专利名称：结合ccx-ckr2的试剂的制作方法
结合CCX-CKR2的试剂相关专利申请的交叉参考 本专利申请要求于2005年4月21日提交的第60/674， 140号美国临时专利申请， 的优先权，出于所有目的，该申请被纳入本文作为参考。发明背景趋化因子构成小细胞因子家族，尤其是在炎症中产生并调节白细胞补充、活化 和增殖的小细胞因子家族(Baggiolini，M等，Jdv. /mmw"o/. 55: 97-179(1994); Springer, T.A.， J""", i ev. P/z>w'o/.57:827-872(1995);禾卩Schall， T丄和K.B.Bacon， 0#r. 0/ /". /wmwo/. 6:865-873(1994))。趋化因子能选择性诱导血液中成形元素(除红血细胞外) 的趋化作用，包括白细胞如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、嗜碱 细胞、肥大细胞以及包括T细胞和B细胞在内的淋巴细胞。除了刺激趋化作用外， 趋化因子还可选择性诱导应答细胞内的其它变化，包括细胞形状变化、暂时提高细 胞内游离钙离子(<^2+)浓度、颗粒胞吐、上调整联蛋白、形成生物活性脂质(如白细胞 三烯)、表达细胞因子、以及与白细胞活化、生长和增殖相关的呼吸爆发。因此，趋 化因子是炎症反应的早期触发器，能引起炎症介质释放、趋化和外渗到感染或炎症 部位。趋化因子的两个亚家族，称之为CXC和CC趋化因子，根据4个保守半胱氨酸 残基中前2个的排列来区分，其要么被一个氨基酸所隔开(如CXC趋化因子中的 SDF-1、 IL-8、 IP-IO、 MIG、 PF4、 ENA-78、 GCP-2、 GRO a 、 GRO P 、 GRO y 、 NAP-2、 NAP-4、 I-TAC)，要么为相邻残基(如CC趋化因子中的MIP-1 a 、 MIP-1 P 、 RANTES、 MCP-1、 MCP-2、 MCP-3、 1-309)。大多数CXC趋化因子吸引中性粒细胞。 例如，CXC趋化因子白介素8(IL-8)、血小板因子4(PF4)和中性粒细胞活化肽2(NAP-2) 是中性粒细胞的有效化学引诱物和活化剂。称为MIG(Y干扰素诱导的单核因子)和 IP-10(干扰素Y可诱导的10kDa蛋白质)的CXC趋化因子在诱导活化的外周血淋巴细 胞的趋化方面尤其具有活性。CC趋化因子通常具有较少选择性并能吸引各种白细胞 类型，包括单核细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、T淋巴细胞、粒细胞和自然杀伤细胞。 CC趋化因子如人单核细胞趋化蛋白l-3(MCP-l、 MCP-2和MCP-3)、 RANTES(活化 后可调节的、正常T细胞表达并分泌的)和巨噬细胞炎性蛋白1 a和1 P (MIP-1 a和 MIP-1 0 )具有单核细胞或淋巴细胞的化学引诱剂和活化剂的特征，但似乎不是中性 粒细胞的化学引诱剂。CC和CXC趋化因子通过属于7跨膜的G蛋白偶联受体超家族的受体进行作用 (Murphy， P.M.， /^ammco/^v.52:145-176(2000))。该G蛋白偶联受体家族包括含有 7个跨膜区的一大群整合膜蛋白。该受体可与G蛋白偶联，该G蛋白为能结合GTP 并例如通过生产胞内介质来介导来自偶联受体的信号传导的异源三聚体调控蛋白。 而且，趋化因子受体可独立进行G蛋白偶联。例如主要在红血细胞上表达的Duffy 受体是一种滥交趋化因子结合受体，其被认为是像趋化因子般作用，从循环环境中 除去趋化因子。总地来讲，趋化因子和趋化因子受体之间的相互作用倾向于滥交，即一种趋化 因子能结合许多趋化因子受体并且反过来一种趋化因子受体能与多种趋化因子相互 作用。针对该规则还有一些例外； 一种此类例外为SDF-1和CXCR4之间的相互作用 (Bleul等， /五x; MM， 184(3): 1101-9(1996); Oberlin等，A^wre ， 382(6594):833-5(1996))。 最初确定为前B细胞生长刺激因子(Nagasawa等，7Vw/ Jcfld Sd ， 91(6):2305-9(1994))的SDF-1为唯一报道过的CXCR4的人配体。SDF-1基因通过另 路剪接编码两种蛋白质，称为SDF-1 a和SDF-1 P 。除了存在于SDF-1 6的N端而 在SDF-1 a上不存在的4个氨基酸残基外，这两种蛋白质是相同的。趋化因子受体信号转导和对配体的选择的许多方面还未被理解。例如，有许多 功能未确定的孤受体。例如，RDC1，虽然早期认为它是血管活性肠肽(VIP)的受体， 但由于无法确定其内源性配体，直到最近才认为它是孤儿受体。参见例如Cook等， ^m 丄她.300(2):149-152(1992)。最近确定，被重命名为CCX-CKR2的RDC1结合趋化因子SDF-1和I-TAC。参 见例如PCT/US04/34807和美国专利申请号10/698,541、 10/912,638和11/050,345， 均将其全文纳入本文作为参考。发明概述本发明提供了竞争性抑制竞争者抗体与CCX-CKR2结合的抗体，其中该竞争者 抗体含有以下序列的互补决定区(CDR): SEQIDNO:12和SEQIDN0:14;或 SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 18。一些实施方式中，该抗体连接到可检测标记上。 一些实施方式中，该抗体连接 到放射性同位素或细胞毒化学物质上。一些实施方式中，该抗体为单克隆抗体。 一些实施方式中，该抗体为抗体片段。 一些实施方式中，该抗体为人源化抗体。一些实施方式中，该抗体包含SEQIDNO:12和/或SEQIDNO:14的互补决定区 (CDR)或与SEQ ID NO: 12禾口/或SEQ ID NO: 14的CDR基本相同的CDR。 一些实施 方式中，该抗体包含SEQ ID NO: 12和/或SEQ ID NO: 14。一些实施方式中，该抗体包含SEQIDNO:16和/或SEQIDNO:18的互补决定区 (CDR)或与SEQ ID NO:16和/或SEQ ID NO:18的CDR基本相同的CDR。 一些实施 方式中，该抗体包含SEQ ID NO: 16和/或SEQ ID NO: 18。本发明还提供了含有药学上可接受的赋形剂和竞争性抑制竞争者抗体与 CCX-CKR2结合的抗体的药物组合物，其中所述竞争者抗体含有以下序列的互补决定区(CDR):SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 14;或 SEQ ID NO: 16禾卩SEQ ID NO: 18。一些实施方式中，该抗体为单克隆抗体。 一些实施方式中，该抗体为抗体片段。 一些实施方式中，该抗体为人源化抗体。一些实施方式中，该抗体包含SEQIDNO:12禾卩/或SEQIDNO:14的互补决定区 (CDR)或与SEQ ID NO: 12禾口/或SEQ ID NO: 14的CDR基本相同的CDR。 一些实施 方式中，该抗体包含SEQ ID NO: 12和/或SEQ ID NO: 14。一些实施方式中，该抗体包含SEQIDNO:16禾n/或SEQIDNO:18的互补决定区 (CDR)或与SEQ ID NO: 16和/或SEQ ID NO: 18的CDR基本相同的CDR。 一些实施 方式中，该抗体包含SEQ ID NO: 16禾口/或SEQIDNO:18。本发明还提供了在生物样品中检测表达CCX-CKR2的细胞的方法。 一些实施方 式中，该方法包括将生物样品与抗体接触并检测抗体的存在，其中所述抗体竞争性 抑制竞争者抗体与CCX-CKR2结合，其中所述竞争者抗体含有以下序列的互补决定区(CDR):SEQIDNO:12和SEQIDNO:14;或 SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO:18。一些实施方式中，该抗体连接到可检测标记上。
本发明还提供抑制血管发生或癌细胞增殖的方法。
一些实施方式中，该方法包括将所述细胞接触竞争性抑制竞争者抗体与CCX-CKR2结合的抗体的步骤，其中所 述竞争者抗体含有以下序列的互补决定区(CDR): SEQIDNO:12和SEQIDNO:14;或SEQIDNO:16和SEQIDNO:18，从而抑制癌细胞非血管发生或增殖。一些实施方式中，该抗体为单克隆抗体。 一些实施方式中，该抗体为单克隆抗 体。 一些实施方式中，该抗体为抗体片段。 一些实施方式中，该抗体为人源化抗体。一些实施方式中，该抗体包含SEQIDNO:12禾卩/或SEQIDNO:14的互补决定区 (CDR)或与SEQ ID NO: 12和/或SEQ ID NO: 14的CDR基本相同的CDR。 一些实施 方式中，该抗体包含SEQ ID NO: 12禾口/或SEQ ID NO: 14。一些实施方式中，该抗体包含SEQIDNO:16和/或SEQIDNO:18的互补决定区 (CDR)或与SEQ ID NO:16禾口/或SEQ ID NO:18的CDR基本相同的CDR。 一些实施 方式中，该抗体包含SEQIDNO:16和/或SEQIDNO:18。一些实施方式中，该细胞存在于个体中。 一些实施方式中，该个体患有或易患 关节炎。 一些实施方式中，该个体不是人。本发明还提供了鉴定CCX-CKR2调控因子(modulator)的方法。 一些实施方式中， 该方法包括(a) 将表达CCX CKR2多肽的细胞或细胞提取物与检测试剂混合；和(b) 进行试验以测试检测试剂是否与竞争者抗体竞争结合CCX CKR2多肽，其中 所述竞争者抗体含有以下序列的互补决定区(CDR):SEQIDNO:12和SEQIDNO:14;或 SEQ ID NO: 16禾口 SEQ IDNO:18，其中，竞争者抗体与检测试剂之间结合CCX-CKR2多肽的竞争是该检测试剂为 CCX CKR2活性调控因子的表征。一些实施方式中，该竞争者抗体包含SEQIDNO:12和SEQIDNO:14的互补决 定区(CDR)。在一些实施方式中，该竞争者抗体包含SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14。一些实施方式中，该竞争者抗体包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18的互补决 定区(CDR)。 一些实施方式中，该竞争者抗体包含SEQIDNO:16和SEQIDNO:18。本发明还提供了测试检测试剂调控CCX-CKR2活性的效力的方法。该方法可用 于，例如，当利用本发明的抗体作为对照药物来分析CCX-CKR2小分子激动药或拮 抗药时。 一些实施方式中，该方法包括(a) 将检测试剂给予第一动物；(b) 给予第二动物与竞争者抗体竞争结合CCX CKR2多肽的抗体，其中该竞争者 抗体含有以下序列的互补决定区(CDR):SEQIDNO:12和SEQIDNO:14;或 SEQIDNO:16和SEQIDNO:18;和(c) 比较检测试剂对第一动物的影响和抗体对第二抗体的影响。 一些实施方式中，该竞争者抗体包含SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14的互补决定区(CDR)。在一些实施方式中，该竞争者抗体包含SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14。 一些实施方式中，该竞争者抗体包含SEQIDNO:16和SEQIDNO:18的互补决定区(CDR)。 一些实施方式中，该竞争者抗体包含SEQIDNO:16和SEQIDNO:18。 本发明还提供了含有SEQIDNO:12、 SEQIDNO:14、 SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:18或者SEQIDNO:12、 SEQIDNO:14、 SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的至少一种CDR的多肽。 一些实施方式中，该多肽为抗体。本发明还提供了编码SEQIDNO:12、 SEQIDNO:14、 SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:18或者SEQIDNO:12、 SEQIDNO:14、 SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的至少一种CDR的多核苷酸。 一些实施方式中，该多核苷酸含有SEQIDNO:ll、 SEQ IDNO:13、 SEQIDNO:15或SEQIDNO:17。本发明还提供了制备嵌合体抗体的方法。
一些实施方式中，该方法包括将编码SEQIDNO:12、 SEQIDNO:14、 SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的至少一种互补决定区(CDR)的多核苷酸可操作地连接到至少编码抗体重链或轻链骨架区 的异源多核苷酸上，以形成编码抗体的嵌合重链或轻链的融合多核苷酸；和 从所述融合多核苷酸表达嵌合重链或轻链。定义"RDC1"，本文中称为"CCX-CKR2"，指假定有7跨膜区的G蛋白偶联受体 (GPCR)。 CCX-CKR2狗直向同源序列最初在1991年确定。参见Libert等，&/e"ce 244:569-572(1989)。该狗序列描述于Libert等，7Vwci油U(7): 1917(1990)。小 鼠序列描述于如Heesen等，/mmw"oge""/cs 47:364-370 (1998)。人序列描述于如 Sreedharan等，尸rac. Ato/. Jcad "SL4 88:4986-4990 (1991)，其将该蛋白质错误描 述为血管活性肠肽受体。"CCX-CKR2"包含为SEQIDNO:2、 SEQIDNO:4、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的保守性修饰变体的序列。CCX-CKR2的片段为上面列出的序列之一或其保守性修饰变体的至少5个，某些时候至少IO、 20、50、 100、 200、 300或直到300个毗连氨基酸的片段。"对象"或"个体"指动物，包括人、非人灵长类、小鼠、大鼠、狗或其它哺 乳动物。"化疗剂"指一种试剂，当其被给予个体后足以抑制、减慢或停止癌细胞的生 长，或足以在癌细胞内产生细胞毒性效应。因此，短语"化疗有效量"描述了将化 疗剂给予个体后足以抑制、减慢或停止癌细胞生长，或者足以对癌细胞产生(直接或 间接)细胞毒性效应的量。"亚治疗量"指比足以抑制、减慢或停止癌细胞生长，或足 以对癌细胞产生细胞毒性效应的量少的量。"抗体"指包含免疫球蛋白基因的骨架区或其片段从而能特异性结合并识别抗 原的多肽。公认的免疫球蛋白基因包括K 、 A、 a、 y、 S、 e和P恒定区基因， 以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分为K或入。重链分为Y、 U、 a、 S和e， 其依次分别定义免疫球蛋白类型IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。天然形成的免疫球蛋白具有相同的核心结构，其中两条相同轻链(大约24kD)和 两条相同重链(大约55或70kD)形成四聚体。每一条链的氨基酸末端部分已知为可变 区(V)并且可与每条链剩下的较为保守的恒定区(C滩区另l」。轻链的可变区内有已知为 J区的C端部分。重链的可变区内除了 J区外还有D区。免疫球蛋白上的大多数氨 基酸序列变化均限于已知为与抗原结合直接相关的超变区或互补决定区(CDR)的V 区上的3个分离的部位。从氨基酸末端开始，这些区域分别称为CDR1、 CDR2和 CDR3。 CDR由更保守的骨架区(FR)限制于固定位置。从氨基酸末端开始，这些区域 分别称为FR1、 FR2、 FR3和FR4。 CDR和FR区的位置以及编号系统由Kabat等确 定(Kabat等，《免疫学感兴趣的蛋白质序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第五版，美国健康和人类服务部(U.S. Department of Health and Human Services),美国政府印刷办公室(U. S. Government Printing Office) (1991))。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含一四聚体。每一四聚体由两对同样的多肽 链组成，每对均具有一 "轻"链(大约25kDa)和一 "重"链(大约50-70kDa)。每条链 的N末端定义有大约100-110或更多氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。术语可 变轻链(VO和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。抗体例如以完整的免疫球蛋白或以由各种肽酶消化产生的许多特征片段而存 在。因此，例如，胃蛋白酶消化抗体铰链区内的二硫键以生产F(ab)'2，其为Fab的 二聚体，Fab本身是通过二硫键连接到VH-Cm的轻链。F(ab)'2可在温和条件下还原
以打破其铰链区的二硫键，从而将F(ab)，2二聚体变为Fab，单体。Fab，单体本质上是 Fab加上部分铰链区(参见(f基鄉竞i^学JY尸WW^M五;V7^L/MMtWOZ0GJ9 (Paul编， 第三版，1993)。虽然各种抗体片段被定义为通过消化完整抗体制得，本领域技术人 员将意识到此类片段可通过化学方法或通过利用重组DNA方法从头合成。因此，本 文中采用的术语抗体还包括通过修饰完整抗体生产的或利用重组DNA法从头合成 的(例如单链Fv)或利用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(参见McCafferty等，Atowe 348:552-554(1990))。可以采用本领域任何已知技术制备单克隆或多克隆抗体(参见例如Kohler和 Milstein， Atow" 256:495-497 (1975); Kozbor等，/mmwwo/ogy 7bi/ay 4:72 (1983); Cole等，(f単^"蘑拔^"/〃^^i^治^^ (Mo"oc/o"a/ v4""Zw&" Ca"cer 7T2era^」第77-96 页(1985))。"单克隆"抗体指来源于单个克隆的抗体。生产单链抗体的技术(美国专利 No.4，946,778)可用于生产本发明多肽的抗体。同样，转基因小鼠或其它生物如其它哺 乳动物可用于表达人源化抗体。或者，噬菌体展示技术可用于确定特异性结合所选 抗原的抗体和异侧Fab片段(参见例如McCafferty等，A^wre 348: 552-554 (1990); Marks等，所o/ec/mo/ogy 10:779-783(1992))。"嵌合抗体"是一种抗体分子，其中，(a)恒定区或其部分被改变、替换或互换， 以至于抗原结合位点(可变区)连接到不同或变化的纲、效应器功能和/或种、或完全 不同的分子的恒定区，从而为嵌合抗体带来新的属性，如酶、毒素、激素、生长因 子、药物等；或(b)可变区或其部分被改变、替换或与具有不同或变化的抗原特异性 的可变区互换。"人源化"抗体是一种保留非人抗体反应性却对人较少有免疫原性的抗体。这 可通过例如保留非人CDR区并用人对应部分替换抗体的剩余部分而获得。参见例如 Morrison等，尸rac,胸/. ^ca"c/.固，81:6851-6855(1984); Morrison和Oi， A/v. /mmw"o/.， 44:65-92(1988); Verhoeyen等，Sde"ce， 239:1534-1536(1988); Padlan， 7Wo/ec./mmww, ， 28:489-498(1991); Padlan， Molec. Immun.， 31(3):169-217(1994)。术语"分离的"当用于蛋白质时表示该蛋白质基本上不带天然状态下与其联合 的其它细胞组分。优选处于均质状态，但也可以为无水或含水溶液。纯度和同质性 一般利用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱测定。存在于制备物 中的优势种蛋白质是基本纯的。术语"纯的"表示在电泳凝胶中基本产生一条带的 蛋白质。具体地，意味着该蛋白质为至少85%纯、更优选至少95%纯、和最优选至 少99%纯。 当涉及蛋白质或肽时，短语"特异性(或选择性)结合"抗体或"与……进行特异 性(或选择性)免疫反应"指在非均质蛋白质和其它生物制品中存在的蛋白质的起决定 性作用的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，特异抗体以背景的至少2倍 来结合特异性蛋白质并且基本上不以显著量结合样品中存在的其它蛋白质。通常， 特异性或选择性反应将为背景信号或噪声的至少2倍，并且更通常为背景的10-100 倍以上。术语"模拟物肽模拟物"和"模拟物"指具有与天然或非天然生成的多肽基本相同的结构和功能特征的合成的化合物(如结合CCX-CKR2的试剂)。肽类似物通常 作为具有与模板肽有类似属性的非肽药物而用于药物工业。这些类型的非肽化合物被称为"肽模拟物"或"模拟物肽模拟物"(Fauchere， A/v. Z)rwgi " 15:29(1986); Veber和Freidinger， WS第392页(1985);和Evans等， / 30:1229(1987)，其纳入本文作为参考)。与治疗上有用的肽结构类似的肽模拟物可用于产生同等或增 强的治疗或预防效果。总体上，模拟物肽模拟物在结构上与模板多肽类似(即具有生 物学或药学活性的多肽)，如在感兴趣的多肽中发现的，然而具有被选自下组的键任 选取代的一个或多个肽键例如-CH2NH-、 -CH2S-、 -CH2-CHr、 -CHK:H-(顺式和反 式)、-COCH2-、 -CH(OH)CH2，-CH2SO-。模拟物可以是完全由合成的、氨基酸的非 天然类似物组成、或是部分天然肽氨基酸和部分氨基酸的非天然类似物的嵌合体分 子。模拟物还可结合有任何量的天然氨基酸保守取代，只要此类取代基本上不改变 模拟物的结构和/或活性。例如，当模拟物组合物能实现感兴趣的多肽的至少一种结 合或酶活性，其就包括在本发明的范围内。"配体"指一种能够结合受体的试剂，如多肽或其它分子。 "保守修饰的变体"应用于氨基酸和核酸序列。就特定核酸序列而言，"保守修 饰的变体"指那些编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或当核酸不编码氨 基酸时，指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并，许多核酸序列编码任何给定 的蛋白质。例如，密码子GCA、 GCC、 GCG和GCU全都编码丙氨酸。因此，在由 密码子限定的丙氨酸的每一个位置，可将该密码子改变为任何所述对应密码子而不 改变编码的多肽。此类核酸变异为"沉默变异"，是一种保守性修饰变异。还描述了 本文中每种编码多肽的核酸序列的每种可能的核酸沉默变异。本领域技术人员能认 识到核酸中的每种密码子(除了 AUG，其通常为甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG， 其通常为色氨酸的唯一密码子)可进行修饰以产生功能上相同的分子。同样，编码多 肽的核酸的每种沉默变异暗含在每种所述序列中。
就氨基酸序列而言，本领域技术人员能认识到对核苷酸、肽、多肽或蛋白质序 列进行单个取代、缺失或插入以改变、插入或缺失编码序列中的单个氨基酸或小比 例氨基酸是一种"保守修饰变体"，其中，该改变能引起氨基酸被化学上相似的氨基 酸取代。保守取代表提供了本领域公知的功能上相似的氨基酸。此类保守修饰变体 被加进并不排除本发明的多态变体、种间同系物和等位基因。以下8组均包含互相保守取代的氨基酸1) 丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2) 天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3) 天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4) 精氨酸(R)、赖氨酸(K);5) 异亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);6) 苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7) 丝氨酸(S)、苏氨酸(T);禾口8) 半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M) (参见例如Creighton，尸rato'似(1984))。"序列相同性百分比"是通过比较窗口比较两条最佳匹配序列来确定的，其中比较窗口中的多核苷酸序列部分当与用于两条序列的最佳匹配的参考序列(其不包含插入或缺失)相比时可包含插入或缺失(即缺口)。该比例由确定两条序列中发生相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的个数来得到匹配位置个数，用比较窗口中的位置总个数除匹配位置个数，用100乘该结果来得到序列相同百分比来计算。在上下文中涉及两条或多条核酸或多肽序列时，术语"相同的"或"相同性"百分比指，当在比较窗口或指定区域内利用以下序列比较算法之一或通过手工比对和肉眼检査进行比较和比对以得到最大对应性时，两条或多条序列或亚序列是相同 的或具有特定比例的相同的氨基酸残基或核苷酸(即在特定区域如本发明的完整多肽序列或本发明多肽的胞外结构域内有60%相同性、任选有65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95%相同性)。此类序列即被称为"基本相同的"。该定义还指检测序列 的互补序列。或者，相同性存在于长度为至少约50的核苷酸的区域中，或更优选的 在长度为100-500或1000或更多核苷酸的区域中。本发明包括与SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、 SEQIDNO:16禾口/或SEQIDNO:18禾口/或SEQIDNO:12、 SEQIDNO:14、 SEQ ID NO:16禾卩/或SEQ ID NO:18内的CDR1或CDR2基本上相同的多肽，如
图1 所示。
为了进行序列比较， 一般需要一条序列作为参考序列，检测序列与之比较。当 采用序列比较算法时，检测序列和参考序列被输入计算机，如果需要的话设定亚序 列坐标，并设定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可设定可选参数。然 后该序列比较算法即基于程序参数计算检测序列相对参考序列的序列相同性百分 比。"比较窗口"在文中包括，参照任何一种选自下组的连续位数的区段例如全长序列或者20-600、约50-200、或约100-150个氨基酸或核苷酸，其中在两条序列 最佳比对后， 一条序列可与相同连续位数的参考序列进行比较。将要比较的序列进 行比对的方法为本领域公知。可通过以下方法进行比较序列的最佳比对例如Smith 和Waterman (1970)爿c/v.々p/. Ma /z. 2:4S2c的局部同源性算法、Needleman和Wunsch (1988) ■/Mo/. 48:443的同源性比对算法、Pearson和Lipman (1988)尸rac. TVar/. 爿cfld Sc/. USA 85:2444的相似性检索方法，这些算法由计算机执行(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、 BESTFIT、 FASTA和TFASTA， Genetics Computer Group, 575 Science Dr.， Madison， WI)，或通过手工比对和肉眼检验来进行比较序列的最佳 比对(参见例如Ausubel等，(f分ff激学虔,新^^展J1 fO#re"f尸ratoco/s /" Mo/ecw/ar 历o/ogy)(1995增补本))。适用于检测序列相同性百分比和序列相似性的算法的例子为BLAST和 BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等(1977) Wwa 25:3389-3402和Altschul等(1990) J Mo/ 215:403-410。进行BLAST分析的软件公开获自[美国] 国家生物技术信息中心(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)。该算法包括首先通过在查询序 列中确定长度为W的短字，其在数据库中与同样长度的字比对时或匹配或满足某些 正值阈分数T，以此确定高评分序列对(HSP)。 T指相邻字的分数阈(Altschul等，如 上)。这些初始相邻字命中作为进行初始检索包含它们的更长HSP的种子。该字命中 沿每条序列往两方向延伸直到能够增加累积比对分数。针对核苷酸序列的累积分数 采用参数M(—对匹配残基的奖分；总是X))和N(错配残基的罚分；总是O)计算。针对氨基酸序列，采用评分距阵来计算累积分数。每个方向的字命中延伸当累积比对分数从其最大获得值下降值X;由于累积到一个或多个负分残基比对，该累积分数变为零或更低；或达到序列的任一末端时停止。BLAST算法参数W、 T和X决定 算法的敏感度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认采用字长(W)为11、期望 (E)或IO、 M=5、 N^4和双链的比较。针对氨基酸序列，BLASTP程序默认采用字长 为3、和期望(E)为10和BLOSUM62评分距阵(参见Henikoff和Henikoff (1989) /Voc. 7Va" Jcad Sc/. 89:10915)比对(B)为50、期望(E)为10、 M=5、 N二4和双链比较。 BLAST算法还进行两条序列之间相似性的统计学分析(参见例如Karlin和 Altschul (1993)A^/.爿caJ. 90:5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性检测为最小和概率(P(N))，其提供一种两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配 的概率指标。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较的最小和概率小于大约0.2，更 优选地小于大约0.01，和最优选地小于大约0.001，则该核酸被认为与参考序列相似。两条核酸序列或多肽基本上相同的指标是由第一核酸编码的多肽与由第二核酸 编码编码的多肽引起的抗体发生免疫交叉反应，如下所述。因此，例如，在两条肽仅在保守取代处有差异时，其中一条多肽通常与第二条多肽基本上相同。两条核酸 序列基本上相同的另一个指标是这两个分子或它们的补体在严格条件下相互杂交， 如下所述。两条核酸序列基本上相同的再一个指标为可采用相同引物来扩增该序列。附图简述图1描绘了本发明抗体的一些互补决定区(CDR)的一些实施方式(SEQ ID NO: 19-22)。发明详述/.本发欲舰沐本发明提供了利用抗CCX-CKR2抗体治疗、预防和诊断CCX-CKR2相关疾病和 病症的试剂和方法。CCX-CKR2相关疾病和病症在以下有更多举例并包括但不限于 癌症、涉及血管发生过度或异常疾病和关节炎。一些实施方式中，所述抗体为分离的。本发明的一些实施方式中，该抗体识别 的表位与SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 14中CDR结合的表位相同。本发明的一些实 施方式中，该抗体识别的表位与SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18中CDR结合的表位 相同。包含SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 14，或SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18的 抗体结合CCX-CKR2并与趋化因子SDF-1和I-TAC竞争结合CCX-CKR2。 CCX-CKR2结合的竞争试验描述于，例如，参见例如PCT/US04/34807和美国专利公 开号US2004/0170634和2005/0074826。本发明的一些实施方式中，抗体结合CCX-CKR2却不结合人外周血。例如，一 些实施方式中，本发明的抗体不结合以下至少一种嗜碱细胞、单核细胞、类浆树 突细胞；B细胞或CD4+T细胞。 一些实施方式中，本发明抗体包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18。一些实施方式中，本发明的抗体包含SEQ IDNO:12和SEQ IDNO:14，或SEQIDN0.16和SEQIDNO:18。 一些实施方式中，本发明抗体包含 SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 18的CDR。 一些实 施方式中，本发明的抗体包含SEQIDNO:12和SEQIDNO:14，或SEQIDN0.16和 SEQ ID NO: 18的CDR。之前已描述了 CDR和FR区的定位和编号系统，如Kabat等(Kabat等，《免疫学 感兴趣的蛋白质序列》，第5版，美国健康和人类服务部，美国政府印刷办公室(1991))。 CDR通常采用NCBI IgBLAST算法确定。本领域技术人员将认识到不同的序列算法 可提供特定抗体氨基酸序列中的CDR位置的略微不同的描述。 一些情况下，重链 CDR发生于氨基酸位31-35(CDR1)、 50-65 (CDR2)和96-102 (CDR3)。 一些情况下， 轻链CDR发生于氨基酸位24-34 (CDR1)、 50-56 (CDR2)禾卩89-97 (CDR3)。 一些实施 方式中，CDR如图l所示。特定抗体识别与另一抗体相同的表位的能力由抗体竞争性抑制第二抗体结合抗 原如CCX-CKR2或其片段或其融合的能力所决定。可采用许多竞争性结合试验中的 任何一种来检测两种抗体对相同抗原之间的竞争。 一个示例性试验为Biacore试验。 简单地说，在这些试验中，通过检测相互作用物如不同抗体抑制另一方结合的能力 将结合位点在结构范围内定位。以足够浓度连续注入两种抗体样品能判断针对相同 结合表位的竞争者抗体对。每次注射，抗体样品均应能够达到显著饱和。第二次抗 体注入的净结合指示结合表位分析。两种应答水平可用来描述由不同表位引起的完 美竞争性比非竞争性结合的分界线。对应于相同和不同结合表位的结合的第二次抗 体注入的相对结合应答量确定表位重叠程度。抗体可识别线性或结构表位，因此抗 体在识别不相似的和远距离的表位时才是竞争性的。本发明可采用本领域已知的其它传统免疫试验。例如，可采用夹心ELISA试验 通过抗体结合的表位来区分抗体。通过利用捕获抗体包被孔表面来进行。往捕获表 面内添加不饱和浓度的标记抗原。该蛋白质将通过特定的抗体:表位相互作用而结合 到抗体上。洗涤后，将与可检测部分共价连接的第二抗体(如，HRP，标记抗体定义 为检测抗体)加入ELISA。如果该抗体识别与捕获抗体相同的表位，则由于特定表位 已不再供结合，它就无法结合目标蛋白质。然而，如果该第二抗体识别目标蛋白质 上的不同表位，它就能够结合并且该结合可通过利用有关酶底物定量活性水平(并抗 体因此结合)来检测。用单个抗体同时作为捕获抗体和检测抗体来限定背景，同时通
过用抗原特异性抗体捕获并用抗原上标记的抗体检测来建立最大信号。通过利用背 景和最大信号作为参考，可评估抗体的配对方式以确定表位特异性。在第一抗体存在下利用任何上述试验，如果第二抗体与抗原的结合减少至少30%、通常至少大约40%、 50%、 60%或75%，且常为至少约90%,则认为第一抗体 竞争性抑制第二抗体的结合。制备多克隆抗体的方法为本领域技术人员已知的。多克隆抗体可如通过注入一 种或多种免疫试剂和一种佐剂(如果需要)从哺乳动物中培养。 一般，该免疫试剂和/ 或佐剂通过多次皮下或腹膜内注射被注入哺乳动物内。该免疫试剂可包括核酸编码 的蛋白质或其片段或其融合蛋白质。可采用将该免疫试剂与已知在被免疫哺乳动物 内具有免疫原性的蛋白质结合。此类免疫原性蛋白质的例子包括但不限于匙孔槭血 蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可采用的佐剂的例 子包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A、合成的海藻糖二白喉菌酸 (trehalose dicorynomycolate))。该免疫方法不需要过度试验即可由本领域技术人员进 行选择。或者，抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可采用杂交瘤方法制备，如由Kohler 和Milstein， iVa化^ 256:495(1975)所描述的那些方法。在杂交瘤方法中，通常用免疫 试剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物以引发生产或能生产将特异性结合到免 疫试剂的抗体的淋巴细胞。或者，该淋巴细胞可在体外免疫。该免疫试剂一般包括 CCX-CKR2多肽、或其片段或其融合。通常，如果需要人体器官细胞时采用外周血 淋巴细胞("PBL")，当需要非人哺乳动物来源时采用脾细胞或淋巴结细胞。然后利 用合适的融合试剂如聚乙二醇使淋巴细胞与无限增殖细胞系融合以形成杂交瘤细胞 (Goding，《单克隆抗体原则与实践》(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice), 第59-103页(1986))。无限增殖细胞系通常为转变的哺乳动物细胞，具体是啮齿类动 物、牛和人类的骨髓瘤细胞。通常采用大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在含有一种或多种抑制为融合的无限增殖细胞的生长或存活的物质的合适的培养基 中培养。例如，如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)， 培养杂交瘤的培养基一般将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷("HAT培养 基")，该物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。一些实施方式中本发明的抗体为与包含SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14,或SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18的抗体竞争结合CCX-CKR2的嵌合的或人源化抗体。如 上所述，抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白，其中人抗体的互补决定区(CDR)的残 基被如具有所需专一性、亲和性和能力的小鼠、大鼠或兔子这样的非人物种的CDR残基所取代。例如，SEQIDNO:12和SEQIDNO:14，或SEQ ID NO:16和SEQ ID NO: 18的CDR可插入人抗体骨架中。可采用本领域已知的各种技术制备人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom 和Winter, /Mo/, 5/o/. 227:381(1991); Marks等，Mo/, 5/o/. 222:581(1991))。 Cole 等和Boerner等的技术还可用于制备人单克隆抗体(Cole等，Mo"oc/owa"w油oofes am/ Ca騰r 77^r卿，第77页(1985)和Boerner等，J. ImmunoU47(l): 86-95 (1991))。类 似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，如内源免疫球蛋白基因已被 部分或全部失活的小鼠中来制备人抗体。通过攻击来观察各方面包括基因重排、组 装和抗体清单，与人中见到的极为相似的人抗体产物。该方式描述于美国专利号 5,545,807; 5,545,806; 5，569，825; 5，625，126; 5,633,425; 5,661,016，和以下禾斗学出 版物Marks等，10: 779-783 (1992); Lonberg等，A^we 368:856-859 (1994); Morrison, A^we 368: 812-13 (1994); Fishwild等，A^we 14:845-51 (1996); Neuberger， A^rt^e说otecA"o/ogy 14:826 (1996); Lonberg禾口 Huszar， /"tem. TmmMwo/. 13:65-93 (1995)。一些实施方式中，本发明的抗体为单链Fv(scFv)。 ScFv抗体的Vh和VL区(如 SEQIDNO:12和SEQIDNO:14，或SEQIDNO:16和SEQ ID NO:18)包含折叠形成 与在双链抗体中发现的相似的抗原结合位点的单链。 一旦折叠，非共价相互作用稳 定单链抗体。尽管一些抗体实施方式的Vh和Vl区可直接連接在一起，技术人员将 意识到该区域可被由一种或多种氨基酸组成的肽接头所分隔。肽接头及其用途为本 领域公知。参见例如Huston等，iVoc,淑'"cac/. 腦8:5879 (1988); Bird等， Sc/e"ce 242:4236 (1988); Glockshuber等，5/oc/zem/s^y 29:1362 (1990);美国专利号4， 946， 778、美国专利号5， 132， 405禾卩Stemmer等，5滅c崎酒14:256-265 (1993)。总体上该肽接头除了将Vh和VL区之间连接起来或维持其最小距离或其它空间关系之外不具有其它特异性生物活性。然而，可选择肽接头的组成氨基酸来影响分子的一些属性如折叠、净电荷或疏水性。单链Fv(scFv)抗体任选包括长度不超过50个氨 基酸，通常不超过40个氨基酸，优选不超过30个氨基酸，和更优选不超过20个氨 基酸的肽接头。 一些实施方式中，肽接头是序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQIDNO: 23) 的多联体，优选2、 3、 4、 5或6条此类序列。然而，应该认识到可以进行接头内的 一些氨基酸取代。例如，用缬氨酸取代甘氨酸。制备scFv抗体的方法已描述于参见Huse等，&/e"ce 246:1275-1281(1989); Ward
等，A^加re 341:544-546 (1989);禾卩Vaughan等，TNtowre 14:309-314 (1996)。简单地说，分离免疫动物B细胞内的mRNA并制备cDNA。采用特异于免疫球蛋白 重链和轻链可变区的引物扩增cDNA。纯化PCR产物并与核酸序列连接。如果需要 接头肽，将编码肽的核酸序列插入到重链和轻链核酸序列间。将编码scFv的核酸插 入载体并在合适宿主细胞中表达。特异性结合所需抗原的scFv—般通过在噬菌体展 示文库中进行淘选而找到。可通过任何方法进行淘选。利用表面表达所需抗原的细 胞或利用包被有所需抗原的固体表面进行常规淘选。为了方便，该表面可以是磁珠。 从固体表面洗涤掉未结合的噬菌体并洗脱结合的噬菌体。根据选择方法的效力并依赖可筛选的克隆数目和完成的严格性找到具有最高亲 和性的抗体。 一般，更高的严格性对应于更具选择性的淘选。然而，如果条件太严 格，将找不到噬菌体。 一轮淘选之后，结合CCX-CKR2包被平板或结合在其表面表 达CCX-CKR2的细胞的噬菌体在大肠杆菌中扩增并接受另一轮淘选。以这种方式， 许多折叠的富集发生于3轮淘选中。因此，即使每轮中的富集很低，多轮淘选将引 起稀少噬菌体的分离并且其含有的遗传物质编码带有最高亲和性或一种在噬菌体上 较好表达的scFv。不考虑所选的淘选方法，噬菌体展示提供的基因型和表型之间的物理连接使得 在甚至大克隆文库中检测cDNA文库中每一成员对抗原的结合成为可能。一个实施方式中，抗体为双特异性抗体。双特异性抗体为对至少两种不同抗原 具有结合特异性或对相同抗原上两种表位具有特异性的单克隆抗体，包括但不限于 人抗体或人源化的抗体。 一个实施方式中， 一种该结合特异性为针对CCK-CKR2蛋 白，另一种是针对另一个不同的癌抗原。或者，四聚体类型技术可创建多价反应物。一些实施方式中，抗体结合到效应部分。该效应部分可以是任何分子，包括可 检测标记部分如放射性标记或荧光标记，或可以是治疗部分。其它实施方式中，治疗部分为细胞毒剂。该方式中，将细胞毒剂靶定到癌组织 或细胞上，引起受难细胞数目减少，从而减少癌症相关症状。细胞毒剂有各种各样 包括但不限于细胞毒药或毒素或此类毒素的活性片段。合适的毒素及其相应片段包 括白喉A链、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、麻疯树毒素、巴豆毒 素、酚霉素、依诺霉素、auristatin等。细胞毒剂还包括将放射性同位素结合到本发 明抗体制成的放射化学物质。本发明的抗体可采用许多公知免疫结合试验来检测表达CCX-CKR2或CCX-CKR2的细胞(参见例如美国专利4,366,241; 4,376,110; 4,517,288和4,837,168)。 有关免疫试验的综述也可参见《细胞生物学方法(MethodsinCellBiology)》，37巻， Asai编，Academic Press, Inc.，纽约(1993);《基础和临床免疫学》(Basic and Clinical Immunology),第7版，Stites和Terr编(199"。因此，本发明提供了检测表达CCX-CKR2的细胞的方法。 一种方法中，对个体 进行活检并对收集到的组织进行体外检测。然后，用本发明的抗CCX-CKR2抗体接 触组织的组织或细胞。得到的任何免疫络合物均提示活检样品中存在CCX-CKR2蛋 白。为了帮助此类检测，可将抗体进行放射性标记或与是检测标记的效应分子如荧 光标记偶联。另一种方法中，可采用成像系统体内检测细胞。然后，确定标记的位 置。可采用传统的视觉诊断成像方法。例如，顺磁同位素可用于MRI。由于胞外结 合易于被胞外酶环境清除和被循环清除，因此抗体内化对相比胞外结合延长其在器 官中的生命周期很重要。CCX-CKR2蛋白还可通过标准免疫试验方法和本发明的抗体来检测。标准方法 包括，例如放射性免疫试验、夹心免疫试验(包括ELISA)、免疫荧光试验、蛋白质印 迹法、亲和色谱(结合固相的亲和配体)和用标记抗体进行原位检测。还可采用次级检 测试剂，如山羊抗小鼠FITC。可采用技术的总述可在Harlow和Lane，《抗体:实验 室手册》(Antibodies: A Laboratory Manual)(1988)中找到。本发明提供了检测癌细胞的方法，包括提供一种预防或诊断癌症的方法。至今 为止CCX-CKR2表达于每种检测的癌细胞附近，但是CCX-CKR2的正常(非癌性)表 达看似受肾脏和一些大脑细胞以及某种发育阶段的胚胎肝脏的限制。参见例如 PCT/US04/34807和美国专利申请号10/698,541和10/912,638。因此，CCX-CKR2在 细胞，具体是非胚胎细胞和/或除肾脏或大脑细胞外的细胞中表达表示可能存在癌细 胞。CCX-CKR2存在于组织血管内皮上还可表示存在癌。 一些情况中，采用本领域 已知的其它方法证实，包含CCX-CKR2表达细胞的样品中存在癌细胞。根据本发明的还有另一个方面，提供了为患有或怀疑患有癌症个体提供选择疗 程的方法。该方法包括从个体中获得生物样品，用特异性结合CCX-CKR2的抗体或 其抗原结合片段接触该样品，检测抗体结合的存在或不存在，并选择适于该个体癌 症的疗程。 一些实施方式中，所述治疗是给予该个体本发明的CCX-CKR2抗体。本发明提供了诊断人类疾病的方法，所述疾病包括但不限于癌症如瘤、神经 胶质瘤、间皮瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、成 胶质细胞瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌和伯基特淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结肠
直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆管癌、胆囊癌、 小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、宫颈癌、 阴道癌、子宫癌、卵巢癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、胰腺癌、胰腺内分 泌癌、类癌、骨癌、皮肤癌、视网膜母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(其它癌症参见《癌症:原理和实践》(CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE)(DeVita， V.T.等编，1997));以及脑和神经功能障碍，如阿耳茨海默病和多发性硬化；肾功能 障碍；类风湿性关节炎；心脏同种异体移植排斥；动脉粥样硬化；哮喘；肾小球肾 炎；接触性皮炎；炎性肠病；结肠炎；银屑病；再灌注损伤；以及本文中描述的其 它病症和疾病。 一些实施方式中，个体未患有卡波西肉瘤、多中心Castleman病或 AIDS相关原发性渗出性淋巴瘤。 ///. CCX"-C02A鉴定遭鄉残伴腳鄉预诚可采用许多不同的筛选方法来鉴定在细胞中，具体是在哺乳动物细胞中，且尤其是在人细胞中调控CCX-CKR2活性水平或功能的试剂。总而言之，筛选方法包括， 例如通过结合CCX-CKR2并阻止本发明的抗体结合CCX-CKR2或活化CCX-CKR2 而从大多数试剂中筛选以确定一种与CCX-CKR2(或其胞外区)相互作用的试剂。一些 实施方式中，试剂结合CCX-CKR2的亲和性是试剂结合另外蛋白质的至少大约1.5、 2、 3、 4、 5、 10、 20、 50、 100、 300、 500或1000倍。 1 .趋化因子受体结合试验一些实施方式中，CCX-CKR2调控因子通过筛选与本发明的抗体竞争结合 CCX-CKR2多肽的分子来确定。本领域技术人员将认识到有许多方法可进行竞争性 分析。 一些实施方式中，将带有CCX-CKR2的样品与标记的本发明抗体(如至少包含 SEQIDN0:12、 SEQIDN0:14、 SEQ ID NO:16禾口/或SEQ ID NO:18的CDR的抗体) 预培养，然后接触潜在竞争者分子。在测试化合物存在的情况下，抗体结合 CCX-CKR2的量的变化(如减少)指示该测试化合物为潜在的CCX-CKR2调控因子。可通过筛选能结合CCX-CKR2的试剂来进行初筛，这是因为至少这样确定的试 剂中至少有些可能是趋化因子受体调控因子。该结合试验通常包括用一种或多种检 测试剂接触CCX-CKR2并给予充分时间让蛋白质与检测试剂形成结合复合物。形成 的任何结合复合物均可采用任何已经建立的分析技术检测。蛋白质结合试验包括单 不限于免疫组织化学结合试验、流式细胞术、放射性配体结合、铕标记配体结合、 生物素标记配体结合或维持CCX-CKR2构象的其它试验。此类试验采用的趋化因子 受体可以是天然表达、克隆的或合成的。可利用结合试验来确定激动剂或拮抗剂。例如，通过用潜在激动剂接触CCX-CKR2并检测CCX-CKR2活性，就有可能确定那 些刺激CCX-CKR2活性的分子。2. 细胞和试剂本发明的筛选方法可以通过体外或以基于细胞的试验来进行。体外试验通过例 如包含CCX-CKR2的膜碎片或完整细胞来进行。基于细胞的试验可在任何表达 CCX-CKR2的细胞中进行。基于细胞的试验利用包含CCX-CKR2的完整细胞或细胞碎片来筛选以试剂结合 CCX-CKR2或调控CCX-CKR2活性的试剂。本发明的可采用的示例性细胞类型包括 如，任何哺乳动物细胞包括白细胞如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细 胞、嗜碱细胞、肥大细胞和淋巴细胞如T细胞和B细胞、白血病细胞、伯基特淋巴 瘤、肿瘤细胞、内皮细胞、周细胞、纤维母细胞、心肌细胞、肌肉细胞、乳腺癌细 胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、成胶质细胞瘤细胞、肝细胞、肾细胞和神经元细胞 以及真菌细胞(包括酵母)。细胞可以是原代细胞或肿瘤细胞或其它类型的无限增殖细 胞系。当然，CCX-CKR2可以在不表达内源性CCX-CKR2的细胞中表达。某些情况下，CCX-CKR2片段，以及融合蛋白，均可用于筛选。在需要竞争结 合CCX-CKR2配体的分子时，采用的CCX-CKR2片段为能结合本发明抗体的片段。 或者，CCX-CKR2的任何片段均可用作鉴定结合CCX-CKR2的分子的耙。CCX-CKR2 片段可包括任何片段，如CCX-CKR2中至少20、 30、 40、 50个氨基酸直到包含除 一个氨基酸外所有氨基酸的蛋白质。 一般地，配体结合片段将包含CCX-CKR2的跨 膜区和/或大部分或所有胞外区。3. 信号传导和粘连活性一些实施方式中，由CCX-CKR2活化所触发的信号传导被用来确定CCX-CKR2 分子。趋化因子受体的信号传导活性可以许多方式确定。例如，信号传导可通过检 测趋化因子受体介导的细胞粘连来确定。趋化因子和趋化因子受体间的相互作用能 通过调控整联蛋白的亲和力和亲合力来引起快速粘连。参见例如Laudanna， 7w聽wo/og/ca/i ev/e薦186:37-46 (2002)。信号传导还可通过定性并定量地确定次级信使如环状AMP或磷酸肌醇来检测， 以及还可监控磷酸化或去磷酸化事件。参见例如Premack等，Atowe 2: 1174-1178 (1996)和Bokoch，肠od 86:1649-1660 (1995)。此外，还可监控CCX-CKR2活化下游的其它事件来检测信号传导活性。下游事
件包括作为趋化因子受体的刺激结果而发生的那些活动或表现。示例性下游事件包 括如，细胞时期改变(如从正常变为癌细胞或从癌细胞变为非癌细胞)。细胞应答包括 细胞粘连(如粘连到内皮细胞)。已建立的涉及血管发生的信号传导级联(如VEGF介导的信号传导)还可监控由CCX-CKR2调控因子产生的影响。可例如在小鸡绒(毛)膜 尿囊膜中估计试剂促进血管发生的能力，如Leung等(1989) Sc/e"ce 246:1306-1309 所述。另一种选择是用大鼠角膜进行试验，如Rastinejad等(1989) Ce〃 56: 345-355 所述。其它试验公开于美国专利号5,840,693。还可采用卵巢血管发生模型(参见例如， Zimmerman, R.C.等，(2003) J C7/"./"ve" 112:659-669; Zimmerman, R.C.等(2001) M/crawwc. 62:15-25;和Hixenbaugh， E.A.等(1993)i ec. 235: 487-500).其它筛选方法基于以下观察CCX-CKR2的存在或活化能诱导某种调控蛋白质 的表达。因此，对此类蛋白质的检测可用于间接确定CCX-CKR2的活性。进行了一 系列ELISA研究来比较转染有CCX-CKR2细胞和未转染细胞的各种分泌蛋白质在细 胞培养基中的相对浓度。通过这些研究确定了 CCX-CKR2能诱导许多分化调控蛋白 质包括生长因子、趋化因子、金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂的产生。因此，所提 供的一些筛选方法包括确定检测试剂是否调控CCX-CKR2产生某种生长因子、趋化 因子、金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂。 一些情况下，这些试验采用在限制血清条 件下生长的细胞(或其提取物)来进行，因为发现这样能增加CCX-CKR2诱导的蛋白 质的产生。以下蛋白质为检测到的各种类型蛋白质的例子，并给出了各类中具体的蛋白质 (l)生长因子(如GM-CSF); (2)趋化因子(如RANTES、 MCP-1); (3)细胞因子(如IL-6); (4)金属蛋白酶(如MMP3);和(5)金属蛋白酶抑制剂(如TIMP-1)。预计也可检测到这 些不同类别中的其它蛋白质。这些具体的蛋白质可用本领域已知的标准免疫学检测方法进行检测。例如，适 用于高通量模式的一种方法是在多孔平板上进行的ELISA。检测TIMP-1的ELISA 试剂盒购自DakoCytomation(产品编号:EL513)。针对IL-6和MMP3的ELISA试剂盒 可获自R and D Systems。特异性结合上面列出的蛋白质的抗体的供应商的进一步例 子在如下例子中提供。酶类的蛋白质如金属蛋白酶也可通过已知的酶学试验进行检其它实施方式中，检测CCX-CKR2潜在调控因子调控细胞粘连的能力。肿瘤细 胞粘连内皮细胞的单层被作为转移性侵入的模型来研究(参见例如Blood和Zetter， 所ov/zew.说o; /z;^. ^"a， 1032， 89-119(1990))。这些内皮细胞单层模拟淋巴脉管系统
并可被各种细胞因子和生长因子(如TNF ct和IL-1 e )刺激。可用静态粘连试验以及使 细胞处于流动条件下以模拟体内脉管系统作用力的试验来评估表达CCX-CKR2的细 胞粘连接到该单层的能力。而且，评估粘连的试验还可在体内进行(参见例如von Andrian， U. R Mfcra">cw/"^w. 3(3): 287-300 (19%)》 4.确认通过任何前述筛选方法最初确定的试剂可被进一步检测以确认其表现的活性。 优选的此类研究采用合适的动物模型来进行。此类方法的基本步骤包括给予作为人 类的疾病模型的动物在初级筛选中确定的导联化合物，然后判断疾病(如癌症、心肌 梗塞、伤口愈合或与血管发生相关的其它疾病)是否实际上得到调控和/或疾病或病症 是否改善。在确认研究中采用的动物模型通常为任何类型的哺乳动物。合适的动物 的特定例子包括但不限于灵长类、小鼠、大鼠和斑马鱼。一些实施方式中，采用关节炎动物模型来筛选和/或确认调控CCX-CKR2的试剂 的治疗用途。示例性关节炎动物模型包括，如，胶原诱导的关节炎(CIA)动物模型。 与CCY-Cffi 2務互^^效试浙CCX-CKR2的调控因子(如拮抗剂或激动剂)可包括，例如，抗体(包括单克隆抗 体、人源化抗体或本领域已知的其它类型的结合蛋白)、小有机分子、siRNA、 CCX-CKR2多肽或其变体、趋化因子(包括但不限于SDF-1和/或I-TAC)、趋化因子 模拟物、趋化因子多肽等。检测CCX-CKR2调控因子的试剂可以是任何小化合物或生物实体，如多肽、糖、 核酸或脂质。或者，调控因子可以是趋化因子或其它配体的遗传改变形式或肽模拟 物形式。典型地，测试化合物是小化学分子和肽。实质上，任何化合物都可用作本 发明试验中的潜在调控因子或配体，尽管最常采用可溶解于水性溶液或有机溶液(特 别是基于DMSO的溶液)的化合物。设计该试验以通过一般平行进行的自动化试验步 骤和为实验提供任何便利来源的化合物来筛选大的化学库(如，在机器人试验中采用 微量滴定平板上的微量滴定模式)。应该认识到有许多化合物的供应商，包括Sigma(St Louis ， MO)、 Aldrich (St. Louis ， MO)、 Sigma-Aldrich (St. Louis， MO)、 Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs ， 瑞士傳。一些实施方式中，该试剂的分子量小于1， 500道尔顿， 一些情况下小于1， 000、 800、 600、 500或400道尔顿。需要相对小分子量的试剂是因为较小分子相比分子量 较大的试剂更可能具有与好的药物代谢动力学特征(包括口服吸收)相一致的物理化 学属性。例如，由于其渗透性和溶解性而不太可能成为成功的药物的试剂由Lipinski 等描述如下(具有超过5个H键的供体(表达为OH和NH的总和))；具有超过500 的分子量；具有超过5的LogP(或超过4.15的MlogP);和/或具有超过10个H键的 受体(表达N和O的总和)。参见例如Lipinski等"dvDragDe//veo; 23:3-25(1997)。取代生物运载体的化合物类型一般是该规则的例外。一个实施方式中，高通量筛选方法包括提供一种包含大规模可能的治疗化合物 (可能的调控因子或配体化合物)的组合化学或肽文库。然后用本文中描述的一种或多 种试验筛选此类"组合化学文库"或"配体文库"来确定呈现所需特征活性的那些文库成员(特别是化学的种类或亚类)。由此确定的化合物可作为常规"导联化合物" 或可将其本身用作可能的或实际的治疗药物。组合化学文库为通过组合许多化学的"构件块"由化学合成或生物合成产生的 各种化合物的集合。例如，线性组合化学文库如多肽文库是通过对给定化合物长度(即 多肽化合物中的氨基酸数目)在每一种可能方向上组合一系列化学构件块(氨基酸)而 形成的。很多化合物可通过此类组合性混合化学构件块来合成。组合性化学文库的制备和筛选为本领域技术人员所公知。此类组合性化学文库 包括但不限于肽文库(参见例如美国专利5， 010， 175， Furka， 尸印AA" 37: 487-493 (1991)和Houghton等，Atow^ 354:84-88(1991))。还可采用产生化学多样性文 库的其它化学物质。此类化学物质包括但不限于类肽(如，PCT公开号WO 91/19735)、编码的肽(如，PCT公开号WO 93/20242)、随机生物寡聚物(如，PCT公 开号WO 92/00091)、苯并二氮萆(如，美国专利号5,288,514)、多聚体(diversomer)如 乙内酰脲、苯并二氮萆和二肽(Hobbs等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993))、插烯多肽(Hagihara等，J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568(1992))、带有葡萄糖骨 架的非肽类肽模拟物(Hirschmann等，J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992))、类 似的有机合成小化合物文库(Chen等，J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994))、寡氨基 甲酸酯(Cho等，&&"ce 261:1303 (1993))和/或肽基磷酸酯(Campbe11等，《/ Og. C/zem. 59:658 (1994))、核酸文库(参见Ausubel、 Berger和Sambrook，均同上)、肽核酸文库 (参见例如美国专利5， 539， 083)、抗体文库(参见例如，Vaughn等，A^wre 5/ofec/wo/ogy， 14(3): 309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文库(参见例如， Liang等，Science, 274: 1520-1522 (1996)和美国专利5,593,853)、小有机分子文库(参 见例如苯并二氮萆，Baum C&EN， 1月18日，第33页(1993);类异戊二烯(美国专 禾ij 5,569,588);噻唑烷酮(thiazolidinone)和间硫吗啉酮(metathiazanone)(美国专利 5,549,974);吡咯烷(美国专利5,525,735和5,519,134);吗啉代化合物(美国专利 5,506,337);苯并二氮萆(5,288,514等)。制备组合文库的设备可商业化购得(参见例如357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech， Louisville KY， Symphony, Rainin， Woburn， MA， 43 3A Applied Biosystems， Foster City, CA， 9050 Plus, Millipore， Bedford, MA)。而且，各种组合文库本身为 商业化提供(参见例如ComGenex, Princeton, N丄，Tripos， Inc., St丄ouis， MO， 3D Pharmaceuticals, Exton， PA， Martek Biosciences, Columbia, MD等)。化舰、贿发主浙CCY-CJO 2縱纽欽舒面本发明的抗体可在体外、体内或先体外后体内(即从体内取出、处理并放回体内) 情况下接触表达CCX-CKR2的细胞。本发明的抗体可直接给予哺乳动物个体以在体 内调控趋化因子受体活性。 一些实施方式中，该抗体与SDF1和/或I-TAC竞争结合 CCX-CKR2。本发明的一些实施方式中，该抗体识别的表位与SEQIDNO:12和SEQ IDNO:14、或SEQIDNO:16和SEQIDNO:18中CDR结合的表位相同。 一些实施方 式中，该抗体包含SEQIDNO:12禾口/或SEQIDNO:14、或SEQ ID NO:16禾口/或SEQ ID NO: 18一些实施方式中能够，CCX-CKR2抗体被给予癌症患者。 一些情况下， CCX-CKR2调控因子被施用来治疗癌症，如瘤、神经胶质瘤、间皮瘤、黑素瘤、淋 巴瘤、白血病、腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、成胶质细胞瘤、白血病、淋巴瘤、 前列腺癌和伯基特淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞 肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆管癌、胆囊癌、小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱 癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、宫颈癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、甲 状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、胰腺癌、胰腺内分泌癌、类癌、骨癌、皮肤癌、 视网膜母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(其它癌症参见《癌症:原理和实践》 (DeVita， V.T.等编，1997));以及脑和神经功能障碍，如阿耳茨海默病和多发性硬化； 肾功能障碍；类风湿性关节炎；心脏同种异体移植排斥；动脉粥样硬化；哮喘；肾 小球肾炎；接触性皮炎；炎性肠病；结肠炎；银屑病；再灌注损伤；以及本文中描 述的其它病症和疾病。 一些实施方式中，个体未患有卡波西肉瘤、多中心Castleman 病或AIDS相关原发性渗出性淋巴瘤。本发明还包含通过给予本发明的抗体在任何需要的个体中增加血管发生。例如， 通过用本发明的抗体接触CCX-CKR2来减少CCX-CKR2活性而增加血管发生有用于 抑制肿瘤，特别是固体肿瘤的形成、生长和/或转移。有关调控CCX-CKR2和血管发 生的实施方式的描述描述于如美国专利申请号11/050,345。
涉及不需要的或有问题的血管发生的其它病症包括类类风湿性关节炎；银屑 病；眼部血管发生病，如糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植片排斥(comeal graft rejection)、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织增生症； Osler-Webber综合征；心血管发生；斑块新生血管发生；毛细血管扩张；血友病关节； 血管纤维瘤；内皮细胞过度或异常刺激病，包括肠粘连、克罗恩病、皮肤病如银屑 病、excema和硬皮病、糖尿病、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、年龄相关的 黄斑变性、动脉粥样硬化、硬皮病、创口肉芽和肥厚性瘢痕即瘢痕瘤，和以血管发 生为病理性结果的疾病如猫抓病和溃疡(幽门螺旋杆菌(i/e/fco^c妙刃/on'))也可用本 发明的抗体进行治疗。血管发生抑制剂可用于预防或抑制粘连，尤其是如开创性或 腹腔镜外科手术和臀部收縮术(bum contractions)后引起的腹膜内或骨盆性粘连。应该 能利用血管发生抑制剂有效处理的其它病症包括由移植术引起的瘢痕化、肝硬化、 急性呼吸窘迫综合征引起的肺纤维化或其它新生儿肺纤维化、临时假体植入、和脑 与硬膜之间的术后粘连。子宫内膜异位症、息肉病、心肌肥大、以及肥胖也可通过 抑制血管发生来治疗。这些病症可涉及其它类型的正常组织的尺寸增加或生长，如 子宫纤维瘤、前列腺肥大和淀粉样变性病。本发明的抗体可预防性地或治疗性地用 于本文中所述的任何症状或疾病。用本发明的抗体来降低CCX-CKR2活性也可用于预防新生血管生成来有效治疗 宿主病症。因此，例如，减少血管发生可用作为治疗血管病症(如血管瘤和动脉粥样 硬化斑块中的毛细血管增殖)、肌肉病症(如心肌血管发生、心肌梗塞或平滑肌内的血 管发生)、关节(如关节炎、血友病关节等)和其它血管发生相关病症的一部分。促进 血管发生也可帮助加速各种生理进程并治疗需要增加血管形成的疾病如伤口愈合、 骨折和烧伤、炎症、心肌缺血和外周血管病。本发明的抗体也可用于增进伤口愈合。并非打算将本发明限制于特定的作用机 制，可以是CCX-CKR2的拮抗使得内源性配体结合到较低亲和性受体上来代替，从 而触发增进的伤口愈合。例如，SDF-1结合CCX-CKR2和CXCR4，然而对CXCR4 的亲和具有较低亲和性。类似地，I-TAC结合CXCR3相比I-TAC结合CCX-CKR2 具有较低亲和性。通过阻止这些配体结合CCX-CKR2， CCX-CKR2拮抗剂使得这些 配体结合到其它受体上，从而增进伤口愈合。因此，相比于通过用激动剂刺激 CCX-CKR2活性来增进伤口愈合，CCX-CKR2拮抗剂可采用不同机制介导来增进伤 口愈合。除了治疗与新生血管形成相关的病症和症状，抑制拮抗剂还可用于调控或预防
新生血管性乘相关的正常生理状况的发生。因此，例如本发明方法可用于节育。根据本发明，降低CCX-CKR2在卵巢或子宫内膜中的活性能减少与排卵、胚芽植入、胎盘形成等相关的新生血管形成。血管发生抑制剂还具有其它治疗用途。例如，本发明的抗体可用于以下(a) 消除脂肪组织并治疗肥胖。参见例如《o/om>z等，A^we ^f"/Zc/朋10(6): 625-632 (2004)。(b) 治疗先兆子痫(preclampsia)。参见例如Levine等，W J! Med 350(7): 672-683 (2004); Maynard等,C//"./廳"111(5):649-658 (2003);禾口(c) 治疗心血管疾病。参见例如March等，Jw. J /Vi^/o/. C/rc.尸/z;^W. 287: H458-H463 (2004); Rehman等，C/rcw/油ow 109:1292-1298(2004)。K絲微欽射激本发明的药物组合物可包括本发明的抗体和药学上可接受的载体。药学上可接 受的载体部分由特定给药组合物以及由用来施用该组合物的特定方法所决定。因此, 本发明的药物组合物的合适制剂有很多种(参见例如《雷明顿药物科学(Remington 's Pharmaceutical Sciences)》，第17版，1985)。适用于给药的制剂包括水溶液和非水溶液、等渗无菌溶液(可包含抗氧化剂、缓 冲液、抑菌剂和使该制剂等渗的溶质)和水性悬液和非水悬液(可包含悬浮剂、增溶剂、 增稠剂、稳定剂和防腐剂)。本发明的操作中，组合物可通过口服、经鼻、局部、静 脉内、腹膜内、皮下或鞘内给药。化合物制剂可以单剂或多剂封闭容器如安瓿和药 水瓶存在。溶液和悬液可由上述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。所述组合物可通过输液泵的方式给药，例如，用来递送胰岛素或化疗物质到特 定器官或肿瘤的类型。本发明的组合物可采用注射剂或导管直接注射到肿瘤或在切 除之前或之后注射到原发性肿瘤附近。本发明的组合物可按需局部或全身给药。对 延长的局部给药而言，抗体可以通过缓释植入注射到肿瘤附近来给药。或者，可用 质粒体外转染个体细胞从而表达本发明的抗体，之后将其注射到肿瘤附近。用于局部治疗皮肤病时，酶抗体可以软膏剂或凝胶施用到皮肤。一些实施方式中，本发明的CCX-CKR2抗体可与其它合适的治疗剂包括如化疗 剂、放射剂等组合施用。对用于组合治疗的合适试剂的选择可由本领域普通技术人 员根据常规药物学原理来确定。治疗试剂的组合可以协同作用来影响各种病症如癌 症、伤口、肾功能障碍、脑功能障碍或神经功能障碍的治疗或预防。采用该方法， 即能够用较低剂量的每种试剂实现疗效，从而降低副作用的可能。 本发明内容中给予患者的剂量应该足以在对象内长时间引起有益反应(如减小肿 瘤尺寸或肿瘤负荷)。针对任何患者的最佳剂量水平依赖于各种因素，包括采用的特 定调控因子的效力、年龄、体重、生理活性、和患者的日常饮食、关于与其它药物 的可能组合、和关于特定疾病的严重性。剂型的大小也将由伴随给予特定化合物或 载体到特定对象的任何副作用的存在、性质和程度所决定。在确定要施用的抗体有效量过程中，医生可评估抗体的循环血浆水平、抗体毒 性和抗抗体抗体的生产。总体上，对典型对象而言，抗体的等效剂量约为lng/kg-10mg/kg。为了给药，当被用于全身并考虑对象的全身健康时，本发明的抗体可以由抗体 的LD-50以及各种浓度下抗体的副作用所决定的速率进行给药。受体免疫系统对抗 体的清除也可影响给药的合适剂量。给药可通过单剂量或多剂量实现。可给予包含本发明抗体的组合物以进行治疗性或预防性治疗。在治疗性应用中， 给予患有疾病(如癌症、关节炎或其它CCX-CKR2相关疾病或病症)的患者的组合物 的量足以治疗或至少部分阻止疾病及其并发症，如縮小肿瘤尺寸等。足以实现上述 目的的量被定义为"治疗有效量"。对该目的有效的量取决于疾病的严重性和患者的 总体健康状态。可根据剂型和所需频率以及患者的耐受程度单次或多次施用组合物。 任何事件中，该组合物应该能提供足以有效治疗患者的足够量的本发明的试剂。能 够在哺乳动物中防止或减缓癌症的发展的调控因子的量被称为"预防有效量"。预防 治疗所需的特定量依赖于哺乳动物的医疗条件和病情历史、所要预防的特定的癌症、 以及其它因素如年龄、体重、性别、施用路径、效力等。此类预防性治疗可用于如 之前患过癌症的哺乳动物以预防癌症复发、或被怀疑具有患癌症的显著可能性的哺 乳动物。本发明的抗体可单独施用或与一种或多种其它药物联用。可能的组合搭档可包 括如添加的抗血管发生因子和/或化疗剂(如细胞毒剂)或放射剂、癌症疫苗、免疫调 节剂、抗血管剂、信号转导抑制剂、抗增殖剂或凋亡诱导物。本发明的抗体可与阻断整联蛋白衔接的抗体和肽、抑制金属蛋白酶的蛋白质和 小分子(如marmistat)、阻断内皮细胞内的磷酸化级联的试剂(如herbamycin)、血管发 生的已知诱导物的显性负受体、抗血管发生诱导物的抗体或阻断其活性的其它化合 物(如苏拉明)、或通过其它方式发生作用的其它化合物(如维生素A、 IL-4、干扰素等)。 实际上，由于此类因素可通过各种机制调控血管发生，采用本发明的抗体与其它抗 血管发生剂组合能够更有效(可能协同地)已知所针对组织内的血管发生。抗血管发生剂，如MMP-2(基质金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质金属蛋白酶 9)抑制剂和COX-II(环氧合酶II)抑制剂均可用于与本发明的抗体和本文中描述的药 物组合物联合。本发明的抗CCX-CKR2抗体还可与信号转导抑制剂如能够抑制 EGFR(表皮生长因子受体)应答的试剂，如EGFR抗体、EGF抗体和EGFR抑制剂分 子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂如VEGF受体和能抑制VEGF的分子；以及 erbB2受体抑制剂如结合erbB2受体的有机分子或抗体，例如HERCEPTINtm(美国加 里福尼亚旧金山南部的Genentech， Inc.)共同使用。本发明的抗CCX-CKR2抗体还可与能促进血管发生和/或伤口愈合的其它药物 组合。本领域技术人员可意识到，当将该组合物应用于需要血管发生的所需部位时， 可掺入一种或多种用于医学外科的物质或治疗剂，例如那些可进一步加强血管发生 反应和/或加速和/或有益改善愈合过程的物质。例如，为了进一步促进血管发生、修 复和/或组织生长，所述组合物中可包含至少一种激素、生长因子或促有丝分裂蛋白 质，如成纤维细胞生长因子、血小板衍生的生长因子、巨噬细胞衍生的生长因子等。 此外，所述组合物中还可包含抗菌剂，如抗生素如硫酸双生霉素或红霉素。其它可 用于医学外科的试剂可包括消炎剂、镇痛剂、麻醉剂、红玉黄菌素、酶、抗组胺剂 和染料。本发明的抗CCX-CKR2抗体还可组合有其它药物包括治疗关节炎的药物。此类 试剂的例子包括消炎治疗剂。例如，糖皮质类固醇如氢化泼尼松和甲泼尼松为常用 的消炎药物。非类固醇类消炎药物(NSAID)也用于抑制炎症。NSAID抑制环氧合(COX) 酶、COX-l和COX-2，其对在发炎部位过量产生的前列腺素的产生很重要。而且， 促炎症细胞因子、肿瘤坏死因子a(TNFa)与多种发炎事件包括关节炎相关，抗TNF a疗法被已临床应用。VII.为用于诊断性和/或预防性应用的试剂盒为了应用于上述诊断、研究和治疗用途，本发明还提供试剂盒。在诊断和研究 用途中此类试剂盒可包含以下的任何或所有试验试剂、缓冲液和本发明的抗 CCX-CKR2抗体。治疗产品可包括无菌盐水或另一种药学上可接受的乳剂和悬浮基。而且，该试剂盒可包含含有对本发明方法的操作的指导(即方案)的指导材料。尽 管指导材料一般包括手写或印刷的材料，它们并不局限于此。能够储存此类指导并 将它们传播到终端用户的任何媒介均被本发明所涵盖。此类媒介包括但不限于电子 储存媒介(如磁盘、磁带、胶巻、芯片)、可视媒介(如CDROM)等。此类媒介可包括 提供此类指导材料的互联网站点地址。实施例公认制备G蛋白偶联受体(GPCR)的抗体非常困难。发明人采用加拿大专利申请CA 2 350 078中描述的Genovac AG， DE方法。结合CCX-CKR2的抗体通过用表达 CCX-CKR2(SEQ ID NO:l)的cDNA接种小鼠来产生。简单地讲，CCX-CKR2被克隆 入表达载体，用基因枪方法将该载体接种入小鼠。在合适的时间点分离B细胞，通 过标准技术与骨髓瘤细胞融合，选择融合的杂交瘤细胞进行体外培养。通过流式细 胞计数分析克隆培养物的上清液对被CCX-CKR2稳定转染的细胞的结合。扩增阳性 克隆并进行再一轮的流式细胞计数筛选。认为单克隆抗体6E10和11G8结合CCX-CKR2。抗体6E10和11G8检测内源性 不产生CCX-CKR2的转染细胞系以及内源性表达CCX-CKR2的细胞(如HeLa和 MCF-7(ATCC， VA))上的CCX-CKR2。而且该抗体能识别CCX-CKR2的小鼠同源物。 例如，抗体6E10和11G8检测小鼠乳腺肿瘤细胞系4T1和Lewis肺癌细胞(ATCC， Va)上的CCX-CKR2。在被CCX-CKR2转染的HEK293细胞系上检测到抗体6E10和 11G8，但未检测到非同种型对照，但这两种抗体不结合被空载体或表达其它趋化因 子受体(如CXCR2)转染的HEK293细胞。放射性配体竞争性结合试验证实抗体还是中和性的。抗体6E10和11G8与SDF-1 和I-TAC竞争结合小鼠和人CCX-CKR2。抗体11G8通常比抗体6E10显示更高的趋 化因子结合抑制百分比。在固定的石蜡包埋组织切片上进行的免疫组织化学(IHC)试验中，抗体6E10和 11G8还识别CCX-CKR2。对各种组织类型的实验中，抗体6E10和11G8的IHC染 色与各个组织上结合有放射性标记SDF或I-TAC的结合试验所确定的表达模式相匹 配。例如在E13胎鼠切片中发现CCX-CKR2染色，但在E17胎鼠或成年鼠的切片中 未发现。CCX-CKR2染色也见于稳定表达人CCX-CKR2的细胞的细胞离心涂片中。确定了重链和轻链可变区编码序列和预测的氨基酸序列。6E10的重链可变区包 含在SEQ ID NO:12 (SEQ ID NO: 11所编码)中。6E10的轻链可变区包含在SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 13所编码)中。11G8的重链可变区包含在SEQ ID NO: 16 (SEQ ID NO: 15所编码)中。11G8的轻链可变区包含在SEQIDNO:18(SEQIDNO:17所编码)中。
离附加的权利要求的精神和范围。本说明书中所引用的所有出版物、数据库、Genbank序列、专利和专利申请均纳 入本文作为参考，正如其被明确地和分别地表明为作为参考而包含在本文中那样。<formula>formula see original document page 32</formula> SEQ ID NO:4 CCX-CKR2.2氨基酸序列MDLHLFDYAEPGNFSDISWPCNSSDCIWDTVMCPNMPNKSVLLYTLSFIYIFIFVIGMTCKVTHLIFSINLFSGIFFLTCMSVDRYLSITYFTNTPSSRKKMVRRVVCILVWLLAFC VSLPDTYYLKTVTSASNNETYCRSFYPEHSIKEWLIGMELVSVVLGFAVPFSIIAVFYFTEYSALEQNAKSEQ ID N0:5 CCX-CKR2.3编码序列CAGAGACGGAGTACTCTGCCTTGGAGCAGAGCACCAAATGA SEQ ID NO:6 CCX-CKR2.3氨基酸序列SEQ ID NO:7 CCX-CKR2.4编码序歹ljETEYSALEQSTK <formula>formula see original document page 34</formula>SEQ ID NO: 12抗体6E10重链可变区的氨基酸序列VRQSPEKGLEWVGQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRTEDT GIYYCTSLRYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPVAPGSLSEQ ID NO: 13抗体6E10轻链可变区的DNA序列SEQIDNO:14抗体6E10轻链可变区的氨基酸序列TYPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSKLG SEQIDNO:15抗体11G8重链可变区的DNA序列ATCCCTTGGCCCCTGGAAGCTTGG SEQIDNO:16抗体11G8重链可变区的氨基酸序列VRQTPEKRLEWVAYITNGGDRSYYSDTVTGRFIISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAM YYCARQGNWAAWFVYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSLSEQDDNO:17抗体11G8轻链可变区的DNA序列G ，"AGAAGGT Ac cAA ^3c GA GG TAs就c订5TGcl丽w灯G ST G5 cG AG AA wA Ac ATccccGGTGTcc丽GGccccccccAGcAAAAccGAcGTc rT_T S丁 PG t:T TG c丁 AG GG G微gT rG Mb cA <JA T_5 GG GJ GG MT wc wc Mw GG AG cK GP AG GcK AS cbecTGcTc LT ^G AT AA GA TA GG AG AT TP GG AA cA wc A庙BG aT T^ cG bG Aa c丁 y丁 bG mc SA SH AM Ac cb AA cT GTTm GG cG GA GG 、A Ac AA虹c MT Ac GG tT Tc yT GA cG KG GT Tc c^ cS TccS cT TJ c^ AG ct cJ TG cT Ac wt cTGTccA GA bG AA TG AA cA Pc AM cG 1T Hy c^ cT TG §c JA rac Tc AG Ac cc cAT cT乂 cw GA Tt GT TG GA G汀A GSAGG g gT 丁 TS y TM G cWAGS TG cA ac Tc G订Gg GS G5 GA 丁A ct ATTTGfi Gc t:T ^G仏T "5T Ac G^ G汀GH GG丌GGTcTGT AT GG TA 9G AG ^J GA T乂G T，Gc仏wccTG打HG 1)T ^c AG ^c Ac AG AG AG cT cc GA AG GG TA TG cA AA cc JG G丁 GG TT cc TA cm AGT AA Ac cc cG GA GSEQIDNO:18抗体11G8轻链可变区的氨基酸序列MKLPVRLLVLMFWIPASTSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSHYrVHSDGNTYLE WYLQKPGQSPKLLrYKVSNRFSGWDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGrYYCFQGS HVPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSKLG
权利要求
1.一种抗体，其竞争性抑制竞争者抗体与CCX-CKR2的结合，其中所述竞争者抗体含有以下序列的互补决定区(CDR)SEQ ID NO12和SEQ ID NO14；或SEQ ID NO16和SEQ ID NO18。
2. 如权利要求l所述的抗体，其特征在于，所述抗体连接可检测标记。
3. 如权利要求l所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
4. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体为人源化抗体。
5. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体含有SEQ ID N0:12和 SEQ ID N0:14的互补决定区(CDR)。
6. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体含有SEQ ID N0:12和 SEQ ID NO:14。
7. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体含有SEQ ID NO: 16和 SEQ ID N0:18的互补决定区(CDR)。
8. 如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体含有SEQ ID N0:16和 SEQ ID NO:18。
9. 一种药物组合物，包含药学上可接受赋形剂和权利要求1的抗体。
10. 如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
11. 如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体为人源化抗体。
12. 如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体含有SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 14的互补决定区(CDR)。
13. 如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体含有SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14。
14. 如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体含有SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 18的互补决定区(CDR)。
15. 如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体含有SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18。
16. —种在生物样品中检测表达CCX-CKR2的细胞的方法，所述方法包括用权 利要求1的抗体接触该生物样品并检测抗体的存在。
17. —种抑制血管发生或癌细胞增殖的方法，所述方法包括用权利要求1的 抗体接触细胞的步骤。
18. 如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述细胞位于个体内。
19. 如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述个体患有或易患关节炎。
20. 如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述个体非人。
21. —种确定CCX-CKR2调控因子的方法，其特征在于，包括(a) 将表达CCX CKR2多肽的细胞或所述细胞的提取物与检测试剂混合；和(b) 进行实验以检测检测试剂是否与竞争者抗体竞争结合CCXCKR2多肽，其 中，所述竞争者抗体含有以下序列的互补决定区(CDR):SEQ ID NO:12禾卩SEQ ID NO:14;或 SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18，其中竞争者抗体与检测试剂之间就结合CCX-CKR2多肽存在竞争指示该检测 试剂为CCX CKR2活性调控因子。
22. —种检测检测试剂调控CCX-CKR2活性的效力的方法，其特征在于，所述方法包括(a) 将检测试剂给予第一动物；(b) 给予第二动物与竞争者抗体竞争结合CCXCKR2多肽的抗体，其中该竞争 者抗体含有以下序列的互补决定区(CDR):SEQ ID N0:12和SEQ ID NO: 14;或 SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18;和(c) 通过比较检测试剂对第一动物的影响和抗体对第二抗体的影响来确定检 测试剂的效力。
23. —种多肽，含有SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16或SEQ ID N0:18。
24. —种多核苷酸，编码SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16或 SEQ ID NO:18。
25. 如权利要求24所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸含有SEQID NO:11、 SEQ ID NO:13、 SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17。
26. —种制备嵌合抗体的方法，所述方法包括可操作地将编码至少一种SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16或 SEQ ID N0:18的互补决定区(CDR)的多核苷酸连到至少编码抗体重链或轻链的骨 架区的异源多核苷酸，以形成编码抗体的嵌合体重链或轻链的融合多核苷酸；和由融合多核苷酸表达嵌合体重链或轻链。
全文摘要
提供了结合CCX-CKR2的抗体及其使用方法。
文档编号C07K16/00GK101163718SQ200680013393
公开日2008年4月16日 申请日期2006年4月19日 优先权日2005年4月21日
发明者M·霍华德, T·沙尔 申请人:凯莫森特里克斯股份有限公司