专利名称：：免疫球蛋白级分及其方法
技术领域：
：本发明涉及用作食品添加剂的含有IgA的组合物的制备。更具体地，本发明涉及制备富集IgA的乳制品提取物组合物的方法以及这样的组合物。
背景技术：
：根据以前在本领域作的工作理解本发明。然而，以下的讨论并非承认或认可任何引用的材料在本申请的优先权日之前在澳大利亚被公开、使用或是作为公知常识的一部分。免疫球蛋白A(IgA)是在人的分泌物(包括乳汁)中主要的免疫球蛋白，其为机体提供抵抗病原体的保护，其结合到引起疾病的病毒、细菌、真菌及它们的毒素。IgA为嬰儿提供抵抗上述病原体的必需保护。当口服时IgA抗体是有效的，这是因为其抵抗肠内酶的降解，因此使得其理想地作为营养品(nutraceuticals)或食品补充剂。IgA可与益生菌联用以抑制或降低由病原体引起的副作用。应用包括将IgA作为营养品成分以靶向病原体，所述病原体引起人粘膜表面例如鼻、眼、耳、肺、乳房部和阴道的感染。此外，含有IgA的产品适于肠和口部健康应用。由于通常存在于牛奶中的IgA水平低，以商业规模提高IgA产量的现有方法是通过免疫方案以提高牛奶中的水平。典型地，牛奶包含比率为约1:8的IgA和IgG。目前在全世界以实际上相同的方式使用实质上相同的方法生产用于食品消费的含有IgA的组合物。最常见的生产方法被称为超免疫法，借助此法给大量的牛施用致免疫物质(例如病毒)以产生超免疫应答。作为超免疫应答的结果，由赋予免疫性的牛产生的牛奶含有增加量的IgA，也称为"超免疫奶"。然后使用标准的膜技术浓缩所述超免疫奶以产生含有约5。/。w/wIgA的乳产品提取物，所述提取物可用作食品补充剂，例如婴儿配方奶。该生产超免疫奶的方法的固有问题在于，免疫法方案通常需最多达三个月在牛内产生超免疫应答，并且还需一个月收获足够数量的超免疫奶以生产商业数量的含有IgA的乳产品提取物。另外，与本发明的方法相比，此方法还是昂贵的。由于可变的糖基化，IgA具有在约4.5-6.5范围内的酸性等电点或pl，通常认为其不能以具有商业价值的量吸附到阳离子交换树脂上。本发明的方法令人惊奇地使得可以通过调节装载和洗脱条件，通过阳离子交换色谱从乳产品(例如脱脂乳)中分级IgA。这样的方法以前还未以商业规模实现。此外，本发明的方法还可包括在纯化乳产品的其它组分(例如乳铁传递蛋白、乳过氧化物酶或生长因子)的现有方法中，作为其一部分。此方法的一个实例是其中乳产品与阳离子交换树脂接触，随着流动相离子强度的增加，通过依次洗脱，首先洗脱富集IgA的级分，随后是贫IgA的乳过氧化物酶级分，然后是乳铁传递蛋白级分。发明概述本发明涉及制备富集IgA的乳产品提取物組合物的方法，其不需要超免疫牛并因此避免了与此相关的时间和成本。因此，本发明的目的在于提供富集IgA的乳产品提取物组合物以及其方法，所述方法可以以商业规模使用，其克服了现有技术中的至少一些缺点。术语"富集IgA的"意为在洗脱的乳产品提取物中IgA:IgG的比率与在分级之前的乳产品中的IgA:IgG的比率相比增加。根据本发明的一个方面，提供了制备富集IgA的乳产品提取物组合物的方法，所述组合物包含从乳产品中提取的IgA和IgG，其中IgA与IgG的相对含量与乳产品中IgA与IgG的相对含量相比升高，所述方法包括提供乳产品源；阳离子交换树脂；和流动相；使乳产品与阳离子交换树脂接触，使得IgA与IgG相比优先吸附在阳离子交换树脂上；用流动相洗脱所述阳离子交换树脂；以及收集洗脱的富集IgA的级分。对本领域的技术人员而言，显而易见的是在富集IgA的乳产品提取物组合物的制备中，所述乳产品不必局限于全牛奶，而是其它乳产品也可用作原料。在本发明的另一方面中，提供一种方法，其中所述乳产品选自全乳、脱脂乳、乳清和初乳。生产富集IgA的乳产品提取物组合物的特定条件可以变化，并仍产生富集IgA的级分。因此，在本发明一个优选的方面中，提供一种方法，其中采用含有0.05-0.4MNaCl(0.29-2.34%w/v)或等同离子强度、优选0.08-0.35MNaCl(0.47-2.05%w/v))、更优选约0.17MNaCl(1%w/v)或等同离子强度的流动相进行洗脱。在替代方案中，可以使用其它合适的等同离子强度的流动相溶液。在本发明的另一方面中，流动相的pH为4.5-9，优选5.5-7.5，最优选pH约6.5。在本发明的另一方面中，在所述接触步骤期间，所述乳产品吸附于阳离子交换柱的流量可为6-90升每升树脂每小时(h)(线性流速60-900cm/h)。优选地，使用的流量为6-70升每升树脂每小时(h)(线性流速60-700cm/h)，更优选为6-40升每升树脂每小时(h)(线性流速60-400cm/h)。在这些流量下，已发现对于IgA的最佳分级，与阳离子交换树脂接触的乳产品的量为约16-300柱(床)体积，优选16-200柱体积，更优选16-40柱体积。在本发明的另一方面，在洗脱富集IgA的级分之前，用低离子强度的緩沖液(〈0.008M的盐或其等同物)或水清洗阳离子交换树脂，以除去残留在柱中的乳产品。此外，在本发明中可使用不同类型的阳离子交换树脂，其中优选Sepharose阳离子交换树脂珠，例如SPSepharoseBigBeads。进一步优选的是粒径范围为45-300nm的树脂珠。在本发明的另一方面中，提供一种方法，其中阳离子交换树脂包括Sepharose珠，优选在45-300fim的粒径范围内。本发明的方法可作为连续方法或作为分批方法使用，优选连续方法。随后可处理洗脱的富集IgA的级分以降低其中的盐含量。脱脂乳含有约1-2.5%的IgGw/w和0.05-0.1%的IgAw/w,牛血清含有20°/。的IgGw/w和0.4%的IgAw/w。发明人发现，采用本发明的方法获得的乳产品提取物浓缩物(洗脱物)令人惊奇地含有比预期更低水平的IgGw/w，其中IgA:IgG的比率通常在l:2的级别上，这等同于IgA浓缩了八至十六倍。使用ELISA(酶联免疫吸附法)试剂盒进行IgA和IgG的定量。对于那些想要在食品物质中提供增加的IgA水平或作为营养品的人来说，IgA:IgG比率的增加具有重要的意义。之前未知在阳离子交换色镨洗脱物中IgA的存在和IgA与IgG的相对量(比率)。因此，本发明的另一方面提供一种方法，其中所得的富集IgA的乳产品提取物组合物包含至少1:8的IgA:IgG比率，优选1:4，更优选至少1:2。可进一步处理富集IgA的乳产品提取物组合物，以减少存在的非IgA蛋白质的量。这可通过膜过滤、柱色谱、透析或其它已知的方法实现。对于标准化的食品物质或营养品的生产而言，这些无关蛋白质的去除可以i人为是重要的。在本发明的另一方面中，提供富集IgA的乳产品提取物组合物，其中IgA:IgG的比率至少为1:8，优选为1:4，更优选为至少1:2。根据本发明的另一方面，提供通过本发明的方法得到的富集IgA的乳产品提取物组合物。此外，本发明的乳产品提取物可被用作食品物质或营养品，优选作为嬰儿食品物质或营养品。本发明的结果尤其令人惊奇，因为认为免疫球蛋白属于具有酸性等电点的一类蛋白质，因此不大可能保留在阳离子树脂上，或以与IgG相比优先结合IgA的方式保留在阳离子树脂上。应当理解，本文描述的本发明不应当限于公开特征的具体实施例。图2A-2C-洗脱剂的盐浓度和流量对IgA洗脱的影响。图3A-3E-与阳离子交换树脂接触的乳产品体积的影响。图4A-4C-与阳离子交换树脂接触的脱脂乳产品体积的影响。图5A-5D-流动相pH对洗脱的IgA组成的影响。图6A-6C-来自乳清蛋白浓缩物(WPC)的IgA纯化。图7A-7E-分离富集IgA的级分、乳铁传递蛋白和乳过氧化物酶的方法；流动相离子强度对不同级分中IgA的影响。具体实施例方式以下是对制备本发明的富集IgA的级分的详细描述。IgA的合适来源可包括乳产品，例如来自哺乳动物例如人、牛、绵羊、山羊、母猪等的全乳、脱脂乳、乳清或初乳。在使乳产品与阳离子交换树脂接触以使IgA吸附时，乳产品的pH优选约为6.5，尽管对于本发明不必调节乳产品的pH。用于使乳产品与阳离子交换树脂接触的流量可在大的范围内变化，例如从6-卯升每升树脂每小时(线性流速60-900cm/h),优选6-70升每升树脂每小时(线性流速60-700cm/h),更优选约6-40升每升树脂每小时(线性流速60-400cm/h)。通过用于工业过程的成本有效性确定下限，从而在非常低的流量下，运行此方法的成本超过了回报。高流量适于IgA的纯化，前提是与树脂接触的乳产品的总量是有限的。当大大超过树脂体积的乳产品体积适于纯化其它乳产品例如乳过氧化物酶和乳铁传递蛋白时，如在澳大利亚专利no.613688中所描述的，本发明人已发现乳产品体积相对于树脂体积在1000级别上的柱体积(升乳产品每升树脂)不适合通过本发明的方法进行IgA的纯化。发明人发现，乳产品体积相对于树脂体积超过约400的柱体积，导致很少的IgA结合到树脂，并且相对于起始原料中的IgG，回收的IgA不会富集。根据本发明，在脱脂乳的情况下，优选的上限为约300柱体积，优选约200柱体积，最优选约34柱体积。随着乳产品相对于树脂的比率增加，结合的IgA的数量和洗脱的IgA的纯度逐渐降低。至于流量，下限通过商业因素而非与柱相关的因素设定。如果装栽的乳产品的体积下降大幅低于16柱体积，则达到清洗和洗脱时间超过可纯化足够的IgA以使得此方法经济上可行的点。在将乳产品装载到阳离子交换树脂的步骤之后，且在用流动相洗脱IgA之前，可通过用水或离子强度小于例如0.0086M氯化钠的緩冲液清洗柱来除去阳离子交换柱内的未结合的乳产品。在洗脱吸附的IgA时，使用由緩冲溶液组成的流动相，所述緩冲溶液具有0.086-0.4M的氯化钠、氯化钾或等同的低离子强度。不限制在流动相中使用的盐的类型。随着离子强度增加超过0.4，IgA的纯度降低，这是因为非IgA蛋白质开始洗脱，因此其它蛋白质稀释了IgA。优选地，使用等同于或小于0.35M氯化钠的离子强度。流动相可具有宽范围的pH，例如4.5-9.0,优选5.5-7.5，最优选约6.5。在上限和下限处，蛋白质稳定性和蛋白质与阳离子交换树脂结合的能力均受影响。5.5-7.5的pH提供最高的IgA纯度，同时不降低产率。在本发明中，适于吸附IgA的阳离子交换树脂的类型可包括例如为Sepharose阳离子交换树脂珠的树脂。例如，分别含有磺丙基官能团和羧甲基基团的SPSepharoseBigBeads和CMSepharose珠(GEHealthcare的产品)是合适的。阳离子交换树脂珠的粒径优选在45-300jim的范围内。根据本发明，在45-165jun范围内和在100-300nm范围内的SPSepharose珠都适合用于IgA的吸附和纯化。可对富集IgA的乳产品提取物组合物进行的进一步处理之一是通过例如透析或超滤进行脱盐。可对富集IgA的乳产品提取物组合物进行的另一种处理是除去非IgA蛋白。可通过进一步的色谱法(例如免疫吸附或体积排阻)除去非IgA蛋白。本发明的富集IgA的乳产品提取物组合物可用作食品物质或营养品，优选用作嬰儿食品物质或营养品。可在分离中进行本发明的方法以制备富集IgA的乳产品提取物组合物，或可以引入本发明的方法作为完整的分级方法的一部分，在所述完整的分级方法中，分级其它所需的乳产品提取物。制备富集IgA的级分和贫IgA级分的方法
技术领域：
：本发明一个优选的方法是用大于45fiM(理想地为90-300nM)的SP(磺丙基)琼脂糖凝胶装填10cm高的柱。以11ml/分钟(线性流速331cm/h或0.55柱体积(CV)/分钟)，向柱中加入乳产品(理想地为脱脂乳)流直到上柱的乳的体积为装填到柱中的树脂体积的134.6倍。以2.5CV的低离子强度(<0.05%(0.0086M)NaCl或等同物)的緩冲液或3.5ml/分钟(线性流速147cm/h或0.25CV/分钟)的水去除保留在柱中的乳10分钟。通过以3.5ml/分钟(线性流速102cm/h或0.175CV/分钟)流过阳离子溶液20分钟，用3.5CV的含有等于1。/。(0.171M)NaCl的钠离子的pH6.5的緩冲液，将富集IgA的级分从柱中洗脱。排出弃去最初的3分钟(0.5CV)，收集其后的20分钟(3.5CV)作为富集IgA的级分(包括3分钟与下一緩冲液应用时间的重叠，即穿透时间)。通过以3.5ml/分钟(线性流速102cm/h或0.175CV/分钟)流过阳离子溶液20分钟，用3.5CV的含有相当于2.5%w/v(0.43M)的NaCl的钠离子(尽管其它阳离子也将是适合的)的緩冲液，将贫IgA的乳过氧化物酶级分从柱中洗脱。排出弃去最初的3分钟(0.5CV)，收集其后的20分钟(3.5CV)作为贫IgA的乳过氧化物酶级分(包括3分钟的与下一緩冲液应用时间的重叠，即穿透时间)。通过使阳离子溶液以3.5m1/分钟(线性流速102cm/h或0.175CV/分钟)流动20分钟，用3.5CV的含有等于2.5%w/v(0.43M)NaCl的钠离子的pH6.5的緩冲液，从柱中洗脱第二级分一贫IgA的乳过氧化物酶。排出弃去最初的3分钟(0.5CV)，收集其后的20分钟(3.5CV)作为贫IgA的乳过氧化物酶级分(包括3分钟[0.5CV与下一緩冲液应用时间的重叠，即穿透时间)。通过使阳离子溶液以3.5ml/分钟(线性流速102cm/h或0.175CV/分钟)流动20分钟，用3.5CV的含有等于8.75%w/v(1.5M)NaCl的钠离子的pH6.5的緩沖液，从柱中洗脱乳铁传递蛋白级分。排出弃去最初的3分钟(0.5CV)，收集其后的20分钟(3.5CV)作为乳铁传递蛋白级分(包括3分钟[0.5CV与下一援沖液应用时间的重叠，即穿透时间)。测定回收的蛋白质级分的IgA、IgG和生长因子IGF1的含量。相对于l。/。w/v的NaCl，用1.125%w/v的NaCl洗脱，增加了富集IgA的级分中的IgA的量并大幅降低了存在于随后级分(乳过氧化物酶和乳铁传递蛋白)中IgA的量(图7A、图7B)。此外，通过用1.125%w/v的NaCl洗脱，富集IgA的级分中的IgG的量减少了50%(图7C)。通过在更高NaCl浓度下洗脱，IgA:IgG的比率也大幅提高(图7D)。用0.172MNaCl和0.193MNaCl洗脱IgA，分别得到具有1:2.01和1:0.92的IgA:IgG比率的级分。有利的是在富集IgA的级分中没有IGF1(图7E)。在富集IgA的级分中发现4艮少的乳过氧化物酶(在0.172M和0.193M的NaCl下均<0.005%w/v)，并且在乳铁传递蛋白级分中发现很少的乳过氧化物酶(在0.172M和0.193M的NaCl下均<0.005%w/v)，^^乳过氧化物酶级分中发现了大量的乳过氧化物酶(在0.172MNaCl时为0.074%w/v，在0.193MNaCl时为0.073%w/v)。在富集IgA的级分中发现很少的乳铁传递蛋白(在0.172MNaCl时为0.02mg/ml，在0.193MNaCl时为0.06mg/ml)，并且在乳过氧化物酶级分中发现很少的乳铁传递蛋白(在0.172MNaCl时为0.01mg/ml，在0.193MNaCl时为0.03mg/ml)，但在乳铁传递蛋白级分中发现<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>权利要求1.一种制备富集IgA的乳产品提取物组合物的方法，所述组合物包含从乳产品提取的IgA和IgG，其中所述IgA与IgG的相对含量与所述乳产品中的IgA与IgG的相对含量相比增加，所述方法包括提供乳产品源；阳离子交换树脂；和流动相；使所述乳产品与所述阳离子交换树脂接触，使得与IgG相比IgA优先吸附于其上；用所述流动相从所述阳离子交换树脂洗脱富集IgA的级分；和收集洗脱的富集IgA的级分。2.根据权利要求l的方法，其中所述乳产品选自全乳、脱脂乳、乳清、优选奶酪乳清、初乳。3.根据权利要求1或2的方法，其中与所述阳离子交换树脂接触的所述乳产品的量是约16柱体积到约300柱体积。4.根据权利要求1或2的方法，其中与所述阳离子交换树脂接触的所述乳产品的量是约16柱体积到约40柱体积。5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中在洗脱富集IgA的级分之前，以低离子强度(〈0.008M的盐或其等同物)的緩冲液或水清洗所述阳离子交换树脂以除去保留在柱中的乳产品。6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中用含有0.05-0.4MNaCl(0.29-2.34%w/v)或等同的离子强度的流动相进行洗脱。7.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中用含有0.08-0.35MNaCl(0.47-2.05%w/v)或等同的离子强度的流动相进行洗脱。8.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中用含有0.17MNaCl(l%w/v)或等同离子强度的流动相进行洗脱。9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中用pH在5.5-7.5范围内的流动相进4亍洗脱。10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中所述阳离子交换树脂包括Sepharose珠。11.根据权利要求10的方法，其中所述Sepharose珠在45-300nm的粒径范围内。12.根据权利要求1至11中任一项的方法，其中在所述乳产品与所述树脂接触的步骤期间，所述阳离子交换树脂经受约6-卯升每升树脂每小时的流量。13.根据权利要求12的方法，其中所述接触流量为约6-70升每升树脂每小时。14.根据权利要求12的方法，其中所述接触流量为约6-40升每升树脂每小时。15.根据权利要求1至14中任一项的方法，其中所述方法为连续方法或分批方法。16.根据权利要求1至14中任一项的方法，其中所述方法为连续方法。17.根据权利要求1至16中任一项的方法，由其得到的富集IgA的乳产品提取物组合物包含至少1:8的IgA:IgG比率，优选至少1:4,更优选至少1:2。18.根据权利要求1至16中任一项的方法，由其得到的富集IgA的乳产品提取物组合物包含至少2%w/w的IgA含量，优选至少10%w/w，更优选至少20%w/w。19.根据权利要求1至18中任一项的方法，其中进一步处理富集IgA的乳产品提取物组合物，以减少存在的非IgA蛋白质和/或盐的量。20.—种富集IgA的乳产品提取物组合物，其中IgA与IgG的比率为至少1:8,优选至少1:4，更优选至少1:2。21.—种富集IgA的乳产品提取物组合物，其通过权利要求1至19中任一项的方法得到。22.权利要求20或21的富集IgA的乳产品提取物组合物作为食品物质或营养品的用途。23.根据权利要求22的用途，其中所述食品物质为嬰儿食品物质或营养品。24.权利要求20或21的富集IgA的乳产品提取物组合物在制备用于治疗或预防由病毒、细菌、真菌及它们的毒素引起的疾病的药物中的用途。25.权利要求20或21的富集IgA的乳产品提取物组合物作为靶向病原体的营养品成分的用途，所述病原体引起人粘膜表面例如鼻、眼、耳、肺、乳房和阴道的感染。全文摘要本发明涉及用作食品添加剂的含有IgA的组合物的制备。更具体地，本发明涉及制备富集IgA的乳制品提取物组合物的方法以及这样的组合物。文档编号C07K1/22GK101171261SQ200680016015公开日2008年4月30日申请日期2006年5月10日优先权日2005年5月10日发明者安德鲁·布朗,彼得·霍布曼,理查德·佩因,米歇尔·罗尼申请人:墨累古尔本合作有限公司