何和所有的溶剂，分散剂，涂层、抗细菌和 抗真菌剂，等渗和延缓吸收剂等。对药物活性物质使用这种介质和试剂是本领域已知的，并 且没有什么常规介质或试剂和调节剂是不相容的，它们在药物组合物中的应用已经被设想 了。补充的活性化合物还可以掺入到组合物中。在一个实施方案中，可以单独或和其它药物或疗法联合使用本发明的药物组合 物，所述其它药物或疗法采用了和非人细胞系表达的蛋白质或它的嵌合分子一样的方式， 例如大肠杆菌、酵母或CHO表达的蛋白质或嵌合分子，用于单独或和其它药物一起治疗疾 病，所述疾病包括无β脂蛋白血症、A-V、β -2-微球蛋白淀粉样变性、A-T、A1AD、Α1ΑΤ、 Aagenaes,奥斯科格综合征、阿-斯二氏综合征、阿-史二氏综合征、阿瑟综合征、ΑΑΤ、阿-考_利三氏综合征、腹肌缺失综合征、腹壁缺损、腹性癫痫、腹型偏头痛、外展肌痉挛性 发音困难、外张肌痉挛性发音困难、阿伯克龙比综合征、眼睑巨口综合征、ABS、HPRT缺乏，胼 胝体Schinzel Typ缺乏，四肢头皮和颅缺损，无月经Primar，HGPRT缺乏，Absorptive Hyperoxaluriaor Enteric^Abt-Letterer-Siwe ^f, ACADL > ACADM ACADM>ACADS>$IJ^ 红细胞增多神经病，刺状红细胞增多，大疱性表皮松解，黑棘皮症(病)，大疱性棘层肥厚， 带有A型胰岛素抵抗力的黑棘皮症(病)，带有B型胰岛素抵抗力的黑棘皮症(病)，棘皮 痣，缺过氧化氢酶血症，无过氧化氢酶症，ACC、房室旁道、无头畸形、带有心脏缺陷ACF、弛缓 不能、阿查德-梯综合征、阿查德(马凡变种)、阿沙尔氏综合征、无胆色素尿性黄疸、软骨成 长不全、类型四软骨成长不全、第三类软骨成长不全、软骨发育不全、软骨发育不全迟缓、软 骨发育不全性侏儒、打喷嚏综合征、色盲、全色盲者、全色盲、全色盲、消色痣、酸性神经酰胺 酶缺乏、酸性麦芽糖酶缺乏症、酸性β -葡萄糖苷酶缺乏症、酸血症、酸血症、丙二酸血症偶 发性共济失调和虚弱、酸中毒、半肢畸形骨骺发育不良、ACM、听神经鞘瘤、听神经瘤、带有下 肢发育不全的尖头多指(趾)并指(趾)畸型、尖头多指(趾)并指(趾)畸型II、尖头多 指(趾)并指(趾)畸型IV、尖头多指(趾)并指(趾)畸型III、后天失语惊厥症、后天 布朗综合征、获得性癫痫性失语、凝血因子XIII缺乏症、后天形成的ACC(由感染引起的、而 仍然是在子宫内)、获得性高草酸盐尿症、获得性低丙种球蛋白血症、获得性免疫缺陷综合 症(艾滋病)、获得性铁超负荷、获得性脂肪营养障碍、获得性部分脂肪营养障碍、获得性游 动脾、ACR、肢端发育不全伴面部及生殖器畸形、Acro Renal、Acrocallosal Syndrome Scninzel Type、尖头并指(趾)(畸形)、I型尖头并指(趾)(畸形)、I型尖头并指(趾) (畸形)亚型I、II型尖头并指(趾)(畸形)、III型尖头并指(趾)(畸形)、IV型尖头并 指(趾)(畸形)、V型尖头并指(趾)(畸形)(ACS 5或ACS V)亚型I、尖头头骨不对称和 轻度并指、尖头、acrochondrohyperplasia、肠病性肢皮炎、肢端发育不全、肢端营养障碍性 神经病、面骨发育不全Nager型、面骨发育不全Postaxial型、面骨发育不全Genee-Wied印 型、肢皮早老家族、肢端肥大症、红斑性肢痛病、肢端肢中发育不全、肢端肢中段性侏儒、肢 端过小症骨骼发育不全、肢端过小症发育不良、带有骨质疏松的肢端溶骨症和颅骨和下颂 骨变化、肢端溶骨症、肢端感觉异常、ACSI、ACS II型、ACS III型、ACS、ACS3、促肾上腺皮质 激素缺乏症、行动肌阵挛、急性臂丛神经炎综合征、急性臂丛神经根综合征、急性脑戈谢病、 急性胆管炎、急性播散脑脊髓脊神经根病、急性弥散性组织细胞增生症X、急性出血性脑灰 质炎、特急性多发性神经炎、急性免疫调解多发性神经炎、小儿急性家族性脑中叶硬化、急 性间歇性卟啉、急性卟啉症、急性肉状瘤病、急性肩神经炎、急性中毒性表皮松懈、酰基辅酶 脱氢酶缺乏长链、酰基辅酶脱氢酶缺乏短链、脂酰辅酶A 二羟基丙酮酰基转移酶、乙酰化辅 酶A氧化酶缺乏、ADA、ADA缺乏、AdamComplex、亚-贝二氏综合征、釉质细胞瘤、Adams Oliver综合征、自适应结肠炎、ADD combined type、ADD、艾迪疾病带有脑硬化、艾迪病贫 血、艾迪生氏病、阿狄森(氏)贫血、肾上腺脑白质营养不良、阿狄森(氏)恶性贫血、内收 拇指_精神发育迟缓、内收肌痉挛性发音困难、内收肌痉挛性发音困难、男性化老年妇女腺 瘤、结肠与直肠腺上皮增生、结肠腺瘤息肉病、家族腺瘤性息肉、腺苷脱氨酶缺乏症、腺苷基 琥珀酸酶缺乏症、多动症主要动冲动型、多动症为主心不在焉型、多动症、蛛网膜粘连、艾迪 综合征、艾迪综合征、艾迪紧张性瞳孔、艾迪瞳孔、adipogenital (拉)色素性视网膜炎多 指、adipogenital (拉)色素性视网膜炎综合征、Adiposa Dolorosa、痛性肥胖症、肥胖性生殖器退化、青春期胱氨酸病、多囊肾、肾上腺皮质腺瘤、肾上腺疾病、肾上腺皮质功能亢进、 引起垂体促肾上腺皮质激素过剩、肾上腺发育不全、肾上腺功能不全、肾上腺肿瘤、肾上腺 男性化、肾上腺_色素性视网膜炎_多趾综合征、肾上腺皮质功能不全、肾上腺皮质功能减 退、促肾上腺皮质激素缺乏单独的、(先天性)肾上腺性性腺综合征、脑白质肾上腺萎缩症、 肾上腺髓周围神经病、肾上腺-色素性视网膜炎-多趾综合征、成人胱氨酸病、成人皮肌炎、 成人型低磷酸酯酶症、成人黄斑变性、成人发病ALD、成年发病ceroidosis、成人发病髓质 囊性疾病、成人发病恶性贫血、成人发病辛德勒疾病、成年发病亚急性坏死性脑脊髓病、成 人多囊肾病、成人发病髓质囊性疾病、adynlosuccinate裂合酶缺失、AE、AEC综合征、AFD、 纤维蛋白原血症、非洲肺铁末沉着症、AGA、无神经节性巨结肠、老年黄斑变性、胼胝体发育 不全、胼胝体发育不全、胼胝体发育不全_婴儿痉挛眼异常、胼胝体发育不全和脉络膜视网 膜异常、胼胝体发育不全-脉络膜视网膜炎、肥大细胞增生病、Agnosis Primary, AGR Triad、AGU、无脑回(畸形)、无脑回-巨脑回畸形频段、AHC、AHD、AHDS、AHF缺乏、AHG缺乏、 AHO,Ahumada Del Castillo、艾卡尔迪综合征、AIED、AIMP、AIP、AIS、运动不能性癫痫发作、 ALA-D卟啉病、无乳糖酶缺乏(症)、Alagille综合征、奥兰岛眼病(χ连锁)、alaninuria、 埃尔伯_勋伯格疾病、白化、白化病、不完全白化病、奥尔布赖特遗传性骨病、尿黑酸症、酒 精相关的出生缺陷、酒精胚胎病、酒精性肝硬化、Aid、ALD、ALD、醛固酮、带有血压正常的醛 甾酮增多症、先天性白内障、亚历山大病、亚力山大病(婴儿型脑白质营养不良)、痛性肌萎 缩、痛觉神经营养不良、黑尿症、尿黑酸黄褐病、烷基DHAP合酶缺失、Allan-Herndon-Dudley 综合征、阿兰_亨综合征、阿兰_亨-Dudley智力迟钝、变应性肉芽肿性血管炎、Cronkhit e_加拿大的变应性肉芽肿性血管炎、前脑无叶无裂畸形、斑秃、局限性脱发、局限性脱发、局 限性脱发、脱发-白发(症-皮纹葡萄膜炎-白癜风-耳聋皮肤葡萄膜-O、脱发 semirumiversal i s、全秃、泛脱发、阿尔佩斯病、alpers弥漫性变性的脑灰质与肝硬化、 alpers进展的小儿灰质营养不良(大脑)、甲抗胰蛋白酶缺乏症、阿尔法-14糖苷酶缺乏 症、阿尔法_半乳糖苷酶缺陷、阿尔法_半乳糖苷缺硼、阿尔法高密度脂蛋白缺乏、α -L-岩 藻糖苷酶缺乏岩藻糖苷(贮积)病3型、α -GalNAc缺陷Schindler型、α脂蛋白、甘露糖 苷过多症、α -N-乙酰半乳糖胺酶缺陷Schindler型、α -NAGA缺失Schindler型、α -神经 氨(糖)酸苷酶缺陷、α-地中海贫血/精神发育迟缓综合征非缺失型、α脂蛋白、奥尔波 特综合征、ALS、alstroem氏综合征、alstroem、alstrom综合征、交替偏瘫综合征、儿童交替 性偏瘫、阿尔茨海默氏病、家庭性黑牙合性白痴、家庭性黑牙合性白痴成人、家庭性黑牙合 性白痴小儿、外阴性别不明、AMC、AMD、成釉细胞瘤、釉质生长不全、闭经-溢乳 nonpuerperal、闭经-溢乳-FSH减少综合征、闭经、氨基酸失常、氨基酸_软骨病_高磷酸 盐尿综合征、AMN、羊膜穿刺、羊膜带、羊膜带综合征、羊膜带破裂复杂、羊膜带序列、羊膜破 裂序列、先天性截肢、AMS、阿姆斯特丹矮小综合症de Lange、淀粉-1、6-糖苷酶缺乏症、长 期血液透析淀粉关节、淀粉状角膜营养不良、淀粉样多神经病、淀粉样变性病、淀粉家族性 地中海热、支链淀粉病、先天性肌发育不全、肌萎缩侧索硬化症、肌萎缩侧索硬化症、肌萎缩 侧索硬化症_葡聚糖体、AN、ANU AN2、肛门闭锁、肛膜、肛门直肠畸形、肛门狭窄、Analine 60淀粉样变性病、血(内)α -脂蛋白缺乏、analrectal^nalrectal、多形性成胶质细胞瘤、 安德森病、安德森一法布里病、安徒生糖原病、安德森-华宝综合征、安德烈综合征、安德烈 综合征二型、雄激素不敏感、雄激素不敏感综合征局部、雄激素不敏感综合征局部、Androgenic Steroids>^il gAnemia Blackfan Diamond、H、5fei
性的、拇指三节指骨综合症、溶血性贫血冷抗体、溶血性贫血带有PGK缺失、恶性贫血、无脑 畸形、angelman综合征、血管骨肥大综合征、血管滤泡淋巴结增生、血管血友病、血管角质瘤 体、漫性体血管角质瘤、弥漫性血管角质瘤、视网膜血管瘤病、淋巴血管瘤、血管神经性水肿 遗传的、先天性外胚层缺陷、无汗性χ连锁外胚层发育不良、虹膜缺失、虹膜缺失_生殖器性 别不清的精神发育迟滞、虹膜与精神发育迟滞、虹膜缺失_小脑共济失调智残、虹膜局部小 脑共济失调精神发育迟滞、虹膜局部小脑共济失调智力发育不全、虹膜缺失型I、虹膜缺失 型II、无虹膜_维尔姆斯肿瘤联合征、无虹膜Wilms瘤-性腺胚细胞瘤、睑缘粘连-外胚层 发育缺陷唇裂/腭裂、强直性脊柱炎、Annular groves、无牙症、真无牙、色弱、异常发育异 常牙本质、冠部牙本质发育异常、命名性失语、无眼、肛肠、肛门直肠畸形、嗅觉丧失、前弓形 腿伴随侏儒症、牙膜角膜营养不良、抗惊厥症、抗Epstein-Ban 病毒核抗原(EBNA)抗体缺 陷、抗体缺乏、抗体缺乏带有接近正常免疫球蛋白、抗血友病因子缺乏症、抗血友病球蛋白 缺乏症、抗磷脂综合征、抗磷脂抗体综合征、抗凝血酶III缺乏、典型抗凝血酶III缺乏(I 型)、抗胰蛋白酶缺失、Antley-Bixler综合征、Antoni麻痹、胫不安、主动脉弓综合征、主动 脉及二尖瓣闭锁合并左心综合征、主动脉瓣狭窄、aparoschisis, APC、apeced综合征、阿佩 尔综合征、aperts、失语、先天性颅外轴性发育不全、先天性皮肤发育不全、先天性皮肤发育 不全并末端横向肢体缺损、再生障碍性贫血、再生障碍性贫血先天性异常、APLS、呼吸暂停、 Appalachian型淀粉样变性病、苹果皮综合征、失用(症)、颊面失用(症)、结构失用(症)、 Ideational失用(症)、ideokinetic失用(症)、观念运动失用(症)、马达失用(症)、眼 球运动失用(症)、APS、蛛网膜炎、蜘蛛足样指/趾挛缩Beals型、蜘蛛足样指/趾、蛛网膜 囊肿、蛛网膜骨化、蛛网膜炎、Aran-Ducherme、阿-杜二氏肌萎缩、再生障碍性贫血、精氨酸 缺失、精氨酸血(症)、arginin0 succinase缺失、精氨琥珀酸酶缺乏症、精氨基琥珀酸裂解 酶缺陷症、精氨基琥珀酸-ASL、精氨基琥珀酸合成酶缺乏、精氨(基)琥珀酸尿、Argonz-Del Castillo综合征、无嗅脑[畸形]、亚美尼亚综合征、阿诺德_基亚里畸形、阿诺德_加综合 征、ARPKD、肌阵挛性心律失常、右心室发育不良、肝动脉发育不良、动静脉畸形、静脉畸形 脑、动脉炎巨细胞、关节炎、Reiter综合征、关节-齿-骨发育不良、关节眼病、先天性多发 性关节松弛、远端、IIA型、ARVD、芳(香)基硫酸酯酶B缺乏症、AS、ASA缺乏、上行性麻痹、 ASD、房间隔缺损、ASH、子宫腔粘连综合征、Ashkenaz i型淀粉样变性病、ASL缺乏、天冬氨酰 基葡萄糖胺尿、艾斯伯格综合征、艾斯伯格型自闭症、窒息性胸廓发育不良、脾综合征、ASS 缺乏、哮喘、星形细胞瘤I级(良性)、星形细胞瘤II级(良性)、不对称哭相心脏缺陷、非 对称性心室间隔肥厚、无症状胼胝、AT、AT III缺陷、AT III变体IA、AT III变体Ib、AT 3、 共济失调、共济失调毛细血管扩张症、共济失调并乳酸酸中毒II型、共济失调脑瘫、衰弱性 共济失调、言语共济失调、ATD、手足脑瘫、皮炎湿疹、食管闭锁伴有或不伴有食管气管瘘、房 间隔缺损、原始房间隔缺损、心房间隔和小室间隔缺损、心房扑动、心房颤动、心房_手指发 育不良、房间隔缺损、房室传导阻滞、房室管畸形、房室间隔缺损、诺里(氏)病、萎缩型脚气 病、橄榄萎缩、注意力缺陷障碍、注意缺陷障碍[伴多动]、减毒结肠腺瘤、非典型性淀粉样 变性病、非典型血症、内耳道闭锁、耳颞综合征、孤独症、自闭症_艾斯伯格型、自闭症痴呆 共济失调和目的性手部使用缺损、自闭症儿童孤独症、自身免疫性艾迪生氏病、自身免疫性 溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性-多(种)内分泌腺病-念珠菌病、自身免疫性多腺疾病I型、常染色体显性遗传白化病、常染色体显性CompellingHelioophthalmic Outburst综合征、常染色体显性遗传索蛋白远端肌病并迟发、常染色体显性EDS、常染色体 显性emery-dreifuss型肌肉萎缩症、常染色体显性圆锥角膜、常染色体显性佩-梅二氏脑 硬化症、常染色体显性多囊肾病、常染色体显性遗传脊髓小脑变性、常染色体隐性遗传无丙 种球蛋白病、常染色体隐性遗传中央核肌病、常染色体隐性遗传康-许二氏综合征、常染色 体隐性遗传EDS、常染色体隐性遗传埃-德二氏肌营养不良、常染色体隐性遗传形式的眼部 白化、常染色体隐性遗传胼胝发育不全、常染色体隐性圆锥角膜、常染色体隐性遗传性多囊 肾病、常染色体隐性遗传重症联合免疫缺陷、AV、AVM、AVSD、AWTA、腋下脓肿、轴突性神经病 巨型、Azorean 神经疾病、B-K 痣综合征、Babinski-Froelich 综合征、BADS、bail larger 氏 综合征、巴尔干疾病、巴_格二氏综合征、球囊二尖瓣、巴洛病同心圆硬化、波罗的海肌阵挛 性癫痫、bannayan-佐纳纳综合症(bzs)、bannayan-莱利-ruvalcaba综合征、本蒂氏病、 bardet-biedl综合征、裸淋巴细胞综合征、巴洛氏综合征、巴[拉克尔]-西[蒙]二氏病、 巴雷特食管、贝瑞特溃疡、巴特综合征、巴特氏综合征、基底细胞痣综合征、巴泽多病、 巴_科综合征、巴藤病、Batten-Mayou综合征、Batten-Spielmeyer-Vogt病、贝敦特纳氏综 合症、贝敦特纳型先天性肌病、Batten-Vogt综合征、BBB综合征、BBB综合症(opitz) ,BBBG 综合征、BCKD缺失、BD、BDLS、BE、贝亚尔斯综合征、贝亚尔斯综合征、贝亚尔斯-赫克特综合 征、蓝色橡皮疱样痣综合征、BEB、beChterew综合征、贝克尔病、贝克肌营养不良、贝克尔痣、 Beckwith Wiedemann综合征、眼距过宽-尿道下裂综合征、Begnez-Cesar综合症、Behcet 综合征、Behcet病、Behrl、Behr2、贝尔氏麻痹、良性黑棘皮病、良性星形细胞瘤、良性颅神经 肿瘤、良性胱氨酸病、良性自发性睑痉挛、良性原发性震颤、良性家族性血尿、良性局灶性肌 萎缩、ALS良性局灶性肌萎缩、良性脑积水、良性高活动度综合征、角化良性黑棘皮病、良性 阵发性腹膜炎、良性复发性血尿、良性复发性肝内胆汁淤积、良性脊髓性肌萎缩症并腓肥 厚、良性对称性脂肪过多症、良性中枢神经系统肿瘤、贝-赛二氏综合征、伯杰氏病、脚气、 贝曼综合征、贝尔纳-霍内尔综合征、伯-苏综合征、贝斯聂痒疹、卵黄状黄斑变性、丙 氨酸-丙酮酸转氨酶、β-半乳糖苷酶缺乏莫基奥综合征、β-葡糖醛酸酶缺乏、β氧化缺 陷、β重型地中海贫血、β轻型地中海贫血、β-脂蛋白缺失、贝特伦肌病、Beuren综合征、 ΒΗ4缺乏症、Biber-Haab-Dimmer角膜营养不良、二叶式主动脉瓣、Biedl-Bardet、双歧脑 颅、双功能酶缺陷、双侧听多发性神经纤维瘤病、双侧听神经瘤、无脾序列征、双侧肾发育不 全、双边颞叶障碍、胆汁发作、葡萄糖苷酸(基)转移酶缺陷I型、Binder综合征、 binswanger病、Binswanger脑病、生物素酶缺乏症、鸟头侏儒Seckel型、出生缺陷、胎记、双 颞钳痕综合征、心室纤维化、Bjornstad综合征、B-K痣综合征、黑锁-白化病-耳聋 sensoneural型(BADS)、布-戴二氏贫血综合征、脓溢原发性关节炎、睑裂狭小、下垂症、倒 转型内眦赘皮综合征、睑痉挛、睑痉挛良性原发、口腔眼睑痉挛、布累西格囊肿、BLFS、失明、 Bloch-Siemens 色素失调症成黑素细胞增多病皮肤 Linearis、Bloch-Siemens-Sulzberger 综合征、布洛赫_苏兹贝格综合征、血型、血型A、血型B、血型AB、血型O、布鲁姆综合征、 Bloom-Torre-Mackacek综合征、蓝橡皮奶头痣、青紫婴儿、蓝尿布综合征、BMD、B0D、B0FS、骨 肿瘤表皮样囊肿息肉、邦-迪-布三氏综合征、Bormevie-Ulrich综合征、遗传性过早白发 综合征、梅_弗综合征、BORJ、borjeson综合征、伯-福-莱三氏综合征、脑肝肾综合征、 Bowen-Conradi 综合征、Bowen—Conradi Hutterite、Bowen-Conradi 型 Hutterite 综合征、Bowman' s Layer、BPEI、BPES、臂丛神经炎、臂丛神经炎综合征、臂丛神经炎、臂丛神经病变、 臂缺血、布-德二氏综合征、短头(畸形)、短形型先天性、心动过缓、颅脑损伤因围产期窒 息、脑瘤、脑肿瘤良性、脑肿瘤恶性、支链α-酮酸脱氢酶缺乏症、支链酮尿I、分支酶缺乏、 Branchio-Oculo-Facial 综合征、branchio-oto 肾发育不全、branchio-oto 肾综合征、 branchiooculofacialBranchiooculofacialBrandtbrandywine
型牙本质发育不全、brandywine的型牙本质发育不全、乳腺癌、良性复发性肝内胆汁淤积综 合征、脆骨病、宽β脂蛋白病、宽拇指综合症、宽拇指和大脚趾特征的面部智力发育迟缓、 宽拇指、Broca失语、Brocq-Duhring病、青铜色糖尿病、青铜色弥漫性硬化症、褐色白化病、 褐釉遗传、布朗-塞卡尔(氏)综合征、布朗综合征、BRRS、勃鲁格尔综合征、Bruton无、 球蛋白血(症)、BS、BSS、Buchanan综合征、Budd综合征、巴德-基亚里综合征、 Buerger-Gruetz综合征、bulbospinal肌肉萎缩χ连锁、过劳综合征、遗传性大疱、大疱CIE、 大疱性先天性鱼鳞病样红皮症、大疱性鱼鳞病、大疱性类天疱疮、Burkitt淋巴瘤、Burkitt 淋巴瘤非洲型、Burkitt淋巴瘤、非非洲型、BffS, Byler病、C综合征、cl酯酶抑制因子异常 II型血管性水肿、Cl-INH、cl酯酶抑制因子缺乏I型血管水肿、C1NH、卡-里二氏病、CAD、 CADASIL、CAH、跟骨外翻、calcaneovalgus、双水焦磷酸钙沉着、胼胝体发育不全和眼部异 常、腓肥厚脊髓性肌肉萎缩症、躯干发育异常、躯干侏儒症、躯干综合征、屈指-腭裂一畸形 足、屈指有限颚偏移、弯肢性侏儒、肢体屈曲综合征、肢体屈曲综合征长肢型、卡-恩二氏 病、Canada-Cronkhite疾病、卡纳万病、卡纳万病包括的、卡纳万脑白质营养不良、癌症、癌 症家族综合征 Lynch 型、cantrell 综合征、Cantrell-Haller-Ravich 综合征、Cantrell 五 联症、氨甲酰磷酸合成酶缺乏症、碳水化合物缺陷糖蛋白综合症、碳水化合物缺陷糖蛋白综 合症Ia型、碳水化合物诱发的高脂血症、葡萄糖乳糖的碳水化合物不耐受、二氧化碳酸中 毒、多重羧化酶缺陷、心肢综合征、心听觉综合征、Jervell and and Lange-Nielsen的 cardioauditory综合征、心脏皮肤综合征、心-面-皮肤综合征、心面综合征Cayler型、II 型糖原贮积病、心肌疾病着色斑病、心肌病、心肌病并索蛋白存储肌病、心肌病由于索蛋白 缺陷、心肌病_中性粒细胞减少症、心肌病_中性粒细胞减少症致死小儿心肌病、心脏病淀 粉样变性、贲门痉挛、cardocardiac综合征、肉碱-酰基肉毒碱易位酶缺乏、肉碱缺乏和紊 乱、肉碱缺乏症原发、肉碱缺乏症继发、肉碱缺乏症继发到MCAD缺乏、肉[毒]碱缺乏病、肉 毒碱棕榈酰转移酶I & II (CPT I & II)、肉毒碱棕榈酰转移酶缺乏、肉毒碱棕榈酰转移酶 缺乏I型、肉毒碱棕榈酰转移酶缺乏I型包括良性典型肌肉形式包括婴幼儿重症形式、肉碱 运输缺损(原发性肉碱缺乏症)、肌肽酶缺乏症、肌肽血、卡罗利病、卡彭特综合征、卡彭特 的、软骨_毛发发育不全、castleman病、castleman病透明血管型、castleman病浆细胞型、 Cast 1 eman肿瘤、猫眼综合征、猫哭综合征、catalayse缺失、Cataract-牙科综合征、 Cataractx连锁梅毒性牙、儿茶酚胺类激素、catel-manzke综合征、catel-manzke型 palatodigital综合征、尾发育异常、尾发育不良序列征、尾部发育不全综合征、灼痛综合征 成人、海绵状血管瘤、海绵状血管瘤、海绵状血管瘤、海绵状淋巴管、海绵状畸形、cayler综 合征、Cazenave 白癜风、CBGD、CBPS, CCA、CCD、CCHS, CCM 综合征、CCMS, CCO、CD、CDGla、 ⑶GlAjDGS Ia型、⑶GS、⑶I、CdLS、腹腔疾病、口炎性腹泻、腹腔口炎性腹泻-皮炎、细胞免 疫缺陷与嘌呤核苷磷酸化酶缺陷、celsus白癜风、中枢性窒息、中央核疾病、中枢性尿崩症、 中央形成多发性神经纤维瘤、中枢通气不足、中枢性睡眠呼吸暂停、远心脂肪营养障碍、中央核性、CEP、脑膨出、头(与)胸廓脂肪营养障碍、神经酰胺三己糖苷酶缺乏症、小脑发育不 全、小脑发育不全、小脑偏侧味觉缺失、小脑发育不全、小脑蚓部发育不全、小脑蚓部发育不 全_呼吸深快-幕式眼动共济失调迟缓、小脑综合征、Cerebellarparenchymal病IV、小脑 髓部畸形综合征、小脑眼皮肤毛细血管扩张、Cerebellarparenchymal病IV家族性的、桥小 脑角肿瘤、脑蛛网膜炎、脑常染色体遗传性脑血管病伴皮层下梗死和脑白质营养不良、 Wernicke-Korsakoff综合征、大脑性双瘫、大脑性巨人症、脑缺血、脑血管畸形、脑性麻痹、 脑oculorenal营养不良、脑眼面部骨骼综合征、大脑_肋骨-下颂综合征、脑肝肾综合征、 大脑黄斑变性、cerebromuscular营养不良Fukuyama型、脑(与)眼发育不全、脑(与)眼 发育不全肌营养不良综合征、脑_眼-面_骨骼综合征、大脑视网膜动静脉瘤综合征、脑苷 脂脂沉积、脑甙(沉积)病、脑-腱性黄瘤病、脑血管亚铁钙沉着、蜡样脂褐质沉积症成人形 式、颈部肌张力障碍、颈部肌张力障碍、颈眼听障碍综合征、颈椎椎管狭窄症、颈椎椎体融 合、CES、CF、CFC 综合征、CFIDS、CFND, CGD、CGF、泛发 Chalasodermia、Chanarin Dorfman 病、Chanarin Dorfman 综合征、Chanarin Dorfman 鱼鳞癣症、Chandler 综合征、Charcot 病、 夏-马-图三氏肌萎缩、图思(氏)病、夏-马-图三氏病、图思(氏)病、夏-马-图三氏 病变种、Charcot-Marie-Tooth-Roussy-Levy 病、CHARGE 联合征、Charge 综合征、CHARGE 综 合征、chaimd外胚层发育不良、切-东二氏综合征、CSH综合征、肉芽肿性唇炎、唇裂、chemke 综合征、Cheney综合征、樱桃红点和肌阵挛综合征、CHF、CHH、chiari病、chiari畸形I、 chiari 畸形、chiaril 型(chiari 畸形 I)、chiari II 型(chiari 畸形 II)、chiari I 型综 合征、Chiari-Budd综合征、希-阿二氏综合征、chiari畸形II、儿童综合征、儿童鱼鳞癣症、 儿童综合征鱼鳞病、儿童脑白质肾上腺萎缩症、儿童皮肌炎、儿童发型肌张力障碍、儿童周 期性呕吐、儿童巨轴索神经病、儿童磷酸酶过低症、儿童期肌营养不良、CHN、胆汁郁积、胆汁 郁积遗传型挪威型、肝内胆汁淤积、新生儿胆汁郁积、口服避孕药使用者胆汁郁积、胆汁郁 积并周围肺动脉狭窄、妊娠胆汁淤积、胆固醇碳链酶缺乏、斑点状软骨发育异常、亨纳曼 (氏)综合征、胎儿软骨营养障碍、软骨营养不良性肌强直、软骨营养障碍、软骨营养障碍并 畸形足、骺软骨营养障碍、增生形式软骨营养障碍、艾-范二氏综合征、软骨发育不全、 chondrohystrophia、软骨骨营养障碍、舞蹈病棘红细胞增多症、绒膜绒毛取样、脉络膜异 常、脉络膜异常并ACC、chorireninal缺损-Joubert综合征、脉络膜硬化、无脉络膜、尖 头_多及并指/趾畸形综合征、克-西_图三氏综合征、克-西_图三氏综合征、圣诞节病、 克里斯马斯病、3号染色体缺失远端3p、3号染色体远端3p单体性、3号染色体远端3q2重 迭、3号染色体远端3q2三体、3号染色体单体3p2、染色体3q部分重叠综合征、染色体3q、 部分三体综合征、3号染色体_三体性3q2、4号染色体4q31_qter缺失综合征、4号染色体 4q32-qter缺失综合征、4号染色体4q33_qter缺失综合征、4号染色体长臂缺失、4号染色 体长臂缺失、4号染色体单体性4q、4号染色体单体性4q、4号染色体单体性远侧4q、4号染 色体部分缺失4p、4号染色体、局部短臂缺失、4号染色体部分单体远侧4q、4号染色体部分 单体4p、4号染色体部分三体4(q25_qter)、4号染色体部分三体4(q26 or q27_qter)、4号 染色体部分三体4 (q31 or 32-qter)、4号染色体部分三体4p、4号染色体部分三体4q2和 4q3、4号染色体部分三体远端4、4号染色体环、4号染色体4q末端缺失综合征、染色体4q 综合征、染色体4q综合征、4号染色体三体4、4号染色体三体4p、4号染色体XY/47 XXY(Mosiac)、5号染色体单体5p、5号染色体、局部短臂缺失综合征、5号染色体三体5p、5号染色体三体5p全部(5pll-pter)、5号染色体三体的5p部分(5pl3或14-pter)、染色体 5p综合征、6号染色体部分三体6q、6号染色体环、6号染色体三体6q2、7号染色体上单体 7p2、7号染色体部分短臂缺失(7p2-)、7号染色体终端7p缺失[del (7) (p21_p22) ]、8号染 色体单体8p2、8号染色体单体8p21-pter、8号染色体部分缺失(短臂)、8号染色体部分单 体8p2、9号染色体完整三体9P、9号染色体部分缺失短臂、9号染色体部分单体9p、9号染色 体部分单体9p22、9号染色体部分单体9p22-pter、9号染色体部分三体9P包括、9号染色体 环、9号染色体四体9p、9号染色体四体9p镶嵌、9号染色体三体9p (多个变种)、9号染色 体三体9(pter-p21到q32)包括、9号染色体三体镶嵌、9号染色体三体镶嵌、10号染色体远 端三体10q、10号染色体单体、10号染色体单体10p、10号染色体、部分缺失(短臂)、10号 染色体、IOp-局部、10号染色体部分染色体10q24-qter、10号染色体三体10q2、ll号染色 体长臂部分单体、11号染色体部分单体llq、ll号染色体部分三体、11号染色体部分三体 llql3_qter、ll号染色体部分三体llq21_qter、11号染色体部分三体llq23_qter、染色体 llq、部分三体、12号染色体等臂染色体12p镶嵌、13号染色体部分单体13q、13号染色体、 长臂部分单体、14号染色体环、14号染色体三体、15号染色体远端三体15q、染色体rl5、15 号染色体环、15号染色体三体15q2、染色体15q、部分重叠综合征、17号染色体中间缺失 17p、18号染色体长臂缺失综合征、18号染色体单体18p、18号染色体单体18Q、18号染色体 环、18号染色体四体18p、染色体18q综合征、21号染色体镶嵌21综合症、21号染色体环、 21号染色体易位21综合症、22号染色体倒重叠(22pter-22qll)、22号染色体部分三体 (22pter-22qll)、22号染色体环、22号染色体三体镶嵌、染色体48 xxyy、染色体48 xxxy、 染色体rl5、染色体三体化、染色体三体化、三倍体染色体综合症、χ染色体、染色体XXYVg 性无胆色素尿性黄疸、慢性蛛网膜粘连、慢性肾上腺皮质功能不全、慢性海绵体炎、先天性 慢性再生障碍性贫血、慢性吞噬功能不全、家族性慢性肉芽肿、慢性家族性黄疸、慢性疲劳 免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性肉芽肿病、慢性格-巴二氏综合征、慢性特发性黄疸、慢 性特发多发性神经炎(CIP)、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、慢性炎症性脱髓鞘性神经病、 慢性运动性抽搐、慢性皮肤粘膜念珠菌病、慢性多发性抽动、慢性非特异性溃疡性结肠炎、 慢性闭塞性胆管炎、慢性消化性溃疡和食管炎综合征、慢性进行性舞蹈病、慢性渐进性眼外 肌麻痹综合征、慢性渐进性眼外肌麻痹与肌病、慢性渐进性眼外肌麻痹并褴褛红色纤维、慢 性复发性神经病、慢性肉样瘤、慢性痉挛、儿童慢性呕吐、CHS、丘-施二氏综合征、瘢痕性类 天疱疮、CIP、肝硬化先天性色素、肝硬化、cistinuria、瓜氨酸血症、CJD、典型Schindler 病、典型型普综合征、典型型PfeifTer综合征、典型血友病、典型形式科凯恩综合征I型(A 型)、典型利氏病、典型苯丙酮尿症、典型χ连锁佩_梅二氏脑硬化、CLE、唇裂/腭裂粘液囊 肿下唇PP指状及生殖器异常、唇裂_腭裂睑裂狭小兔眼及增宽、唇裂/腭裂大拇指畸形和 小头畸型、腭裂关节挛缩-担架助步器畸形、腭裂和唇裂、锁骨颅骨发育不全小颂(症)、 缺拇指&远端无指(趾)畸形、锁骨发育不全、锁骨颅骨发育不全、喀喇音杂音综合征、 CLN1、阵挛性痉挛、cloustons综合征、畸形足、CMDI, CMM, CMT、CMTC, CMTX, COA综合征、主 动脉缩窄、科茨病、鹅卵石发育异常、Cochin Jewish病、科凯恩综合征、COD-MD综合征、 COD、Coffin Lowry 综合征、Coffin 综合征、Coffin Siris 综合征、COFS 综合征、Cogan 角 膜营养不良、Cogan里斯综合征、科恩综合征、冷凝集素病、抗肾小球基膜抗体病、冷抗体溶 血性贫血、溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎、溃疡性结肠炎慢性非特异性溃疡性结肠炎、火棉胶婴儿、缺损心脏缺损闭锁鼻孔迟缓生长发育生殖泌尿系统异常及异常耳、缺损、结肠神经 官能症、色盲、色盲、Colpoc印haly、柱状样食管、结合锥杆细胞变性、联合免疫缺陷与免疫 球蛋白、联合中外胚叶缺陷、常见变异型低丙种球蛋白血症、常见变异型免疫缺陷病、共同 心室、交通性脑积水、完全缺乏次黄嘌呤_鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、完全性房室隔缺损、补 体成分1抑制剂缺乏、补体成分Cl调节成分缺失、完全性心脏传导阻滞、复合碳水化合物不 耐受、复杂的局部疼痛综合征、复杂V ATP合酶缺失、复合物I、复合物I NADH脱氢酶缺陷、 复合物II、复合物II 丁二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶缺乏症、复合物III、复合物III辅酶QlO 细胞色素c氧化还原酶缺陷、复合物IV、复合物IV细胞色素C氧化酶缺陷、复合物IV缺失、 复合物V、脑震荡、锥杆细胞变性、锥杆细胞变性进展的、锥体营养不良、锥杆细胞营养不良、 汇合网状乳头状瘤病、先天性低Pk动力学、先天性无腹部肌肉、先天性无胸腺和甲状旁腺、 先天性色素缺乏、先天性艾迪生氏病、先天性肾上腺增生、先天性肾上腺增生、先天性无纤 维蛋白原血症、先天性肺泡换气不足、新生儿先天性贫血、先天性双侧persylvian综合征、 先天性布朗综合征、先天性心脏缺损、先天性中枢性低通气综合征、先天性大脑性麻痹、先 天性颈椎骨连结、先天性拇指紧并智力发育迟缓、先天性挛缩性细长指(趾)、先天性多重 挛缩并蜘蛛足样指/趾、先天性发绀、先天性颅骨和头皮缺陷、肝内胆管先天性扩张、先天 性髓鞘形成障碍、先天性吞噬功能不全、先天性发育异常血管扩张、先天性红细胞生成性卟 啉症、先天性因子XIII缺乏症、先天性无法自主控制呼吸、先天性家族性非溶血性黄疸I 型、先天性家族拖延性腹泻、先天性形式科凯恩综合征II型(B型)、先天性泛发性纤维瘤 病、先天性德国麻疹、先天性巨轴索神经病、先天性心脏传导阻滞、先天性心脏缺损、先天性 Hemidysplasia并鱼鳞样红皮症及肢体缺损、先天性溶血性黄疸、先天性溶血性贫血、先天 性肝纤维化、先天性遗传性角膜变性、先天性遗传性淋巴水肿.、先天性软骨增殖过多、先天 性hypomyelinating多发性神经病、先天性hypomyelination神经病、先天性 hypomyelination、先天性hypomyelination (Onion Bulb)多发性神经病、先天性鱼鳞病样 红皮症、先天性圆锥角膜、先天性高乳酸血症、先天性乳糖不耐受、先天性脂肪营养不良、先 天性肝硬化、先天性肺叶气肿、先天性局限性肺气肿、先天性巨舌(症)、先天性髓狭窄、先 天性巨结肠症、先天性色素痣、先天性中胚层dysmorphodystrophy、先天性中胚叶营养不 良、先天性微绒毛萎缩、先天性多发性关节、先天性肌营养不良症、hypomyelination所致先 天性神经病、先天性全血细胞减少、先天性恶性贫血、先天性恶性贫血由于缺乏内因子、先 天性恶性贫血由于缺乏内因子、先天性色素沉着、先天性卟啉症、先天性近位肌病并索蛋白 存储肌病、先天性肺气肿、先天性纯红细胞贫血、先天性纯红细胞再生障碍性贫血、先天性 视网膜失明、先天性视网膜囊肿、先天性色素性视网膜炎、先天性视网膜劈裂、先天性Rod 病、先天性风疹综合征、先天性头皮缺损并远端肢体缺陷、先天性感觉神经病、先天性SMA 并关节弯曲、先天性球形红细胞性贫血、先天性脊柱骨骺发育不良、先天性栓颈髓综合征、 先天性酪氨酸病、先天性水痘综合征、先天性海绵状血管畸形、先天性血管遮蔽视网膜、先 天性字盲、先天性游动脾(儿科)、充血性心肌病、圆锥形角膜、结合性血胆红素过多症、结 膜炎、结膜炎Ligneous、结膜-尿道-滑膜综合征、Corm综合征、结缔组织病、康拉迪病、 conradihunermann综合征、全身再生障碍性贫血、体质性红细胞发育不全、体质性湿疹、体 质性肝功能不全、体质性血栓病血小板、制约先天性阶、缩窄性心包炎并侏儒症、连续肌纤 维活动综合征、挛缩性蜘蛛指(趾)综合征、双脚肌肉萎缩挛缩并动眼(运动)运用不能、瘈疯、Cooley贫血、铜运输疾病、粪卟啉症、三房心、三房心Sinistrum、三腔二房心、两腔 心、科里病、角膜营养不良、角膜淀粉样变性病、角膜混浊-皮肤Laxa-智力发育迟缓、角膜 营养不良、Cornelia de Lange综合征、日冕牙本质发育不全、冠心病、冠心病、胼胝体发育 不全、皮质基底神经节变性、外皮畸形、皮质基底神经节变性(CBGD)、皮质延髓变性、皮质 methloxidase缺乏I型、皮质methyloxidase缺乏II型、皮质醇、Costello综合征、婴儿猝 死症、C0VESDEM综合征、C0X、C0X缺失、COX缺陷法国加拿大型、COX缺陷婴儿线粒体肌病包 括deToni-Fanconi-Debre、COX缺陷型良性婴幼儿线粒体肌病、CP、CPE0、CPE0并肌病、CPEO 并褴褛红色纤维、CPPD家族形式、CPT缺陷、CPTD、颅动脉炎、颅的脑膜脑膨出、 Cranio-Oro-Digital综合征、颅腕跗营养不良、脑膨出、头盖骨综合征智力发育迟缓Scott 型、颅面骨发育不全、颅面骨发育不全-PD动脉-多毛症-唇发育不全、craniofrontonasal 发育异常、卢页骨干飯端发育不良、cranioorodigital综合征、cranioorodigital综合征II 型、颅狭小crouzon型、颅狭小、颅缝早闭鼻孔闭锁桡骨肱骨骨连结、颅缝早闭多毛症面部 及其他异常、颅缝早闭面中部发育不良及足部畸形、颅缝早闭原发、颅缝早闭-桡骨发育不 良综合征、颅缝早闭与桡骨缺损、颅裂(畸形)、CREST综合症、克罗伊茨费尔特-雅各布病、 猫叫综合征、婴儿暴亡症、克里格勒_纳贾尔综合征I型、克隆氏病、克-卡二氏综合征、 Cross综合征、Cross综合征、克-麦-布三氏综合征、Crouzon、Crouzon综合征、Crouzon 颅面骨发育不全、冷球蛋白血症原发性混合、隐眼并指综合征、隐睾症-侏儒-智力低下、施 奈德(氏)结晶状角膜营养不良、CS、CSD、CSID、CSO、CST综合征、卷曲头发融合睑指甲发 育异常、克-白-施三氏综合征、Curth Macklin型鱼鳞hystric、CurthMacklin型、 Cushing' S、柯兴氏综合征、Cushing’ s III、皮肤恶性黑色素瘤的遗传、皮肤性卟啉病、皮肤 松弛症、皮肤松弛症-生长缺失综合征、先天性毛细血管扩张性大理石样皮肤、CVI, CVID、 CVS、周期性呕吐综合征、肾髓质性疾病、水囊状淋巴管瘤、囊性纤维化、囊性淋巴管瘤、胱氨 酸-赖氨酸-精氨酸ornithinuria、胱氨酸贮积症、阿-考-利三氏综合征、胱氨酸尿、胱氨 酸尿并双碱基氨基酸尿症、胱氨酸尿I型、胱氨酸尿II型、胱氨酸尿III型、先天性肾髓质 囊月中、细胞色素 c 氧化Sl缺陷、D. C.、dacryosialoadenopathy> dacryosialoadenopathia> dalpro、道尔顿、色盲、Danbolt-Cross综合征、眼跳跳脚综合征、丹迪-沃克综合征、丹 迪_沃克囊肿、丹迪_沃克畸形、丹迪_沃克畸形、Danish心脏型淀粉样变性病(型III)、 达里耳P 病、Davidson 病、Davies 病、DBA、DBS、DC、DD、De Barsy 综合征、De Barsy-Moens-Diercks 综合征、德朗热综合征、De Morsier 综合征、De Santis Cacchione 综合征、凡科尼综合征、先天性耳聋和功能性心脏病、耳聋-侏儒-视网膜萎缩、耳聋-功能 性心脏病、耳聋指(趾)甲营养不良骨营养不良和智力迟钝、耳聋与卷发Bjornstad型、神 经性耳聋与肛门闭锁及姆指发育不全、脱支酶缺乏、年度性皮肤剥脱、肠细胞内在因子受体 缺乏、自然杀手细胞缺乏、肉碱肾重吸收缺损、糖蛋白唾液酸苷酶缺乏、线粒体呼吸链复合 物IV缺陷、缺乏血小板膜糖蛋白ib、缺失血管假性血友病因子受体、短链酰基辅酶脱氢酶 缺乏(ACADS)、肢中性侏儒畸形、退行性舞蹈病、退行性腰椎管狭窄症、德戈斯病、 Degos-Kohlmeier病、网状色素沉着症、DEH、代-罗二氏综合征、德雅兰-索塔斯病、9p缺失 综合征局部、Ilq缺失综合征局部、13q缺失综合征局部、delleman-oorthuys综合征、 delIeman综合征、痴呆并肺叶萎缩及Neuronal细胞质内含物、脱髓鞘疾病、DeMyer综合征、 牙本质发育不全牙冠、牙本质发育不全牙根、牙本质发育不全I型、牙本质发育不全II型、牙本质发育不全brandywine型、牙本质发育不全遮蔽型、牙本质发育不全III型、 牙-眼-骨发育不全、dentooculocutaneous综合征、Denys-Drash综合征、二丙基醋酸钠、 D印akeneTM暴露、双丙戊酸钠、D印akote Sprinkle、去色-牙龈纤维瘤-小眼畸形、德卡姆 病、异位性皮炎、剥脱性皮炎、疱疹样皮炎、多态型皮炎、泛发性皮肤松驰、泛发性皮肤松驰、 皮肤松垂、皮肌炎sine肌炎、皮肌炎、皮肤脆裂症、皮肤口炎Stevensjohnson型、 Desbuquois夸综合征、索蛋白存储肌病、新生儿脱皮、绿色弱、发展性阅读障碍、发育格斯特 曼综合征、德韦尔吉疾病、德维克病、视神经脊髓炎、右位心_支气管扩张和鼻窦炎、右位心 并内脏逆转、DGS、DGSX Golabi-Rosen综合征包括、DH、DHAP烷基转移酶缺失、DHBS缺失、 DH0F、D!PR缺失、尿崩症、尿崩症糖尿病视神经萎缩和耳聋、尿崩症垂体神经部的、糖尿病胰 岛素依赖型、糖尿病、糖尿病艾迪生氏病水肿、糖尿病酸中毒、糖尿病长胡须妇女综合征、糖 尿病神经病变、戴-布二氏贫血、膈肌呼吸暂停、骨干性续连症、畸形性侏儒、骨畸形性发育 不良、骨畸形性侏儒综合征、二羧基氨基酸尿、脂肪酸氧化缺损造成的二羧酸尿症、脂 肪酸β-氧化缺损造成的二羧酸尿症、MCADH缺损造成的二羧酸尿症、二色性色盲、 Dicker-Opitz, DIDM0AD、间脑综合征、儿童间脑综合征、消瘦间脑综合征、Dienoyl-辅酶还 原酶缺陷、婴儿弥漫性脑变性、弥漫性脑变性疾病、弥漫性特发性骨质增生、 Diffusum-Glycopeptiduria> DiGeorge 综 合 征、Digital-Oro-Cranio 综 合 征、 Digito-Oto-Palatal 综合征、Digito-Oto-Palatal 综合症 I 型、Digito-Oto-Palatal 综合 症II型、二盐生物蝶呤合成酶缺乏症、二氢蝶啶还原酶缺乏症、磷酸二羟丙酮合酶、扩张型 (充血)心肌病、迪米特里疾病、脑性麻痹的双侧瘫痪、Diplo-Y综合征、二糖酶缺失、二糖不 耐症I、盘状红斑狼疮、盘状红斑狼疮、DISH、角化病、角化病I型、角化病4、角化病6、角化 病8、角化病9 Netherton型、角化病11植烷酸型、角化病12 (中性脂储存型)、角化病13、 角化病14、角化病14毛发硫营养障碍型、角化病15 (角膜炎耳聋型)、角化病16、角化病18 型变异性红角皮病型、角化病19、角化病20、角化病24、脾脏移位、播散性红斑狼疮、播散性 神经性皮炎、多发性硬化、远端Ilq单体、远端Ilq综合征、远端先天性多数关节弯曲IIA 型、远端先天性多数关节弯曲IIA型、远端关节弯曲IIA型、远端关节弯曲2A型、远端重复 6q、远端重叠10q、重复(IOq)综合征、远端重叠15q、远端单体9p、远端三体6q、远端三体 IOq综合症、远端三体llq、双丙戊酸钠、DJS、DKC、DLE、DLPIII、DM、DMC综合征、DMC病、DMD、 遗传 DNS、Doc I、Doc 2、Doc 4、Doc 6 (Harlequin 型)、Doc 8 Curth-Macklin 型、Doc 11 植烷酸型、Doc 12(中性脂储存型)、Doc 13,Doc 14,Doc 14毛发硫营养障碍型、Doc 15 (角 膜炎耳鸯型)、Doc 16,Doc 16 UnilateralHemidysplasia 型、Doc 18,Doc 19,Doc 20,Doc 24、窦勒氏体-脊髓病、dolichospondylic发育异常、细长指(趾)、细长指(趾)综合征、 显型Kenny-Caffe综合征、显型先天性肌强直病、Donahue综合征、Donath-Landsteiner溶 血性贫血、多纳-兰兹泰纳综合征、耳聋-指(趾)甲发育不全-骨发育不全-智力发育迟 缓综合征、耳聋-指(趾)甲发育不全-骨发育不全-智力发育迟缓综合征、DRD、 DorfmanChanarin综合征、Dowling-Meara综合征、唐氏综合症、DR综合征、drash综合征、 DRD.Dreifuss-Emery型肌肉萎缩症与挛缩、心肌梗死后综合征、漂移脾脏、药物诱导的黑棘 皮病、药物诱导的红斑狼疮、药物相关肾上腺功能不全、Drummond综合征、干型脚气病、干眼 症、DTD、Duane眼球退缩综合征、杜安综合征、杜安综合征IA IB和IC型、杜安综合征2A 2B 和2C型、杜安综合征3A 3B和3C型、1867强森症候群、杜宾-约翰逊综合征、多博维茨综合征、进行性假肥大性肌营养不良、Duchenne瘫痪、Duhring病、Duncan病、Duncan病、十二指 肠闭锁、十二指肠狭窄、十二指肠炎、重叠4p综合征、重复6q局部、Dupuy综合征、Dupuytren 挛缩、Dutch-Kennedy综合征、侏儒症、侏儒症campomelic、侏儒症管状骨皮层增厚及瞬时 低钙、侏儒症Levi型、侏儒症间向性、侏儒症-甲发育不良、侏儒症-心包炎、侏儒症并肾萎 缩和耳聋、侏儒症并佝偻病、DWM, Dyggve MelchiorClausen综合征、家族性自主神经异常、 家族性血β脂蛋白异常、dyschondrodysplasia并血管瘤、软骨骨生成障碍、遗传性泛发性 色素异常病、头颅异常和内脏囊肿、先天性角化不良、先天性角化不良常染色体隐性遗传、 先天性角化不良斯科金斯型、先天性角化不良综合征、毛囊角化不良Vegetans、诵读困难、 髓鞘形成不良性白质营养不良、髓鞘形成不良性白质营养不良-megalobare、痉挛性发音困 难、亨纳曼(氏)综合征、骺骨发育异常Hemimelica、指甲发育异常并牙发育不全、锁骨头颅 发育不全、纤维发育异常、发育异常巨人综合症X连锁的、骨性牙质发育异常、发育不良性 痣综合征、发育不良痣型、肌阵挛性小脑协同失调、食管协同失调、肌张力障碍、眦错位、肥 胖性生殖器退化、营养不良内皮炎眼角膜、营养不良mesodermalis、营养不良性大疱性表皮 松解症、营养不良、窒息性胸廓、强直性肌营养不良、E-D综合征、Eagle-Barrett综合征、视 网膜Eales、视网膜静脉周围炎、耳朵异常-挛缩-骨发育异常并脊柱后侧凸、耳膑矮小综合 症、早期约束缺陷、早期高钙血综合征并Elfin Facie、早发性肌张力障碍、Eaton Lambert 综合征、EB、Ebstein异常、EBV易感性(EBVS)、EBVS, ECD、ECPSG、外胚层发育不良、外胚层 发育不全并唇裂和腭裂、外胚层发育不良-外分泌胰腺功能不全、外胚层发育不良 Rapp-Hodgkin型、外胚层和中胚层发育不良先天性、外胚层和中胚层发育不良伴骨参与、多 腔性糜烂性外胚叶病、晶状体异位、膀胱外翻、异位ACTH综合征、异位促肾上腺皮质激素综 合征、肛门闭锁、手先天性缺指、缺指(畸形)、缺指(趾)_外胚层发育异常-唇腭裂综合 征、缺指(趾)_外胚层发育异常-唇腭裂综合征、缺指(趾)_外胚层发育异常-唇腭裂、 湿疹、湿疹_血小板减少免疫缺陷综合症、EDA、EDMD, EDS、EDS动脉瘀斑型、EDS关节松弛、 EDS典型严重形式、EDSdysfibronectinemic、EDS重型、EDS运动过度、EDS脊柱后侧凸、EDS 脊柱后侧凸、EDS缓和型、EDS眼球脊柱侧凸、EDS Progeroid, EDS牙周变性、EDS血管、EEC 综合征、Ε 、ΕΗΒΑ、ΕΗΚ、埃勒斯-当洛综合征、埃勒斯_当洛综合征、埃勒斯_当洛IX、艾森 曼格尔复征、艾森曼格尔复征、艾森曼格尔病、艾森曼格尔反应、艾森门格综合征、艾森门格 综合征、的ekman-lobstein疾病、手ektrodactyly、EKV、弹力纤维病、广泛弹性组织(纤 维)破裂、营养不良性弹性组织变性综合症、选择性缄默症(obsolete)、选择性缄默症、心 电图(ECG或EKG)、电子转移黄素蛋白(ETF)脱氢酶缺陷(GAII & MADD)、电生理研究 (EPS)、出生象指甲、象皮病先天性血管瘤病、血管扩张性肥大、小精灵面容并高钙血症、 埃-范二氏综合征、埃-范二氏综合征、胚组织瘤肾脏、胚性腺肌肉瘤肾、胚胎肾脏癌肾、胚 胎混合肿瘤肾、EMC、Emery Dreyfus肌肉萎缩症、埃-德二氏肌营养不良、金刚砂-dreifuss 型综合征、EMF、EMG综合征、空蝶鞍综合征、弥漫性轴周性脑炎、同心性轴周性脑炎、脑膨出、 颅面血管瘤病、脑病、脑三叉神经血管瘤病、内生软骨瘤病多发性海绵状血管瘤、地方性多 发性神经炎、心内膜垫缺损、心内膜垫缺损、内膜增生、心内膜弹力纤维增生症(EFE)、内源 性高甘油三酯血症、内淋巴水肿、子宫内膜生长、子宫内膜异位症、心肌心内膜纤维化、角膜 内皮先天性营养不良、内皮角膜上皮营养不良、内皮、恩格尔曼病、巨舌、小肠结肠炎、肠细 胞维生素B12吸收不良、eosinophia综合征、嗜酸性蜂窝组织炎、嗜酸性筋膜炎、嗜酸性肉芽肿、嗜酸性粒细胞综合征、表皮痣综合征、大疱性表皮松解、获得性大疱表皮松解、遗传性 大疱性表皮松解、大疱性表皮松解致死的、表皮松解Hereditaria Tarda、表皮松解性角化 过度(症)、表皮松解性角化过度(症)(大疱CIE)、奔驰性癫痫、癫痫、肾上腺素、骨骺变化 和高度近视、骺软骨瘤良性、Epiphysealis Hemimelica发育异常、偶发的异常眼球运动、上 皮基底膜角膜营养不良、Meesmarm青少年角膜上皮营养不良、多重上皮瘤病伴痣、上皮、 Epival、EPS、男性Epstein-Barr病毒诱导淋巴增生症、重症肌无力综合征、erdheim切斯特 疾病、多形红斑渗出、多形(性)红斑Stevens Johnson型、erythroblastophthisis、胎儿 红细胞、新生儿红细胞增多、儿童幼红细胞增多贫血、红细胞磷酸甘油酸激酶缺乏症、不全 性红细胞发生、进行性红斑角皮病对称的、进行性红斑角皮病对称鱼鳞病、变异性红角皮 病、变异性红角皮病型、冬令红斑角质松解、红细胞生成性卟啉病、红细胞生成性卟啉病、埃 斯科瓦尔综合征、食道闭锁、食管蠕动停止、食管炎消化性溃疡、食道闭锁及/或气管食管 瘘、家族性原发性血脂过多症、原发性果糖尿症、特发性血尿、自发性出血性血小板增多症、 特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、原发性moschowitz疾病、特发性血小板增多症、特发性 血小板减少、血小板增多症、特发性震颤、酯酶抑制剂缺陷、范可尼贫血Estren-Dameshek 变种、与雌激素有关的胆汁郁积、ET、ETF、ethylmalonic adipicaciduria、奥伊伦堡病、pc、 EVCS、夸张惊跳反应、露脑(畸形)、外源性高甘油三酯血症、脐疝_巨舌-巨人综合征、贫血 性甲状腺肿、膨胀风疹综合征、膀胱外翻、EXT、对外软骨瘤病综合症、肝外胆管闭锁、髓外浆 细胞瘤、渗出性视网膜炎、眼睛后退综合征、FAU FAA、法布里病、FAC、FACB, FA⑶、FACE、 FACF、FACG、FACH、面神经麻痹、面神经麻痹、面部外胚层发育不良、面部外胚层发育不良、面 肩胛肱骨营养不良、面-耳-脊椎畸形谱、面-心_皮肤综合症、面-额_鼻发育不全、 faciocutaneoskeletal综合征、面-指(趾)_生殖器综合征、面生殖发育异常、 faciogenitopopliteal 综合征、faciopalatoosseous 综合征、faciopalatoosseous 综合征 II型、面肩肱肌营养不良、人为低血糖症、因子VIII缺陷、因子IX缺乏症、因子XI缺乏症、 因子XII缺乏症、因子XIII缺陷、基底节钙化症、基底节钙化症、胃分泌胃抗恶性贫血因子 衰竭、Fairbank疾病、Fallot四联症、家族肢皮早老、家族肢端过小症、家族性腺瘤性结肠 息肉、家族性腺瘤息肉病并肠外表现、家族性前脑无叶无裂畸形、家族性α-脂蛋白缺乏 症、家族性肌萎缩舞蹈病并刺状红细胞增多、家族性肌阵挛心律失常、家族性关节软骨钙沉 着、家族性非典型痣-恶性黑色素瘤综合征、家族性宽β脂蛋白病、家族钙痛风、家族焦磷 酸钙关节病、家族性慢性阻塞性肺病、家族持续脱皮、家族性皮肤淀粉样变性、家族性异常 蛋白血症、家族性肺气肿、家族性肠病微绒毛、家族性中心凹注视视网膜先天性裂、家族冬 眠综合症、家族性高胆固醇、家族性血色病、家族性高胆固醇血、家族性高密度脂蛋白缺乏 症、家族性高血清胆固醇、家族高脂血症、家族低蛋白质血症并淋巴管炎肠病、家族性黄疸、 家族性少年伴随η印hronophtisis的眼部异常、家族性苔藓样淀粉样变性(IX型)、家族性 腰椎管狭窄症、家族性原发性淋巴水肿、家族性地中海热、多发性家族性息肉病、家族性颈 项疱、家族性发作性多浆膜炎、家族性结肠息肉、家族性原发性肺动脉高压、家族性肾性糖 尿、家族性脾性贫血、家族性骇病、家族性内脏淀粉样变性病(VIII型)、FAMMM、FANCA、 FANCB, FANCC, FANCD, FANCE, Fanconi 全骨髓病、Fanconi 各类血细胞减少症、Fancon III、 Fanconi贫血、Fanconi贫血I型、Fanconi贫血互补群、Fanconi贫血互补群A、Fanconi贫 血互补群B、Fanconi贫血互补群C、Fanconi贫血互补群D、Fanconi贫血互补群E、Fanconi贫血互补群 G、Fanconi 贫血互补群 H、Fanconi 贫血 Estren-Dameshek 变种、FANF, FANG、 FANH、FAP、FAPG,Farber病、Farber脂肪肉芽肿、FAS、空腹性低血糖、脂肪所致高脂血症、JL 童致命肉芽肿病、脂肪氧化障碍、脂肪肝并脑病、FAV、FCH、FCMD、FCS综合征、FD、FDH、发热 性皮肤粘膜综合征Stevens Johnson型、发热性中性急性皮肤病、热性癫痫发作、Feinberg 综合征、范[辛格]-勒[罗伊]二氏综合征、女性伪特纳氏综合症、股骨发育不全双边Robin 异常、股骨发育不全双边、股骨面综合征、股骨发育不全_异常面容综合征、胎儿酒精综合 征、胎儿抗惊厥剂症、胎儿水囊状淋巴管瘤、酒精胎儿效应、水痘胎儿效应、反应停胎儿效 应、水痘_带状疱疹病毒胎儿效应、心肌心内膜纤维化、胎儿面部综合征、胎儿虹膜炎综合 征、胎儿输血综合征、胎儿丙戊酸盐综合征、胎儿丙戊酸暴露综合征、胎儿感染水痘、胎儿水 痘带状疱疹综合征、FFDD II型、TO综合症、FGDYJHS、纤维蛋白稳定因子缺乏症、纤维形成 酶缺失、星形(胶质)细胞纤维素变性、类(血)纤维蛋白脑白质营养不良、纤维蛋白连接 酶缺失、成纤维细胞瘤、(胰管)粘稠物阻塞症、(拉)进行性骨化性纤维发育不良、纤维弹 性组织心内膜炎、纤维肌痛、纤维肌痛-纤维肌炎、纤维肌炎、纤维化性胆管炎、纤维组织 炎、多关节纤维性关节强硬、纤维性海绵体炎、纤维性结构不良、阴茎纤维斑块、阴茎纤维硬 化、Fickler-Winkler型、菲德勒病、Fifth Digit综合征、Filippi综合征、芬兰型淀粉样变 (V型)、第一级先天性心脏传导阻滞、第一和第二鳃弓综合征、Fischer综合征、鱼味综合 征、裂隙舌、腺癌综合征、弗-谢二氏病、含黄素单氧化酶2、漂浮β-脂蛋白病、 Floating-Harbor综合征、游动脾、婴儿松弛综合征、瓣膜松弛综合征、流利失语、FMD、FMF、 FMO Adult LiverForm, FM02、FND、局灶性脑缺血、局灶性真皮发育不全综合征、局灶性真皮 发育不全、局灶性皮肤指骨发育不全、局灶性肌张力障碍、病灶性癫痫、局灶性真皮面部发 育不全II型、局灶性神经性肌强直、F0DH、苯丙酮尿性白痴综合征、Fong病、F0P、福布斯病、 福-奥二氏综合征、forestier的疾病、福-埃二氏综合征(X连锁)、福瑟吉尔病、Fountain 综合征、进展性黄斑营养不良、FPO综合征II型、FPO、Fraccaro型软骨成长不全(IB型)、 脆性X染色体综合征、Franceschetti-Zwalen-Klein综合征、Francois颅面骨畸型综合征、 Francois-Neetens斑点营养不良、斑点状角膜营养不、弗雷泽综合征、FRAXA, FRDA, Fredrickson型I高脂蛋白血症、弗-谢二氏综合征、Freire-Maia综合征、弗雷氏综合征、 friedreich 共济失调、friedreich 病、friedreich 衰弱、FRNS、Froelich 综合征、弗-希二 氏综合征、弗-希二氏综合征哺乳期子宫萎缩、额指(趾)综合征、frontofacionasal发育 不全、frontofacionasal发育异常、额鼻发育异常、额鼻发育异常并冠状颅缝早闭、果 糖-1-磷酸醛缩酶缺乏、果糖血症、果糖尿症、弗赖恩斯综合征、FSH、FSHD、FSS、富克斯营养 不良、岩藻糖苷(贮积)病1型、岩藻糖苷(贮积)病2型、岩藻糖苷(贮积)病3型、福原 综合征、Fukuyama病、Fukuyama型肌营养不良、延胡索酰乙酰乙酸酶缺失、沟舌、G综合征、 G6PD 缺陷、G6PD、GA I、GA IIB、GA IIA、GA II、GAII & MADD、溢乳-闭经综合征 nonpuerperal、溢乳-闭经无怀孕、氨基半乳糖6-硫酸酯酶缺失、半乳糖磷酸转尿苷酰 酶缺失、半乳糖血(症)、GALB缺失、GalIoway-Mowat综合征、Galloway综合征、GALT缺失、 丙种球蛋白缺乏症、GAN、神经节苷脂神经氨(糖)酸苷酶缺陷、神经节苷唾液酸酶缺乏、神 经节苷脂沉积症GMl 1型、神经节苷脂沉积症GMl 2型、神经节苷脂沉积症β己糖胺酶B 缺乏、Gardner综合征、脂肪软骨营养不良、Garies-Mason综合征、加瑟综合征、胃内因子未 能分泌、肠细胞维生素B12、胃泌素瘤、胃炎、胃食管裂伤出血、胃肠道息肉及外胚层改变、胃十二指肠溃疡、腹裂(畸形)、戈谢病、Gaucher-Schlagenhaufer、Gayet-Wernicke综合征、 GBS、GCA、GCM综合征、GCPS, Gee-Herter病、季-塞二氏病、Gehrig病、南方网氏综合征、 Genee-Wiedemann综合征、全身性肌张力障碍、泛发家族神经性肌强直、泛发纤维瘤病、全身 性屈曲癫痫、全身性糖原病、泛发性多汗症、泛发脂褐质沉积症、泛发重症肌无力、泛发肌强 直、全身性散发神经粘液瘤、遗传疾病、生殖器缺陷、生殖系统和泌尿系统缺陷、格斯特曼综 合征、Gerstmann Tetrad、GHBP, GHD、GHR、巨轴突病、巨轴索神经病、巨良性淋巴瘤、巨细胞 成神经胶质细胞瘤、巨细胞动脉炎、巨细胞病变肝、巨细胞性肝炎、巨细胞新生儿肝硬化、视 网膜巨大囊肿、巨淋巴结增生、巨血小板综合征遗传、巨舌、gic黄斑营养不良、Gilbert病、 吉尔伯特综合征、吉耳伯-德夫斯综合征、Gilbert-Lereboullet综合征、Gilford综合征、 Gilles de la Tourette综合症、Gillespie综合征、牙龈纤维瘤病-异常手指指甲鼻子耳 朵脾肿大、GLA缺乏、GLA、GLB1、青光眼、视网膜神经胶质瘤、完全失语、球样细胞性脑白质营 养不良、舌下垂小颂(症)及腭裂、葡糖脑苷脂酶缺失、葡糖脑苷脂沉积病、葡萄糖-6-磷酸 脱氢酶缺乏症、6-磷酸葡萄糖运输缺陷、葡萄糖-6-磷酸盐转移缺失、葡萄糖G磷酸酶缺乏 症、葡萄糖_半乳糖吸收不良、神经酰胺脂沉积[症]、戊二酸尿I、戊二酸血症I、戊二酸血 症II、戊二酸尿II、戊二酸尿型II、戊二酸尿型III、戊二酸血症I、戊二酸血症II、戊二酸 尿I、戊二酸尿II、戊二酸尿IIA型、戊二酸尿IIB型、戊二酰-辅酶A脱氢酶缺乏症、 glutaurate-天冬氨酸运输缺陷、谷蛋白敏感性肠病、肌肉糖原病型VII、糖原累积病I、糖 原累积病III、糖原累积病IV、糖原累积病ν型、糖原累积病VI、糖原累积病VII、糖原累积 病VIII、糖原累积病II型、糖原累积病型II、糖原病、糖原病I型、糖原病IA型、糖原病IB 型、糖原病II型、糖原病II型、糖原病III型、糖原病类型IV、糖原病ν型、糖原病VI型、糖 原病型VII、糖原病型VIII、羟基乙酸尿症、糖脂类脂沉着症、GM2神经节苷脂沉积症1型、 GNPTA、Goitrous自身免疫性甲状腺炎、戈尔登哈(氏)综合征、Goldenhar-Gorlin综合征、 Goldscheider病、戈尔茨综合征、Goltz-Gorlin综合征、性腺发育不全45X、性腺发育不全 X0、前房角发育不良-牙发育不全、Goodman综合征、Goodman、肺出血肾炎综合征、戈登综合 征、Gorlin综合征、格-肖-摩三氏综合征、gottron进行性对称性先天性红斑角皮病、 gottron氏综合征、古-加二氏综合征、癫痫大发作、颗粒型角膜营养不良、肉芽肿性动脉 炎、肉芽肿性结肠炎、肉芽肿性皮炎并嗜曙红细胞增多、肉芽肿性回肠炎、格雷夫斯病、格雷 夫斯甲亢、格雷夫斯病、Greig头多指综合征、Groenow I型角膜营养不良、Groenow II型 角膜营养不良、格-斯二氏综合征、grotton综合征、生长激素受体缺乏、生长激素结合蛋白 缺失、生长激素缺乏症、Myhre Growth-Mental缺失综合征、发育迟缓-Rieger异常、GRS、 gruber的综合征、GS、GSD6、GSD8、GTS、鸟苷三磷酸环化水解酶缺失、鸟苷三磷酸环化水解酶 缺失、Guenther卟啉病、盖-斯二氏综合征、Guillain-Barr6、传染性神经元炎、先天性红细 胞生成性卟啉病、H病、H. Gottron综合征、习惯痉挛、HAE、先天性因子XII缺乏症、哈格曼 因子、Haim-Munk综合征、豪-谢综合征综合征、HajduCheney、HAL缺失、霍-帕二氏综合征、 哈-斯_弗三氏综合征、哈-斯二氏综合征、哈勒沃登-施帕茨病、哈-斯二氏综合征、 Hallopeau-Siemens病、拇重复轴后性多指症及缺乏胼胝、Halushi-Behcet综合症、淋巴错 构瘤、Hand-Schueller-Christian综合征、HANE、Hanhart综合征、快乐木偶综合症、原田综 合征、HardE综合征、HARD综合征、唇裂、斑色胎、Harlequin型Doc6、Harlequin型鱼鳞病、 Harley综合征、Harrington综合征、Hart综合征、哈特奈扑病、哈特奈扑病症、糙皮病-小脑共济失调_氨基酸尿症、Hashimoto病、Hashimoto-Pritzker综合征、Hashimoto综合征、 Hashimoto甲状腺炎、Hashimoto-Pritzker综合征、Hay Well综合征、外胚层发育不全 海_韦综合征、10^、!《^、!101)、皿、心-手综合征(Holt-Oram型)、心脏病、赫克特综合征、 HED> Heerferdt-Waldenstrom 禾口 Lofgren 综合征、hegglin 病、heinrichsbauer 综合征、血 管瘤、家族性血管瘤、血管瘤血小板减少综合征、软骨营养障碍性侏儒、血管瘤鳃裂唇 pseudocleft综合征、半面(身材)短小、Hemimegalenc印haly、脑性麻痹轻偏瘫、脑性麻痹 偏瘫、脊髓半切除、血色素沉着(症)、血色病综合征、透析相关性淀粉样变、血红蛋白触控 综合征、溶血性贫血新生儿、冷溶血性贫血抗体、新生儿溶血病、溶血性尿毒症综合征、血友 病、血友病A、血友病B、血友病B因子IX、血友病C、出血性血小板减少营养不良、 Hemorrhagica Aleukia、铁血黄素沉着病、肝果糖激酶缺失、肝磷酸激酶缺失、肝卟啉病、肝 卟啉病、肝静脉闭塞病、丙型肝炎、肝肾综合症、肝豆状核变性、h印atophosphorylase缺失、 肝肾糖原沉积病、肝肾综合症、肝肾酪氨酸血症、遗传红斑性肢痛病、遗传黑尿症、遗传性淀 粉样变性、遗传性血管水肿、遗传性Areflexic站立困难、多神经炎型遗传性运动失调、遗 传性共济失调、遗传性共济失调脊髓小脑性共济失调型、遗传性良性黑棘皮病、遗传性小脑 共济失调、遗传性舞蹈病、遗传性慢性进行性舞蹈病、遗传性结缔组织病、遗传性粪卟啉症、 遗传性粪卟啉症、遗传性皮肤恶性黑素瘤、遗传性耳聋_视网膜色素变性、遗传性缺锌病、 遗传性DNS、遗传性异位沉积症、遗传性肺气肿、遗传性果糖代谢紊乱、遗传性出血性毛细血 管扩张、遗传性出血性毛细血管扩张型I、遗传性出血性毛细血管扩张型II、遗传性出血性 毛细血管扩张型III、遗传性高尿酸血症及舞蹈手足徐动症、遗传性薄红细胞增多Major、 遗传性薄红细胞增多Minor、遗传性淋巴水肿.、遗传性迟发性淋巴水肿、遗传性迟发性淋 巴水肿I型、遗传性迟发性淋巴水肿II型、遗传性运动感觉神经病、遗传性运动感觉神经病 I、遗传性运动感觉神经病III型、遗传性肾炎、遗传性肾炎并神经性耳聋、遗传性淀粉样变 性肾病、遗传性肾病及耳聋、遗传性非息肉性结肠直肠癌、遗传性非息肉性结肠直肠癌、遗 传性非球形红细胞溶血性贫血、遗传性甲-骨发育不良症、遗传性视神经视网膜病、遗传性 结肠息肉、遗传性感觉神经和自主神经病I型、遗传性感觉神经和自主神经病II型、遗传性 感觉神经和自主神经病III型、遗传性感觉运动神经病、遗传性感觉神经病I型、遗传性感 觉神经病I型、遗传性感觉神经病II型、遗传性感觉神经病第III类、遗传性感觉根性神经 病变I型、遗传性感觉根性神经病变I型、遗传性感觉根性神经病变II型、遗传性位点特异 性癌症、遗传性球形红细胞溶血性贫血、遗传性球形红细胞增多症、遗传性高酪氨酸血症1 型、遗传性结缔组织病、致死性遗传性大疱性表皮松解症、Hermans-Herzberg斑痣性错构瘤 病、海-普二氏综合征、雌雄同体、带状疱疹、环状疱疹Stevens-Johnson型、埃尔病、杂合子 β地中海贫血、hexoaminidasea亚单位缺失(变异B)、hexoaminidase α亚单位缺失(变 异 B)、HFA、HFM、HGPS, HH、HHHO, HHRH、HHT、裂孔疝-小头畸型-肾病 Galloway 型、化脓性 汗腺炎、hidrosadenitis腋脉、hidrosadenitis化脓、出汗性外胚层发育不良、HIE综合征、 高肛门闭锁、高钾、高位肩胛、HIM、先天性巨结肠症、获得性先天性巨结肠症、先天性巨结肠 症多指尺侧&大趾和VSD、先天性巨结肠症与D型短指、多毛症、HIS缺乏、组氨酸氨裂解酶 (HAL)缺失、组氨酸酶缺失、组氨酸血症、组织细胞增多病、组织细胞增多病X、HLHS、HLP II 型、HMG, HMI, HMSN I、HNHA, H0CM、霍奇金病、霍奇金病、何杰金氏淋巴瘤、 Hollaender-Simons病、霍-艾二氏综合征、全羧化酶合成酶缺乏症、前脑无裂畸形、前脑无裂畸形复杂、前脑无裂序列征、霍-奥二氏综合征、Holt-Oram型心-手综合征、血(内)高 胱氨酸过多、高胱氨酸尿症、尿黑酸氧化酶缺乏、homogentisicacidura、纯合甲抗胰蛋白酶 缺乏症、H00D、霍内尔综合征、Horton 病、HOS、H0S1、Houston-Harris 型 Achondrogenesis (IA 型)、HPS、HRS、HS、HSAN I 型、HSAN II 型、HSAN-III、HSMN、HSMN III 型、HSNI、HSN-III、Huebner-Herter 病、Hunner，s Patch、hunner 溃疡、亨特综合症、 Hunter-Thompson型肢端肢中发育不全、亨廷顿舞蹈病、亨廷顿舞蹈病、第I型粘多糖增多 症、赫尔利综合征、胡_射二氏综合征、HUS、郝-吉二氏早衰综合症、郝-吉二氏综合征、 —_ , _ s'HK^^iiE^HutteriteBowen-Conradi M>Hyaline Panneuropathy
水性无脑(畸型、脑积水、脑积水无脑回(畸形)和视网膜发育异常、脑积水内部 Dandy-Walker型、脑积水hydrocephalus非交通性脑积水Dandy-Walker型、脑积水、肾积水 并奇特面部表情、羟化酶缺乏、颈部水囊瘤、Hyper-IgE综合征、Hyper-IgM综合征、醛甾酮 过多症、醛留酮过多症并血钾过少Alkatosis、醛留酮过多症不伴随高血压、高氨血、氨 [基]甲酰磷酸合成酶缺乏所致高氨血、鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏所致高氨血、高氨血II 型、超β肌肽血、体质性肝机能不良、高胆红素血II、家族性高钙血症与肾钙质沉着和尿蓝 母尿、高钙血症-supravalvar主动脉狭窄、Hypercalciuric佝偻病、血碳酸过多性酸中毒、 分解代谢过度蛋白丢失性肠病、血氯过多性酸中毒、高胆固醇血症、高胆固醇血症类型IV、 血(内)乳糜微粒过多症、高胱氨酸血症、hyperekplexia、可过度伸展关节、高球蛋白血症 性紫癜、血内甘氨酸过多症并酮症酸中毒和乳酸酸中毒、血内甘氨酸过多非酮症、高促性腺 素性功能减退症、高免疫球蛋白E综合征、超免疫球蛋白E-复发性感染综合症、血(清中) 免疫球蛋白过多症E-葡萄球菌性、高血钾、运动机能亢进综合征、Hyperlipemic视网膜炎、 高脂血症I、高脂血症IV、高脂蛋白血症型I、高脂蛋白血症型III、高脂蛋白血症型IV、高草 酸尿、hyperphalangy-食指指弯曲并小颂舌下垂综合征、高苯丙氨酸血症、增殖性大疱性表 皮松解、呼吸过度、高钾血症、血前β-脂蛋白过多、血脯氨酸过多(症)1型、血脯氨酸过多 (症)II型、脾机能亢进、距增宽并食管畸形和尿道下裂、器官距离过远_尿道下裂综合征、 肥厚性心肌病、肥大性间质性神经病、增生性间质性神经炎、间质性增生性神经根神经病、 refsum肥厚性神经病、肥厚型梗阻性心肌病、高尿酸血症舞蹈手足徐动症自残综合征、高尿 酸血症-智力发育不全、高缬氨酸血、钙化不全(无机盐不足)型、软骨形成不足、 hypochrondroplasia、血(内)丙种球蛋白过少、婴儿暂时性血(内)丙种球蛋白过少、 hypogenital营养不良并糖尿病倾向、缺舌-缺指(趾)综合征、低血糖症、外源性低血糖、 IS^lll^^g^ ( € )、hypoglycosylationla M、hypoglycosylationIa
型、性腺机能减退并嗅觉丧失、低促性腺素功能减退症和嗅觉丧失、少汗性外胚叶发育不 全、汗外胚层发育异常症常染色体显性遗传型、汗外胚层发育异常症常染色体显性遗传型 常染色体显性型、低钾血、低钾血症性碱中毒与多钙尿、低钾血综合征、肠乳糖酶缺、 Hypomaturation型(乳白色牙)、Ito黑色素过少症、短肢-稀毛-面部血管瘤综合征、 hypomyelination神经病、甲状旁腺功能减退、磷酸酶过少症、磷酸盐血症性佝偻病并高钙 血症、色素沉着不足、色素减少黄斑病变、降口角肌发育不全与心脏缺陷、再生不良性贫血、 先天性发育不全性贫血、发育不全性软骨营养障碍、发育不全牙釉质_甲松离_少汗、发育 不全(发育不全-explastic)型、左心发育不良综合征、发育不全_(拇指)三指节畸形、低 血钾症、尿道下裂_吞咽困难综合征、嗅觉减退、下丘脑错构母细胞瘤脑下垂体机能减退肛门闭锁多指、丘脑_幼儿肥胖症、甲状腺机能减退、肌张力减退_智力减退_性腺机能减退 性肥胖综合症、次黄嘌呤_鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺损(完全缺失)、I"细胞病、医源性低 血糖症、IBGC、IBIDS 综合症、IBM、IBS、IC、I-细胞病、I CD、ICE 综合征 Cogan-Reese 型、冰 岛型淀粉样变性病(型VI)、I-细胞病、鱼鳞病样红皮症角膜参与和耳聋、鱼鳞病样红皮毛 发生长异常及男性、鱼鳞病样红皮症与白细胞空泡形成、鱼鳞病、先天鳞癣、先天性鱼鳞并 毛发硫营养障碍症、豪猪状鱼鳞病、豪猪状鱼鳞病、迂回线状鱼鳞病、单纯鱼鳞病、鱼鳞病 Tay综合征、寻常性鱼鳞病、鱼鳞癣中性脂质贮积病、黄疸钩端螺旋体病、黄疸钩端螺旋体 病、黄疸(慢性家族性)、新生儿重症黄疸、黄疸intermittens juvenalis、原发性肺泡换气 不足、原发性淀粉样变性、原发性Takayasu动脉炎、原发性基底神经节钙化(IBGC)、原发性 臂丛神经病变、原发性颈部肌张力障碍、原发性肺动脉扩张、原发性面神经麻痹、原发性家 族性高脂血症、原发性肥厚性主动脉瓣狭窄、原发性低蛋白质血症、原发性免疫球蛋白缺乏 症、原发性新生儿肝炎、原发性非特异性溃疡性结肠炎、原发性周围静脉周围炎、原发性肺 纤维化、难治性原发性铁粒幼红细胞性贫血、原发性肾性血尿、特发性脂泻、原发性血小板 增多、原发性血小板减少性紫癜、原发性血小板减少性紫癜(ITP)、IDPA、iga肾病、IHSS、回 肠炎、回肠结肠炎、Illinois型淀粉样变性病、ILS、IM、IMD2、IMD5、由于缺乏胸腺的免疫功 能缺陷、免疫性溶血性贫血阵发性冷、免疫缺陷与运动失调性毛细血管扩张症、免疫缺陷细 胞并异常免疫球蛋白合成、免疫缺陷常可变不开分类、免疫缺陷与Hyper-IgM、免疫缺陷并 白细胞减少、免疫缺陷-2、免疫缺陷_5(IMD5)、免疫球蛋白缺乏症、肛门闭锁、肛门闭锁与 手足和耳朵异常、闭锁鼻泪管与早衰综合征、无力中性白细胞综合征、不能完全张口和短手 指屈肌、INAD、先天性缺陷尿素合成精氨酸型、先天性缺陷UreaSynthesis Arginino Succinic型、先天性尿素合成氨甲酰磷酸型、先天性缺陷尿素合成瓜氨酸血症型、先天性尿 素合成谷氨酸合成型、INCL、包涵体肌炎、完全性房室隔缺损、不全睾丸女性化、色素失调 症、Incontinent! Pigment! Achromians、食指异常并小颂舌下垂综合征、印第安纳型淀粉 样变性(第二类)、静止性系统性肥大细胞增多症、小儿后天失语、小儿常染色体隐性遗传 性多囊肾病、小儿脚气、小儿脑神经节苷脂、小儿大脑瘫痪、小儿阿-考-利三氏综合征、小 儿癫痫、小儿范科尼综合征并阿-考-利三氏综合征、婴儿芬兰型神经元腊样脂褐质症、小 儿戈谢病、小儿低血糖、小儿hypophasphatasia、小儿肺叶肺气肿、小儿肌阵挛性脑病、小儿 肌阵挛性脑病并肌阵挛、婴儿型肌纤维瘤病、婴幼儿坏死性脑病、婴儿神经元蜡样质脂褐质 沉积症、小儿神经轴索营养不良、婴幼儿发病Schindler病、小儿植烷酸贮积病、小儿雷夫 叙姆病(IRD)、小儿sipoidosis GM-2gangliosideosis (s型)、小儿睡眠呼吸暂停、婴儿痉 挛症、小儿脊髓性肌肉萎缩症(所有类型)、小儿脊髓性肌萎缩症ALS、小儿脊髓性肌萎缩型 I型、婴儿型神经元腊样脂褐质症、传染性肝炎、炎症性肠病、炎性乳腺癌、炎性线状皮脂腺 痣综合征、枕骨裂脑露畸形、胰岛素抵抗的黑棘皮病、胰岛素性脂肪营养不良、胰岛素依赖 型糖尿病、意向肌阵挛、中间型胱氨酸病、中级枫糖尿症、间歇性共济失调与丙酮酸脱氢酶 缺乏症、间歇性槭糖尿病、脑内积水症、间质性膀胱炎、间质性中间缺失包括4q、肠原性脂肪 代谢障碍、肠噬脂肉芽肿、肠淋巴管扩张症、肠息肉I、肠息肉II、肠息肉III、肠息肉病-皮 肤色素沉着综合症、肠假性梗阻与眼外肌麻痹、颅内新生物、颅内肿瘤、颅内血管畸形、子宫 内侏儒症、子宫内粘连、倒立微笑并隐匿性神经性膀胱、Iowa型淀粉样变性(IV型)、IP、 IPA、虹膜角膜内皮综合征、虹膜角膜内皮(ICE)综合征Cogan-Resse型、iridogoniodysgenesis并躯体异常、虹膜萎缩并角膜水肿和青光眼、虹膜痣综合征、铁超负 荷性贫血、铁超负荷疾病、过敏性肠综合征、过敏性大肠综合征、isaacs综合征、 Isaacs-Merten综合征、局部缺血性心肌病、隔离无脑回序列、异亮氨酸33淀粉样变性、异 戊酸辅酶A脱氢酶缺乏症、异戊酸酸血症、异戊酸血症、异戊酰辅酶A羧化酶缺陷、ITO黑 (色)素过少症、ΙΤ0, ITP、IVA、Ivemark 综合征、iwanoff 囊肿、Jackknife 抽搐、 Jackson-Weiss颅缝早闭、Jackson-Weiss综合征、杰克逊氏癫痫病、雅各布森综合征、 雅-雷二氏综合征、Jaffe-Lichenstein 病、Jakob 病、雅 _ 克二氏病、Janeway I、Janeway 丙种球蛋白异常血症、Jansen干骺端成骨不全、Jansen型干骺端软骨发育不良、亚-莱综合 征、颂动瞬目(反射)、JBS、JDMS, Jegher综合征、空肠闭锁、空肠炎、空肠回肠炎、耶韦尔和 朗格-尼尔森综合征、热纳综合征、JMS、乔布综合征、Job-Buckley综合征、约-布二氏异常、 John Dalton、约[翰逊]-斯[蒂文]二氏病、jonston 脱发、Joseph 病、Joseph 病 I 型、 Joseph 病 II 型、Joseph 病 III 型、Joubert 综合征、Joubert-Bolthauser 综合征、JRA> Juberg Hayward综合征、Juberg-Marsidi综合征、Juberg-Marsidi智力迟钝综合征、法兰 西跳跃病、Maine法兰西跳跃病、幼年型关节炎、幼年常染色体隐性遗传性多囊肾病、幼年期 胱氨酸病、幼年(儿童)皮肌炎(JDMS)、幼年糖尿病、幼年戈谢病、幼年痛风舞蹈手足徐动症 和智力迟钝综合征、幼年维生素bl2小肠吸收不良、幼年维生素bl2小肠吸收不良、幼年性 黄斑变性、青少年恶性贫血、青年性视网膜劈裂症、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性 肌萎缩包括、青少年脊髓性肌萎缩包括ALS、青少年脊髓性肌萎缩III型、近关节痛性肥胖 症、肾小球旁增生、歌舞伎化妆综合征、卡勒病、kallmann综合征、Kanner综合征、Kanzaki 病、卡波疾病(非卡波西肉瘤)、κ轻链缺失、Karsch-Neugebauer综合征、kartagener综 合征_慢性sinobronchial病和右位心、卡塔格纳三联征、卡-梅二氏综合征、卡斯特综合 征、川崎病、川崎综合症、KBG综合征、KD、Kearns-Sayre病、Kearns-Sayre综合征、Kennedy 病、Kennedy综合征、Kennedy型脊髓延髓肌肉萎缩症、Kennedy-Stefanis病、Kenny病、 Kenny综合征、Kenny型管状骨(髓腔)狭窄(症)、Kenny-Caffe综合征、Kera. Palmoplant. Con. Pes Planus Ony. Periodon. Arach.、角膜炎鱼鳞病耳聋综合征、圆锥角膜、局限性后圆 锥形角膜、角质层分离、先天性剥脱性角质松解、Winter去角质红斑、角膜软化症、毛囊角化 病、脱发性小棘毛囊角化病、脱发性小棘毛囊角化病鱼鳞病、角化黑棘皮病、角化病 palmoplantaris与牙周病和甲弯曲、角化病palmoplantaris先天性扁平足甲弯曲牙周变 性蜘蛛足样指/趾、先天性角化病palmoplantaris、扁平足、钩甲、牙周病、蜘蛛足样指/趾、 肢端溶骨症、图案状红色角化病、脂溢性角化病、酮酸脱羧酶缺陷、酮酸尿、酮症甘氨酸血 症、KFS、KID综合症、肾脏发育不全、囊性肾脏视网膜发育不全Jouber t综合症、Killian综 合征、Killian/Teschler-Nicola综合征、Kiloh-Nevin综合征II、发纽结病、舞蹈眼综合 征、kleeblattschadel 畸形、克-列二氏综合征、Kleine-Levin 冬眠综合症、Klinefelter、 克_费二氏综合征、克-费二氏综合征I型、克-费二氏综合征II型、克-费二氏综合征 III型、Klippel Trenaunay综合征、克-特-韦三氏综合征、克-布二氏综合征、KMS、Kniest 发育不良、克尼斯克综合征、克尼斯克病、Koebberling-Durmigan综合征、科-德二氏病、 Kok病、Korsakoff精神病、korsakoff综合征、Krabbe病包括、Krabbe脑白质营养不良、 Kramer综合征、KSS、KTS、KTff综合征、库夫斯病、库-韦病、库-威二氏综合征、库-兰二氏 麻痹、KWS、L-3-羟基-酰基-辅酶a脱氢酶(LCHAD)缺陷、Iaband综合征、Labhart-Willi综合征、迷路综合征、迷路积水、泪管-耳-齿-指(趾)综合征、乳糖酶独自不耐受、乳糖 酶缺乏、哺乳期子宫萎缩、乳酸酸中毒莱伯遗传性视神经病、乳酸和丙酮酸酸血症并碳水化 合物灵敏感、乳酸和丙酮酸酸血症并偶发性共济失调和虚弱、乳酸和丙酮酸盐、高乳酸血 症、成人不耐乳糖、乳糖不耐受、儿童不耐乳糖、LADD综合征、LADD、拉福拉病包括、Lzfora 小体病、拉_罗二氏因子缺乏症、LAM、Lambert型鱼鳞病、兰伯特-伊顿综合征、兰伯特_伊 顿肌无力综合征、层状隐性鱼鳞病、层状鱼鳞病、Lancereaux-Mathieu-ffei 1螺旋体病、 landau-kleffner _ ☆征、Landouzy Dejerine 月Jl 肉妻 _ €、Landry 上 ^ff t生 _、 Langer-Salidino型软骨发育不全(第二类)、Langer Giedion综合征、兰格汉斯细胞肉芳 肿病、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(LCH)、大心房和心室缺损、拉伦侏儒症、Laron型垂体 性侏儒症、拉尔森(氏)综合征、喉张力障碍、拉塔病(在马来西亚发现)、晚期小儿神经轴 索营养不良、晚期小儿神经轴索营养不良、迟发科凯恩综合征三型(c型)、迟发性肌张力障 碍、迟发性免疫球蛋白缺乏症、迟发佩-梅二氏脑硬化、格子状角膜变性、角膜网络状营养 不良、Launois-Bensaude>_ 克二氏胃&征、LaurenceLaurence-Moon
劳-穆-鲍-比四氏综合征、劳_赛二氏综合征、LCA、LCAD缺失、LCAD, LCAD, LCADH缺乏、 LCH、LCHAD, LCPD、热纳综合征、Ieband综合征、Ieber黑矇症、Ieber先天性黑矇、黑矇症、 先天性柱锥体缺失、Leber' s先天性视网膜毯层变性、Leber' s先天毯视网膜发育异常、 Leber' s病、Leber' s视神经萎缩、Leber' s视神经病，左心室纤维化、小腿溃疡、 Legg-Calve-幼年性变形性骨软骨炎、Leigh，s病、Leigh，s综合症、Leigh，s综合症(亚 急性坏死性脑脊髓病)、Leigh脑坏死、Lennox-Gastaut综合征、雀斑-饮水过多-消化综 合症(Lentigio-Polypose-Digestive Syndr ome)、Lenz DysmorphogeneticSyndr ome、 Ienz发育异常、Ienz眼小畸形综合症、Lenz综合症、豹斑综合征、矮妖精貌综合征、柔脑脊 膜血管瘤、钩端螺旋体性黄疸、Leri-Weill Disease、Leri-Weill软骨骨生成障碍、 Leri-WeilSyndrome、莱穆瓦耳综合征、Leroy Disease、Lesch Nyhan Syndrome，致死性婴 儿海葱次苷甲肌病、致死性新生儿侏儒症、致死性骨软骨发育不良、累-赛二氏病(非类脂 组织细胞增多病)、白细胞异常白化病、白细胞包埋伴随血小板异常、脑白质营养不良、脑白 质营养不良伴随罗森塔尔纤维、Leukoenc印halitis (脑白质炎) PeriaxialisConcentric (集中性的)、舞蹈-棘状细胞增多综合征、果糖尿、 Levy-Hollister综合征、角膜缘带肌营养不良、乳球蛋白、Lerbe氏遗传性神经病、左颈内 动脉、尖锐红苔癣、尖锐苔癣、苔癣样淀粉样变性、扁平苔癣、苔癣银屑病、 Lignac-Debre-Fanconi Syndrome，利尼亚克-范科尼综合征、木样结膜炎、肢带型肌营养不 良、LimbMalformations-Dento-Digital Syndrome (四肢畸形...)，局限性糊精聚积病，线 性痣黑素过度病、线状痣Sebacous综合症、线形硬皮病，线性脂腺痣序列、线状脂腺痣综合 征、舌裂、皱襞舌、裂缝舌、舌面运动障碍、Lip Pseudocleft-hemangiomatous Branchial CystSyndrome (唇假裂-血管瘤鳃裂囊肿综合症)、脂质肉芽肿病、脂质组织细胞增多病、角 甙脂型、脂质积累病、脂肪贮积肌病伴随SCAD不足(Lipid-Storage myopathy Associated with SCAD Deficiency)、婴儿神经节苷脂沉积、Lipoatrophic 糖尿病(Lipoatrophic DiabetesMellitus)、脂肪营养障碍、脂质角膜营养不良、脂质超常增生假两性畸型(Lipoid Hyperplasia-Male Pseudohermaphroditism)、先天性胰腺脂肪过多症、脂粘多糖贮积病、 Lipomyelomeningocele、脂蛋白酶缺失性家族性肾上腺脑白质营养不良、激光同位素分离、LIS1、无脑回1、无脑回I型、无脑回异形伴随胼胝体小脑发育不全或其他异常、小儿痉挛性 双侧瘫、肝磷酸化酶、肝、肾、脾、乳糖吸收障碍综合症、脑叶萎缩、智力脑叶萎缩、叶性前脑 无裂畸形、婴儿肺叶紧张肺气肿、洛博斯泰因病(I型)、螯状指畸形、局部大疱性表皮松解、 局部脂肪营养障碍、局部肩带骨神经炎、吕夫勒菌病、吕夫勒菌心肌心内膜纤维化伴随嗜曙 红血球增多、吕夫勒菌壁性心内膜炎、洛克恩综合症、高级洛克恩综合症、长链3-羟酰 基-辅酶A脱氢酶、长链脂酰辅酶A脱氢酶缺陷、长链脂酰辅酶A脱氢酶、长链酰基-CoA脱 氢酶缺乏、无耳聋性QT综合征、低血糖、低密度脂蛋白缺失、低位肛门闭锁、低钾综合 症、目艮脑肾综合征 Lowe’ s Syndrome λ Lowe-B i cke 1 Syndrome Λ Lowe-Terry-MacLachlan Syndrome，下腰痛、硫黄乳、白细胞三烯d、Lubs综合征、勒夫特病、腰部椎管狭窄、腰椎管狭 窄症、腰骨氐椎管狭窄、Lundborg-Unverricht Disease、Lundborg-UnverrichtDisease Included、Lupus、狼疫、红斑狼疫、Luschka-MagendieForamina Atresia、莱尔综合征、中毒 性表皮融解坏死、淋巴结样的甲状腺肿、淋巴管扩张的蛋白丢失性肠病、淋巴管平滑肌瘤、 淋巴管平滑肌瘤、淋巴管瘤、淋巴管畸形、Lynch Syndromes, Lynch Syndrome I, Lynch Syndrome II，Schindler型溶酶体α-N-乙酰半乳糖胺酶缺失(Lysosomal Alpha-N-Acetylgalactosaminidase DeficiencySchindler Type) > Lysosomal Glycoaminoacid StorageDisease-Angiokeratoma Corporis Diffusum, Sl{φH 1^fSI^ 失、单关节关节炎、Machado Disease、马-约病、巨脑、巨头畸形、巨头畸形偏身肥大、巨头 畸形伴随多发性脂肪瘤和Hemangiomata、巨头畸形伴随假视神经乳头水肿和Multiple (多 重)Hemangiomata、巨球蛋白血症、巨舌(症)、巨舌-脐突出-内脏肥大综合症、 Macrostomia(巨口 )Ablepheron Syndrome、Bernard-Soulier Type 家方矣性巨血小板减少 ^E (Macrothrombocytopenia Familial Bernard-Soulier Type) >W1NIIIISEiiiI^ 性淀粉样变性、黄斑变性、盘状黄斑变性、盘状黄斑变性、盘状黄斑变性、斑点状角膜营养障 碍、最大容许量、Madelung’ s Disease、马富奇综合征(多发性软骨瘤伴内脏海绵状血管 瘤)、癫痫大发作、吸收不良、吸收不良_外胚层发育异常_鼻翼发育不全、Maladie de Roger, Maladie de Tics，疟疾、雄性四肢和肾畸形、雄性性腺发育障碍症、恶性棘皮症、恶 性黑棘皮病、恶性星形细胞瘤、恶性萎缩性丘疹病、恶性疟、恶性高苯丙氨酸血、恶性高热、 恶性体温过高、恶性黑色素瘤、中枢神经系统恶性肿瘤、马洛里-魏斯二氏撕裂、马洛里-魏 斯二氏撕裂、马-韦综合征(贲门粘膜裂伤综合征hMammary Paget's Disease、下颂骨成 釉细胞瘤、下颂面骨发育不全、甘露糖苷过多症、面-点-指纹型角膜营养不良 (Map-Dot-Fingerprint Type Corneal Dystrophy)、槭糖尿病、大理石状骨、阵发性夜间血 红蛋白尿(马-米二氏综合征)、马卡斯 格恩颂动瞬目综合症、马卡斯 格恩(氏)现象、 马卡斯 格恩下垂症伴随颂动瞬目反射、冈恩综合征(单侧睑下垂时、患侧上睑与下颂联合 运动)、马卡斯 格恩(颂动瞬目反射)综合症、马卡斯 格恩下垂(伴随颂动瞬目反射)、 马_沃二氏综合征(常染色体隐性遗传性多发性关节弯曲畸形)、马-沃二氏结缔组织病、 马方营养衰竭、马方-Achard综合症、马方综合症、马方综合症I型、马方变异体、马方型运 动过度综合症、边缘部角膜营养不良、玛丽共济失调、玛丽病、马-施二氏病、 MarieStrumpell Disease，马-施二氏脊椎炎(关节强硬性脊椎炎)，马-斯二氏综合征(遗 传性共济失调、白内障、侏儒及智力缺陷综合征)，马-斯-格综合症、标志X染色体综合征、 马绍尔综合征、Maroteaux LamySyndrome、Maroteaux Type Acromesomelic Dysplasia，马绍尔外胚层发育不良伴随视觉听力缺陷、马绍尔-史密斯综合症、马绍尔综合症、马绍尔型 聋-近视-洪水-鞍鼻(Marshall TypeDeafness-Myopia-Cataract-Saddle Nose)、马-奥 综合征(假副甲状腺功能低减症)、马-贝综合症、Martorell综合征、MASA Syndrome、大面 积肌阵挛病、肥大细胞白血病、肥大细胞增生病、肥大细胞增生病伴随血液紊乱、Maumenee Corneal Dystrophy (角膜营养不良)、上颂骨成釉细胞瘤、上颂骨骨代谢障碍、上颂窦-鼻 发育异常、上颂窦-鼻发育异常粘合型、上颂窦-眼睑联带运动、梅-海二氏(血小板)异 常(梅-黑二氏异常、遗传性核酸异常)、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏、麦卡德尔病(糖原贮 积病IV型)、MCCime-Albright、(肾)髓质囊性病，McKusick型干骺端软骨发育不良、二尖 瓣关闭速度、混合型结缔组织病、美氏综合症、美-格二氏综合征(内脏囊肿-头颅发育不 良综合征)、正中面裂综合征、地中海贫血、中链酰基辅酶A脱氢酶、中链酰基辅酶A脱氢酶 缺失、中链酰基辅酶A脱氢酶缺失、(肾)髓质囊性病、髓状海绵样肾、最大呼气流量、食管
Megalencephaly with Hyaline Panneuropathy> g^J 红细胞性贫血、妊娠期幼巨红细胞性贫血、巨角膜-精神迟滞综合症、基底细胞痣综合征、 Meige氏淋巴水肿、Meige氏综合症(Meige’ s Syndrome)、巨牙脑白质营养不良、肠粘膜粘 膜黑斑息肉病、肠粘膜粘膜黑斑息肉病、MELAS Syndrome, MELAS, Melkersson Syndrome, 梅-弗综合征，梅-尼二氏骨发育不良，梅-尼二氏综合征、粘膜脂肪营养障碍、达科斯塔综 合征(神经性循环衰弱)、美尼尔斯病(耳性眩晕病)、美尼尔斯病、脑膜毛细管血管瘤、门 克斯病、钢发综合征I、失语身体失调及拇指外翻型智力迟钝、智力迟缓-耳聋-骨骼异 常-粗糖脸及厚唇(Mental Retardation-Deafness-Skeletal Abnormal ities-CoarseFace With Full Lips)、第五拇指和脚趾发育不全型智力迟缓、骨软骨发育不全型智力迟缓、生 长迟滞-耳聋-生殖器短小型智力迟缓(Mental Retradation-X-Iinked with Growth De lay-Deafness-Microgeni-talism) ,Menzel型橄榄体脑桥小脑萎缩、人鱼综合征、肌阵孪癫 痫破碎红纤维综合症、肌阵孪癫痫破碎红纤维综合症、Merten-Singleton Syndrome、肢体 损伤综合症、肾小球系膜免疫球蛋白a型肾病、肠系膜脂肪营养障碍、Mesiodens-Cataract Syndrome λ Mesodermal Dysmorphodystrophy、Mesomelic Dwarf i sm-MadeIungDef ormi ty, 代谢性酸中毒、异染性脑白质营养不良、内翻跖、间向性侏儒综合症、变型骨发育不良、变型 骨发育不良I、变型骨发育不良II、甲基丙二酸血症、甲基丙二酸单酰CoA羧基变位酶缺失 症、Meulengracht’ s Disease，下颂面骨发育不全I、巨球蛋白血症、恶性组织细胞增多症、 微血管病性溶血性贫血、脑过小、原发性小头侏儒I、小头畸型、小头_裂孔疝气_肾病变 Galloway 型(Microcephaly-Hiatal Hern i a-Nephr ο sis Galloway Type)、小头-裂孑 L 沛 气-肾病变综合症、小囊性角膜(上皮)营养不良、小红细胞症、Microlissenc印haly、眼小 畸形、无眼或眼小畸形伴随相关异常、脑回小伴随肌营养不良、无小耳畸形的膝盖骨小颂综 合症、微绒毛包埋病，肾小球膜免疫性沉积物、收缩中期卡嗒音收缩晚期杂音综合症、 Miescher' s Type I Syndrome> 米库利兹综合征、Mikulicz-RadeckiSyndrome, Mikulicz-Sjogren Syndrome、轻度常染色体隐性遗传、轻中度槭糖尿病、轻度槭糖尿病、轴 后面骨发育不全、米-迪综合征、米-弗综合症、梅热病、明-肖二氏综合征(家族性球形红 细胞增多症，先天溶血性贫血，先天溶血性黄疸)、癫痫小发作、维勒布兰德病(体质性血小 板异常症)、镜像右位心、线粒体β -氧化紊乱、线粒体和细胞质的、线粒体细胞病、线粒体 细胞病、Kearn-Sayre Type、线粒体脑病、线粒体脑肌病乳酸性酸中毒和中风样发作、线粒体肌病、线粒体脑肌病乳酸性酸中毒和中风样发作、线粒体磷酸烯醇丙酮酸羧激酶缺乏、二 尖瓣脱垂、混合性呼吸暂停、混合型结缔组织病、混合型肝性卟啉症、非流畅性失语、混合性 睡眠呼吸暂停、强直阵挛混合性斜颈、MJD、芒伊尔_库恩综合征(先天性病，筛窦炎与支气 管扩张症联合存在)、恶性淋巴瘤I (ML I)、恶性淋巴瘤II、恶性淋巴瘤III、恶性淋巴瘤IV、 地中海淋巴瘤紊舌L I (ML Disorder Typel) ,ML Disorder TypeII,ML Disorder Type III， ML Disorder TypelV、膜性狼疮性肾炎、中度神经发育迟缓综合症、运动神经元病、MNGIE, MNS、M0bitZI，M0bitZII、默比厄斯(氏)综合征(先天性双侧面瘫)、莫比乌斯综合征(痛 性运动不能)、Moersch-WoItmarm综合征、莫尔综合征(OFD综合征II型、舌裂、传导性耳 聋、拇指部分重叠)、Monomodal视性失语(Monomodal Visual Amnesia)，多发性单神经炎、 单神经炎、单一神经末才肖病变、单体性3p2(Monosomy 3p2)、Monosomy 9p Partial, Monosomy Ilq Partial, Monosomy 13q Partial, Monosomy 18qSyndrome, Monosomy X、单 股性纤维性结构不良、Morgagni-Turner-Albright Syndrome、局限性硬皮病、离心性骨软 骨发育不良、粘多糖贮积症IV型、粘多糖贮积症IV型A、粘多糖贮积症IV型B、粘多糖贮积 症IV型综合症、脊髓空洞症、花斑四体9p(M0SaiCTetraS0my 9p)，运动神经元病、运动神经 元综合症、运动神经元病、运动神经元病、运动神经元病、动力系统疾病(聚集并缓慢)、烟 雾阴影疾病、moyamoya病(由于脑底异常血管网破裂所致阻塞及小出血引起的大脑缺血导 致进行性神经机能缺陷，脑底异常血管网病)、粘多糖(贮积)病，粘多糖(贮积)病I，粘 多糖(贮积)病 IH，粘多糖(贮积)病 1H/S Hurler/Scheie Syndrome, MPS I S Scheie Syndrome, MPSII, MPS II A, MPS II B, MPS II-AR、常染色体隐性遗传亨特综合征、MPS II-XR，MPS II-XR严重常染色体隐性遗传，粘多糖(贮积)病V，粘多糖(贮积)病VI，粘 多糖(C积)病 VI Severe Intermediate MildMaroteaux-Lamy (轻中重度· · ·)，粘多糖 (贮积)病VII，粘多糖(贮积)病VII sly综合症(粘多糖贮积症VII型由于β -葡糖 苷酸酶缺乏引起的疾病)、粘多糖(贮积)病VIII、粘多糖(贮积)紊乱、MPS DisorderI, MPS Disorder II，MPS Disorder III，MPS Disorder VI, MPS DisorderType VII，迈-罗 二氏综合征(典型症状为反复发作的面瘫，非炎症性面肿及折叠性唇裂)、恶性狭窄、多系 统萎缩症、多发性硫酸脂酶缺乏症、对称性脂肪过多症、主动脉瓣下肌性狭窄、槭糖尿病、槭 糖尿病Ib型、槭糖尿病II型、粘脂沉积症III、粘脂沉积症IV、粘多糖增多症、粘多糖增多 症I-H、粘多糖增多症I-S，粘多糖增多症II，粘多糖增多症III，粘多糖增多症IV，粘多糖增 多症VI，粘多糖增多症VII，粘多糖增多症I型、粘多糖增多症II型、粘多糖增多症III型、 粘多糖增多症IV型、黏性、多硫酸酯酶缺乏症、粘液性结肠炎、(胰管)粘稠物阻塞症、 Mulibrey Dwarfism, Mulibrey Nanism Syndrome、副中肾管发育不全-肾发育不全-颈胸 体节发育不全、副中肾管-肾-颈胸-上肢体缺陷、副中肾管和肾发育不全伴随上肢和肋畸 形、副中肾管-肾-颈胸体节畸形、Binswanger型多发性脑梗死性痴呆、 MulticentricCastleman' s Disease、多病灶嗜曙红细胞肉芽瘤、多重乙酰辅酶A脱氢酶缺 失/戊二酸尿II型、Multiple Angiomas (复杂血管瘤)andEndochondromas、多发性羧酶缺 乏症、多发性软骨疣、多发性软骨性外生骨疣、多发性内生软骨瘤病、多发性内分泌缺陷综 合征、多发性骨骺发育不良、多发性外生骨疣、多发性外生骨疣综合征、多发性家族性息肉 病、多发性色素斑综合征、多发性骨髓瘤、肩带多神经炎、骨软骨瘤病、多发周围神经炎、多 发硫酸酯酶缺乏、对称性脂肪过多症、多系统萎缩症、多发性骨性结合骨发育不全、多发性骨性结合骨发育不全伴随长骨碎裂、Mulvihill-Smith综合症、MURGS联合征(米勒管、肾 脏、颈椎缺陷)、Murk Jansen型干骺端软骨发育不良或发育异常或结构不良、肌肉肉毒碱 缺乏症、肌肉中央轴疾病、肌磷酸果糖激酶缺乏、肌肉中央核疾病疾病、肌肉营养障碍、肌营 养不良χ连锁隐性(遗传)、先天肌肉萎缩症伴随中枢神经系统牵连、精神迟滞致进行性先 天肌营养不良、面肩胛臂的肌肉萎缩症、肌风湿病、肌强直-递进性发作、肌肉骨骼痛、四肢 短缺病、哑症、、微血管压、微血管压、丽S、重症肌无力、假麻痹性重症肌无力、 Lambert-Eaton肌无力综合征症、髓鞘破坏弥漫性硬化、骨髓瘤病、Myhre综合症、肌阵挛无 定向型癫痫小发作、肌阵挛张力障碍、婴儿肌阵挛脑病、肌阵挛型癫痫、Hartimg型肌阵挛型 癫痫(Myoclonic Epilepsy Hartung Type)、肌阵挛性癫痫伴随蓬毛样红纤维、肌阵挛型癫 痫和蓬毛样红纤维病、家族性递进肌阵挛癫痫、家族性肌阵挛癫痫、肌阵挛发作、肌阵挛、肌 阵挛性癫痫、Myoenc^phalopathy Ragged-Red Fiber Disease (...蓬毛样红纤维病)、肌 纤维瘤病、先天肌纤维瘤病、肌原性面_肩胛-腓骨综合症、Myoneurogastointestinal Disorder andEnc印halopathy(脑病)、肌病先天性多数关节弯曲、肌肉[毒]碱缺乏病、肌 肉中央区纤维化、myopathy Congenital (先天性肌病…)Nonprogressive、myopathy Congenital Nonprogressive withCentral Axis，肌病伴随肉毒碱棕榈酰基转移酶缺失、 myopathy-Marinesco-Sjogren综合症、肌病-代谢康胃素棕榈酰转移酶缺失、肌病线粒 体-脑病-乳酸酸中毒_中风、伴随肌浆体和肌浆体的肌病、肌磷酸化酶缺失、骨化性肌炎、 斯太纳特(氏)病(萎缩性肌强直，肌强直性营养不良)、先天性肌强直病、先天间歇性肌强 直、肌强直性营养不良、肌强直肌病侏儒软骨营养障碍和面部异常、肌管性肌病、伴X染色 体的肌管性肌病、Myproic Acid, myriachit (西伯利亚说法)、黏液水肿、N-乙酰半乳糖 胺-1-磷酸转移酶缺乏、N-乙酰基谷氨酸合成酶缺陷、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸缺陷、 Naegeli EctodermalDysplasias (外胚层器官发育不良)、纳赫尔综合征、纳赫尔面骨发育 不全综合征、纳赫尔综合征、η-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶缺乏、(指、趾)甲营养不良-耳 聋综合症、(指、趾)甲发育不全和牙发育不全、指甲膝盖综合征、南斯-霍兰综合征，鸟头 侏儒、小头(畸形)、小眼、发作性睡眠、发作性睡眠综合症、非水反相色谱法、鼻-额-(Nasal -fronto-faciodysplasia)、鼻翼发育不全甲状腺功能减退消化液缺乏、鼻上颂发育不全、 鼻脂肪营养障碍(Nasu Lipodystrophy)、NBIA1、官能性抑郁症、神经缺损指数、无蛋白膳 食、引起坏死的脑脊髓病(Necrotizing Encephalomyelopathy of Leigh’s，)、引起坏死的 呼吸器官肉芽肿病、Neill-Dingwall Syndrome、纳尔逊综合征(双侧肾上腺切除后发生脑 下垂体肿瘤及皮肤粘膜色素沉着)、纤维状肌病、新生儿脑白质肾上腺萎缩症、新生儿脑白 质肾上腺萎缩症(NALD)，新生儿脑白质肾上腺萎缩症(ALD)，新生儿常染色体隐性遗传多 囊性肾病、新生儿侏儒、新生儿肝炎、新生儿低血糖、新生儿乳糖耐受不良、渗出性肠病致使 新生儿淋巴水肿、新生儿坏死性小肠结肠炎、新生儿Progeroid综合症， Wiedemann-Rautenstrauch氏新生儿假性脑积水Progeroid综合症、新生物蛛网膜炎、肾胚 细胞瘤、肾原发性尿崩症、家族性少年肾结核、肾病性胱氨酸病、肾_假两性畸形_肾母细胞 瘤、肾病-小头畸型综合症、肾变病-烟胺比林dysmigration综合症(N印hrosis-Neuronal Dysmigration Syndrome)、肾病变-糖尿病-侏儒-佝偻-血磷酸盐过少综合症、Netherton Disease,内瑟顿综合征(伴有结节毛的鱼鳞癣)、内瑟顿综合征鱼鳞病、Nettleship FallsSyndrome (χ连锁隐性)、Neu-Laxova综合征、Neuhauser综合症、神经管缺陷、神经痛性肌萎缩、粘多糖-η-乙酰神经氨水解酶缺陷、神经性黑皮症、听神经神经细胞瘤、神经细 胞瘤、神经棘红细胞增多症、Schindler型神经轴性营养不良、大脑铁聚集I型神经退行性 变(NBIAI)，听神经神经纤维瘤，神经先天性多关节挛缩，眼脑脊髓病，神经性肌强直，局部 神经性肌强直、神经性肌强直、扩散的、家族的、神经性肌强直、局部神经性肌强直、散发的、 Schindler型烟胺比林轴突营养障碍，成年烟胺比林蜡样质脂褐质沉积症、少年神经元腊样 脂褐质症、I型烟胺比林蜡样脂褐质沉积症、噬神经细胞急性葡萄糖脑苷脂酶缺乏症、神经 性淀粉样变性病、神经性脚气病、神经共济失调和色素性视网膜炎、Brachialpelxus神经病 变综合症、遗传性知觉器官神经病变I型、传性知觉器官神经病变II型、神经精神医学卟啉 症、中性脂类积贮病、Nev II，痣样基底细胞癌综合征、痣、痣多孔、粉刺样痣、贫血性痣、 Jadassohn皮脂型痣、Nezelof综合症、Nezelof型胸腺不发育、Nezelof型重度联合免疫缺 陷、多发性神经纤维瘤、多发性神经纤维瘤1、多发性神经纤维瘤2、多发性神经纤维瘤-1、 多发性神经纤维瘤_2、标准人血清、Niemann皮克病、Niemann皮克病A型(急性噬神经细 胞型)、Niemann皮克病B型、Niemann皮克病C型(慢性噬神经细胞型)、Niemann皮克病 D型(Nova凹形变异)，Niemann皮克病E型，Niemann皮克病F型(海蓝组织细胞病)、夜 盲(症)、Nigrospinodentatal 退化(Nigrospinodentatal Degeneration) >NIIkawakuroki 综合症(Nil kawakuroki Syndrome)、新生儿狼疮综合征、结节性黑色素瘤、Noack综合症I 型、遗传原发性夜间肌阵挛、结节角膜退化、非大疱性先天鱼鳞癣样红皮病、非大疱性先天 鱼鳞癣样红皮病、阻塞性脑积水、非缺失型α地中海贫血/精神发育迟缓，综合症、非酮高 甘氨酸血症I型(NKHI)，非酮性高甘氨酸血症、非脂性网状内皮组织增殖、非噬神经细胞慢 性成人戈谢病、非瘢痕化表皮松解大泡生成、非动脉硬化性大脑钙化、非关节性风湿病、非 大脑型、青少年戈谢病、非糖尿性糖尿病、非局部缺血型海葱次苷甲肌病、轻微冠状动脉缺 乏导致的非酮症低血糖和肉[毒]碱缺乏病、脂酰辅酶A脱氢酶缺失导致的非酮症低血糖、 非酮甘氨酸血症、Nonne' s综合症、Nonne-Milroy-Meige综合症、非乳光乳光牙本质、非产 后乳溢闭经，非分泌性骨髓瘤、非球形红细胞溶血型贫血、非热带性口炎性腹泻、努南综合 征(假特纳综合征)、去甲肾上腺素、标准压脑积水、Norman-Roberts综合症、Norrbottnian 戈谢病、Norrie病、挪威型遗传性胆汁郁积、尼曼-皮克二氏病(神经鞘磷脂沉积病)、NPS、 坏死性涎腺组织化生病、正常血清白蛋白、颈背张力障碍痴呆综合症、营养性神经病变、 Nyhan综合症、眼耳脊椎发育不良光谱、阻塞性呼吸暂停、阻塞性脑积水、阻塞性睡眠呼吸暂 停、燕麦形细胞癌综合症、咬合Thromboaortopathy、燕麦形细胞癌综合症、隐蔽颅内脉管畸 形、隐性脊柱神经管闭合不全序列征、Ochoa综合症、褐黄病、褐黄病性关节炎、眼_脑-肾 综合征、0CRL、耳头畸形、眼白化病、眼睛疱疹、眼睛重症肌无力、眼耳脊椎发育不良、眼耳脊 椎(发育不良)综合症、眼-口-生殖器综合征、眼脑综合症伴随色素沉着不足、眼脑皮肤 综合症、眼脑肾、眼脑肾营养不良、眼皮肤白化病、眼-脑-肾综合征、眼脑体综合征(不发 育)、眼皮肤白化病、眼皮肤白化病切东综合征、眼、齿、指(趾)发育不良、眼牙数字综合症、 眼-齿_骨骼发育异常、眼胃肠道肌肉营养不良、眼胃肠道肌肉营养不良、眼颂骨发育不全 伴随稀毛、乌-弗-多三氏综合征、眼球运动挛缩和肌内萎缩、眼交感神经的麻痹、ODD综合 征(眼齿指(趾)综合征)、牙源性肿瘤、牙香毛簇综合症、口-面-指(趾)、口-面-指 (趾)综合征、俄亥俄型淀粉样变性病(VII型)、内耳炎、先天性内耳炎、迟发内耳炎、弃耕 地综合症、羊水过少序列征、精神幼稚病、精神幼稚病患者营养不良、橄榄体脑桥小脑萎缩、橄榄体脑桥小脑萎缩伴随痴呆和锥体外束征、橄榄体脑桥小脑萎缩伴随视网膜退化、橄榄 体脑桥小脑萎缩I、橄榄体脑桥小脑萎缩II、橄榄体脑桥小脑萎缩III、橄榄体脑桥小脑萎 缩IV、橄榄体脑桥小脑萎缩V、骨软骨瘤病、奥利尔骨软骨瘤病、脐突出-内脏肥大-巨舌 (症)综合症、Ondine诅咒、洋葱-延髓神经病变、薤白多发性神经病、甲_骨发育不良症、 Onychotrichodysplasia伴随中性粒细胞减少症、橄榄体脑桥小脑萎缩、橄榄体脑桥小脑萎 缩I、橄榄体脑桥小脑萎缩II、橄榄体脑桥小脑萎缩III、橄榄体脑桥小脑萎缩IV、橄榄体脑 桥小脑萎缩V、耳-腭-指(趾)综合征、耳-腭-指(趾)综合征I型、耳-腭-指(趾) 综合征II型、耳-腭-指(趾)I综合征、耳-腭-指(趾)II综合征、眼肌麻痹症、眼肌麻 痹-肠内假性梗阻、眼肌麻痹、视网膜和镉肌病色素退化、眼肌麻痹阳性综合征、眼肌麻痹 综合症、Opitz束支传导阻滞综合症、Opitz BBB/G复合物综合症、Opitz BBBG综合症、 Opitz-Frias综合症、OpitzG综合征(器官距离过远-尿道下裂综合)、OpitzG/BBB综合 症、Opitz g综合征(器官距离过远-尿道下裂综合征)、Opitz-Kaveggia综合症、Opitz Oculogenitolaryngeal综合症、Opitz三角头(畸形)综合症、奥皮茨综合征(眼距宽、尿 道下裂综合征)、视性眼阵挛、视性眼阵挛_肌阵挛、Opthalmoneuromyelitis、视力萎缩多 发性神经病和耳聋、视神经脊髓炎、视神经神经脊髓炎、Opticomyelitis、视交叉蛛网膜炎、 口面裂缝、口面运动运动障碍、口面张力障碍、口面指发育不良综合征、口面指发育不良综 合征I型、口面指发育不良综合征I、口面指发育不良综合征II、口面指发育不良综合征 III、口面指发育不良综合征IV、眶(内)囊肿伴随大脑和病灶皮肤畸形、鸟氨酸氨甲酰转移 酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷、Orocraniodigital综合症、口 -面-指综合征、 Oromandibular张力障碍、直立性低血压、奥斯勒-韦伯-朗迪病(遗传性出血性毛细管扩 张)、Osseous-Oculo-Dento发育不良、Osseous-Oculo-Dento发育不良、骨炎畸形、骨软骨 营养不良畸形、骨软骨肉瘤、Melnick和Needles型骨发育不良、成骨缺陷、成骨不全、先天 性成骨不全症，迟发性成骨不全症，Osteohypertrophic毛细血管瘤、婴儿多型骨病 HyperostoticaHyperostoticaOsteopathyrosis>
症、成人型常染色体显性骨硬化症、婴儿型恶性常染色体显性骨硬化症、中级典型性轻度常 染色体隐性遗传骨硬化症、全身性脆性骨硬化、骨硬化性骨髓瘤、原中隔孔缺损(包括心内 膜垫缺损)、继发孔缺损、鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症、耳鼻喉腭指状综合症、耳-腭-指综 合征ι型、耳-腭-指综合征π型、耳-腭-指综合征I型、耳-牙发育异常、耳腭指综合 征、耳腭指综合征II型、Oudtshoorn皮肤、卵巢侏儒综合症型、卵巢发育不全综合症型、卵 巢楔形切除、草酸盐沉着症、氧化酶不足、尖头[畸形]、尖头[畸形]-尖头[畸形]、压力 容积、震颤麻痹、儿童丘疹性肢皮炎、甲肥厚Ichtyosiforme、先天性指(趾)甲肥厚伴随诞 生牙、先天性指(趾)甲肥厚、先天性指(趾)甲肥厚散布角化症(经酮)、杰-柳二氏型先 天性指(趾)甲肥厚、阵发性心房纤维颤动伴随多系统萎缩症、Paget病、骨Paget病、胸 Paget病、乳头Paget病、乳头乳晕Paget病、冰内生物综合症、疼痛性眼肌麻痹、PAIS、腭肌 阵挛、腭-耳-指综合症II型、里斯特氏综合征、Pallister-Hall综合征、 Pallister-Killian花斑综合症、里斯特氏花斑非整倍性、里斯特氏花斑综合症、12p四体 性Pallister嵌合体综合征、Pal Iister-W综合症、掌跖角化过度和秃顶、瘫痪、胰囊性纤维 化、抑酞酶分泌不足和骨髓机能障碍、抑酞酶溃疡原的肿瘤综合症、全骨髓再生障碍、全骨 髓病、泛酰酸激酶伴随的神经退行性变(PKAN)、帕-列二氏综合征(掌跖角化过度-牙周炎Psuedotabes，麻痹周期强直、麻痹性脚气病、麻痹性臂丛神经炎、 旁正中的下唇唇凹-胭翼状赘蹼综合征、旁正中间脑综合症、副淀粉样变性、复杂肌阵挛、 先天性肌强直病、Von Eulenburg先天性肌强直病、Parkinson病、阵发性前房心动过速、阵 发性冷性血红蛋白尿症、阵发性张力障碍、阵发性舞蹈手足徐动症、阵发性Kinesigenic张 力障碍、阵发性夜间血红蛋白尿(并有贫血)、普通阵发性血红蛋白尿、发作性睡眠、鹦鹉综 合症、Parry病、帕-罗二氏综合征、Parsonage-Turner综合症、部分雄激素不敏感综合征、 4号染色体短臂部分缺失、5号染色体短臂部分缺失、9号染色体短臂部分缺失、3q部分复制 综合症、15q部分复制综合症、局部面瘫伴随泌尿异常、部分性脂肪代谢障碍、11号染色体 长臂局部单体性、局部脊柱知觉综合症、Ilq部分三体型、Partington综合症、阵发性房性 心动过速、开放性动脉导管、病理肌阵挛、少关节型的-起始幼年型关节炎、泡林藤属、妊娠 和分娩并发病症、房室束穿行部、PC缺乏、PC缺乏A簇、PC缺乏B簇，先天性肌强直病、先天 副肌强直、PCC缺乏、阵发性冷性血红蛋白尿、PCLD，血浆凝固时间、舒张压、动脉导管未闭、 PDH缺乏、皮尔森综合征丙酮酸羧化酶缺乏症、小儿阻塞性睡眠呼吸暂停、蜕皮综合症、佩利 措伊斯_梅茨巴赫病、佩_梅二氏病(家族性脑中叶硬化)、糙皮-小脑共济失调_肾氨基 酸尿综合症、骨盆痛综合症、寻常天疱疮、Pena ShokeirII型综合症、Pena Shokeir综合症 II型、阴茎纤维瘤病、阴茎纤维化、阴茎硬结、五X综合征、Cantrell五联症、五联症综合症、 五染色体性X、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶缺失、Pepper综合症、女性化侏儒综合征、关节周围 的，肌风湿病、心包收缩伴随生长不足、胶原周(围)淀粉样变性、围产期多囊肾病、会阴肛 门、周期性淀粉状蛋白综合症、周期性睡眠病态饥饿、周期性综合周围神经病症、周期性视 网膜囊性退化、周期性骨发育不全-鼻发育不全-智力迟缓、末梢神经炎、周围神经病变、腹 膜心包膈疝、恶性贫血、四肢不全伴随小颂(症)、腓侧肌萎缩、腓神经神经麻痹、Peroutka 喷嚏、过氧化物酶脂酰辅酶A氧化、过氧化物酶β -氧化失常、过氧化物酶双功能酶、过氧化 物酶乙酰辅酶A乙酰基转移酶、过氧化物酶乙酰辅酶A乙酰基转移酶缺陷、主动脉干永存、 幼年性变形性骨软骨炎、癫痫小发作、变异型小发作、杰格斯(氏)综合征、Peutz-Touraine 综合症、阴茎纤维性海绵体炎、斐弗、斐弗综合征I型(尖头并指畸形)、前列腺素al、前列 腺素all、前列腺素alii、磷酸甘油酸酯激酶、PH I型、PH I型、咽囊综合征、肺心病短链酰 基辅酶A脱氢酶缺失、苯丙氨酸羟化酶缺乏症、苯丙氨酸血症、苯丙酮尿症、苯丙酮酸性精 神幼稚病、海豹肢症、海豹肢综合症、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶缺陷、磷酸果糖激酶缺乏、磷 酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油激酶、磷酸化酶六激酶缺失、磷酸化酶缺乏糖原贮积病、肝 磷酸化酶激酶缺失、光喷嚏反射、光喷嚏、光线疗法角膜切除术、PHS，物理学家约翰.道尔 顿、植烷酸贮积病、Pi Phenotype ZZ、PI，脑皮克病、皮克病、皮克韦坎(氏)综合征(肺泡 换气低下肥胖综合征)、皮尔 罗斑(氏)刺槐毒素、皮尔 罗斑(氏)复合物、皮尔·罗斑 (氏)序列、皮尔 罗斑(氏)综合征、皮尔 罗斑(氏)综合症伴随Hyperphalangy和指 (趾)弯曲、Pierre-Marie病、苍白球黑质红核色素沉着退化、Pili Torti和神经性耳聋、 PiliTorti-感觉神经听力损伤、垂体性侏儒症II型、肾上腺切除术术后垂体(肿)瘤、毛发 糠疹、毛发(角化性)红糠疹，胰管空肠吻合术、PKAN、多囊性肾病、多囊性肾病1、多囊性肾 病2、多囊性肾病3、苯丙酮酸尿、苯丙酮酸尿1、斜形头、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞性骨髓瘤、 浆细胞性白血病、血浆促凝血酶原激酶成分缺乏、血浆转谷氨酰胺酶缺失、阴茎海绵体硬结 症海绵体、阴茎海绵体硬结症、类脊髓灰质炎、裂缝舌、PLS，胸大肌缺损、Pneumorenal综合症、阵发性夜间血红蛋白尿，、周围神经髓磷脂、嘌呤核苷磷酸化酶)缺乏、多囊卵巢病、对 羟苯丙酮、皮肤异色萎缩和奔流、先天性皮肤异色病、波兰异常、波兰序列征(一侧胸肌缺 失及并指畸形)、波兰并趾、波兰综合征(胸大肌无发育并短指综合征)、进行性大脑灰质营 养不良、多关节炎Enterica，结节性多动脉炎、多关节-起发的幼年型关节炎I型、多关 节_起发的幼年型关节炎II型、多关节_起发的幼年型关节炎I型和II型、多软骨炎、多 囊性肾病、髓型多囊性肾病、多囊性肝病、多囊卵巢病、多囊肝肾病、多指(趾Pjoubert综 合症、多发育不良性大疱性表皮松解、多营养不良型智力发育不全，多发营养不良性侏儒、 多(内分泌)腺性自身免疫综合征III型、多(内分泌)腺性自身免疫综合征II型、多(内 分泌)腺性自身免疫综合征I型、多(内分泌)腺性自身免疫综合征II型、(内分泌腺摘 除后的激素)缺失综合征II型、多腺体综合征、多腺体视网膜黄斑退化、多形态黄斑变性、 血小板糖蛋白Ib多晶型现象、角膜多形性角膜变性、风湿性多肌病、多肌炎和皮肌炎、原发 性无丙种球蛋白血症、多发性神经炎、多发性神经病-耳聋-眼萎缩、周围多发性神经病、多 发性神经病和多神经根神经瘤、多发性骨纤维性发育不良，多骨者、家族性肾上腺脑白质营 养不良、Gardner型息肉病、息肉病错构肠、息肉-骨瘤-表皮囊综合症、息肉病皮肤色素沉 着和指甲改变、息肉斑综合症、再发性多浆膜炎、Y多体性、多指(趾)(畸形)伴随奇异状 颅、Greig型多指(趾)(畸形)_同质异形头盖骨、蓬佩病、糖原贮积病-II型、胭翼状胬肉 综合征、豪猪人、孔洞脑、孔洞脑、胆色素原脱氨酶、吓啉症、急性间歇性卟啉症、ALA-D卟啉 症、迟发性皮肤卟啉症、遗传性原粪卟啉症、皮肤迟发性症状性卟啉症、肝卟淋病杂色镖鲈、 瑞典型卟啉病、多样性卟啉病、急性间歇性比咯紫质、吓啉、斑形脱发，葡萄酒色痣、葡萄牙 型淀粉样变性、感染后多发性神经炎、进行性肌阵挛性癫痫、进行性骨发育异常、进行性苍 白退化综合症、进行性脊延髓肌萎缩症、进行性核上性麻痹、进行性全身性硬化症、进行性 脉络膜毯层营养不良、脯氨酸氧化酶缺乏、丙酸血症、丙酸血症I型(PCCA缺失)、丙酸血症 II型(PCCB缺失)、丙酰辅酶A羧化酶缺失、红色弱、第一原色盲、充血性心力衰竭继发性蛋 白丢失性肠病、Proteus综合征、包括4q在内的基部丢失、原发性色素性视网膜炎、TOS、干 梅腹综合征、畸形性骨炎、粘脂贮积症III型、假性营养不良、假性黑(色)棘皮症、假性软 骨发育不全、假性胆碱脂酶缺乏、假痛风、假血友病、假两性畸型、假两性同体-肾紊 乱-Wilm肿瘤、假肥大性肌营养不良、假性甲状旁腺功能减退症、假性低磷酸酶症、假多胚 现象、假性反应停综合征、，弹性痣、银屑病、毛囊胶孢子虫病、假性妊娠、佩莱格里尼-斯蒂 德(氏)综合征，意识运动震撼、精神运动性癫痫、意识运动等量癫痫、PTC缺乏症、翼状胬 肉、翼状颈皮、大面积翼状胬肉、颈蹼淋巴管扩张综合征、肺动脉闭锁、肺淋巴管肌瘤病、，肺 动脉狭窄、肺狭窄-心室间隔缺损、髓石、髓发育不良、主动脉弓综合征、单纯无淋巴细胞 症、单纯表皮组织细胞增多病、嘌呤核苷磷酸化酶缺陷、嘌呤核苷磷酸化酶缺陷、Purtilo综 合症、弹性痣、弹性痣显性性状、弹性痣隐性性状、致密性成骨不全症、致密性成骨不全症、 癫痫小发作、焦谷氨酸尿(症)、焦谷氨酸尿(症)、吡咯啉羧化物脱氢酶缺失、丙酮酸羧化 酶缺乏症、丙酮酸羧化酶缺乏症A簇、丙酮酸羧化酶缺乏症B簇，丙酮酸脱氢酶缺失、丙酮酸 激酶缺乏症、q25_qter，q26or q27_qter，q31 or 32-qter，伴随细胞外钙沉积过少的QT延 长、非先天耳聋性QT延长、伴随先天耳聋性QT延长、痉挛性两侧麻痹四肢瘫痪、脑性麻痹四 肢瘫痪、量子散开、r4，r6, rl4, rl8, r21，r22，脊柱后裂、桡骨发育不全-巨核细胞血细胞减 少症、桡骨发育不全_血小板减少综合征、桡骨发育不全_血小板减少综合征神经麻痹、根性神经病知觉、根性神经病知觉退缩、根部牙本质发育异常、急发性张力障碍帕金森(氏) 综合征、Rapp-Hodgkin综合症、Rapp-Hodg kin(少汗的)外胚层器官发育不良综合症、 Rapp-Hodgkin少汗的外胚层器官发育不良综合症、罕见的遗传性共济失调伴随由植烷酸羟 化酶缺陷导致的多神经炎改变和耳聋、Rautenstrauch-Wiedemann综合征、 Rautenstrauch-Wiedemann型新生儿吉福德(氏)综合征、Raynaud现象、重组干燥血浆、反 应性功能性低血糖、先天隐形肌强直继发性反应性低血糖、神经纤维瘤病、直肠会阴成形 术、再发性呕吐、交感反射神经血管营养障碍、交感反射性营养不良综合症、屈光不正、顽固 性贫血、冰冻麻痹、雷夫叙姆病(多神经炎型遗传性运动失调病)、雷夫叙姆病(多神经炎型 遗传性运动失调病)、节段性回肠炎、Reid-Barlow综合症、赖芬斯坦综合征(性腺机能不 全、睾丸萎缩精子少、尿道裂、女性化乳房)、Reiger异常-生长迟缓、Reiger综合症、 Reimann间发性疾病、Reimann综合症、Reis-Bucklers角膜营养不良、Reiter综合症、复发 Guillain-Barre综合症、复发-忽重忽轻型多发性硬化症、肾发育不全、肾脏发育不良、遗 传、肾脏发育不良-Loken-Senior型视黄醛发育不全、肾性糖尿、肾性糖尿A型、肾性糖尿B 型、肾性糖尿O型、肾-眼脑营养不良、肾-视黄醛发育异常伴随(肾)髓质囊性病、意向性 肌阵挛、原子力意向性肌阵挛、轴后面骨发育不全、原子力意向性肌阵挛、轴后面骨发育不 全、轴后性多指症、脑炎后的意向性肌阵挛、后角膜营养不良遗传、豆状核后综合征、胺碘苯 丙酸乙酯使用后的蛛网膜炎、出生后的痉挛性两侧麻痹、手术后的胆汁阻塞、产后溢乳闭经 综合征、产后垂体功能减退、产后全垂体机能减退综合症、产后全垂体机能减退、产后垂体 坏死、体位性低血压、失钾性肾炎、失钾综合症、PotterI型婴儿多囊肾病、PotterIII型婴 儿多囊肾病、持续性肺动脉高压、PPS，帕-魏二氏综合征、Prader-Labhart-Willi凡科尼综 合征、前白蛋白77位酪氨酸淀粉样变性病、预激综合征、孕烯醇酮缺失、早产儿心房收缩、 早老综合征、早产儿心室收缩、新生儿心室综合波、新生儿或分娩时神经轴性营养不良、早 老性痴呆、早老性视网膜黄斑退化、原发性肾上腺机能不足、原发性无丙种球蛋白血症、原 发性醛固酮增多症、原发性肺泡换气不足、原发性淀粉样变性、原发性贫血、原发脚气、原发 胆汁、原发性胆汁性肝硬变、原发布朗综合征、原发肉[毒]碱缺乏病缺乏、原发中枢通气不 足综合征、原发性睫运动障碍型、原发性皮肤淀粉样变性病、原发性张力障碍、初期肾上腺 皮质功能减退症、原发家族性上颚发育不全、原发性血色病、原发型多汗(症)、原发性尿草 酸盐过多[I型]、原发性尿草酸盐过多1型(PHl)、原发性尿草酸盐过多I型、原发性尿草 酸盐过多II型、原发性尿草酸盐过多III型、原发性性腺机能减退、原发性小肠淋巴管扩 张、原发性侧索硬化症、原发非遗传的淀粉样变性病、原发闭塞肺血管疾病、原发性进行性 多发性硬化症，原发性肺动脉高压、原发性进行性多发性硬化症，原发性肺动脉高压、原发 性阅读障碍、原发性肾性糖尿、原发硬化性胆管炎、自发性血小板增多，原发中枢神经系肿 瘤、视觉性失认症、直肠结肠炎、直肠结肠炎、成年吉福德(氏)综合征、儿童吉福德(氏) 综合征、吉福德(氏)矮小、Progeriod身材矮小症伴随色素痣、De Barsy Progeriod综合 症、进行性自主衰竭伴随多系统萎缩、进行性延髓性麻痹、包括进行性延髓性麻痹、进行性 心肌病变性着色斑病、家族进行性小脑性共济失调、进行性大脑灰质营养不良、灰质营养不 良(大脑)、进生性骨干发育不全、进行性单侧面萎缩、进行性家族性肌阵挛性癫痫、进行性 一侧面萎缩、进行性感觉迟钝、进行性婴儿大脑灰质营养不良、进行性豆状核变性、进行性 脂肪营养不良、儿童进行性肌营养不良、家族性肾-视网膜营养不良、肾-视网膜综合症、郎-奥_韦三氏综合征、呼吸性酸中毒、呼吸道功能障碍、呼吸肌阵挛多动腿综合征、 RestrictiveCardio myopathy>Retention Hyperlipemia、Rehtore 综合征(不明显)、网状 细胞发育不全、Retinal Aplastic-Cystic Kidneys-JoubertSyndrome、视锥退化、视锥营 养不良、视锥-视杆营养不良、色素性视网膜炎、色素性视网膜炎和先天性耳聋、视网膜成 神经细胞瘤、视黄醇缺陷、视网膜先天性裂、青少年视网膜先天性裂、眼球退缩综合征、眼球 后神经病变、豆状核后综合征、Rett综合征、、Reye综合征、Reye综合征、RGS、Rh血液因子、 Rh病、Rh因子不相容性、Rh不相容性、Rh[血型]不相容性、风湿热、风湿热、风湿热、鼻鼻 窦性大脑蛛网膜炎、肢端斑点状软骨发育异常(RCDP)、缺过氧化氢酶血症、传统的Refsum 病(多神经炎型遗传性运动失调病)、节律性肌阵挛、Rib GapDefects with Micrognathia、 Ribbing病(不明显)、Ribbing病(骨骺端软骨发育不全)、里-汉二氏综合征、Rieger综 合征、Rieter综合征、右心室纤维化、赖利-戴综合征、赖-史二氏综合征、环状染色体14、 环状染色体18、环4、环4染色体、环6、环6染色体、环9、环9染色体R9、环14、环15染色 体(镶嵌样图象)、环18、环染色体18、环21、环21染色体、环22、环22染色体、里特病(新 生儿剥脱性皮炎)、Ritter-Lyell综合征、RLS、RMSS、Roberts SC-短肢综合征、罗伯茨综合 征、罗伯茨短四肢畸形综合征、Robertson外胚层发育不良、Robin形态缺陷、Robin序列征 (原发缺陷_早期下颂发育不良)、Rob in综合征、Robinow侏儒症、Robinow综合征、Robinow 综合征显性形式、Robinow综合征隐性形式、线形体、罗杰病(先天性心室间隔缺损)、 Rokitansky病、罗马诺-沃德综合征、龙贝里综合征(进行性半面萎缩)，无根牙， Rosenberg-Chutorian 综合征、Rosewater 综合征、Rosselli-Gulienatti 综合征、 Rothmund-Thomson综合征(先天性血管萎缩性皮肤异色病)、罗-雷二氏综合征、RP、伴X 染色体的RS、Rs (鲁宾斯坦因综合征)、RSDS、RSH综合征、RSS (俄罗斯春夏型脑炎)、RSTS、 RTS (鲁宾斯坦(氏)综合征)、先天性风疹、鲁宾斯坦因综合征、鲁-塔二氏综合征、鲁-塔 二氏拇指与大趾增宽综合征、赤发赤脸白化病、Ruhr综合征、Russell间脑恶病质、Russell 综合征、Russell综合征(婴儿间脑综合征)、RuSSeil-SilVer侏儒症、鲁-辛二氏综合征、 伴X染色体的鲁_辛二氏综合征、鲁_迈综合征(RMSS)、鲁瓦卡巴综合征、Ruvalcaba型骨 异常增生症伴随精神发育迟缓、骶骨退化、先天性骶骨发育不全、SAE、塞-科二氏综合征、 Sakati,Sakati综合征、Sakati-Nyhan综合征、点头状痉挛、涎腺出汗综合征、Salzman小结 状角膜营养不良、桑德霍夫病、Sanfilippo综合征、Sanfilippo型A、Sanfilippo型B、 Santavuori _、Santavuori-Haltia _、Boeck π 肉Sathre-chotzen>M IA
麻痹、SBMA (脊延髓肌萎缩症)、SC断肢综合征、SC综合征、SCA3、SCAD缺陷、成人局部发作 的SCAD缺陷、先天性全身SCAD缺陷、SCAD、SCAD缺陷、皮肤烫伤综合征、先天性头皮缺陷、 舟状头、肩胛骨升高、Scapuloperoneal肌病、Scapuloperoneal肌肉营养不良、 Scapuloperoneal综合征疾病型、瘢痕形成大泡、SCHAD, Schaumann病、沙伊综合征、 SchereshevkII-Turner综合征、席尔德病(弥漫性轴突周围性脑炎)、席尔德脑炎、席尔德 病、I型席尔德病(婴儿发作)、婴儿期的席尔德病、席尔德病、II型席尔德病(成人发作)、 Schinzel 综合征、Schinzel-Giedon 综合征、Schinzel 肢端角军释综合征、Schinzel-Giedion 面中部退缩综合征、脑裂、精神分裂症、愚型干骺端软骨发育不良、愚型干骺端成骨不全、 施-弗二氏综合征、施密特综合征、Schopf-Schultz-Passarge综合征、 11 er-Christian _、Schut-Haymaker Μ、Schut-Haymaker-PassargeIA M禾口IB型施-詹二氏综合征、施-詹二氏综合征、2型施-詹二氏综合征、SCID、硬皮症、全身渐 进性家族硬化症、弥散性家族脑硬化症、坐骨神经压碎、Scott头盖骨综合征伴随智力迟钝、 沟舌、SCS、SD、SDS、SDYS、季节性结膜炎、脂腺痣综合征、脂腺痣、脂溢性角化病、皮脂溢性 疣、塞克尔综合征、塞克尔型侏儒征、继发性先天性心脏传导阻滞、继发性淀汾样变性、继发 性睑痉挛、继发性非热带性口炎性腹泻、继发性布朗综合征、继发性脚气病、继发性全身淀 粉样病变、继发性张力障碍、继发性分泌小体缺陷、继发性IgA缺陷、SED迟缓、先天性SED、 SEDC、间歇性线状无色痣、间歇性张力障碍、间歇性肌阵挛、塞普综合征、Seitelberger病、 癫痫、IgG亚型选择性缺陷、选择性缄默、IgG亚型选择性缺陷、选择性IgM缺陷、选择性缄 默、选择性IgA缺陷、自体愈合细胞增多病、半叶性前脑无裂畸形、精细管萎缩症、老年性视 网膜劈裂症、老年疣、Senior-Loken综合征、I型遗传性感觉神经病、II型遗传性感觉神经 病、I型遗传性感觉神经病、感觉神经根性神经病、退行性感觉神经根性神经病、脓毒渐进性 肉芽肿病、S印to-Optic发育不良、血浆局限性脑膜炎、血清蛋白酶抑制剂缺陷、血浆肌肽酶 缺陷、塞特莱斯综合征、重度联合免疫缺陷症、重度联合免疫缺陷症伴随腺苷脱胺酶缺陷、 重度联合免疫缺陷症(SCID)、性转换、性幼稚症、SGB综合征、希恩综合征、Shields型牙质 生长不全、带状疱疹、水痘_带状疱疹病毒、航行脚气病、SHORT综合征、断臂18染色体缺失 综合征、短链脂酰辅酶A脱氢酶(SCAD)缺陷、身材矮小和面毛细血管扩张、身材矮小性面/ 骨骼异常_阻滞_巨牙、身材矮小_伸展过度-Rieger异常-出牙延迟、身材矮小-甲发育 不良、身材矮小和面毛细血管扩张性红斑、SHORT综合征、Shoshin脚气病、肩胛带综合征、
~ 15t^'pfIiE>ShwachmanShwachman-Diamond-Oski>Shwachmann
征、夏_德综合征、Shy-Magee综合征、SI缺陷、粘脂病I型、II型婴儿唾液酸沉积症、唾液 酸沉积症、Sialolipidosis、病态窦房结综合征、镰状细胞性贫血、镰状红细胞病、镰状细 胞_血红蛋白C病、镰状细胞-血红蛋白D病、镰状细胞-地中海贫血病、镰刀样细胞特征、 高铁成红细胞性贫血、高铁成红细胞性贫血、成高铁红细胞染色、SIDS、 Siegel-Cattan-Mamou综合征、Siemens-Bloch型有色皮肤病、西门子综合征、西尔弗综合 征、塞尔沃_鲁塞尔侏儒症、塞尔沃_鲁塞尔综合征、Simmond病、西门子综合征、单一的表 皮溶解性大疱、单一的畸形综合征、Simpson-Golabi-Behmel综合征、 Sinding-Larsen-Johansson病、辛-梅二氏综合征、窦性心律不齐、静脉窦、窦性心动过速、 人鱼体序列征、并腿畸胎、内脏逆位支气管扩张和鼻窦炎、SJA综合征、Sjogren Larsson并 发性鱼鳞病、舍格伦综合征、Sj ο gren综合征、SJS (史蒂文斯-约翰逊综合征)、骨骼发育 异常、Weismarm Netter Stuhl型骨骼发育异常、脱皮综合征、皮肤肿疡、颅骨不对称和轻度 精神发育迟缓、颅骨不对称和轻度并指、SLE (全身性红斑狼疮)、睡眠性呼吸暂停、SLO、Sly 综合征、SMA、婴儿急性 SMA、SMA I、SMA III、I 型 SMA、II 型 SMA、III 型 SMA、SMA3、SMAX1、 SMCR、Smith Lemli Opitz 综合征、Smith Magenis 综合征、Smith Magenis 染色体部位、 Smith-McCort 侏儒症、Smith 病、Smoldering Myeloma、SMS、SNE、光线照射引起喷嚏、丙戊 酸钠、孤立性骨浆细胞瘤、Sorsby病、Sotos综合征、Souques-Charcot综合征、南非遗传性 卟啉病、痉挛性发音困难、痉挛性斜颈、痉挛性斜颈、痉挛性大脑性麻痹、痉挛性结肠、痉挛 性发音困难、痉挛性截瘫、SPD钙质沉着病、正常免疫球蛋白的特异抗体缺陷、特异阅读障 碍、SPH2、球形红细胞性贫血、球形红细胞症、球形晶状体-短矮畸形综合征、鞘磷脂沉积 症、神经鞘磷脂酶缺乏、蜘蛛状指、斯皮尔梅伊尔_沃格特病、Spielmeyer-Vogt-Batten综合征、脊柱裂、脊柱裂孔、脊柱裂孔、脊柱动静脉畸形、家族遗传性脊髓性共济失调、脊髓性 共济失调、脊髓压碎、脊髓弥漫性特发性骨肥厚、脊柱DISH、脊髓性肌萎缩、各型脊髓性肌萎 缩、ALS型脊髓性肌萎缩、脊髓性肌萎缩_腓过度增生、I型脊髓性肌萎缩、III型脊髓性肌 萎缩、3型脊髓性肌萎缩、脊髓性肌萎缩_腓过度增生、脊髓骨化蛛网膜炎、脊柱狭窄、脊髓 小脑性共济失调、I型脊髓小脑萎缩、I型脊髓小脑萎缩(SCAl)、II型脊髓小脑萎缩(SCA II)、III型脊髓小脑萎缩(SCAIII)、III型脊髓小脑萎缩(SCA3)、IV型脊髓小脑萎缩 (SCAIV)、V型脊髓小脑萎缩(SCAV)、VI型脊髓小脑萎缩(SCAVI)、VII型脊髓小脑萎缩 (SCAVII)，钩端螺旋体性黄疸，脾发育不全综合征、脾下垂、脾下垂、手裂畸形-下颂面骨发 育不全、手裂畸形、脊椎关节炎、I型脊柱肋骨发育异常、脊椎骨骺迟缓性发育不良、脊椎胸 廓结构不良、脊椎关节强硬性马尾神经根病、海绵肾、多型性成胶质细胞瘤、自发性低血糖、 高位肩胛、春季卡他性眼炎、SRS、ST、腐败鱼综合征、葡萄球菌皮肤烫伤综合征、Stargardt 病、Startle病、癫痫持续状态、斯-里-奥三氏综合征、硬毛病、斯坦_利文撒尔二氏综合 征、斯坦纳特病、Stengel 综合征、Stengel-Batten-Mayou-Spielmeyer-Vogt-Stock 病、狭 窄性胆管炎、腰锥管狭窄、狭窄、类固醇硫酸脂酶缺乏、Stevanovic外胚层器官发育不良、 Stevens Johnson综合征、STCD、Stickler综合征、硬汉综合征、硬汉综合征、Still病、 施-特-杜三氏综合征、Stillis病、刺激物敏感的肌阵挛、硬汉综合征、硬汉、Streeter Anomaly、常染色体显性型纹状体黑质变性、Striopallidodentate Calcinosis、间质、德斯 米膜、间质角膜营养不良、淋巴瘤性甲状腺肿、斯_卡_韦三氏综合征、斯特奇_韦伯综合 征、斯特奇-韦伯斑痣性错构瘤病、亚急性海绵样脑病、亚急性坏死性脑脊髓病、亚急性海 绵样脑病、亚急性坏死性脑病、亚急性肉样瘤病、亚急性嗜神经的、主动脉瓣下狭窄、动脉硬 化性皮层下脑病、心内膜下硬化、琥珀酰胆碱敏感性、先天性蔗糖酶-异麦芽糖酶缺陷、先 天性蔗糖-异麦芽糖吸收不良症、先天性蔗糖不耐受、嗜苏丹型脑白质营养不良ADL、嗜苏 丹型脑白质营养不良佩-梅二氏病家族性脑中叶硬化型、内藏嗜苏丹型脑白质营养不良、 婴儿猝死综合征、Sudeck氏萎缩症、Sugio-Kaj II综合征、Summerski 11综合征、尖头并指、 Summitt氏尖头并指、Summitt综合征、上斜肌鞘综合征、肾上腺、主动脉瓣上狭窄、室上性 心动过速、Surdicardiac综合征、耶-兰综合征、持续室性心动过速、汗腺溃疡、汗味综合 征、斯威特综合征、瑞士干酪软骨综合征、阿佩尔(氏)综合征、I型并指伴发小头畸形和智 力迟钝、Syndromatic肝导管发育不全、脊髓空洞症、全身性非白血病性网状内皮组织增殖、 系统性淀粉样变性、全身肉碱缺乏症、系统性弹性破裂、全身性红斑狼疮、系统性肥大细胞 病、全身性肥大细胞增多症、全身性幼年型关节炎、全身性硬化症、Systopic脾、胸腺依赖性 淋巴细胞缺乏、食物进肠过速低血糖症、心动过速、塔卡热综合征、主动脉弓综合征、大动脉 炎、仰趾足、马蹄内翻足、马蹄足、内翻足、外翻足、纵排脊柱狭窄、丹吉尔病、视网膜毯层变 性、桡骨发育不全-血小板减少综合征、迟发性张力障碍、迟发性肌肉萎缩症、迟发性运动 障碍、迟发性口部运动障碍、迟发性张力障碍、缓慢尺骨麻痹、靶型红细胞贫血、巨跟骨、垂 井病、内含TAS中线缺乏、TAS中线缺乏、Tay Sachs鞘脂类代谢障碍、泰_萨克斯病、Tay鱼 鳞病综合征、Tay Sachs鞘脂类代谢障碍、Tay鱼鳞病综合征、I型塔伊贝综合征、塔伊贝综 合征、TCD、TC0F1、特-柯二氏综合征、变形性肌张力不全、毛发-牙齿-骨综合征、I型毛 发-牙齿-骨综合征、II型毛发_牙齿_骨综合征、III型毛发_牙齿_骨综合征、毛细血 管扩张、内眦距离过宽与并发畸形、内眦距离过宽-尿道下裂综合征、颞叶性癫痫、颞颥动脉炎/巨细胞动脉炎、颞颥动脉炎、中毒性上皮坏死、腱鞘上部斜粘着、张力肌痛、4q内末端 缺失、Terrian角膜营养不良、角膜营养不良综合征、脊索受限综合征、脊索受限畸形序列 征、脊髓栓系综合征、颈部脊索受限综合征、四氢生物喋呤缺乏、四氢生物喋呤缺乏、法乐 (氏)四联症、短四肢畸形_血小板减少综合征、9号染色体短臂四体性、9p四体性、18号染 色体短臂四体性、丘脑综合征、丘脑性疼痛综合征、丘脑感觉过敏性感觉缺失、中型地中海 贫血、轻型地中海贫血、重型地中海贫血、硫胺素缺乏症、硫胺素反应型枫糖尿病、薄基底膜 型肾病、乙酰辅酶A乙酰基转移酶缺乏症、RCDP、酰基辅酶A磷酸二羟丙酮酰基转移酶、第三 和第四咽囊综合征、三度先天性心脏传导阻滞、肌强直性白内障、胸盆指(趾)营养不良、胸 脊椎管、胸腹综合征、胸腹心异位综合征、三M综合征、三M细骨型侏儒症、Glanzmann and Naegeli血小板机能不全、原发性血小板增多症、血小板减少-桡骨缺失综合征、血小板减 少及血管瘤综合征、AT III引起的遗传性血栓形成倾向、血栓性血小板减少性紫癜、血栓性 溃疡性结肠炎、胸腺发育不良伴正常免疫球蛋白、胸腺发育不全、DiGeorge型胸腺发育不 全、原发性胸腺发育不全伴无Y球蛋白血症、DiGeorge型胸腺发育不全、先天性胸腺发育 不全、三叉神经痛、抽搐、Tinel's综合征、托洛萨-亨特综合征、强直性痉挛性斜颈、强直性 瞳孔综合征、牙齿和指甲综合征、弓形体病、其他病毒、风疹、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒感 染、 TORCH综合征、变形性肌张力不全、斜颈、全身性脂肪营养不良、完全性肺静脉 异常连接、Touraine' s 口疮病、秽语综合征、Tourette障碍、Townes-Brocks综合征、汤 斯综合征、中毒性麻痹性贫血、中毒性表皮坏死溶解、Toxopachyosteose Diaphysaire Tibio-Peroniere, Toxopachyosteose、弓形体病和病毒性风疹、细胞巨化病毒、单纯性疱 疹、伴有或不伴有食管闭锁的气管食管瘘、气管食管瘘、一过性新生儿重症肌无力、过渡型 房室间隔缺损、大动脉转位、经电话传送监护、蛋氨酸-30甲状腺激素结合蛋白淀粉样变 性病(I型)、Trapezoidoc印haly-多重骨连接综合征、特雷歇·柯林斯(氏)综合征、 特_弗二氏综合征、Trevor病、三心房心脏、毛发-牙齿-骨综合征、(毛)发灰白营养不 良、毛发-鼻-指(趾)综合征、三尖瓣闭锁、三功能蛋白质缺乏症、三叉神经痛、甘油三酯 储存障碍、长链脂肪酸氧化受损、膀胱三角炎、三角头、三角头综合征、三角头C综合征、三 甲基氨基酸尿症、三指节拇指发育不全远端指甲营养不良、拇指三节指骨综合征、Behcet 三联体综合征、三X染色体综合征、第四染色体三体综合征、三倍体综合征、三倍性、三倍 性综合征、牙关紧闭假屈曲指综合征、三体性、三体性G综合征、三体性X、6q部分三体性、 部分6q三体性综合征、嵌合型9三体性、9P三体综合征、部分Ilq三体性、嵌合型14三 体性、嵌合型14三体性综合征、21 (号染色体)三体型综合征、嵌合型22三体性、嵌合型 22三体性综合征、TRPS, TRPSl, TRPS2，TRPS3、真雌雄同体、动脉干、色氨酸吸收不良、色氨 酸加氧酶综合征、TS，TTP, TTTS，结节性(脑)硬化、肾小管扩张、特科特综合征、特纳综 合征、遗传性骨-指(趾)甲发育不良综合征、伴有正常染色体(核型)的特纳综合征、 Turner-Varny综合征、尖形头、孪生儿输血综合征、双生胎儿血液交换综合征、A型、B型、 AB型、O型、I型糖尿病、I型家族性不完全男性、不完全性男性假两性畸形、I型戈谢病 (家族性脾性贫血、葡萄糖脑苷脂酶缺乏症)、I型组织细胞增多病、II型(PCCB缺乏症)、 II型酪氨酸血症、间歇性缺血性心跳骤停、先天性末端多关节挛缩、II I型戈谢病(家族 性脾性贫血、葡萄糖脑苷脂酶缺乏症)、III型酪氨酸血症、III型遗传性乳光牙本质、典型性视网膜先天性裂、酪氨酸酶阴性白化病(I型)、酪氨酸酶阳性白化病(II型)、I型酪 氨酸血症急性型、I型酪氨酸血症慢性型、酪氨酸病、尿素循环酶病、溃疡性结肠炎、非特异 性慢性溃疡性结肠炎、尺骨乳房综合征、Pallister尺骨乳房综合征、尺神经麻痹、潜水医 学会、公开病愈率、UnconjugatedBenign Bilirubinemiav,甲状旁腺活动低下、单侧鱼鳞 病样红斑伴同侧肢体畸形、单侧软骨瘤病、单侧胸肌缺陷及并指、单侧半发育不良、单侧巨 脑、单侧部分脂肪代谢障碍、单侧肾发育不全、结肠不规则、肌阵挛性癫痫、翁-伦病(肌 阵挛)、Unverricht-Lundborg-LafDisease、进行性肌阵挛性癫痫、上肢-心血管综合征 (Holt-Oram)，上运动神经元病、上呼吸道呼吸暂停、尿素循环障碍、精氨酸酶型尿素循环障 碍、精氨酸琥珀酸酶型尿素循环障碍、氨甲酰基磷酸合成酶型尿素循环障碍、瓜氨酸血症型 尿素循环障碍、典型性N-丙烯基谷氨酸合成酶型尿素循环障碍、鸟氨酸转氨甲酰酶型尿素 循环障碍、尿道综合征、尿道-眼-关节综合征、I型重症二磷酸尿苷葡萄糖苷酸(基)转 移酶缺乏症、尿道缺陷、Urofacial综合征、III型六氢尿卟啉共合成酶、色素性荨麻疹、乌 谢尔综合征(先天性聋视网膜色素变性综合征)、I型乌谢尔综合征、II型乌谢尔综合征、 III型乌谢尔综合征、IV型乌谢尔综合征、子宫粘连、Uoporphyrinogen I合成酶、眼色素层 炎、眼色素层脑膜炎综合征、变异的克雅氏病、VACTEL联合征、VACTERL联合征、VACTERL综 合征、跟骨外翻、缬氨酸转酰胺酶缺乏症、缬氨酸血症、丙戊酸、丙戊酸盐接触、丙戊酸接触、 丙戊酸、Van Buren' s 病、Vander Hoeve-Habertsma-Waardenburg-Gauldi 综合征、不定期 发病免疫球蛋白缺乏症丙种球蛋白异常血症、变异的克罗伊茨费尔特-雅各布病、水痘胚 胎病、多样性卟啉病、脉管性胎记、Binswanger' s型脉管性痴呆、脉管性勃起组织瘤、脉管 性血友病、血管畸形、脑血管畸形、血管炎、血管舒缩失调、加压素抵抗性尿崩症、加压素敏 感性尿崩症、法特联合征、vcf综合征、vcf, Velocardiofacial综合征、性病的关节炎、静 脉畸形、心室纤维性颤动、心室间隔缺损、先天性心室缺损、心室间隔缺损、室性心动过速、 小静脉畸形、VE0HD、小脑蚓发育不全、小脑发育不全、春季角(膜)结膜炎、毛瘤、脊椎的肛 门的气管食管的食管的桡骨的、脊椎强直性骨肥厚、Huntington’ s舞蹈症的早期发作、极 长链乙酰辅酶A脱氢酶缺乏症、前庭神经鞘瘤、前庭神经鞘瘤多发性神经纤维瘤、前庭小脑 的、Virchow' s尖头、内脏黄肉芽肿病、内脏黄肉芽肿病、内脏肌病-外部眼肌麻痹、内脏肥 大-脐带突出-巨舌综合征、视性失语、维生素A缺乏症、维生素Bl缺乏症、黄斑营养不良、 白癜风、头部白癜风、玻璃体视网膜变性、春季角(膜)结膜炎、伏格特-小柳-原田三氏综 合征、VLCAD、沃格特综合征(纹状体综合征)、Vogt Cephalosyndactyly, Vogt Koyanagi Harada综合征、(冯)别-施二氏综合征、Von Eulenburg先天性肌强直病、Von Frey ’ s综 合征、冯·吉尔克病、(冯)希-林二氏综合征、Von Mikulicz综合征、冯·雷克林霍曾病、 Von Willebrandt病、后叶加压素、弗龙里克病(I型)、室间隔缺损、普通型角化病、普通型 鱼鳞病、W综合征、瓦尔敦堡综合征、瓦_克二氏综合征、瓦尔敦堡综合征(I型)、瓦尔敦堡 综合征(II型)、IIA型瓦尔敦堡综合征、IIB型瓦尔敦堡综合征、III型瓦尔敦堡综合征、IV 型瓦尔敦堡综合征、Waelsch’ s综合征、WAGR复合体、WAGR综合征、Waldenstroem’ s巨球蛋 [=IifilSE^ffaldenstrom' s Purpura、Waldens trom' s 综合征、Waldmann 病、Walker-Warburg 综合征、游动脾、Warburg综合征、温型抗体溶血性贫血、温型交叉反应抗体疾病、瓦滕 贝格综合征、细菌性心内膜炎、脑部水分、细菌性心内膜炎、Watson-Alagille综合征、 沃_弗二氏综合征、蜡质的疾病、威_贝二氏综合征、韦弗综合征、Weaver-Smith综合征、Weber-Cockayne病、Wegener’ s肉芽肿病、韦尔病(钩端螺旋体性黄疸)、Weil综合征、 WeiIl-Marchesani、韦-马二氏综合征、Weill-Reyes 综合征、Weismann-Netter-Stuhl 综 合征、Weissenbacher-ZweymuIler 综合征、韦尔综合征、Wenckebach、Werdnig-Hoffman 病、 Werdnig-Hoffman 瘫痪、Werlhof，s 病、沃纳综合征、Wernicke，S(C)I 综合征、Wernicke，s 失语症、Wernicke-Kor sakoff综合征、韦斯特综合征、湿性脚气病、WHCR、Whipple，s病、 肠脂肪肉芽肿症、吹口哨面容综合征、吹口哨面容及风车叶状手综合征、White-Darier 病、怀_诺二氏综合征、轮生痣样黑色素过度病、WHS、Wieacker综合征、Wieacker综合 征、ffieacker-ffolff 综合征、Wiedmann-Beckwith 综合征、Wiedemann-Rautenstrauch 综 合征、维尔德穆特综合征，Willebrand-Juergens病、威-普二氏综合征，威廉斯综合征、 Williams-Beuren综合征、肾母细胞瘤，肾母细胞瘤虹膜缺失_成性腺细胞瘤_智力发 育迟缓综合征、肾母细胞瘤虹膜缺失_成性腺细胞瘤_智力发育迟缓、肾母细胞瘤虹 膜缺失_成性腺细胞瘤_智力发育迟缓综合征、肾母细胞瘤_假两性畸形_肾病、肾母 细胞瘤和假两性畸形、肾母细胞瘤_假两性畸形_肾小球病、Wilson' s病、Wilson' s综 合征、Winchester-Grossman综合征、维-奥二氏综合征、Wiskott-Aldrich型免疫缺陷、 头皮白痂病外胚层器官发育不良、头皮白痂病牙齿-指甲综合征、Wittmaack-Ekbom综合 征、丽综合征、韦克斯勒记忆量表、WNS、Wohlfart病、沃-库-韦病(遗传性近位性神经 原性肌萎缩症)、4号染色体短臂部分单体综合征、Wolf-Hirschhorn染色体区域(WHCR)、 Wolf-Hirschhorn综合征、沃-帕-怀综合征、遗传性少年型糖尿病、沃尔曼病(酸性脂肪酶 缺乏所致溶酶体贮积病)、Woody Guthrie，s病、吾-巴-怀三氏综合征、Writer，s痉挛、 WS, WSS，WWS、视网膜动静脉瘤、X染色体连锁的Addison，s病、X染色体连锁的脑白质肾上 腺萎缩症、X染色体连锁的成人脊延髓肌萎缩症、X染色体连锁的成人脊髓性肌萎缩、χ连锁 无丙种球蛋白血症伴生长激素缺乏症、χ连锁无丙种球蛋白血症，淋巴组织增生型X连锁综 合征、X连锁的心肌病和中性粒细胞减少症、X连锁的中央核型肌病、X-连锁铜缺乏症、X连 锁的铜吸收不良、X连锁的显性康-许二氏综合征、X连锁的显性遗传性胼胝体发育不良、X 连锁的张力障碍_帕金森综合征、X连锁的鱼鳞病、婴儿伴性无丙种球蛋白血症、X连锁的 新生儿Nectrotizing脑病、X连锁的青年性视网膜劈裂症、X连锁的无脑回症、X连锁的淋 巴组织增生综合征、X连锁的智力发育低下_紧握的拇指综合征、X连锁的智力发育低下伴 张力减退、X连锁的智力发育低下和巨睾丸、X连锁的进行性多样性免疫缺陷、X连锁的隐性 康_许二氏综合征、X连锁的隐性重症联合免疫缺陷综合征、X连锁的视网膜先天性裂、X连 锁的脊柱骨骺发育不良、黄嘌呤氧化酶缺乏症(黄嘌呤尿缺乏、遗传性)、全身的黄肉芽肿 病、结节性黄瘤，着色性干皮病、显性着色性干皮病、AIXPA型着色性干皮病、Type BII XPB 着色性干皮病、Type EVXPE着色性干皮病、Type C IIIXPC着色性干皮病、Type D IV XPD 着色性干皮病、Type F VI XPF着色性干皮病、Type G V II XPG着色性干皮病、着色性干 皮病变种Type XP-V、干皮病-畸形足珐琅质缺陷、干皮性白痴、干眼症，干燥性角膜炎、X 连锁淋巴组织增生、先天性性腺发育不全综合征、着色性干皮病、XX男性综合征、性别逆转、 XXXXX综合征、XXY综合征、XYY综合征、XYY染色体模式、黄色突变性白化病、黄指(趾)甲 综合征、YKL，年青女性动脉炎、Yunis-Varon综合征、YY综合征、Z-E综合征、Z和蛋白酶抑 制剂缺乏症、泽韦格综合征、Zellweger脑-肝-肾综合征、佐-埃二氏综合征、齐-奥二氏 病(变形性肌张力不全)、济_拉二氏综合征、先天性锌缺乏、津-柯-恩三氏综合征、ZLS、佐林格-埃利森综合征。在另一个具体实施方案中，包含分离的GM-CSF或其嵌合分子的药物组合物可单 独或与其它生物制剂、药物或治疗方法(如手术、放疗、骨髓移植、外周干细胞移植、传统化 疗，包括顺钼、链脲霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、丝裂霉素C、白消安、Oblimersen、依托泊甙、长 春新碱、环磷酰胺、吉西他滨、紫杉醇、cytabarine等化疗药物；抗病毒治疗包括去羟肌苷、 AZT、病毒唑、利巴韦林、齐多夫定、dideoycytidine ；其它治疗方法包括抗生素、细胞因子、 生长因子、小分子药物)联合用于急性骨髓性白血病和急性淋巴细胞性白血病等多种白血 病；用于白细胞减少症(白细胞减少)等癌症化疗相关的疾病，如急性骨髓性白血病或其 他高危病人接受化疗后发生的包括发热性中性粒细胞减少症等中性粒细胞减少症、或急性 骨髓性白血病及骨髓增生异常综合征巩固化疗后产生的中性粒细胞减少症、或发生Kaposi 肉瘤的HIV病人诱导产生的中性粒细胞减少症；用于辅助骨髓移植或外周干细胞移植；辅 助治疗失败或延迟的骨髓移植物；加速自体骨髓或外周干细胞(外周血祖细胞，PBPC)移植 (如非何杰金氏淋巴瘤患者)的骨髓恢复；用于何杰金氏病；提高用于移植的PBPC的动员 和产量。而在另一个具体实施方案中，包含分离的GM-CSF或其嵌合分子的药物组合物可 单独或与其它生物制剂、药物或治疗方法联合使用，作为佐剂提高化疗量效强度；引起化 疗激发效应(如，改变细胞周期动态增加细胞毒性)；作为化疗中的造血保护剂；与放化疗 联合使用时逆转中性粒细胞减少；预防或治疗化疗所致黏膜损害(粘膜炎)的副作用；缓 解白血病患者的真菌感染；作为免疫佐剂有助于树突状细胞和抗原递呈细胞的成熟；作为 乙肝病毒和流感病毒等疫苗的佐剂；用于早产儿脓毒血症细菌及真菌感染的辅助治疗；用 于免疫抑制的器官移植病人的抗感染辅助治疗；抑制HIV复制，有利于提高CD4数并减少 AIDS患者感染量；作为肿瘤疫苗，增强黑色素瘤肿瘤抗原表位多肽的免疫反应；促进伤口 修复，如难治性腿部溃疡；刺激动脉血管生成，如用于外周动脉性疾病；在神经系统损伤中 可刺激轴突再生；中风后的脑保护；用于肺泡蛋白沉积症；减少移植物抗宿主性疾病，如干 细胞移植时。在另一个具体实施方案中，包含分离的IL-3或其嵌合分子的药物组合物可单独 或与其它生物制剂、药物或治疗方法联合使用治疗多种疾病，不仅包括骨髓增生异常综合 征(MDS)、异源相关克隆造血紊乱等骨髓异常性疾病；以骨髓形态和成熟度(骨髓增生不 能)异常为特征，并进一步导致外周血细胞减少、贫血、白细胞减少及血小板减少的骨髓异 常性疾病；Diamond-Blackfan贫血(DBA)；对如白细胞恶变等造血系统癌症高剂量化疗后 移植增生的骨髓移植物；非何杰金氏淋巴瘤；乳腺癌；基因转移治疗；HIV相关的白细胞减 少症和骨髓抑制；血小板减少症；二次造血不足；再生障碍性贫血、FSCCL等特定类型的贫 血；旋毛虫等寄生虫感染；肺癌；疱疹病毒等病毒感染。在另一个具体实施方案中，包含分离IL-4或其嵌合分子的药物组合物可单独或 与其它生物制剂、药物或治疗方法联合用于多种疾病的治疗和预防，包括自身免疫性疾病， 如牛皮癣，通过促进TH2细胞反应，Grave’ s甲亢，自身免疫性糖尿病，免疫脱髓鞘性神经炎 (如多样硬化症)，Crohn氏病；治疗过敏性疾病，如作为支持治疗促进同种异体移植物的组 织存活(如皮肤、心脏移植)，逆转或预防迟发型超敏反应或肠炎；治疗感染性炎症(如幽 门螺旋杆菌所致的胃炎)；血管球性肾炎；海曼肾炎，膜性肾病，牙周病，风湿性关节炎；预防白细胞交通性胸膜炎；修复炎性反应失调后的细胞免疫(如烧伤和其它损伤)；调节睡眠 行为(如治疗睡眠失调)。在另一个具体实施方案中，包含分离IL-5其嵌合分子的药物组合物可单独或与 其它生物制剂、药物或治疗方法联合用于多种疾病的治疗，包括丝虫等寄生虫感染、急性骨 髓性白血病(AML)等癌症。而且，本发明的药用药物组合物有更高的药效，更强的热稳定性，更长的血清半衰 期或在与表达在非人细胞系的蛋白质或其嵌合体相比时具有更高的血液溶解性。本发明也 表现出了更低的免疫相关的清除作用或相关副作用。由于这些改良的特性，与表达在非人 细胞系的蛋白质或其嵌合体相比本发明的药物组合物可以以更低的频率给药。降低给药频 率可以增强病人的适应性从而有利于治疗结果。病人的生活质量同样也会有所提高。因此，在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以以治疗剂量用与表达在非人 细胞系的蛋白质或其嵌合体相同的给药方式给药。治疗剂量是指产生体内活性必须的药物 组合物的量。给予复合物的精确的量由如所治疗症状的准确类型、治疗病人的身体条件和 药物组合物中的其他成分等因素决定。含有本发明蛋白或嵌合分子同工型的药物组合物可 以以利于给药的不同的配方配制用以治疗具有上述一个或多个症状的病人。药物组合物的 平均治疗有效程度可能有所不同。预计的有效剂量在0. lng/kg体重到20μ g/kg体重之间； 或根据合格医师的建议或处方。本发明进一步提供了至少包含部分蛋白或其嵌合分子的分离的蛋白质或嵌合分 子和药物组合物在不同疗法和/或诊断中的应用。更具体地，本发明提供了治疗或预防被试哺乳动物疾病的方法，其中可以增加本 发明中的蛋白或嵌合分子的量或活性来缓解疾病，这种方法包括向所述被试哺乳动物给予 有效剂量的分离的蛋白质、包含该蛋白的嵌合分子、包含该蛋白质的胞外区域片断的嵌合 分子、或包含该分离的蛋白质或嵌合分子的药物组合物。下面以非限制性的实施例对本发明进一步加以阐述。实施例1(a)pIRESbleo3-Fc 构建体的制备编码人IgGl的Fc结构域的DNA序列通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，来自 EST cDNA 库(Clone ID 6277773，Invitrogen)，使用分别掺入了 限制性内切酶 BamHl 和BstXl位点的正向引物(SEQ ID NO :21)和反向引物(SEQ ID NO :22)。该扩增子克 隆入pi RESbleo3(Cat. No. 6989-1，BD Biosciences)中相应的酶切位点以制备构建体 pIRESbleo3-Fc。pIRESbleo3_Fc用BamHl和BstXl消化释放出780bp期望大小的插入片 段，如凝胶电泳所测定的。(b)表达蛋白质的DNA构建体的制备编码蛋白质的DNA序列通过PCR扩增，来自EST cDNA库，使用根据表8引入了限制 性酶切位点的正向引物和反向引物。扩增后，扩增子经合适的限制性内切酶消化并且克隆 到如表8所示的表达载体中，以制备载体_蛋白质构建体。合适的限制性内切酶用于消化 含有编码蛋白质的DNA序列的载体，以释放如表8中所示的期望大小的片段。对载体-蛋 白质构建体测序以确定此处所描述的克隆过程的完整性。表8[1434]蛋白质-Fc和相关的克隆信息 (c)Megapr印载体-蛋白的制备将载体-蛋白转化的E. coli过夜培养，取750 μ 1菌液加入含氨苄西林(100 μ g/ ml) 750ml 无菌 LB 肉汤。37 °C 震荡培养 16 小时。按 QiagenEndofree Plasmid Mega Kit (Qiagen Mega Prep Kit #12381)制备质粒。或者，克隆到载体(例如pIRESbleo3)中的编码该蛋白质的核苷酸序列可 以用引物进行扩增，该引物加入了允许编码蛋白质的DNA序列克隆到载体-Fc (例如 pIRESbleo3-Fc)中Fc核苷酸序列上游的限制性酶切位点，以使蛋白质和Fc核苷酸序列直 接地或通过连接子地符合读框地融合。实施例2(a)人细胞表达GM-CSF的产生与纯化⑴本发明的GM-CSF的产生在第O天，用来自转化的胚胎人肾细胞系的3X IO7细胞接种五个500cm2组织培 养板(Corning)，所述细胞例如 HEK 293、HEK 293 c 18、HEK 293T、293 CEN4、HEK 293F、 HEK 293FT、HEK 293Ε、AD-293 (Stratagene)或者 293Α (Invitrogen)。细胞接种到每 平板90mlDulbecco氏改良的Eagle氏培养基/Ham氏营养混合物F12 (DMEM/F12) (JRH Biosciences)中，培养基添加了 10 % (ν/ν)供体小牛血清(FCS、JRH Biosciences), IOmM HEPES (Sigma), 4 mM L-谷氨酰胺(Ameresco)和 (ν/ν)青霉素-链霉素(JRH Biosciences)。另外，可用10% (ν/ν)热灭活的供体牛血清(DCS,JRH Biosciences)代替 无 HEPES 的 FCS。第1天，用磷酸钙进行转染。转染前，用120ml新配的加入上述补充物的DMEM/F12对每个培养板换液。制备磷酸钙/DNA沉淀物将UOOyg pIRESbleo(Invitrogen)含人 GM-CSF基因的质粒DNA和3000或3720 μ 1 2. 5Μ CaCl2加入无菌H2O,使总量至30ml (溶 液A)。IOml移液管逐滴将30ml溶液A加入2x HEPES缓冲盐溶液(HBS)(溶液B)中。加 入过程中，轻轻吹打溶液B。混合物在25°C涡旋振荡培养20分钟。混合物也可在无涡旋下 孵育。12ml混合物滴加加入到各平板。4小时后，去除所含的转染培养基，并且按照每块板 IOOml加入DMEM/F12培养基，该培养基中补充有10% (ν/ν)热灭活的供体小牛血清(DCS， JRHBiosciences), IOmM HEPES,4mM L-谷氨酰胺，(ν/ν)青霉素-链霉素，并且用 3. 5mM HCl调节到pH7，在37°C下孵育过夜。在第2天，弃去细胞培养上清。向收集的培养基中加入IOOmM PMSF(1% (ν/ν)) 和500mM EDTA (1 % (ν/ν))。平板中的内容物用50ml无血清DMEM/F12培养基洗涤2次，再 向每个培养板加入IOOml新鲜的无血清DMEM/F12培养基，该培养基中补充有40mM N-乙 酰-D-甘露糖胺，IOmM L-谷氨酰胺，4. lg/L甘露糖、(ν/ν)青霉素-链霉素和ITS溶液 (5mg/L牛胰岛素，5mg/L部分离子渗透的人转铁蛋白和5yg/ml硒)(Sigma)。此外，补充 物含40mM N-乙酰-D-甘露糖胺，7mM L-谷氨酸盐、0. 5g/L甘露糖和1 % (ν/ν)青链霉素。 培养板在37 °C条件下孵育。第3天，收集无血清DMEM/F12培养基并且每平板加入IOOml新鲜的无血清的添加 有如第2天用的培养基中所添加的物质的DMEM/F12培养基。将IOOmM PMSF(1% (ν/ν))和 500mM EDTA(1% (ν/ν))加入到收集的细胞培养上清中并且混合物在4°C贮存。第4 天，收集无血清 DMEM/F12 培养基。IOOmM PMSF (1% (ν/ν))和 500mM EDTA (1% (ν/ν))加入到收集的细胞培养上清中并且与第3天的收集物汇集在一起。结合的收集物通 过加入十分之一体积的200mMMES/50mM MgCl2 pH6调节到pH6，在用0. 45mm低-蛋白质吸 附过滤器(Durapore、Millipore)除去微粒前。混合物在_70°C贮存或立即使用。(ii)本发明的GM-CSF纯化染料-配体色谱(DLC)的过程作为纯化GM-CSF的第一步。为了在批量纯化微量 形式中有效的结合和释放，固定化活性染料库用于筛选GM-CSF。然后，合适的染料-蛋白质 结合在小规模的柱形式中检验。小规模纯化中，5ml解冻的细胞培养上清的样品在pH6. 0的条件下通过0. 5ml染料 配体柱。在该优化的步骤中，为了获得分级的最大回收率，选出最佳的染料球珠-细胞因子 和pH组合，以进行大批量DLC。对于大规模DLC，活性染料编号78 High (Zymatrix)被选择作为对GM-CSF具有最 佳结合和洗脱性质的活性染料。过滤的细胞培养上清在重力流下通过4. Oml或8. Oml的 分别具有3ml或6ml用50mM MES/5mMMgCl2预先平衡到pH6的DLC树脂的柱体(Alltech、 Extract CleanFilter columns)。通过样品的整体流贮存在4°C直到ELISA结果证实纯化 成功。柱子用缓冲液A(20mM MES/5mM MgCl2 pH 6)洗柱，直至通过色度蛋白试验(Biorad 蛋白试验)检测不到蛋白级分。GM-CSF用三种洗脱缓冲液依照如下顺序洗脱。洗脱液1 缓冲液 C(50mM Tris-Cl/10mM EDTA pH8)洗脱液2 :EN1. 0(50mM Tris-Cl/10mM EDTA/1. OM NaCl pH8)洗脱液3 :EN2. 0 (50mM Tris-Cl/10mM EDTA/2. OM NaCl pH8)用银染SDSPAGE检测洗脱级分，采用 4-20%Tris-Glycine胶(Invitrogen)，并用GM-CSF ELISA 法监测(R&D Systems Duoset)。Buffer Em. 0 的洗脱液中检测到 GM-CSF。 通过SDS PAGE分析，90%的污染蛋白在基本纯化步骤中被去除。收集合GM-CSF的DLC级 分，用于体积排阻色谱法。m ^ ^ DLC Wi ^ 用 Superdex 75 preparative grade 16/70 (Pharmacia^ Uppsala, Sweden)柱进行排阻色谱法(SEC)。重碳酸铵平流液按Iml/分钟速度流动。 另外，可用50mM MES缓冲液(pH6. 5)按1. 5ml/分钟流速过S印hadex 200 preparative grade (Pharmacia、Uppsala、Sweden)柱。总过柱时间为 120 分钟，Superdex 柱在 40-100 分 钟间出现高峰；S印hadex柱则在20-100分钟间出现高峰。用银染SDS PAGE检测洗脱级分， 采用 4-20% Tris-Glycine 胶(Invitrogen)。Superdex 柱中 GM-CSF 从洗脱液中检出时间 为55-65分钟，Sephadex柱中的检出时间约为52分钟。用S印hadex柱纯化的GM-CSF通过阴离子交换树脂(Uno Q、Bio-Rad Laboratories)进行进一步纯化，后者预先用50mM MES(Sigma)平衡至pH 6.5。用线性梯 度的从50mM MES pH6. 5至含IMNaCl 50mM MES pH 6. 5将结合的GM-CSF从柱上洗脱。用 HiPrep 26/10快速脱盐柱将含细胞因子的级分在PBS中去除盐分。纯化的GM-CSF表观分子量为14_32kDa，用银染SDS PAGE检测纯度为100%。将含 GM-CSF的级分收集后，用离心过滤装置(AmiconUltrEuMillipore)浓缩于一小于2ml的柱 上。以14230 M-I cm-Ι的摩尔吸光系数检测280nm吸收值，纯化的GM-CSF浓度为417ug/ ml ο(b)人细胞表达的IL-3的生产与纯化(i)本发明的IL-3的生产第0 天，将转染的人胚肾细胞，如 HEK 293,HEK 293 cl8、HEK 293T、293 CEN4、HEK 293F、HEK 293FT、HEK 293E、AD-293 (Stratagene)、或 293A (Invitrogen)，按细胞数 3 X 107 接种于500cm2组织培养皿(Corning)中。每孔细胞加入90ml Dulbecco' s Modified Eagle ‘ sMedium/Ham ‘ s Nutrient Mixture F12(DMEM/F12)(JRHBiosciences), J^ # 基中预先加入10% (ν/ν)热灭活的胎牛血清(FCS、JRH Biosciences)、4mM L-谷氨酸 盐(Amresco)和1% (ν/ν)青链霉素(青霉素G5000U/ml、链霉素硫酸盐5000 μ g/ml) (JRHBiosciences)。也可用 10% (ν/ν)热灭活的供体牛血清(DCS、JRHBiosciences)代替 不含HEPES的FCS。第一天，用磷酸钙进行转染。转染前，用120ml新配的加入上述补充物的DMEM/F12 对每个培养板换液。制备磷酸钙/DNA沉淀物将UOOyg pIRESbleo3 (Invitrogen)含人 IL-3基因的质粒DNA和3000或3720 μ 1 2. 5Μ CaC12加入无菌Η20，使总量至30ml (溶液 A)。IOml移液管逐滴将30ml溶液A加入2 χ HEPES缓冲盐溶液(HBS)(溶液B)。加液过 程中，用溶液B轻吹气泡。25°C漩涡孵育混合液20分钟，混合液也可在无漩涡下孵育。将 12ml混合液逐滴加入每个孔。将培养板37°C、5% C02孵育过夜。第二天，弃掉培养上清。用50ml DMEM/F12培养基洗每个培养板中的培养物，每培 养板加入100ml含4mM L-谷氨酸盐和1 % (ν/ν)青链霉素的新鲜无血清DMEM/F12培养基。 加入的DMEM/F12也可补入40mM N-乙酰-D-甘露糖胺、7mM L-谷氨酸盐、0. 5g/L甘露糖和 1% (ν/ν)青链霉素。将培养板37°C，5% C02孵育过夜。第3天，收集培养上清。每个培养板加入含4mM L-谷氨酸盐和1 % (ν/ν)青链霉素的新鲜无血清DMEM/F12培养基100ml。37°C、5% C02孵育过夜。收集的培养上清中加入 IOOmM PMSF (1% (v/v)) R 500mMEDTA(l% (ν/ν))，混勻后 4°C保存。第4天，收集培养上清，加入 IOOmM PMSF(1% (ν/ν))及 500mMEDTA(1 % (v/v))，在 用0. 45 μ m低蛋白结合滤器(Durapore、Millipore)去除颗粒前，将其与第3天收集保存的 上清液混合。该混合液可立即使用或置-70°C保存。(ii)本发明的IL-3的纯化用切向流式滤器(TFF)装置(PeliconXL, Ultracell, Millipore)浓缩 1 升过滤 的细胞培养上清。将样品以150ml/分钟速度通过150cm2的再生纤维素膜，用5KDa为标准 分子量分离点直至样品被浓缩为40或50ml。为使浓缩样品完全过滤，用额外的等量50mM MES pH 5. 6缓冲液继续浓缩至另一 40ml。完全过滤的步骤重复2_3次至最终浓缩至80ml。 之后用0. 45μπι低蛋白结合滤器(Durapore、Millipore)过滤浓缩的完全过滤样品。用50mM MES ρΗ5· 6 (Sigma)将阳离子交换柱(Bio-RadLaboratories、Uno S12) 预平衡至PH5. 6，通过将浓缩的细胞培养上清从TFF过柱纯化IL-3。用线性梯度的从50mM MES pH 5. 6 至含 IM NaCl 50mM MES pH5. 6 将结合的 IL-3 从柱上洗脱。用 ELISA 和 IDSDS PAGE (4-20% gradient Tris-Glycine gels (Invitrogen))分析所得级分的表观分子量和 纯化程度，用抗IL-3 ELISA(R & DSystems)定量。以5KDa为标准分子量分离点，用离心过 滤装置(AmiconUltra、Millipore)将含IL-3的级分浓缩约50倍。用 Superdex 75 preparative grade 16/70 (Pharmacia、Uppsala、Sweden)柱通过 体积排阻色谱法对IL-3进一步纯化。重碳酸铵平流液流速为0.5ml/分钟。此外，可以 用1 χ Dulbecco，s磷酸盐缓冲盐液(DPBS修正)(JRH Biosciences) (ρΗ7· 3)作为平流液 以1. 5ml/分钟速度流过。重碳酸铵缓冲液总过柱时间为240分钟，洗脱峰值为70和190 分钟之间。而用DPBS修正缓冲液时，总过柱时间为120分钟，洗脱峰值为20和100分钟 之间。用anti-IL-3 ELISA(R & D Systems)和银染SDS PAGE检测洗脱级分，采用4-20% Tris-Glycine胶(Invitrogen)。用重碳酸铵缓冲液时，IL-3洗脱峰值为90和120分钟之 间；而用DPBS修正缓冲液时，峰值为约53分钟。纯化的IL-3表观分子量为16-32 kDa之间，用银染SDS PAGE检测纯度至少为 99%。将含IL-3的级分收集后，用离心过滤装置(Amicon Ultra, Millipore)浓缩于一小 于2ml的柱上。以12615 M-Icm-I的摩尔吸光系数检测280nm吸收值，纯化的IL-3浓度为 931ug/mlο(c)人细胞表达的IL-4的生产与纯化(i)本发明的IL-4的生产第O 天，将转染的人胚肾细胞，如 HEK 293,HEK 293 cl8、HEK 293T、293 CEN4、HEK 293F、HEK 293FT、HEK 293E、AD-293 (Stratagene)、或 293A (Invitrogen)，按细胞数 3 X IO7 接种于500cm2组织培养皿(Corning)中。每孔细胞加入90ml Dulbecco' s Modified Eagle' sMedium/Ham' s Nutrient Mixture F12 (DMEM/F12) (JRHBiosciences),
中预先加入 10% (v/v)热灭活的胎牛血清(FCS、JRH Biosciences) UOmM HEPES(Sigma)、 (JRH Biosciences)、4mML-谷氨酸盐(Ameresco)和 1% (v/v)青链霉素。也可用 10% (ν/ ν)供体牛血清(DCS、JRH Biosciences)代替不合HEPES的FCS第一天，用磷酸钙进行转染。转染前，用120ml新配的加入上述补充物的DMEM/F12对每个培养板换液。制备磷酸钙/DNA沉淀物将UOOyg pIRESbleo(Invitrogen)含人 IL-4基因的质粒DNA和3000或3720 μ 1 2. 5Μ CaCl2加入无菌H2O,使总量至30ml (溶液A)。 IOml移液管逐滴将30ml溶液A加入2xHEPES缓冲盐溶液(HBS)(溶液B)。加液过程中，用 溶液B轻吹气泡。25°C漩涡孵育混合液20分钟，混合液也可在无漩涡下孵育。将12ml混 合液逐滴加入每个孔。4小时后去除含转染液的培养基，每培养板加入IOOml含10% (ν/ν) 热灭活供体牛血清(DCS、JRH Biosciences) UOmM HEPES、4mM L-谷氨酸盐、(ν/ν)青链 霉素和 3. 5mM HC1、pH7 的 DMEM/F12。37°C孵育过夜。第二天，收集DMEM/F12培养基上清，将IOOmM PMSF(1% (ν/ν))和500mM EDTA(1% (ν/ν))加入收集的培养基。分别用50ml无血清DMEM/F12洗培养板中培养物两次，每培养 板加入IOOml新鲜无血清DMEM/F12培养基(DMEM/F12培养基中补入40mM N-乙酰-D-甘 露糖胺、IOmM L-谷氨酸盐、4. lg/L甘露糖、(ν/ν)青链霉素和ITS溶液(5mg/L牛胰岛 素、5mg/L部分铁离子饱和的铁传递蛋白及5μ g/ml硒)(Sigma).此外，补充物中可含40mM N-乙酰-D-甘露糖胺、7mM L-谷氨酸盐、0.5g/L甘露糖和(ν/ν)青链霉素。37°C孵育 过夜。第3天，收集DMEM/F12培养基，每个培养板加入含第二天所用补充物的IOOml 新鲜无血清DMEM/F12培养基。收集的培养基中加入100 mM PMSF(1% (ν/ν))及500 mM EDTA (1% (v/v))，混勻后 4°C保存。第4天，收集培养板中的DMEM/F12培养基。收集的培养基中加入IOOmM PMSF (1% (ν/ν))及500mM EDTA (1% (ν/ν))。取出5ml混合液进行ELISA检测，剩余的混合液与第3 天收集的无血清液体混合。在用0.45 μ m低蛋白结合滤器(Durapore、Mililpore)去除颗 粒前，向混合液加入1/10体积的200mM MES/50mM MgCl2 pH6，使其pH值为6。该混合液可 立即使用或置-70°C保存。(b)本发明的IL-4的纯化配体染料色谱(DLC)为纯化IL-4的基本步骤。用固定反应染料库筛选IL_4、以 选出能有效结合并在一批纯化微量形式中释放。用小规模体积形式测试适当的染料蛋白结
I=I O小规模纯化时，将5ml细胞培养上清解冻，使之通过0. 5ml、pH6的配体染料柱。该 优化步骤获得最佳染料珠_细胞因子和PH共同作用的信息，有利于最大化恢复大规模DLC 的级分。因大规模DLC反应染料数17 High (Zymatrix)被筛选为反应染料，该染料对IL_4 具有最佳结合与洗脱的特点。在重力作用下，过滤的细胞培养上清流过4. Oml或8. Oml柱 体(Alltech、Extract CleanFilter columns)，这两种柱体分别含 3ml 或 6ml DLC 树脂，并 用50mM MES/5mM MgCl2与平衡至pH6。流出的大批样品保存于4°C，直至ELISA结果确认 纯化成功。用缓冲液A(20mM MES/5mM MgCl2 pH6)洗柱，直至通过色度蛋白试验(Biorad 蛋白试验)检测不到蛋白级分。IL-4用下列洗脱缓冲液依次洗脱。洗脱液1 缓冲液 C(50mM Tris-Cl/10mM EDTA pH8)洗脱液2 :EN1. 0(50mM Tris-Cl/10mM EDTA/1. 0 M NaCl pH8)洗脱液3 :EN2. 0 (50mM Tris-Cl/10mM EDTA/2. 0 M NaCl pH8)用银染SDS PAGE 检测洗脱级分，采用 4-20% Tris-Glycine 胶(Invitrogen)，并用IL-4 ELISA法监测(R&D Systems Duoset)。在缓冲液2和3中可检测到洗脱的IL-4。 通过SDS PAGE分析，90%的污染蛋白在该基本纯化步骤中被去除。收集含IL-4的DLC级 分，用离心过滤装置(Amicon Ultra, Millipore)浓缩至少于2ml，用于体积排阻色谱法。m ^ ^ DLC Wi ^ 用 Superdex 75 preparative grade 16/70 (Pharmacia^ Uppsala,Sweden)柱进行排阻色谱法(SEC)。重碳酸铵平流液按Iml/分钟速度流过。总 过柱时间为120分钟，峰值出现于40和100分钟之间。另外，可用50mM MES缓冲液(pH 5. 6) 按 1. 5ml/ 分钟流速过 Sephadex 200 preparative grade (Pharmacia、Uppsala、Sweden) 柱。此时，IL-4洗脱时间为20-100分钟之间。用银染SDS PAGE检测洗脱级分，采用4-20% Tris-Glycine 胶(Invitrogen)，并用 IL-4 ELISA 法监测(R&D Systems Duoset)。对于 Superdex柱SEC、IL-4洗脱时间约为65-70分钟间、而对于S印hadex柱SEC，则IL-4洗脱 时间约为75分钟。纯化的IL-4表观分子量为14kDa，用银染SDS PAGE检测纯度至少为95%。将含 IL-4的级分收集后，用离心过滤装置(Amicon Ultra、Millipore)浓缩于一小于2ml的柱 上。以8855 M-I cm-1的摩尔吸光系数检测280nm吸收值，纯化的IL-4浓度为507ug/ml。(d)人细胞表达的IL-5的生产与纯化(i)本发明的IL-5的生产第0 天，将转染的人胚肾细胞，如 HEK 293,HEK 293 cl8、HEK 293T、293 CEN4、HEK 293F、HEK 293FT、HEK 293E、AD-293 (Stratagene)、或 293A (Invitrogen)，按细胞数 3 X 107 接种于500cm2组织培养皿(Corning)中。每孔细胞加入90ml Dulbecco' s Modified Eagle' sMedium/Ham' s Nutrient Mixture F12 (DMEM/F12) (JRHBiosciences),
中预先加入 10% (v/v)热灭活的胎牛血清(FCS, JRH Biosciences) UOmM HEPES(Sigma)、 4mM L-谷氨酸盐(Amresco)和 1% (ν/ν)青链霉素(JRH Biosciences)。也可用 10% (ν/ ν)热灭活的供体牛血清(DCS、JRH Biosciences)代替不含HEPES的FCS。第一天，用磷酸钙进行转染。转染前，用120ml新配的加入上述补充物的DMEM/F12 对每个培养板换液。制备磷酸钙/DNA沉淀物将UOOyg pIRESbleo(Invitrogen)含人 IL-5基因的质粒DNA和3000或3720 μ 1 2. 5Μ CaC12加入无菌Η20，使总量至30ml (溶液 A)。IOml移液管逐滴将30ml溶液A加入2 χ HEPES缓冲盐溶液(HBS)(溶液B)。加液过 程中，用溶液B轻吹气泡。25°C漩涡孵育混合液20分钟，混合液也可在无漩涡下孵育。将 12ml混合液逐滴加入每个孔。4小时后去除含转染液的培养基，每培养板加入IOOml含10% (ν/ν)热灭活供体牛血清(DCS、JRH Biosciences) UOmM HEPES、4mM L-谷氨酸盐、(ν/ ν)青链霉素和3. 5mM HCl、pH7的DMEM/F12。37°C孵育过夜。第二天，收集DMEM/F12培养基上清，将IOOmM PMSF(1% (ν/ν))和500mM EDTA(1% (ν/ν))加入收集的培养基。分别用50ml无血清DMEM/F12洗培养板中培养物两次，每培养 板加入100ml新鲜无血清DMEM/F12培养基(DMEM/F12培养基中补入40mM N-乙酰-D-甘 露糖胺、IOmM L-谷氨酸盐、4. lg/L甘露糖、(ν/ν)青链霉素和ITS溶液(5mg/L牛胰岛 素、5mg/L部分铁离子饱和的铁传递蛋白及Syg/ml硒)(Sigma).此外，补充物中可含40mM N-乙酰-D-甘露糖胺、7mM L-谷氨酸盐、0.5g/L甘露糖和(ν/ν)青链霉素。37°C孵育 过夜。第3天，收集DMEM/F12培养基，每个培养板加入含第二天所用补充物的100ml新鲜无血清DMEM/F12培养基。收集的培养基中加入IOOmM PMSF(1% (ν/ν))及500mM EDTA (1 % (ν/ν))，混勻后 4°C保存。第4天，收集培养板中的DMEM/F12培养基。收集的培养基中加入IOOmM PMSF (1% (ν/ν))及500mM EDTA (1% (ν/ν))。取出5ml混合液进行ELISA检测，剩余的混合液与第3 天收集的无血清液体混合。在用0.45mm低蛋白结合滤器(Durapore、Millipore)去除颗粒 前，向混合液加入1/10体积的200mM MES/50mM MgCl2 pH6，使其pH值为6。该混合液可立 即使用或置-70°C保存。(ii)本发明的IL-5的纯化用切向流式滤器(TFF)装置(PeliconXL, Ultracell, Millipore)将 1 升过滤的 细胞培养上清浓缩20倍。将样品以150ml/分钟速度通过150cm2的再生纤维素膜，用5KDa 为标准分子量分离点直至样品被浓缩为50ml。为使浓缩样品完全过滤，用额外的等量20mM Tris-ClpH 8. 5缓冲液继续浓缩至另一 50ml。也可用额外的等量的50mM HEPESpH 8继续 浓缩至另一 50ml，以使浓缩样品完全过滤。完全过滤的步骤重复2 (如用Tris缓冲液)或 3次(如用HEPES)至最终浓缩至50ml。用 20mM Tris-Cl pH8. 5(Sigma)预平衡Macropr印-Q 柱(Bio-RadLaboratories)， 通过阴离子交换色谱(AEC)将浓缩的细胞培养上清从TFF过柱纯化IL-5。用线性梯度的从 20mM Tris-Cl pH8. 5 至含 IM NaCl 20mM Tris-Cl pH8. 5 将结合的 IL-5 从柱上洗脱。此外， 也可用 50mM HEPES pH8 (Sigma)预平衡的 Uno S12 柱(Bio-RadLaboratories)进行阴离子 交换色谱。用 ELISA 和 ID SDS PAGE (4-20% gradient Tris-Glycine gels (Invitrogen)) 分析所得级分的表观分子量和纯化程度，用抗IL-5 ELISA(R & D Systems)定量。用 Superdex 75 preparative grade 16/70 (Pharmacia、Uppsala、Sweden)柱通 过体积排阻色谱法(SEC)对含IL-5的级分进一步纯化。对于某些实验，可在SEC前用离 心过滤装置(Amicon Ultra、Millipore)将级分浓缩至约2ml。对于SEC、1 %重碳酸铵平 流液流速为Iml/分钟。总过柱时间为120分钟，峰值为40-100分钟之间。此外，50mMl χ Dulbecco，s 磷酸盐缓冲盐液(DPBS 修正)(JRH Biosciences)可作为 Superdex 75 preparative grade 16/70 preparative grade (Pharmacia、Uppsala、Sweden)平流液，流 速为1. 5ml/分钟。此时，IL-5洗脱时间为20-100分钟。可用银染SDS PAGE (4-20% Tris-Glycine 胶(Invitrogen))和 IL-5 ELISA(R & D Systems)检测洗脱级分。用重碳酸铵缓冲液时，IL-5洗脱时间为50-65分钟；用DPBS修 正缓冲液时，IL-5洗脱时间为45分钟。含IL-5的级分可用离心过滤装置(Amicon Ultra、 Millipore)浓缩至少于2ml，也可用HiPr印26/10快速脱盐柱(Pharmacia、Uppsala、 Sweden)脱盐至 PBS。化的IL-5表观分子量为16_36kDa之间，用银染SDS PAGE(用4_20 % Tris-Glycine胶(Invitrogen))检测纯度至少为99%。以8605 M-Icm-I的摩尔吸光系数 检测280nm吸收值，纯化的IL-5浓度为206ug/ml。实施例3 (a)本发明的GM-CSF的表征(i)双向聚丙烯酰胺电泳由实施例2 (a)收集的样品通过透析或脱盐柱(Pharmacia HR10/10 FastDesalting Column)更换缓冲液到再纯化的(18 MOhm)水中，并且用SpeedVac浓缩器干燥。 此外，可用最新的TCA或丙酮沉淀技术处理收集到的样品。然后，样品再溶于240ml MSD缓 冲液中(5M尿素、2M硫脲、65mM DTT,2% (w/v)CHAPS,2% (w/v)硫代甜菜碱3_10、0. 2% (ν/ ν)载体两性电解质、40mM Tris.O. 002% (w/v)溴酚蓝、水)并且在15000g下离心8分钟。等电聚焦(IEF)用预制Ilcm或预制17cm凝胶pH3-10固相pH梯度IEF胶条 (BioRad)进行。IEF胶条在封闭管中的样品中在室温下再水化至少6小时。IEF胶条置于 聚焦室中并用液状石蜡覆盖。IEF对Ilcm胶条在100V 1小时，200V 1小时，600V 2小时， 1000V 2小时，2000V 2小时，3500V 12小时和100V 12小时以上进行，或对17cm胶条85kV 数小时进行(使用相同的V斜升过程)。接下来的等电聚焦，胶条被还原并被烷基化，在应用到第二向凝胶前。胶条在 lXTris/HCl ρΗ8· 8、6M 尿素、2% (w/v) SDS,2% (v/v)甘油、5mM 三丁基氧膦(TBP) ,2. 5% (ν/ν)丙烯酰胺中培养至少20分钟。Ilcm胶条在第二向分离，通过Criterion预灌注(11 X8cmX 1謹厚)10-20 %的 Tris glycine 梯度凝胶(BioRad)。17cm胶条分离为 17X 17cm、l. 5mm厚，自灌注的 10-20% 的Tris glycine梯度凝胶。Precision或Kaleidoscope分子量标记(BioRad)也用于凝 胶。胶条放入槽中，使用含有作为行迹染料的溴酚蓝的0. 5%的琼脂糖。SDS-PAGE用 Criterion或Protean II 电泳系统(BioRad) (200Vlh(直到缓冲液前 进到即将脱离凝胶末端)用于Ilcm凝胶和15mA恒定电流每凝胶21h用于17cm凝胶)进 行。所用的缓冲液为192mM甘氨酸，0. 1% (w/v) SDS,24. 8mM Tris碱在pH8. 3下。完成后的第二向凝胶固定30分钟-在10%的甲醇(MeOH)和7%乙酸(HAc)中过 夜。然后，凝胶用Sypro Ruby凝胶染料(BioRad)染色至少3小时并且用10%的MeOH和
的HAc脱色至少30分钟。可选的，固定后，凝胶用De印Purple荧光染料染色。凝胶在 300mM Na2C03>35mM NaHCO3培养2X30分钟，然后，在1 200稀释的De印Purple染料在 黑暗中培养至少1小时。然后，凝胶通过在10 %的MeOH、7 %的HAc中培养2 X 15分钟脱色。 在两个过程中，凝胶用FX激光光密度计(BioRad)和合适的滤光器成像。(ii)用图像分析软件分析2维蛋白电泳图软件ImaReJ(http://rsb. info, nih. Rov/ii/)用于分析各凝胶上蛋白斑点的相 对强度。对凝胶的选定区域的斑点进行光密度法并且用蛋白质斑点的凝胶的合适区域进行 背景消减。计算各蛋白斑点的相对百分比强度并且通过归一化使所有斑点的强度的结合值 达到100 %，相对于凝胶中的其他斑点，各蛋白质斑点的强度被测定。各个斑点的分子量通过斑点和凝胶底之间的各个距离的测量和与也用于凝胶的 Precision或Kaleidoscope分子量标记显示的距离的比较来测定。4th多项式的指数函数 适用于精确的标记用于分别的蛋白质斑点定位补差。用该方法，各个斑点的分子量可以准 确地确定。同工型的电荷(pKa值)用ImageJ通过测量斑点和各凝胶左侧的分别的距离确 定。因为胶条的Pl值和凝胶的物理距离之间的关系是线性的，相应于同工型斑点的不同 PKa值的pi值容易被确定。胶上的主要蛋白定位相应的GM-CSF同工型。低强度点可能是GM-CSF或低水平污染，但是由于低强度而不能被PMF确认。对胶的检测发现本发明的GM-CSF有10-30个同 工型。表9显示这些同工型的主要特点pl值(士 1.0)、表观分子量(士20%)和相对强度 (实际值士20%，或总数士2%，不论那个更大)。数值表反应含点胶所选区域中的测量强 度中心，因此只反应一次特定读图时所选区域的pi和分子量。考虑到2D胶中蛋白点固有 的体积和位置上的可变性，以表9中所列数据为基础，分子pi值的范围为2-7 ；分子表观分 子量的范围为16-40kDa。表9GM-CSF同工型的分子量和pi值 (ii)单向聚丙烯酰胺电泳将从例2(a)收集的样品干燥，再用60 μ 1 ID样品缓冲液(10%甘油、0. 1% SDS, IOmM DTT,63mM tris-HCl)重溶，100°C 加热 5minute。为 了进行 PNGaseF 处理，取 30 μ L 等 份的样品并加入ΝΡ40至终浓度达0. 5% JnAPNGase Fl μ L、及唾液酸酶A(neuramidase)、 0-聚糖酶、β (1-4)-半乳糖苷酶和β-N-乙酰葡糖胺酶各1 μ L。处理的和未处理的样品 在37°C培养3小时。处理的和未处理的样品在预制Tris凝胶，例如Tris 4-20%梯度凝胶 (BioRad)或Tris HCl梯度凝胶(Invitrogen)中电泳。精确分子量标记(BioRad产品目录 编码 161-0363)也用于凝胶。Criterion 4-20%或 18%凝胶用于 ID SDS-PAGE(BioRad 产 品目录编码345-0033 或 345-0024)。SDS-PAGE 通过Mini Protean II 或 Criterion 电泳系统(BioRad)在 200V 下进行 约1小时，或直至缓冲液前沿快要跑出胶边缘为止。使用的缓冲液为192mM甘氨酸、0. 1% (w/v) SDS,24. 8mM Tris 碱在 pH8. 3 下。将完整胶在10% MeOH和7% HAc中固定30分钟。然后用Sypro Ruby胶染色剂 (BioRad)染色至少3小时，再用10% MeOH和7% HAc脱色至少30分钟。此外，也可用Deep Purple(Amersham)按操作指示进行胶染色。用FX激光显像密度仪(BioRad)在适当的滤光 片下对胶显像。N连接寡糖释放(PNGase处理)后，GM-CSF的表观分子量(如SDS-PAGE所示) 为12-30kDa。N-连接和0-连接寡糖释放(糖苷酶处理)后，GM-CSF的表观分子量(如 SDS-PAGE 所示)为 ll-25kDa。[1523](iii)N-末端测序将上述制备胶(可来自于二维或一维胶)上的蛋白条带切下，置于0.5ml试管中， 加入IOOml抽提缓冲液(IOOmM醋酸钠，0. 1% SDS,50mMDTT ρΗ5· 5)。凝胶切片在37°C振荡 培养16小时。上清液按照厂商技术说明书用于ProSorb膜(ABI)并且按照厂商技术说明 书用自动化494蛋白质测序仪(Applied Biosystems)测序。获得的序列用于确定蛋白质 的同一性。(iv)肽质量指纹谱蛋白质条带从上述制备的凝胶切下(从双向凝胶或单向凝胶)并且用25 μ 1洗涤 缓冲液(在50mM NH4HCO3中有50%乙腈)洗涤。凝胶切片在室温下保留至少1小时并且经 真空离心30分钟干燥。凝胶切片和12 μ 1胰岛素溶液(20 μ g胰岛素，1200 μ 1 NH4HCO3)置 于各样品槽中并且在4°C培养1小时。除去余下的胰岛素溶液并且加入20 μ 1 50mMNH4HC03O 混合物在37°C轻轻振荡过夜培养。浓缩肽样品并用C18Zip-TipS(Millip0re、Bedf0rd、MA) 或含有Poros R2 (PerseptiveBiosystems,Framingham.MA)层析树脂的预制微型柱脱盐。结 合肽在0.8μ 1基质溶液(α-氰基-4-羟基肉桂酸(Sigma)、8mg/ml在70%乙腈中/1%甲 酸)中直接洗脱到目的平板中。胰蛋白酶的肽质量指纹谱通过使用Perseptive Biosystems Voyager DE-STR的基质-辅助激光解吸/解吸电离飞行时间质谱测定(MALDI-TOF MS)产 生。谱图通过使用20kV加速电压的反射模式获得。质量校准使用胰岛素自溶峰，2211. IlDa 和842. 51Da作为内标进行。由肽质量指纹谱(PMF)产生的数据用于确定蛋白质同一性。搜 索(主要的Homo sapien (人类)和哺乳动物条目)在数据库中进行，例如the SffISS-PROT 和 TrEMBL，经过 PeptIdent (www, expasy. ch/tools/peptident. html)程序。识别参数包括 0. IDa允许误差的肽质量，每个肽逃脱胰蛋白酶裂解的最大片段，和蛋氨酸亚砜和半胱氨 酸_丙烯酰胺修饰。识别基于匹配的肽质量编号和这些肽覆盖的氨基酸序列的总百分比， 在其他数据库输入比较。一般的，具有至少30%总序列覆盖的肽质量对于确定同一性是必 须的，但是非常低和高质量的蛋白质，和由这些蛋白得到的蛋白质片段，不可能总是满足这 些标准，因此需要进一步识别。无确定结果的或无蛋白同一性之处可以由MALDI-TOF PMF分析获得，保留的 肽混合物或从复制凝胶切下的相同的斑点经胰蛋白酶消化并通过电喷雾离子化串联 MS(ESI-MS/MS)分析。为了 ESI-MS/MS，肽由 Poros R2 微型柱上用 1-2 μ 1 70% 乙腈， 甲酸直接洗脱到硼硅电喷雾针头(Micromass、Manchester、UK)。串联MS用Q-Tof混合 型三级/正交加速TOF质谱仪(Micromass)进行。含有样品的电喷雾针头包埋在来源和 用毛细管电压900-1200V获得的稳定流中。进行先驱离子扫描以检测混合物中肽的质量 和电荷比值(m/z)。各个个别的先驱离子的m/z挑选出来用于断裂并且用18-30eV碰撞 能量的氩气碰撞。碎片离子(对应来自前体肽的氨基酸的缺失)被记录并用MassLynx Version3. 4 (Micromass) & ||。 M-Slii^ljfflilfflMiissSeq(Micromiiss)禾呈;！5白勺 y_ $ b_ 畠 子‘梯度’系列的质量差异推断出来并且通过手工翻译确定。然后，肽序列用于搜索NCBI 和TrEMBL数据库，使用BLASTP程序“short nearly exact matches”。两个配对肽的最小 值对于提供给定的同一性的确信是必须的。凝胶斑点的同一性被证实是IL-2。胶上的点被证实为GM-CSF。此外，胰蛋白酶肽聚集处发现的IDa的变化说明人GM-CSF理论氨基酸序列中2NX(S/T/C)模体的天冬酰胺残基(N)转变为天冬氨酸(D)。这符合PNGaseF可将移除的相 关N连接寡糖上的N诱导为D残基。因此证实本发明的GM-CSF N-连接糖基化位点为N-44 和N-54(由信号序列起始处开始编号)。(b)本发明中IL-3的表征(i) 二维聚丙烯酰胺电泳用实施例3(a) (i)的方法处理和分析实施例2 (b)中收集的样品。胶上主要的蛋 白点对应IL-3的同工型。低强度点可能为IL-3或低水平污染，但是由于强度低而不能用 PMF证实。通过对胶进行观察发现，IL-3的同工型为5-15个。表10显示这些同工型的主 要特点pl值(士 1.0)，表观分子量(士20%)，和相对强度(实际值士20%，或总数士2% present，不论那个更大)。数值表反应含点胶所选区域中的测量强度中心，因此只反应一 次特定读图时所选区域的Pl和分子量。考虑到2D胶中蛋白点固有的体积和位置上的可 变性，以表10中所列数据为基础，分子pi值的范围为3. 5-7. 5 ；分子表观分子量的范围为 15-35kDa。表 10IL-3同工型的表观分子量与pi值 (ii) 一维聚丙烯酰胺电泳用实施例3(a) (ii)的方法处理和分析实施例2 (b)中收集的样品。N连接寡糖释放(PNGase处理)后，IL-3表观分子量(如SDS-PAGE所示)为10_25kDa。(iii)N-连接蛋白序列本发明的IL-3N末端序列由实施例3(a) (iii)所述方法检测。(iv)肽质量指纹实施例3(a) (iv)中的方法检测本发明的IL_3肽质量指纹。胶上的点被确认为IL-3。(C)本发明的IL-4的表征(i) 二维聚丙烯酰胺电泳用实施例3(a)⑴的方法处理和分析实施例2 (c)中收集的样品。胶上主要的蛋白点对应IL-4的同工型。通过对胶进行观察发现，IL-4的同工型 为1-3个。表11、12显示这些同工型的主要特点pl值(士 1.0)，表观分子量(士20%)，和 相对强度(实际值士20%，或总数士2% present，不论那个更大)。数值表反应含点胶所 选区域中的测量强度中心，因此只反应一次特定读图时所选区域的Pl和分子量。考虑到2D 胶中蛋白点固有的体积和位置上的可变性，以表11、12中所列数据为基础，分子pi值的范 围为8-11 ；分子表观分子量的范围为15-20kDa。表11IL-4同工型的表观分子量与pi值 表 12IL-4同工型的表观分子量与pi值 ( ) 一维聚丙烯酰电泳实施例2(c)所收集的样本的处理和分析如上面的实施例3(a) (ii)所述。N连接 寡糖释放(PNGase处理)后，IL-4表观分子量(如SDS-PAGE所示)为10_20kDa。N连接和 0连接寡糖释放(分别由PNGase和糖苷酶混合物处理)后，IL-4表观分子量(如SDS-PAGE 所示)为10-18kDa(iii)蛋白质的N-末端测序本发明的IL-4N末端序列由实施例3(a) (iii)所述方法检测。(iv)肽质量指纹实施例3(a) (iv)中的方法检测本发明的IL_4肽质量指纹。胶上的点被确认为IL-4。胰蛋白酶肽聚集处发现的IDa的变化说明人IL-4理论氨基酸序列中NX(S/T/C) 模体的天冬酰胺残基(N)转变为天冬氨酸(D)。因此证实本发明的IL-4N-连接糖基化位点 为N-62 (由信号序列起始处开始编号)。(ν) 二硫键的检测用胰岛素(酶蛋白=1 50)在50mM NH4HCO3中37°C处理本发明的IL-4过 夜。将一半混合物脱水干燥后重溶于水。将0.5yg蛋白等分的该溶液注入装了 C18柱 (Zorbax C18，150X0. 5mm，5u)的 Agilent XCTUltra LC-MS，该柱以 0. 1 % 甲酸校正的乙 腈/水作为流动相。用0% -90%的乙腈以12 μ 1/分钟梯度洗柱45分钟，将肽段洗脱。 Data-dependentAuto MSn将质谱设置为正离子模式。肽段通过二硫键相互连接，可根据它 们分子量总和减掉两个H，用MS前体扫描检测。然后用MS/MS检测其结构。用胰蛋白酶消 化(lug in 25 μ 1 0. IM NH4HCO3)加二硫苏糖醇(DTT，0. 1Μ，3μ 1)避光作用1小时，再用 乙酰胺(0.5Μ，3μ1)同样处理，可进一步确认二硫键。如二硫键连接蛋白消失可进一步明 确二硫键的存在。此外，如上述方法不能检测出二硫键，本发明的蛋白又是糖基化的，则需用上述实 施例3(a) (ii)所述方法通过酶作用去糖基化后再行检测。因检测出二肽27-36 和 151-153，46-61 和 89-99，及 67-71 和 113-126 对应质谱， 说明本发明的IL-4包含3个二硫键，分别位于Cys-27和Cys-151, Cys-48和Cys-89，及 Cys-70和Cys-123。当减少肽段样品或将肽段烷化后，这些质谱消失。(d)本发明的IL-5的表征(i) 二维聚丙烯酰胺电泳用实施例3(a)⑴的方法处理和分析实施例2 (d)中收集的样品。胶上主要的蛋白点对应IL-5的同工型。低强度点可能为IL-5或低水平污染，但 是由于强度低而不能用PF证实。通过对胶进行观察发现，IL-5的同工型为15-25个。表 13、14显示这些同工型的主要特点pl值(士 1.0)，表观分子量(士20% )，和相对强度(实 际值士20%，或总数士2% present，不论那个更大)。数值表反应含点胶所选区域中的测量强度中心，因此只反应一次特定读图时所选区域的Pl和分子量。考虑到2D胶中蛋白点 固有的体积和位置上的可变性，以表13、14中所列数据为基础，分子pi值的范围为4-9 ；分 子表观分子量的范围为15-25kDa。表 13IL-5同工型的表观分子量与pi值 表14IL-5同工型的表观分子量与pi值 (ii) 一维聚丙烯酰电泳用实施例3(a) (ii)的方法处理和分析实施例2 (d)中收集的样品。N连接寡糖释放 (PNGase处理)后，IL-5的表观分子量(如SDS-PAGE所示)出现两条带一条位于ll_16kDa 之间，另一条位于15_25kDa之间。N连接和0连接寡糖释放(分别由PNGase和糖苷酶混合 物处理)后，IL-5的表观分子量(如SDS-PAGE所示)出现两条带一条位于10_15kDa之 间，另一条位于15-22kDa之间。(iii)N末端序列[1578]本发明的IL-5N末端序列由实施例3(a) (iii)所述方法检测(iv)肽质量指纹实施例3(a) (iv)中的方法检测本发明的IL-5肽质量指纹。胶上的点被确认为IL-5。实施例4(a)本发明的GM-CSF的氨基酸、单糖、寡糖、磷酸盐、硫酸盐和同工型构成(i)用于氨基酸、单糖、寡糖、磷酸盐和硫酸盐分析的样品的制备为了单糖和寡糖糖基化和磷酸化和硫酸化翻译后修饰的鉴定，首先通过水解或 酶的方法从多肽主链上将糖基移除。样品缓冲液组分也被除去，并用水置换以消除在分 析开始前水解和酶解反应的抑制作用。PBS中纯化的GM-CSF溶液通过4升去离子超滤水 (ISMOhm)大规模透析4天，每天换液两遍，用额定截留分子量(NMWC) 5KDa的再生纤维素透 析膜(Spectrapore)。透析后，用 Savant Speed Vac (New York、USA)干燥溶液。然后，干 燥过的样品用2ml去离子超滤水(ISMOhm)重悬并且分成各部分用于各种分析。(ii)通过气相水解方法的氨基酸组成成分分析样品中的氨基酸用由6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯(AQC) 的柱前衍生法进行分析。分离稳定的荧光氨基酸衍生物并且通过反相(ClS)HPLC纯化。操 作根据Waters AccQTag氨基酸分析方法进行。取100 μ 1 GM-CSF制品的样品并在Speed Vac中干燥。然后，干燥的样品在110°C 水解24小时。水解后，在如下的衍生之前样品再次干燥。干燥样品再溶于IOyL氨基酸内 标(α -氨基丁酸、ΑΑΒΑ)，加入35 μ L硼酸盐缓冲液之后加入15 μ L AQC衍生试剂。反应混 合物在恒温孵育器中在50°C加热12分钟。衍生氨基酸样品转入HPLC系统的自动采样器， HPLC系统包括串联的Waters Alliance 2695分离组件，Waters474荧光探测器和Waters 2487 Dual λ吸光率探测器。控制和分析软件是Waters Empower Pro Module (Waters Corporation、Milford.MA、USA)。样品通过 Waters AccQTag 柱(15cmX3. 9mm ID)，使用本 领域已知的色谱参数(例如合适的洗脱液和梯度流)。(iii)中性和氨基单糖组成分析取100 μ 1两种GM-CSF制品的样品并用两种不同的方式处理以释放单糖。每种处
理方法各三份。1.用2Μ的三氟乙酸(TFA)加热到100°C水解4小时以释放中性糖(半乳糖，葡萄 糖，岩藻糖和甘露糖)。2.用4M的HCl加热到100°C水解4小时以释放氨基糖(N-乙酰-氨基半乳糖，
N-乙酰-氨基葡糖)。所有的水解产物用Speed Vac系统冻干，再溶于200 μ 1含有0. 8nmol内标物的水 中。用于中性和氨基糖的内标物是2-脱氧-葡萄糖。然后，样品在IOOOOg下离心30分 钟以除去蛋白质碎片。上清液转入新的试管并通过高PH阴离子交换层析分析，使用LC 50 系统和GP50泵和ED50脉冲电流探测器(Dionex Ltd) 一起。中性和氨基糖分析用Dionex CarboPac PA-20柱进行。用IOmM等强度氢氧化物浓缩物洗脱20分钟以上。该过程用Dionex EG50洗脱发生系统完成。(iv)酸性单糖组成分析[1595]取100 μ 1 GM-CSF制品的样品并且用如下方法处理以释放唾液酸单糖。处理三份。样品用0. IM TFA在80°C水解40分钟以释放N-乙酰和N-羟乙酰基神经氨酸。用 Speed Vac冻干水解产物，再溶解于200 μ 1含有0. 8nmol内标物的水中。用于分析唾液酸 的内标物是乳糖酸。然后，样品在10、000g下离心30分钟以除去蛋白质碎片。将上清液转 入新的试管并且通过高PH阴离子交换层析分析，使用Dionex LC 50系统和GP50泵和ED50 脉冲电流探测器一起。唾液酸分析用DionexCarboPac PAl进行，使用本领域已知的色谱参 数(例如合适的洗脱液和梯度流)。(ν)寡糖组成的分析为了分析寡糖组成，取300μ 1两种IL-2制品样品三份，并按照如下方法处理。用酶肽-Ν4-(Ν-乙酰- β -D-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶(PNGase)完成N-连接 寡糖的释放。l/5th体积的变性溶液(2% SDS(Sigma)/l M β _巯基乙醇(Sigma))加入样 品中。样品加热到100°C 5分钟。l/10th体积的15% Triton-XlOO(Sigma)加入到样品中。 样品轻轻混合并且使其冷却至室温。加入25单位的PNGase (Sigma)并且在37°C培养。通过β -消除的方法完成0-连接寡糖的释放。体积的4Μ四氢硼酸钠(新制 的)(Sigma)溶液加入到样品中。1/2体积的0. 4M NaOH(BDH,HPLC grade)加入到样品中。 样品在50°C下培养16小时。样品在冰中冷却并且将1/2体积的0. 4M乙酸(Sigma)加入到 样品中。N-连接和0-连接样品进一步处理以除去缓冲液组成，使用CarboPac graphitised carbon SPE柱。柱平衡和洗脱条件如下。柱用1个柱体积80% ν/ν乙腈 (Sigma)预平衡，然后用两个柱体积的水平衡。样品在重力流下装柱并且用两个柱体积的 H2O冲洗。为了洗脱中性寡糖，2ml 50% ν/ν乙腈用于柱中。为了洗脱酸性寡糖，2ml 50% ν/ν乙腈/0. 1% ν/ν甲酸用于柱中。任何保留的寡糖通过加入2ml 80% ν/ν乙腈/0. 1% ν/ν甲酸进行洗脱。由SPE柱分离的含有中性或氨基N-连接寡糖和中性或氨基0-连接寡糖的级分用 Speed Vac干燥。样品再溶解于200μ 1水，并且通过高pH阴离子交换层析分析，使用Dionex LC 20系统和GP50泵和ED50脉冲电流探测器一起。中性和氨基寡糖的分析是用CarboPac PA100柱和本领域已知的色谱参数(例如合适的洗脱液和梯度流)进行的。(vi)硫酸盐和磷酸盐组成的分析硫酸盐/磷酸盐分析基本上通过由Harrison和Packer (Harrison and Packer Methods Mol Biol 125 :211_216、2000)描述的方法进行。取100 μ 1 GM-CSF制品的样品用于硫酸盐/磷酸盐分析，并且在4Μ HCl中在100°C 下水解4小时。通过在Speed Vac中干燥样品除去HCl。然后，样品再溶解于200 μ 1 H2O0 24μ 1样品注入带有GP50泵和ED50脉冲电流探测器的Dionex LC 50系统中。通过Dionex IonPacASll阴离子交换柱进行分离，使用本领域已知的色谱参数(例如合适的洗脱液和梯 度流)。用Dionex自我再生阴离子微膜抑制器(SRMS-I)中和氢氧化物离子并且SOjP PO4 离子用电导监测器检测。(vii)蛋白质同工型的进一步分离用薄膜阴离子交换柱进行GM-CSF同工型的进一步分离。合适的样品体积，例如，24μ 1，通过 ProPac SAX-10 柱(Dionex Ltd)分离，使用带有 UV-Vis 检测器(Dionex Ltd) 的Dionex SUMMIT系统。分离用合适的洗脱液和本领域已知的梯度进行。GM-CSF同工型在 不同型的峰中发现被洗脱。(viii)结果氨基酸组成将GM-CSF水解，用上述反相高效液相色谱法测氨基酸组。结果表示为重量数和各 氨基酸占该序列的百分比(表15).表15 单糖将GM-CSF氨基酸骨架上的各个单糖水解掉，用高pH阴离子交换层析(HP AEC)进 行后面组分的分析。用GalNAc和3倍甘露糖分别对检测结果进行标准化(表16-18)。表 19为对三种标本检测结果的汇总。表16 表17 表18 表19 考虑到上述色谱分析过程固有可变性，当用GalNAc标准化后，本发明的GM-CSF 中单糖和唾液酸成分为1 0.1-1. 5海藻糖，1 2-12GlcNAc,l 1.0-6.0半乳糖， 1 1.0-6.0甘露糖及1 0-3.0 NeuNAc ；当用3倍甘露糖为标准，为3 0.1-2. 5海藻糖， 3 0. 5-2. 5 GalNAc, 3 5. 0-10. 0 GlcNAc, 3 2. 0-5. 半乳糖及 3 0-3. ONeuNAc。氨基酸组分与单糖、磷酸盐及硫酸盐的数据组合后列于表20。考虑到上述色谱分 析过程固有可变性，本发明的GM-CSF酸性单糖成分百分比为大约6-11%，N连接寡糖酸性 百分比为大约27-41%，0连接寡糖酸性百分比为大约43-66%。表 20 (b)本发明的IL-3氨基酸、单糖、寡糖、磷酸、硫酸盐及同工型成分分析(i)用于氨基酸、单糖、寡糖、磷酸盐、硫酸盐和同工型分析的样品的制备PBS中的纯化的IL-3的溶液按照上述实施例4 (a) (i)处理。(ii)通过气相水解法分析氨基酸组成IL-3制品的样品按照上述实施例4(a) (ii)处理。(iii)中性和氨基单糖组成的分析IL-3制品的样品按照上述实施例4(a) (iii)处理。(iv)酸性单糖组成的分析IL-3制品的样品按照上述实施例4(a) (iv)处理。(ν)寡糖组成的分析IL-3制品的样品按照上述实施例4(a) (ν)处理。(vi)硫酸盐和磷酸盐组成的分析IL-3制品的样品按照上述实施例4(a) (vi)处理。(vii)蛋白质同工型的进一步分离对IL-3样品制品的处理如上面实施例4(a) (vii)所述。发现IL_3c同工型以不同峰的模式被洗脱。(Viii)结果单糖将IL-3氨基酸骨架上的各个单糖、硫酸盐和硫酸盐水解掉，用高pH阴离子交换层 析(HP AEC)进行后面组分的分析。用GalNAc和3倍甘露糖分别对检测结果进行标准化 (表21-23)。表24为对三种样品检测结果的汇总。应注意葡萄糖为常见污染物，其本身往 往不是N或0连接寡糖的成分。表21 表 22 表 23 表24 考虑到上述色谱分析过程固有可变性，当用GalNAc标准化后，本发明的IL_3中单 糖和唾液酸成分为1 2-6海藻糖，1 3-5GlcNAc,l 0.5-2半乳糖，1 0. 5-2甘露糖及 1 0-2 NeuNAc ；当用3倍甘露糖为标准，为3 5-16海藻糖，3 2-4 GalNAc, 3 9-14 GlcNAc, 3 3-6 半乳糖及 3 0.1-2 NeuAc0(c)本发明的IL-4的氨基酸、单糖、寡糖、磷酸盐、硫酸盐及同工型成分分析(i)制备氨基酸、单糖、寡糖、磷酸盐、硫酸盐及同工型分析样品用实施例4(a) (i)所述方法处理溶于PBS中的纯化的IL_4.( )通过气相水解法分析氨基酸组成IL-4制品的样品按照上述实施例4(a) (ii)处理。(iii)中性和氨基单糖组成的分析IL-4制品的样品按照上述实施例4(a) (iii)处理。(iv)酸性单糖组成的分析IL-4制品的样品按照上述实施例4(a) (iv)处理。(ν)寡糖组成的分析IL-4制品的样品按照上述实施例4(a) (ν)处理。(vi)硫酸盐和磷酸盐组成的分析IL-4制品的样品按照上述实施例4(a) (vi)处理。(vii)蛋白质同工型的进一步分离IL-4制品的样品按照上述实施例4(a) (vii)进行处理。(viii)结果将IL-4氨基酸骨架上的各个单糖、磷酸盐和硫酸盐水解掉，用高pH阴离子交换层 析(HP AEC)进行分析，以百分数与氨基酸组分数据列于表25。葡萄糖为常见污染物，其本 身往往不是N或0连接寡糖的成分。考虑到上述色谱分析过程固有可变性，本发明的IL-4 的N连接寡糖酸性百分比为大约0-30%。表25
1674](d)本发明的IL-5基酸、单糖、寡糖、磷酸盐、硫酸盐及同工型成分分析1675](i)制备氨基酸、单糖、寡糖、磷酸盐、硫酸盐及同工型分析样品1676]用实施例4(a) (i)所述方法处理溶于PBS中的纯化的IL-5.1677]( )通过气相水解法分析氨基酸组成1678]IL-5制品的样品按照上述实施例4(a)(ii)处理。1679](iii)中性和氨基单糖组成的分析1680]IL-5制品的样品按照上述实施例4(a)(iii)处理。1681](iv)酸性单糖组成的分析1682]IL-5制品的样品按照上述实施例4(a)(iv)处理。1683](ν)寡糖组成的分析1684]IL-5制品的样品按照上述实施例4(a)(ν)处理。1685](vi)硫酸盐和磷酸盐组成的分析1686]IL-5制品的样品按照上述实施例4(a)(vi)处理。1687](vii)蛋白质同工型的进一步分离1688]IL-5制品的样品按照上述实施例4(a)(vii)进行处理。1689](Viii)结果1690]氨基酸组分1691]IL-5水解，用上述反相高效液相色谱法测氨基酸组分(表26)。结果表示为重量
数和氨基酸占该序列的百分比(包括标准偏差(SD))。氨基乙酸为氨基酸分析中常见污染 物，可造成氨基酸组分的人为变化。考虑到这一点，结果与理论值是具有可比性的，除非我 们注意到丙氨酸(A)和天冬氨酸(D)的水平高于预期。表 26 单糖和硫酸盐 将IL-5氨基酸骨架上的各个单糖硫酸盐水解掉，用高pH阴离子交换层析(HP AEC)进行组分分析。用GalNAc和3倍甘露糖分别对结果进行标准化(表27-29)。表30为 三种样本结果的汇总。葡萄糖为常见污染物，其本身往往不是N或0连接寡糖的成分。我 们也注意到在半乳糖峰前沿有洗脱的污染物，这样半乳糖的水平就被人为提高，GlcNAc水 平也看起来较高。表27
第1轮的单糖组分单糖nmol/nmol 蛋白以GalNAc为标准以甘露糖为标准甘露糖2. 411. 173. 00NeuNAC0. 230. 110. 29NeuGly0. 000. 000. 00SO44. 779. 2523. 72 表 28
第2轮的单糖组分单糖nmol/nmol 蛋白以GalNAc为标准以甘露糖为标准海藻糖0. 720. 3 30. 87GalNAc2. 191. 002. 65GlcNAc9. 134. 1711. 02半乳糖3. 751. 714. 53葡萄糖4. 221. 935. 09甘露糖2. 481. 133. 00NeuNAC0. 260. 120. 32NouGly0. 000. 000. 00SO43. 025. 2913. 99表 29
第3轮的单糖组分 表30
单糖组分单糖nmol/nmol 蛋白以GalNAc为标准以甘露糖为标准最小最大最小最大最小最大海藻糖0. 000. 720. 000. 330. 000. 87GalNAc2. 062. 281. 001. 002. 502. 65GlcNAc8.499. 324. 094. 1710. 2111. 02半乳糖3. 753. 901. 651. 894. 134. 85葡萄糖4. 134. 841. 932. 135. 095. 31甘露糖2.412. 741. 131. 203. 003. 00NeuNAC0. 230. 270. 110. 120. 290. 32NeuGly0. 000. 000. 000. 000. 000. 00SO43. 024. 775. 299. 2513. 9923. 72 氨基酸组分数据与单糖、磷酸盐和硫酸盐数据共同按不同类别显示于表31。考虑到上述色谱分析过程固有可变性，当用GalNAc标准化后，本发明的IL-5中单糖、硫酸盐 和唾液酸成分为1 0-0. 5海藻糖，1 2-4. 5GlcNAc,l 1-2半乳糖，1 1-2甘露糖及 1 0.1-1 NeuNAc,l 5-10硫酸盐；当用3倍甘露糖为标准，为3 0-1海藻糖，3 2-3 GalNAc, 3 3_12GlcNAc，3 2-5 半乳糖及 3 0.2-1 NeuNAc, 3 12-24 硫酸盐。考虑到上述色谱分析过程固有可变性，本发明的IL-5唾液酸占单糖百分比为大 约2-10%，IL-5硫酸盐占单糖百分比为大约10-25%，N-连接IL-5寡糖酸性百分比为大约 25-50%, IL-5的0-连接寡糖酸性百分比为大约0-40%。表31 实施例5糖质量指纹谱用如实施例3的2D凝胶电泳技术分离本发明的蛋白质并且吸附到聚偏氟乙 烯(PVDF)膜上。斑点用一个标准量的蛋白质染料(胶体考马斯蓝、Sypro Ruby或De印 Purple)染色，并且同工型的相对量用光密度法定量。切离各个斑点并且用一系列去糖基化 酶和/或化学方法处理，视情况而定，以除去存在的寡糖，按照本说明书描述的方法。一旦 寡糖被除去，对其进行分离并且在使用石墨化碳柱和有机溶液(MeCN)梯度洗脱系统的液 相色谱-电喷雾质谱系统(LC-MS)中分析。产生的峰形产生了同工型中存在的寡糖的“指 纹谱”。进一步的，质谱系统对样品中存在的各种糖的质量产生信号，其通过用GlycoSuite 数据库的模式匹配以识别它们的结构。另外，各个质量峰可以多倍片段化以给出MSn光谱。 这些片段可以得到结构的预测，使用本领域已知的方法，例如，通过GlycosidIQ程序包的 使用。上述的分离、去糖基化和分析步骤均用非人细胞系统如大肠杆菌、酵母或CHO细 胞所表达的相应蛋白进行重复。发现相应的糖质量指纹显著不同。在结构水平，这样的结果 表明本发明的蛋白质和相应的非人细胞表达蛋白质具有不同模式(pattern)的聚糖结构。实施例6荧光辅助糖电泳用荧光辅助糖电泳实验(FACE protocols)获得靶分子的寡糖分布型。来自目的 细胞因子的寡糖用氢氧化铵从氨基酸主链水解，接着用荧光8-氨基萘基-1，3，6-三磺酸 (ANTS)标记。聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离种类和用于识别目的分子特有的寡糖分布型的 标准。进一步的，用依赖于荧光的飞行质谱(MALDI-T0F)的基质辅助激光解吸和电离-时 间和对各种糖的离子化特异的基质来识别寡糖。测定各种糖的质量并且用GlycoSuite数据库识别蛋白质结构。潜在的糖结构特征进一步通过串联质谱技术描述，其使得得到寡糖 存在和它们的相对量的部分的或者全部的特征描述。进一步的，重复使用通过2D凝胶电泳 识别同工型的方法以产生分离的各个同工型中存在的寡糖的分布型。实施例7QCM 禾口 SPR用石英晶体微量天平(QCM)或表面等离子共振(SPR)检测目的分子的结合特征和 活性。两种方法中，合适的分子受体用厂商描述的化学作用结合到晶片上。目的分子溶解于 合适的生物缓冲液中并使其通过缓冲液与芯片上的受体相互作用。通过改变振荡频率(在 QCM方法中)或通过改变芯片的光散射特性(在sra方法中)来测量晶片表面上的总蛋白 质质量的改变。然后，只用生物缓冲液处理芯片以观察到目的分子释放回溶液中。然后，受 体达到饱和和完全分离的速率用于计算目的分子的结合曲线。实施例8转基因宿主细胞系的产生(a)含有α -2,6-唾液酸转移酶的转基因宿主细胞系编码α-2，6-唾液酸转移酶(α 2，6 ST)的 cDNA 通过 PCR 由 poly (A)-primed cDNA 扩增。PCR产物连接到合适的载体中，例如pIRESpuro4或pCEP4，以产生α 2,6 ST质粒。对 克隆的cDNA测序并且通过与已经公开的α-2，6 ST cDNA序列比较证实其同一性。DNA测 序用已知的方法进行。哺乳动物宿主细胞，包括表达高水平目的分子的相同谱系的细胞株系(细胞 系-目的分子)用α 2，6ST质粒转染，其还携带抗生素抗性标记。通过抗生素存在下培养 细胞进行稳定的转染细胞的选择；收集转染后表现出抗生素_抗性的细胞株系并且用于细 胞内α2，6 ST活性的检验。为了分离表达α2，6 ST的单个细胞株系，细胞收集物通过如 Kronman(Gene 121 =295-304,1992)描述的限制稀释法克隆。单个的细胞株系被随机选择， 细胞扩增并且检测株系的a2，6 ST活性。洗涤细胞沉淀，在溶解缓冲液中重悬，并且在超声波降解前置于冰中。细胞溶胞产 物离心并且将澄清的上清液用于蛋白质浓度(经由已知方法)和唾液酸转移酶活性分析。 唾液酸转移酶活性通过已知方法，例如Datta et al. (J Biol Chem 270 =1497-1500,1995) 所描述的方法分析。从高表达α 2，6ST细胞系-目的分子细胞中纯化表达的目的分子并且进行体外和 /或体内半衰期生物测定(见实施例10)。来自高表达α2，6 ST细胞的目的分子与得自没 有经过任何转基因操作的相同亲本细胞系的目的分子或得自其他细胞系的目的分子相比， 表现出增加的体外和/或体内半衰期。(b)含有岩藻糖基转移酶的转基因宿主细胞系编码岩藻糖基转移酶(FT)的00嫩，例如？讥1、？肌21讥3、？肌41讥5、？肌61^7、 FUT8、FUT9、FUT10、FUT11，通过 PCR 由 poly (A)-primed cDNA 扩增。PCR 产物连接入合适的 载体中，例如pIRESpuro4或pCEP4，以产生alpha 2、6ST质粒。克隆的cDNA测序并且通过 与已经公开的FT cDNA序列的比较证实它的同一性。DNA测序用已知方法进行。人宿主细胞，包括表达高水平目的分子分子(细胞系-目的分子)的相同谱系的 细胞株系用FT质粒转染，其还携带抗生素抗性标记。通过在抗生素存在下细胞的培养进行稳定的转染细胞的选择；收集转染后表现出抗生素-抗性的细胞的株系并且用于细胞内FT 活性的检验。为了分离表达FT的单个细胞株系，细胞收集物通过限制稀释法克隆，如前述 的Kronman，1992所描述；单个细胞株系被随机选择，细胞扩增并且检测株系的FT活性。洗涤细胞沉淀，在溶解缓冲液中重悬，并且在超声波降解前置于冰中。细胞溶胞产 物离心并且澄清的上清液用于蛋白质浓度(经已知方法)和FT活性分析。FT活性通过已 知方法分析，例如 Mas et al. (Glycobiology 8(6) :605_13、1998)所描述的。表达的目的分子由高表达FT细胞系-目的分子细胞纯化。Lewis χ-特异性抗 体，例如L5和唾液酸化Lewis χ-特异性抗体，例如KM93，HECA493、2H5或CSLEX，用于检 测Lewis χ或唾液酸化Lewis χ结构的存在，依照本领域已知的方法，例如，如Lucka et al. (Glycobiology 15(1) :87，2005)详细描述的。或者，Lewis χ 或唾液酸化 Lewis χ 结构 的存在可以通过用合适的糖苷酶处理样品检测并且检测糖苷酶在参数上的影响，例如用MS 时的质量或用HPLC时的保留时间。糖质量指纹谱，如实施例5中描述的，也可以用于预测 Lewis χ或唾液酸化Lewis χ结构的存在。实施例9差别基因表达基因表达的差别可以用目的分子的目的细胞系分析。目的细胞生长到合适的密度 并且用一定范围的浓度的目的分子或缓冲液对照处理多个小时，例如，72小时。在不同的时间，进行RNA收获，纯化和逆转录，按照Affymetrix实验方案。然后， 制备标记的cRNA(例如生物素标记)并且与表达矩阵杂交，例如U133 GeneChips0然后洗 涤并且信号放大，GeneChips用GeneChip扫描仪(AfTymetrix)扫描，并且杂交强度和在不 同时间点的倍数变化信息用GeneChip software (Affymetrix)获得。目的分子诱导独特的基因表达并且导致与通过不同来源，例如E.coli、酵母或 CHO细胞产生的细胞因子或受体诱导的分布型相比不同的mRNA分布型。实施例10本发明的目的分子的半衰期的测定目的分子的半衰期在体外系统进行测定。包含目的分子的组合物混合到人血清/ 血浆中并且在一定温度培养一定时间(例如37度培养4小时，12小时等)。在该处理后保 留的目的分子的量通过本领域已知的ELISA法或斑点印迹法测定。保留的目的分子的生物 学活性通过由相关领域的技术人员选择的合适的生物鉴定法的进行来测定。所选择的血清 可以来自于多种人类血型(例如Α，Β，ΑΒ，0等)。目的分子的半衰期还在体内系统中进行测定。包含目的分子的组合物通过放射性 示踪剂标记(或其他方法)并且经静脉、皮下、后眼窝、肌内或腹膜内注射到为研究所选择 的物种中，例如，小鼠、大鼠、猪、灵长类或人。在注射后的时间点取血样并且对目的分子的 存在进行分析(通过ELISA法，斑点印迹法或通过三氯乙酸(TCA)-沉淀标记，例如放射性 计数)。含有产生自不同来源，例如E. coli，酵母，或CHO细胞的目的分子的组合物的比较 可以作为对照进行。实施例11本发明的目的分子的体内试验在此所描述的体内试验的个体受试者是温血脊椎动物，包括人。[1744]临床试验受到严格地控制以确保个体不置于不必要的风险中并且他们被充分地 告知他们在研究中的作用。优选的，为了补偿接受治疗的心理作用，治疗以双盲方式进行。志愿者随机分配入 对照或目的分子治疗组。进一步地，有关的临床医生对于给药给受者的治疗制度也是盲的， 以防止在他们的治疗后观察中存在偏见。用这种随机方式，各志愿者具有被给予新的治疗 或对照的相同的机会。志愿者接受目的分子或对照剂一段时间，同时，结合表现出的疾病状态或健康状 况的生物学参数在开始(任何治疗前的基线)，结束(在最终的治疗后)，和在研究期间规 律的间隔中被测量。该测量包括与治疗前水平相比的体液，组织或器官中目的分子的水平。 其他测量包括，但不限于，疾病状态或被治疗的健康状况的指标，体重，血压，疾病的药理学 指示剂的血清效价，例如特殊疾病指示剂或毒性和ADME (吸收，分布，代谢和排泄)测量。记录的各个病人的信息包括年龄(岁)，性别，身高(cm)，疾病状态或病的家族史 (是/否)，动机等级(少/中/大)和编号以及对于表现出的疾病或病的在先疗法的种类。参加该试验的志愿者是成年人，年龄在18至65岁并且加入试验的男性和女性的 人数大致均等。具有某些特征的志愿者对于对照剂和目的分子治疗平均分布。一般的，用 对照剂治疗的志愿者对治疗有很少的或没有反应，然而在试验结束时，用目的分子治疗的 志愿者显示出他们的疾病状态或病的指标趋向于阳性。实施例12(a)本发明的GM-CSF和非人系统表达GM-CSF生物活性的比较GM-CSF可诱导TF-I细胞增殖。在48孔板中，用0-10ng/ml GM_CSF37°C处理 30000/m TF-I细胞9天。用流式细胞仪计数细胞。用文献(Dedov et al. Apoptosis 8 399-406,2003)报道的 FACScan 流式细胞仪(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA)分析。CellQuest Software 分析结果。用不同的表达于Ε. coli表达的两种不同GM-CSF分子(R & D SystemsCat # 215-GM ；WH0#88/646)重复上述实验。曲线与吸光度拟合后，计算ED50，并用4元方程计算GM-CSF分子浓度值。本发明的GM-CSF 的 ED50 约为 0. 05-0. 08ng/ml，而 R&D SystemsGM-CSF 的 ED50 为(0. 4-0. 6ng/ml)，WHO GM-CSF(0. 4-0. 6ng/ml)，两者均表达于 E. coli (表 2)这样，本发 明的GM-CSF较E. coli表达的人GM-CSF的增殖活性强5_12倍。(b)本发明的GM-CSF和非人系统表达GM-CSF血清稳定性的比较用胎牛血清分别孵育本发明的GM-CSF和E. coli表达的GM_CSF(R&D Systems) 24 小时。按使用说明，用ELISA(R&D Systems DuoSet)检测减少的量。用例12(a)方法检测 GM-CSF生物活性。两种E. coli产生的GM-CSF的量减少水平相似(结果未示)。相比之下， 本发明的GM-CSF在血清中孵育24小时后任保持较高的生物活性(图3).(c)粒细胞和巨噬细胞克隆的增殖与分化据报道，GM-CSF可调节粒细胞和巨噬细胞克隆的增殖与分化。将200个TF-I细 胞接种于35mm培养皿中，用本发明的GM-CSF和E. coli表达的人GM-CSF分别处理细胞。 37°C、5%C02条件下孵育14天，计数克隆数。用IOOmm计数板在显微镜下计数克隆数。一 个克隆包括至少40个细胞。[1759]通过计数TF-I细胞，不同浓度[1. 25,2. 5,5ng/ml (ρ < 0.01)]本发明的GM-CSF 处理组产生的克隆数较E. coli表达的人GM-CSF多1. 5-2倍(图4)。(d)本发明的IL-3和非人系统表达IL-3生物活性的比较据报道，IL-3可诱导M-NFS-60细胞增殖。在48孔板中，用Ο-lng/ml本发明的 IL-3 37°C处理30000M-NFS-60细胞/ml 4天。用流式细胞仪计数细胞。对于流式细胞计 数，活细胞用 FACScan流式细胞测定仪(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA)用已经公开的方法(Dedov et al. Apoptosis 8 =399-406,2003)计数。数据分析 用 CellQuest Software 进行。用不同的表达于E. coli表达的两种不同IL-3分子(R&D SystemsCat # 203-IL ； WHO #91/510)重复上述实验。曲线与吸光度拟合后，计算ED50，并用4元方程计算IL_3分子浓度值本发明的IL-3 的 ED50 约为 0. 12-0. 18ng/ml，而 R & DSystemsIL-3 的 ED50 为 (0. 20-0. 30ng/ml)，WHO IL-3 (0. 20-0. 30ng/ml)，两者均表达于 E. coli。(图 5).这样，本 发明的IL-3较E. coli表达的人IL-3的增殖活性强1. 1-2. 5倍。(e)本发明的IL-4和非人系统表达IL_4生物活性的比较⑴对本发明的IL-4与非人系统(CH0 and Ε. coli)表达的IL-4进行检测。在96 孔板中，用 0-2ng/ml IL-4 在 37°C下孵育 TF-1 细胞(100000 cells/ml) 7 天。用 CellTiter 96 Aqueous One Solution细胞增殖实验(Promega)检测存活细胞。。在该分析中，存在于 电子耦合试剂(吩嗪硫酸甲酯)中的四唑盐化合物MTS(3-(4，5-dimethylthiaZ0l-2-yl)-5 -(3-carboxymethoxyphenyl)(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)被细胞生物还原为有 色甲腊产物。有色甲腊浓度通过用分光光度计(E Max precision microplate reader, MolecularDevices)在490nm下读出生成溶液的吸光度测定。用不同非人细胞表达的两种不同IL-4分子(R & D Systems Cat #204_IL，表达于 Ε. coli ；WHO #88/656，表达于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)重复上述实验。曲线与吸光度拟合后，计算ED5tl，并用4元方程计算IL-4分子浓度值。本发明的IL-4 的 ED50 约为 0. 024-0· 036ng/ml，而 R & DSystems IL-4 的 ED50 为 (0. 9-1. 3ng/ml，表达于 E. coli 细胞)，WH0IL-4 (0. 028-0. 042ng/ml，表达于 CHO 细胞)(图 6(a))。这样，本发明的IL-4较E. coli表达的人IL-4的增殖活性强25-54倍，较CHO表达 的IL-4强1. 75倍。(ii)为进一步检测标准细胞培养条件下的稳定性，37 □ C下本发明的IL-4与细 胞培养基(RPMI 1640，10%胎牛血清)孵育4天后，加入TF-I细胞。将0-2ng/ml本发明 的IL-4预孵育过的培养基加入96孔板中的TF-I细胞(200，000 cells/ml)。3天后，用 CellTiter 96Aqueous One Solution细胞增殖实验(Promega)检测存活细胞。在该实验中， MTS ((3- (4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)~2~(4-sulfopheny l)-2H-tetrazolium)作为一种四唑成分，在电子偶联剂(吩嗪氨甲蝶呤)存在时，可被细胞 降解为一种甲腊产物。甲腊的浓度可通过分光光度计(E最大精密微孔阅读器，Molecular Devices)读取490nm吸光度而得到。用一种E. coli(R & D Systems Cat # 204-IL)表达的人IL-4分子重复上述实验。曲线与吸光度拟合后，计算ED5tl，并用4元方程计算IL-4分子浓度值。细胞培养条件下，本发明的IL-4的ED50约为0. 24-0. 36ng/ml，而E. coli细胞表达的IL-4的ED50为 4. 7-7. lng/ml (图6(b))。这样，本发明的IL-4较E. coli表达的人IL-4诱导增殖能力强 13-30倍，表现出更高的细胞培养条件下的稳定性。(f)本发明的IL-5和非人系统表达IL-5生物活性的比较人红白血病细胞系TF-I对多种细胞因子应答。据报道，IL-5可诱导TF-I细胞增 殖。在96孔板中，用0-100ng/ml IL-5在37°C下孵育TF-1细胞(10000个/孔)68小时。用CellTiter 96 Aqueous One Solution 细胞增殖实验(Promega)计数细胞数。 在该实验中，MTS ((3- (4，5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)作为一种四唑成分，在电子偶联剂(吩嗪氨甲蝶呤)存在 时，可被细胞降解为一种甲腊产物。甲腊的浓度可通过分光光度计(E最大精密微孔阅读 器，Molecular Devices)读取490nm吸光度而得到。曲线与吸光度拟合后，计算ED50，并用4元方程计算IL_5分子浓度值.用不同非人细胞，如E. coli、酵母、CHO细胞和ED5tl，表达的人IL_5分子重复上述 实验，结果显示明显差异。实施例13(a)本发明的GM-CSF和非人系统表达GM-CSF体外免疫反应特点的比较用标准蛋白检测技术，如Bradford蛋白实验(Bradford M AnalBiochem 72: 248-254，1976)对本发明的GM-CSF蛋白浓度估算。用标准蛋白检测技术标准化后，将本发明的GM-CSF稀释并用购买的ELISA试剂 盒，如 R&D Systems 人 GM-CSF DuoSet ELISA kit(Cat# DY215)，按使用说明检测。该
ELISA试剂盒以E. coli表达的人GM-CSF为标准。当与标准蛋白实验检测的相同蛋白浓度比较后发现，R&D Systems人GM-CSF DuoSet ELISA kit在0D450nm下不能正确估算本发明的GM-CSF浓度值。在结构水平，该结果说明本发明的GM-CSF和非人系统表达GM-CSF体外免疫反应 特点不同。(b)本发明的IL-3和非人系统表达IL-3体外免疫反应特点的比较用Bradford蛋白实验(Bradford 1976 supra)对本发明的IL-3蛋白浓度估算。用Bradford蛋白实验对本发明的IL_3标准化后，将本发明的IL_3与表达于昆虫 细胞(BD Pharmingen ；Cat. #554604)的人IL-3稀释，并按操作说明书用R&D Systems人 IL-3 DuoSet ELISA kit (Cat. #DY203)检测。ELISA 试剂盒以 Ε. coli 表达的人 IL-3 为
标准品。通过与根据E.coli表达的人IL-3所制的标准曲线比较后，R&DSystems DuoSet
IL-3 ELISA kit对本发明的IL-3浓度检测结果约为466 pg/ml，0D450nm值为0. 3 (图7)； 而在相似0D450nm值时的实际加入浓度为2000pg/ml(Figure 7)。同样，通过与根据Ε. coli 表达的人IL-3所制的标准曲线比较后，R&D Systems DuoSet IL-3 ELISAkit对昆虫细
胞表达的IL-3浓度检测结果约为280pg/ml，0D450nm值为0. 2 (图7)；而在相似0D450nm 值时的实际加入浓度为2000pg/ml (图7)。[1788]R&D Systems 人 IL-3 DuoSet ELISA 试剂盒用 E. coli 表达的 IL-3 作为标准品，
抗体为E. col表达的人IL-3抗体，该试剂盒被用于实验室和临床对人IL-3水平的检测，其 检测结果显示本发明的IL-3的浓度应比预期高4倍。这些结果说明本发明的IL-3和非人系统表达IL-3免疫反应特点有显著差异(c)本发明的IL-4和非人系统表达IL-4体外免疫反应特点的比较用Bradford蛋白实验(Bradford 1976 supra)对本发明的IL-4蛋白浓度估算用Bradford蛋白实验对本发明的IL-4标准化后，将本发明的IL-4稀释，并按操 作说明书用 R&D Systems 人 IL-4 DuoSet ELISAkit (Cat. # DY204)检测。ELISA 试剂盒 以E. coli表达的人IL-4为标准品。通过与根据E. coli表达的人IL-4所制的标准曲线比较后，R&DSystems DuoSet IL-4 ELISA kit对本发明的IL-4浓度检测结果约为780pg/ml，0D450nm值为0. 55(图8)； 而在相似0D450nm值时的实际加入浓度为1500g/ml (图8)。R&D Systems 人 IL-4 DuoSet ELISA 试剂盒用 Ε. coli 表达的 IL-4 作为标准品， 抗体为E. coil表达的人IL-4抗体，该试剂盒被用于实验室和临床对人IL-4水平的检测， 其检测结果显示本发明的IL-4的浓度应比预期高2倍。这些结果说明本发明的IL-4和非人系统表达IL-4免疫反应特点有显著差异(d)本发明的IL-5和非人系统表达IL-5体外免疫反应特点的比较用标准蛋白检测技术，如Bradford蛋白实验(Bradford 1976supra)对本发明的 IL-5蛋白浓度估算。用Bradford蛋白实验对本发明的IL-5标准化后，将本发明的IL-5稀释，并按操 作说明书用 R&D Systems 人 IL-5 DuoSet ELISAkit (Cat. # DY218)检测。ELISA 试剂盒 以E. coli表达的人IL-5为标准品。当与标准蛋白实验检测的相同蛋白浓度比较后发现，R&D Systems人IL-5 DuoSet ELISA kit在0D450nm下不能正确估算本发明的IL-5浓度值。用购买的ELISA试剂盒检测的本发明的IL-5浓度与通过标准蛋白实验方法测定 的不同，这是因为商业ELISA试剂盒所用抗体的捕捉和/或检测倍非人细胞表达的人IL-5 蛋白提高。在结构水平，该结果说明本发明的IL-5和非人系统表达IL-5体外免疫反应特点 不同。实施例14本发明的目的分子的进一步纯化和用ESI-MS/MS的肽质量指纹谱除实施例2所述的纯化方法外，本发明的目的分子的纯化进一步通过RP-HPLC进 行，用商业可获得的柱。洗脱蛋白质通过215或280nm吸光度监测并且被收集，同时为了由 于流动细胞和收集端之间的导管体积带来的延迟进行校正。来自ID或2D凝胶的含有蛋白质样品的凝胶块在胰岛素溶液中消化，如实施例3 所述。或者，含有蛋白样品的溶液用胰岛素在碳酸氢铵缓冲液(10-25mM、pH 7.5-9)中消 化。溶液在37°C下过夜培养。然后通过加入乙酸直到pH在4-5范围内以中止反应。肽样 品被浓缩并且用C18 Zip-Tips (Millipore,Bedford,MA)或如实施例3所述，含有Poros R2层析树脂(Perspetive Biosystems, Framingham, MA)的预制微柱除盐。蛋白样品(2_5μ1)注入C18预柱中并且用0. 甲酸在30μ1/分钟下冲洗 以浓缩和除盐。冲洗3分钟后，预柱转换为成列的含有C18 RP 二氧化硅(Atlantis、 75 μ mX 100mm, Waters Corporation)的分析柱。肽用线性溶剂梯度由柱中洗脱，逐步地， /AH2O CH3CN(95 5;+0.1% 甲酸)到 H2O CH3CN(20 80、+0.1% 甲酸)以 200nl/分 钟进行 40 分钟以上。LC 洗脱在 Micromass QTOF Ultima 质谱仪(Micromass、Manchester、 UK)中经阳离子nanoflow电喷雾分析。串联MS用Q-Tof混合四级/正交加速TOF质谱仪(Micromass)进行。QTOF根据 采集模式(DDA)的数据进行操作。获得TOFMS检测扫描(m/z 400-2000、1. Os)，同时三种 最多的多电荷离子(计数> 15)在检测扫描中连续地经MS/MS分析。MS/MS谱收集8s (m/z 50-2000)。LC/MS/MS 数据用 Mascot (Matrix Science、London、UK)和 ProteinLynx Global Server( “PLGS”)(Micromass)搜索。蛋白样品预期为目的分子。实施例15(a)非人动物中的免疫原性(i)用目的蛋白质的动物免疫非人动物分别的组，例如，小鼠用I-IOOug本发明的蛋白质和在非人细胞中表达 的蛋白质经皮下，腹膜内或肌内(IP)免疫。动物在免疫后一个月接受二次免疫。免疫前， 蛋白质在佐剂中乳化，例如，用于初次免疫的完全Freud’ S佐剂和用于二次免疫的不完全 Freud，s 佐剂。(ii)对目的蛋白质的抗体的鉴定为了测定抗体反应，来自各组的动物从尾部取血并收集血清。蛋白特异性抗体通 过固相ELISA用50ng/孔的本发明的蛋白质测定。不同的免疫免疫球蛋白同种型通过用标 记的表现出抗IgGl、IgG2、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgD的检测抗体测定。或者，抗性反应靠 吸附到用于斑点印迹法或Western blot的膜上的本发明的蛋白质测量。不同免疫球蛋白 的同种型的测定按照上面所述检测。预期本发明的蛋白质引起不同于在非人细胞中表达的 蛋白的抗体反应。(iii)T细胞增殖分析将免疫的动物安乐死并制备脾细胞。合适的数量的脾细胞，例如，5X IO5细胞， 来自用本发明的蛋白质免疫的动物，和不同浓度的本发明的蛋白质一起培养一段时间，并 且相同数量的来自用非人细胞中表达的蛋白质免疫的动物的脾细胞和不同浓度的非人细 胞中表达的蛋白一起培养。为了 T细胞增殖分析，脾细胞培养96小时并在最后16小时用 IyCi [3H]胸腺嘧啶(6-7yCi/umol)处理。收获细胞到过滤器上并且掺入用标准方法测定 的[3H]胸腺嘧啶。与在非人细胞中表达的蛋白质相比，预期本发明的蛋白质引起不同的增 殖反应。(iv) IFN gamma 分析为了 IFN gamma分析，和本发明的蛋白质或非人细胞表达的蛋白质一起培养的脾 细胞培养上清在96小时时收获并且IFN gamma产物通过sandwich ELISA检测，例如，R&D 系统抗-IFN gamma Quantikine ELISA试剂盒(Cat # DIF50)，按照厂商技术说明书。预期来自用本发明的蛋白一起培养的细胞的培养上清的IFN gamma产物与来自用非人细胞中 表达的蛋白质一起培养的细胞的IFN gamma产物相比是不同的。(b)体外人免疫原性分析(i)人T细胞反应分析人树突状细胞和CD4+T细胞制备自人全血，如Stickler et al. Toxicological Sciences 77 =280-289,2004所述。树突状细胞和CD4+T细胞置于96孔板中共培 养，包含2X104树突状细胞和2X105⑶4+T细胞。本发明的蛋白质和在非人细胞中 表达的蛋白质经酶消化为肽片段，用通过切割位点预测软件鉴定的合适的酶，例如， PeptideCutter (http://au. expasy. ortools/peptidecutter)。得到的月太片段通过合适 的技术纯化，例如，液相色谱，并且加入共培养物中至终浓度5ug/ml。培养物培养5天，然后 将0.5uCi 3H胸腺嘧啶加入各培养物中。将细胞收获到过滤器中并且通过[3H]胸腺嘧啶掺 入测定细胞增殖。预期得自本发明的蛋白质肽可以引起较弱的增殖反应，相对于来自非人细胞中表 达的蛋白质的肽。(ii)人抗体反应分析对经用非人细胞表达的蛋白质治疗的人供体取血并且制备血浆。通过抗50ng/ well的本发明的蛋白质和非人细胞中表达的蛋白质的固相ELISA测定蛋白特异性抗体。不 同的免疫球蛋白同种型通过用表现出抗人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD的标记的 检测抗体测定。或者，通过斑点印迹法或Western blot时吸附在的膜上本发明的蛋白质和在非人 细胞中表达的蛋白质测定抗体反应。不同免疫球蛋白同种型的测定按照上面所描述的检 测。预期存在于用非人细胞表达的蛋白治疗的人的血清中的免疫球蛋白可以结合在 非人细胞中表达的蛋白质，而与本发明的蛋白质结合弱或不结合。实施例16来自重组基因组构建体的本发明的蛋白质的制备通过PCR扩增编码本发明的GM-CSF、IL-3、IL-4与IL-5的基因组序列SEQ ID NO 69、70、71、72)，并将其克隆至相应表达载体，如 pIRESbleo3、pCMV_SP0RT6、pUMCV3、pORF、 p0RF9、pcDNA3. 1/GS、pCEP4、pIRESpuro3、pIRESpuro4、pcDNA3. 1/Hygro (+)、pcDNA3. 1/ Hygro (-)、pEF6/V5-His。将这些重组的结构按上述方法(实施例1 (c))制备并转染至人细 胞。从重组DNA结构中获得本发明的GM-CSF、IL-3、IL-4和IL-5产物及纯化方法参见实施 例2。本领域技术人员可以理解在此描述的发明可以被变异或修饰为与那些特别描述 的不同。应当理解为本发明包括了所有的这样的变异或修饰。本发明还分别或全部地包括 了说明书中涉及的或指出的所有的步骤，特征，组分和化合物和任意两种或多种所述的步 骤或特征的随意组合。参考文献Ackland et al. 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分离的蛋白质，其具有可测量的理化参数特征，其中所述的特征表示、关联于一个或多个特征性的药理学特性或形成一个或多个特征性的药理学特性的基础，其中所述的分离的蛋白质具有包括多个可测量的理化参数{[Px]1、[Px]2、...[Px]n、}的理化特征，其中Px表示可测量的理化参数且“n”是≥1的整数，其中[Px]1至[Px]n中的每一个各自为不同的可测量的理化参数，其中任一个可测量的理化特性的值或一个以上可测量的理化特性的一系列的值表示、关联于一个特征性的药理学特性Ty或者一系列特征性的药理学特性{[Ty]1、[Ty]2、....[Ty]m}，或形成一个特征性的药理学特性Ty的基础或者一系列特征性的药理学特性{[Ty]1、[Ty]2、....[Ty]m}的基础，其中Ty表示一个特征性的药理学特性且m是≥1的整数，其中[Ty]1到[Ty]m中的每一个各自为不同的药理学特征，其中所述的分离的蛋白质选自GM CSF、IL 3、IL 4和IL 5。
2.权利要求1的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质具有一个或者多个表2所示的可测 量的理化参数。
3.权利要求1的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质具有一个或者多个表3中所示的特 征性的药理学特性。
4.嵌合分子，其包含融合到一个或多个肽、多肽或蛋白质部分上的权利要求1的分离 的蛋白质或其片断。
5.权利要求4的嵌合分子，其中肽、多肽或蛋白质部分包括人免疫球蛋白的恒定区 (Fe)或框架区。
6.权利要求4的嵌合分子，其中嵌合分子选自GM-CSF-Fc、IL-3-Fc、IL-4-Fc和 IL-5-Fco
7.药物组合物，含有权利要求1至6任一项的分离的蛋白质或嵌合分子。
8.在哺乳动物受试者中治疗或预防疾病的方法，其中所述的疾病能够通过增加蛋白 质的量或活性来改善，所述的方法包括给予所述哺乳动物受试者有效量的根据权利要求1 至3任一项的分离的蛋白质、权利要求4至6任一项的嵌合分子或权利要求7的药物组合 物。
9.核苷酸序列，选自SEQ ID No :25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、51、53、55、57、 61、63、65或67 ；或与上述列举的任一序列具有至少大约90%同一性的核苷酸序列；或能与 任一上述序列或它们的互补形式在高严格条件下杂交的核苷酸序列。
10.分离的蛋白质或嵌合分子，由选自SEQID NO :25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、 47、51、53、55、57、61、63、65或67的核苷酸序列所编码，或由与上述列举的任一序列具有至 少大约90%同一性的核苷酸序列或能与任一个上述序列或任一它们的互补形式在高严格 条件下杂交的核苷酸序列所编码。
11.分离的核苷酸分子，编码蛋白质或嵌合分子或其功能部分，包括与SEQID N0:25、 27、29、31、35、37、39、41、43、45、47、51、53、55、57、61、63、65 或 67 具有至少 90 % 的相似性 的核苷酸序列，或最佳比对后和/或能够与SEQ ID NO :25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、 47、51、53、55、57、61、63、65或67，或它们的互补形式的一个或多个在高严格条件下杂交的 核苷酸序列。
12.分离的核苷酸分子，包括编码具有基本上如SEQID NO :26、28、30、32、36、38、40、 42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66或68的一个或多个所示的氨基酸序列的蛋白质或嵌合分子的核苷酸序列，或编码与 SEQ ID NO :26、28、30、32、36、38、40、42、44、46、48、52、54、 56、58、62、64、66或68最佳比对后的一个或多个具有至少大约90%相似性的氨基酸序列的 蛋白质或嵌合分子的核苷酸序列。
13.试剂盒，用于测定生物制品中存在的人细胞表达的人蛋白质或嵌合分子水平，包 括(a)固相支持基质；(b) —种或多种抗权利要求1-3任一项的人蛋白质或权利要求4-6任 一项的嵌合分子的抗体；(c)封闭溶液；(d) —种或多种底物贮液；(e)底物缓冲溶液；(f) 标准人蛋白质或嵌合分子样品和(g)使用说明书。
14.权利要求13的试剂盒，其中标准人蛋白质或嵌合分子样品是权利要求2或3的分 离的蛋白质或权利要求4的嵌合分子的制品。
15.权利要求13或14的试剂盒，其中每一种抗体衍生自用包含权利要求2或3的分 离的蛋白质或权利要求4的嵌合分子的制品对哺乳动物的免疫。
16.权利要求13至15任一项的试剂盒，其中人细胞表达的人蛋白质是天然存在的人 GM-CSF、IL-3、IL-4 和 IL-5。
全文摘要
本发明概括地涉及蛋白质学、诊断学、治疗学和营养学领域。尤其是，本发明提供一种分离的蛋白质分子，该分子属于短链4螺旋束超家族或与短链4螺旋束超家族相关，如GM-CSF、IL-3、IL-4和IL-5及包含该蛋白质分子的至少一部分的嵌合分子例如GM-CSF-Fc、IL-3-Fc、IL-4-Fc和IL-5-Fc。其中蛋白质或其嵌合分子具有可测量的理化参数特征，其中该特征表示、关联于一个或多个药理学特性或形成一个或多个药理学特性的基础。本发明进一步设想将分离的蛋白质或其嵌合分子用于诊断、预防、治疗、营养和/或研究应用范围中。
文档编号C07K14/54GK101932599SQ200680008088
公开日2010年12月29日 申请日期2006年1月25日 优先权日2005年11月10日
发明者A·D·沃茨, C·A·利德尔, G·R·皮尔金顿, I·贝姆, J·D·普里斯特, J·S·惠特克 申请人:阿波罗生命科学有限公司