专利名称：：白蛋白溶液的制作方法白蛋白溶液本发明涉及一种从含有能占据白蛋白结合位点的稳定剂分子的原料白蛋白溶液制备白蛋白水溶液的方法，所述方法中，为了提高对其它分子的白蛋白结合能力(ABiC)，例如那些具有生理作用的分子结合能力，至少要除去原料白蛋白溶液中白蛋白上的一部分稳定剂分子使它们与原料白蛋白溶液分离。
背景技术：
：在许多可导致器官衰竭的严重疾病中，血管容量和血管含血量之间不匹配起着主要作用。如果容量太大或者含血量太少，可引起血压降低器官不能被血液灌满。如果容量太小或含血量太多，则血压升高引起心脏机能不全和/或肺水肿。血管的含血量急剧和缓慢减少均可引起血压下降灌注减到最少。出血时会发生含血量急剧减少。缓慢的含血量减少例如可以是由于作为括容蛋白(onkotisch)的白蛋白浓度降低使得血液从血管床渗透入胞间隙而致血液丧失所引起(例如在肝病中白蛋白合成受影响时)。然而，血管容量的急剧和缓慢增长也可引起血压下降。急剧的血管扩张是由于例如在过敏性休克中产生的血管扩张纤维激素(vasodilatorytextilehormone)例如组胺、缓激肽、激肽释放酶、白细胞三烯或前列腺素的急性级联反应所引起。门动脉压缓慢升高导致的血管缓慢扩张与内脏网络微动脉扩张的增加相关，弓I起肝肾综合征和由于容量扩大而形成腹水。对每种病例均存在的容量和含血量不匹配可用两种治疗策略来改变。第一，可尝试通过给予拟晶体或胶体类血浆替代液来增加血管内含血量。如果这样平均动脉压仍然不足以使足够的血液流入所有器官，那么在第二个步骤中采用"升压剂"(血管收縮剂例如儿茶酚胺)使血管收缩。这种血管收縮方法具体可用于治疗肝病和败血症的血管张力丧失，以试图进一步减少血管系统的容量。在因较高水平血管扩张剂所引起急性或慢性血管扩张疾病中，单通过长时间输注来增加血量而不用血管收縮剂要维持足够的血压是不可能的。此类重症监护医学疾病的例子是因血压下降导致的肝脏衰竭和肝肾衰竭(由于血流不足引起肝衰竭继发肾衰竭)或败血症。这两种疾病均与高死亡率和高医疗费用相关联。现有的解决方案推荐联合给予血管收縮剂和血浆替代液。然而，现有的血浆替代液在血管中的存留时间有限。拟晶体(含盐)输注液会很快扩散入胞间隙。含聚合物的血桨替代液例如淀粉液(羟乙基淀粉、HAES)或明胶液(Gelaflindin)在血管中较长时间有效，因为它们的水结合性能够保持使得血浆液留在血管内而较长时间增加血管内含血量。然而，人造聚合物的问题是不相容。特别合适的血浆替代液是天然的血清白蛋白胶体溶液。血清白蛋白作为血浆扩充剂在医疗领域已使用了几十年，认为它具有最佳的生物耐受性因此是最优选的血浆扩充介质，尽管最昂贵。用于输注的人血清白蛋白溶液可商品化获得。然而，这些溶液必须添加稳定剂才能进行巴氏消毒和保存，和避免白蛋白的自发性聚合。通常单用或联用N-乙酰色氨酸和辛酸或它们的钠盐。这些稳定剂对白蛋白分子具有很高的结合亲和力可占据和阻断白蛋白生物学功能的重要结合位点。Meta-分析显示当与其它血浆血浆替代液比较时，在重症监护中采用血清白蛋白溶液与死亡率增加相关联(Cochranemeta-analysisinBMJ1998;317,第235-240页)。那么，除少数特殊适应症外，现有的白蛋白输注液看来没有临床价值。目前理论上不知道现有的血清白蛋白液制备方法对作为血浆扩充剂的血清白蛋白的理想性能如何起负面影响。该篇文献前后矛盾地提到稳定剂N-乙酰色氨酸和辛酸在某些情况下具有破坏性副作用。因为这些稳定剂高亲和力地占据封闭了对白蛋白重要功能所需的结合位点，故希望是否可以在给予患者白蛋白溶液之前除去这些稳定剂。然而，无稳定剂的白蛋白溶液具有上述问题即白蛋白自发聚合使得此种溶液很难保存。人血清白蛋白可结合的配体具有重要生物学功能在许多出版物中有所论述。综述可见J.Petersjr.,AllaboutAlbumin(有关白蛋白的一切)，AcademicPress,SanDiego，NewYork,Boston,London,Sydney,TokyoToronto,1996禾口在PacificiGM,VianiA，MethodsofDeterminingPlasmaandTextileBindingofDrugs(领iJ定血桨纤维蛋白所结合药物的方法)，ClinPharmacokinet,1992,23(6):449-468。由于测定白蛋白结合能力的方法非常多，结果难以比较对其医疗相关用途的解释实际上是不可能的。以建立的一种显示白蛋白结合行为的新方法是检测结合丹磺酰肌氨酸(dansylsarcosin)的白蛋白结合能力(ABiC)(KlammtS、BrinkmannB、MitznerS、MunzertE、LoockJ、StangeJ、EmmrichJ、LiebeS，AlbuminBindingCapacity(ABiC)isreducedincommerciallyavailableHumanSerumAlbuminpreparationswithstabilizers(商品化含禾急定剂的人血清白蛋白制品的白蛋白结合能力(ABiC)减弱)，ZeitschriftfUrGastroenterologie,增刊2001,39:24-27.)。这些方法是根据在预定的实验条件下检测测试的标记物丹磺酰肌氨酸的超滤部分和将这种结合能力与参比白蛋白作比较。在对健康献血者和严重肝病患者的比较中，观察到血清白蛋白的这种结合能力显著降低，其解释是由于所研究的患者肝脏解毒功能失调引起内源配体大量占据血清白蛋白的结合位点。已知商品化人血清白蛋白制品对特定模式标记物(例如布洛芬)的结合能力也受到显著限制。特己知在无配体的白蛋白中，如果将N-乙酰色氨酸以高摩尔比1:1的量分布加入，白蛋白结合丹磺酰肌氨酸的能力可从100%降低到约60%(根据Klammt等，2001，采用AbiC检测)。技术和医疗文献中包括了许多关于纯化供体血浆或用生物技术制备(重组)白蛋白的出版物属于所述。然而，这些出版物主要讲述的是关于最纯的白蛋白片段的可能制备物和从血浆中或在重组产物的情况下，从载体系统中去除其它蛋白质成分或可能的毒性成分。直到1976年，除去商品化血清白蛋白溶液中低分子量配体例如稳定剂的方法都采用基于用异辛垸和醋酸混合物抽提的Goodman方法(GoodmanDS，Science,125，1996，1957)，或采用基于在强酸介质中自发形成脂质层的William方法(WilliamsEJ和FosterJF，JAmChemSoc，81,965，1959)。这两种方法非常费时并且由于其潜在的毒性而不适合制备治疗用制品。用这些方法制备的白蛋白溶液在保存时稳定性极差。1967年以来，已在白蛋白溶液中加入游离脂肪酸例如辛酸作为稳定剂，可通过提高溶液的酸性再用活性炭处理将其从白蛋白溶液中去除。该方法最初由Chen等发表在JournalofBiologicalChemistry,第212巻，第2号，第173-181页，1967年1月25日。该方法中，用酸(HCl)将蒸馏水配的白蛋白溶液酸化至pH3或更低导致氢键断裂和相应的脂肪酸质子化而使白蛋白分子解折叠。这样使白蛋白与脂肪酸之间的键松驰，其程度能让脂肪酸以小分子扩散到活性炭中。然后，将白蛋白溶液与活性炭混合在冰浴中用磁性搅拌子搅拌1小时。接着，20200g离心此混合物分离除去活性炭。用这个方法可去除各种脂肪酸。去除脂肪酸的这种标准方法(至今)是依据对各种条件例如pH和活性炭与白蛋白的质量比的详细研究而建立的，至今为止，上述标准方法最为成功。因此，去除白蛋白分子中的稳定剂只能通过用强酸介质破坏白蛋白分子结构和同时降低结合亲和力来实现。在pH3以上不能成功地实质性降低人血清白蛋白中的游离脂肪酸。该方法的一个重要缺点是采用相当酸性的水性介质会改变白蛋白分子的结构，不仅会切断氨基酸之间彼此分开的成环键，还会打开疏水结合袋导致白蛋白增量吸附到所用的活性炭上。Chen等人发现在他们的方法中20。/。的白蛋白损失在炭颗粒中。由于白蛋白分子结构的改变会触发人血清白蛋白在保存时的自发性聚合，因此该方法不适合作为商品化治疗性白蛋白溶液的主要制备方法。因此，本发明的目的是提供一种对白蛋白温和的简单、快速和费用低廉的方法来制备稳定的商品化原料白蛋白溶液，例如在临给予患者之前可在病床旁去除大部分稳定剂而提高白蛋白结合能力却不破坏白蛋白结构的方法。具体而言，所述方法能提高白蛋白SudlowII结合位点的结合能力，在所有白蛋白应用于静脉血浆替代疗法中，此结合位点对内源性白蛋白搜寻固定毒素的作用至关重要，对体外脱毒方法，例如血浆交换白蛋白或体外白蛋白透析也至关重要。为了实现本发明的目的，本发明提供一种从含有能占据白蛋白结合位点的稳定剂分子的原料白蛋白溶液来制备白蛋白水溶液的方法，在提高白蛋白对其它分子的白蛋白结合能力(ABiC)的方法中，需要除去原料白蛋白溶液中白蛋白上的一部分稳定剂分子使其与原料白蛋白溶液分离，此方法中(a)使原料白蛋白溶液与固体吸附材料接触，该吸附材料对至少一部分优选所有稳定剂分子的亲和力高于白蛋白对相应稳定剂分子的亲和力；所述方法在pH〉3时进行；和(b)使白蛋白与吸附材料分离。特别优选所述方法在pH5-9时进行，更优选在6-8。特别优选的pH范围是6.9-7.5。目前医疗应用的人血清白蛋白中四分之一用作血浆替代介质(总共每年约200吨)，除了其胶体渗透性能外，完整的结合毒素(例如苯并二氮卓类)的性能起着主要作用，即可用于治疗肝病相关适应症。然而，商品白蛋白制剂的结合位点被稳定剂占据，反映为白蛋白结合能力(ABiC)下降，使此种性能受到限制。本发明方法使得可在给药地点附近制备商品化的、稳定的白蛋白溶液而无需活性pH处理。所制备溶液含有的白蛋白的ABiC提高。因此，人血清白蛋白作为血浆扩充剂的特性得到了临床改进，使得白蛋白的结合能力可与人血清白蛋白(HSA)的生理转运能力相媲美。对患者的循环肾和脑功能有积极影响并且显著改善了成本/效益比。本发明获得以下惊人的发现利用相应的方法采用合适的吸附材料，无需大大降低pH，即可简单、快速、无须大的花费而大量去除商品白蛋白溶液中所含的用来稳定和防止自发聚合的稳定剂，得到的白蛋白溶液输送能力以白蛋白结合能力(ABiC)衡量获得了提高。本发明的方法特别适合临时或在病床边制备商品化的稳定的白蛋白溶液，制备后可马上给予患者。此方法的另一优点是溶液中的白蛋白不会遭受现有技术采用的大大降低pH极端条件使白蛋白链中形成环和结合位点的结合键断裂而氨基酸彼此分离来去除白蛋白分子结合位点上的稳定剂。本发明的方法中，不会发生现有技术已知的可导致对白蛋白结构有害的改变。定义白蛋白结合能力(ABiC)本
发明内容中所述的白蛋白结合能力(ABiC)是用Klammt等的方法测定的。首先，用光散射测量法(浊度法)测定白蛋白溶液中的白蛋白浓度，然后稀释将溶液的白蛋白浓度调至150微摩尔/升或300微摩尔/升。接下来，加入等摩尔比的一体积含预定浓度的白蛋白结合位点II(安定结合位点)特异性荧光标记物(丹磺酰肌氨酸，SigmaChemical)的白蛋白溶液，25。C温育20分钟。温育后，通过超滤(CentrisartI,SartoriusG6ttingen;排除分子量:20000道尔顿)分离去除未结合的荧光标记物，用荧光光谱测定分离溶液中未结合的荧光标记物含量(Fluoroscan，Labsystems,芬兰；激发光:355nm;发射光:460nm)。为了加强荧光，在未结合的荧光标记物溶液中添加浓度150微摩尔/升或300微摩尔/升的无配体白蛋白(无脂肪酸，粉剂购自SigmaAldrich)。与样品氨基酸溶液一起，对相应的参比白蛋白溶液进行同样检测。参比是纯化的去配体的人血清白蛋白(BiSeKo,BiotestPharmaGmbH，Dreieich，德国)。或者，还可去除50名以上健康献血者(采用DeutschesRotesKreuz[德国红十字会]标准)合并血清白蛋白中的配体。白蛋白结合能力(ABiC)用以下公式计算ABiC[%]=未结合荧光标记物浓度(参比白蛋白)x100未结合荧光标记物浓度(样品白蛋白)NB:按照Klammt等的方法用上述公式测定的白蛋白结合能力(ABiC)不能给出白蛋白所有结合位点对配体的绝对结合能力，而是与参比白蛋白比较的结合SudlowII结合位点(安定结合位点)的配体的相对结合能力。因此，该数值可能超过100%。然而，这种标记物特别容易从结合键上去除，故这种专用的检测方法特别适用于检测白蛋白结合能力甚至最微小的变化。用N-乙酰色氨酸和/或辛酸或它们的钠盐作为稳定剂的常用商品化白蛋白溶液采用本文所述测定方法检测得到的白蛋白结合能力通常不到60%。本发明采用带有吸附剂的吸附方法，所用吸附剂在pH〉3，优选pH5-9时对所用的稳定剂(例如辛酸和/或N-乙酰色氨酸)的亲和力高于对白蛋白本身。采用本发明的方法，无需酸化超过100%(与参比白蛋白相比)在不到30分钟内即可提高商品化稳定白蛋白溶液中的白蛋白结合能力。本发明方法的一个基本优点是白蛋白不会经历极端条件(例如严重酸化或采用变性方法)发生结构的实质性变化，而基本上维持其天然构象。因此，输注入患者体内后，由于去除了稳定剂而结合能力提高，获得了比商品化白蛋白制品高得多的活性。本发明方法的另一优点是可利用便宜和简单的设备快速去除含稳定剂白蛋白溶液中的稳定剂，而制备去除稳定剂的白蛋白溶液。因此，在去除稳定剂后，不需要使白蛋白复性例如自发再生白蛋白内部的环(其与不确定地自发形成减少的或聚合的白蛋白分子相关关)。通常，去除稳定剂后，本发明的白蛋白溶液只需流经孔径65000道尔顿以上的颗粒滤除器来去除可能存在的粗颗粒。这使得此方法可在接近给药时刻(例如在病床旁)时实施。由于白蛋白常规用作血浆扩充剂给予病人，因此优选采用本发明的人血清白蛋白(HSA)。尽管本发明方法可用来去除许多稳定剂或其它配体，但特别适合用来去除稳定剂分子N-乙酰色氨酸和/或辛酸或它们的阴离子。本方法优选用于Ka值(结合常数)大于104的配体。本发明方法的一优选实施方式中，在步骤a)中使原料白蛋白溶液流经含有吸附材料的柱子(层析柱)使原料白蛋白溶液与吸附材料接触。本发明方法的另一实施方式中，在步骤a)中使原料白蛋白流经吸附材料形成的床使原料白蛋白溶液与吸附材料接触。一特别合适的例子是采用缓速搅拌器或振荡器或逆流器轻柔摇动的流体床。这可防止靠近吸附材料的填充床中的通道或通路被非常小的颗粒占据而阻止或阻断白蛋白溶液的流通量。如已提到的那样，在步骤b)中优选通过颗粒滤除器过滤白蛋白溶液来实现白蛋白溶液与吸附材料的分离，所选择的颗粒滤除期能让白蛋白通过而固体吸附材料留下。本发明方法的另一优选实施方式中，所述吸附材料结合于或位于基质上。合适的基质材料为支撑纺织物(例如聚合物纤维纺织物)或开孔聚合物泡沫结构(例如开孔聚氨基甲酸酯泡沫)。另一替代实施方式中，通过混合作为"间隔"的高度多孔颗粒使吸附材料颗粒同样简单地形成固体反应床，为吸附材料颗粒提供足够的空间和合适的通道尺寸。当固定于高度多孔的开孔聚合物泡沫中时，还可(例如)通过钻孔同时或随后产生通道。采用这一实施方式的优选填塞是采用能对相对高黏稠白蛋白溶液提供低灌注反压的纺织物或支撑聚合物的"疏松"填塞。而且，本说明书所采用的用来留住微粒的滤器比上述实施例中的要低级的多。本发明方法还有一优选实施方式中，重复步骤a)和b)多次，优选2-6次，每次都将步骤b)获得的处理过的白蛋白溶液再返回给步骤a)。为了提高稳定剂的去除速率，步骤a)中最好采用再生的和/或新鲜的吸附材料来去除稳定剂分子。这可通过在提供的设备中更换吸附材料来进行，但特别优选使白蛋白溶液依次进料通过顺序排列的多个装有吸附材料的吸附装置。本发明方法还有一优选实施方式中，选择好与原料白蛋白溶液中的白蛋白浓度相当的吸附材料用量和/或步骤a)中原料白蛋白溶液与吸附材料之间的接触时间，这样根据Klammt等的方法检测得到的白蛋白溶液的白蛋白结合能力(ABiC)至少是参比品的60%，优选至少70%，特别优选至少80%和还要特别优选至少90%。此式所需的吸附材料用量和接触时间将根据所用的原料白蛋白和所用的装置而不同，可由技术人员按其通用知识和技术来确定。本发明方法还有一优选实施方式中，选择好与原料白蛋白溶液中的白蛋白浓度相当的吸附材料用量和/或步骤a)中原料白蛋白溶液与吸附材料之间的接触时间，这样将原料白蛋白溶液中结合和未结合的稳定剂分子，具体是N-乙酰色氨酸和/或辛酸或它们的阴离子的浓度降到低于其初始浓度的70%，优选低于50%，特别优选低于30%和还要特别优选低于10%。吸附材料用量和接触时间将根据所用的原料白蛋白和所用的装置而不同，可由技术人员按其通用知识和技术来确定。本发明方法的还有一优选实施方式中，选择好与原料白蛋白溶液中的白蛋白浓度相当的吸附材料用量和/或步骤a)中原料白蛋白溶液与吸附材料之间的接触时间，这样将原料白蛋白溶液中结合和未结合的稳定剂分子，具体是N-乙酰色氨酸和/或辛酸或它们的阴离子的浓度降到低于其初始浓度的3.5摩尔/摩尔白蛋白，优选低于2.5摩尔/摩尔白蛋白,特别优选低于1.5摩尔/摩尔白蛋白和还要特别优选低于0.5摩尔/摩尔白蛋白。特别优选用于进行本发明方法的吸附材料是填装在柱内或床中或支撑基质上的微粒材料，这样可在吸附材料颗粒之间形成载流通道，其中覆盖所用的所有吸附材料颗粒之间形成的通道全长的平均通道直径为100nm-1000pm，优选小于500pm，更优选小于300pm和特别优选小于200|im，还要优选小于100pm。通道直径越小，白蛋白分子与吸附材料所形成的通道壁接触的概率或频率就越高，本发明方法的去除率也就越高。然而，通道尺寸一定不能太小而使白蛋白流速减缓太多。因此，如果覆盖所用的所有吸附材料颗粒之间形成的通道全长的平均直径为100nm-60pm是优选的，特别优选小于10nm。本发明方法一特别优选实施方式中，如下选择步骤a)中原料白蛋白溶液与吸附材料之间的最短接触时间dm[iim〗/10[pm/min〗S接触时间[min]Sdm[pm〗/0.1|>m/min]，其中"dm"指覆盖所用的所有吸附材料颗粒之间形成的通道全长的平均直径。如下选择步骤a)中原料白蛋白溶液与吸附材料之间的最短接触时间可更有效地去除(稳定剂)dm[|um]/4[jim/min]^接角虫日寸间[min]^dm[nm]/0.3[]im/min]，其中"dm"指覆盖所有吸附材料颗粒之间形成的通道全长的平均通道直径。本发明方法一特别优选实施方式中，所述吸附材料是活性炭。采用活性炭的优点是此材料形成悬液或粉剂，例如装填到柱中或作为吸附床材料。重要的是，活性炭粉末颗粒之间可形成通道，一方面形成的通道足够宽能让白蛋白溶液以足够流速流过吸附材料，另一方面通道又足够窄使得白蛋白溶液中的白蛋白分子在流过时能高频率地直接接触活性炭颗粒。特别优选活性炭粉颗粒之间形成的通道具有所引用的优选通道直径。覆盖活性炭颗粒之间形成的通道全长的活性炭颗粒产生的通道平均直径应是100nm-100(^m，优选小于500(im，特别优选小于300|im，更优选小于200pm和还要优选小于100|im。或者，也可将活性炭作为吸附材料包埋在固体多孔基质中，例如由纤维素、树脂或其它聚合纤维或开孔泡沫所形成的聚合物基质中。当将活性炭包埋在基质中时，应注意该基质要让白蛋白溶液流入并且该基质携带活性炭颗粒的方式应能使活性炭颗粒与白蛋白接触。而且，基质材料的孔隙率应能使孔形成直径为如上所述的通道可让白蛋白溶液流过。最好采用亲水性支撑基质，让吸附材料变湿。这样的支撑基质(例如)包括纤维素或其它天然或合成制备的亲水聚合物。活性炭颗粒本身是一种含有大孔(〉25nm)、细孔(l-25nm)和微孑L(〈lnm)的多孔材料，因此活性炭具有非常大的内表面积。活性炭的这些孔尺寸通常以糖蜜值(大孔)、亚甲蓝吸附(细孑L)和碘值(微孑L)表示。采用BET测定内表面积以m2/g活性炭表示。众所周知，活性炭是一种吸附介质，能吸收分子到其孔中留在那里或通过表面化学键固定物质。因为孔多和内表面积很大，活性炭相对它的重量或外部体积具有非常高的吸附能力。这取决于分子能否扩散进入这些孔中。本领域制备的商品化白蛋白的现状显示单用活性炭不足以去除含稳定剂白蛋白溶液中与白蛋白分子牢固结合的稳定剂，具体说是不能以可接受的速率去除。至今采用在浆液中加入作为吸附介质的活性炭去除白蛋白溶液中的稳定剂方法在pH超过3时不成功也证实了上述说法。已知的方法只有在强酸化和伴有白蛋白结构改变或变性后才能成功去除白蛋白中的稳定剂分子并成功地使它们结合于活性炭。本发明人目前发现对吸附材料颗粒(具体是活性炭)进行一种特别安排，即通过选择颗粒之间的通道尺寸可导致与白蛋白分子牢固结合的稳定剂分子在较温和条件例如pH〉3下比以往更容易更快速地释放。所述通道的平均直径超过100nm因而白蛋白分子能轻松进入。因此，此孔径必需比活性炭吸附剂常用的细孔或微孔要大得多。但通道的平均直径应不超过lOOOium。已证明只要大于100nm的平均通道直径越小，去除白蛋白分子上的稳定剂的速率就越快。吸附材料颗粒的安排宜使通道具有至少一个进口和一个出口，这样进入的白蛋白分子不会被困住而可离开通道。而且，已发现当采用活性炭作为吸附材料时稳定剂的去除速率还可进一步改进，如果获得和制造的用作吸附材料的活性炭具有各种孔隙和内表面积，选择糖蜜值(IUPAC)为100-400、优选200-300的活性炭。更优选活性炭的亚甲基兰吸附值(IUPAC)为l-100g/100g活性炭，优选为10-30g/100g活性炭，碘值(IUPAC)为500-3000，优选为800-1500，禾卩/或内表面总面积(BET)(IUPAC)为100-5000m2/g活性炭，优选为800-1400m2/g活性炭。本发明还涉及具有上述特征的吸附材料和其在实施本发明方法中的应用。而且，本发明还涉及用本发明方法制备的白蛋白水溶液来制备治疗低白蛋白血症的制剂、血浆替代介质或血浆扩充剂和或改善患者循环功能、肾和/或脑功能的制剂。所述介质指能更强地固定对白蛋白具有亲和力的生理物质。本发明还涉及利用本发明方法制备的白蛋白水溶液来制备作为血浆替代剂或作为白蛋白透析的透析液来纯化血液的方法。特别是对后一种应用，本发明制备的白蛋白溶液比相应的无配体白蛋白溶液例如重组人血清白蛋白要便宜得多。本发明方法或根据本方法制备的去除了稳定剂的白蛋白溶液能很好地应用于医疗。严重肝病、血循环低渗和肌张力过度疾病的患者的白蛋白结合能力(ABiC)受限，采用目前生产的标准白蛋白制品不能得到改善。尽管这种联系还未得到实验证实，但理论上这种受限的结合能力是由于白蛋白搜寻的毒素不再被损伤的肝脏生理性完全破坏而内源性积累的结果。用人血清白蛋白的商品制品来增强受限的白蛋白结合能力的尝试由于其制备方法必然导致的制品含有过量稳定剂因而失败了。然而，为保证白蛋白溶液不含病毒和防止自发聚合安全贮而进行的巴氏消毒必须用这些稳定剂。迄今除去这些稳定剂都需要用极端酸性条件和/或伴有大量白蛋白损失。本发明提供了一种不需要主动先酸化而在临用前制备具有改善的白蛋白结合能力的白蛋白溶液的方法。根据本发明制备的白蛋白溶液可用作血浆替代剂，为不含稳定剂的白蛋白，白蛋白的安定结合位点(sudiow结合位点n)对血管活性物质和毒素具有亲和力，从而具有高度结合能力。本发明方法所采用的装置廉价又经济，因此容易实施，例如可在病床边，面临将所述溶液输注到患者体内之前。由于本发明制备的白蛋白的结合能力有所改善，所述白蛋白溶液不仅可作为血浆替代剂，如上述通过提高胶体渗透压使水份结合渗入血管中，而且可通过主动吸附而固定血管扩张剂和其它有毒物质。这导致血管扩张减轻，而血容量补充对血管床充盈程度具有协同作用。最终，对平均动脉压产生可观的影响，改善了对血管系统的灌注，如舒张压升高显示的那样。而且，优选用本发明制备的白蛋白溶液来改善白蛋白透析时的配体结合。本发明方法的优点是，可高速，即在相对短的时间内除去白蛋白溶液中的稳定剂。商品化白蛋白溶液用10-30分钟处理机可实质性提高白蛋白的结合能力。因此，本方法尤其适合在病床边制备商品化稳定的白蛋白溶液，虽然本发明不限于此。也可以不在诊所或其它机构或企业中制备这种药物。用本发明的方法，可将含用辛酸和或N-乙酰色氨酸稳定剂的商品白蛋白溶液中这些稳定剂各自的浓度降低到低于5摩尔/摩尔白蛋白，优选低于1摩尔/摩尔白蛋白，尤其优选低于0.2摩尔/摩尔白蛋白。现在利用一些实施例更详细地描述本发明。实施例实施例l:填装柱中的粉末吸附材料在比较去除含稳定剂白蛋白溶液中的稳定剂分子效果的实验中，制备并检测了各种吸附材料制品。对于本发明吸附材料的两种制品而言，用工业研磨机将成分明确的活性炭NoritGAC830(Norit)研磨加工成不同大小的颗粒粒径。然后用显微镜和商品颗粒分析仪测量研磨产品的粒径。对于本发明的第一批产品(A1)，将NoritGAC830研磨成粒径lmm(D50)，就第二批次而言(A2)，NoritGAC830被研磨到粒径达0.1mm(D50)。D50对应于50%(见下)。采用NoritROX压碎的炭来进行比较(V)。将100g活性炭材料置于直径6cm高10cm带有筛网底的柱内加入水。使20g商品化白蛋白的330ml盐溶液(ZLBBehring,pH7.2)以170ml/min的速率循环回流通过各柱内的吸附材料。检测0时和20、30、60和120分钟时的辛酸、N-乙酰色氨酸和白蛋白的浓度以及白蛋白结合能力(Klammt等,2001)。也测定了240、1440和2880分钟时的对照值。结果见图1所示。NoritROX压碎的炭末材料颗粒之间形成的间隙或通道非常大，这是因为挤压成形的这种材料当装填入柱中时，其颗粒直径有时会超过lmm，尤其是在100-250ml/min高速率时对输注压有利。然而，对本发明的Al批和A2批研磨活性炭进行比较显示，通道相当大的吸附材料在实践中不适合在短时间内提高白蛋白的结合能力。对于装柱的Al批和A2批研磨活性炭粉末材料而言，以下公式(I)给出了通道直径的良好近似值Rk=[Rp2+(Rp*0.57735)2]05-RP(I)其中，RK是颗粒之间的平均通道半径，Rp是颗粒本身的平均半径。对平均直径为lmm，即半径Rp为50(Him的Al批的研磨颗粒而言，平均通道半径RK为77pm，即平均通道宽度(也就是直径)约150Mm。对平均直径为O.lmm，即半径Rp为5(Hmi的A2批的研磨颗粒而言，平均通道半径RK为7.7pm，即平均通道宽度(也就是直径)约15|_mi。根据以上公式计算的通道宽度结果也的到了树脂柱材料的固定样品显微镜检查的证实。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>用NoritROX得到的结果证实了以上所述，在生理条件下，具体在中性pH时，在迄今所釆用的实验条件下即利用含大宽度通道的活性炭粉末或悬液不可能在60分钟内基本去除稳定剂，至少在数量上不可能实质上提高白蛋白的结合能力。令人惊奇的是，根据本申请给出的数据延长接触时间后，即使用这种活性炭也可去除辛酸，而导致白蛋白结合能力提高。据估计所需的最短接触时间是通道宽度的函数这个准则，对平均宽度(dm)为1000pm的通道，接触时间应延长到250分钟以上。实验显示在240分钟时ABiC刚超过80%，超过90%的可接受值只是在一天(1440分钟)之后才检测到。在对测试的活性炭的表面结构研究中，显示只有小到几乎看不见的一小部分白蛋白分子才可能真正直接接触活性炭表面，这是因为一方面只有大孔才让白蛋白分子一定程度地进入，而大部分细孔太小白蛋白不能通过。然而，大孔仅构成全部孔的非常小的一部分并立即迅速在外表面以下分枝为细孔，而细孔不再让白蛋白分子通过。当大孔让白蛋白分子进入后，大部分白蛋白分子被困在孔中，特别是采用大孔活性炭时，可能引起白蛋白大量损失。测试批次Al和A2显示可通过产生更窄的平均通道宽度来解决这个问题，例如采用平均直径更小的颗粒粉末。结果进一步证实吸附材料的安排对除去稳定剂的效果具有重要作用，这是不能单单通过选择吸附剂来自动实现的。另一方面，在本发明方法中，采用通道尺寸与白蛋白分子相匹配的吸附材料。这些通道的全长均能让白蛋白分子通过而且其大小便于白蛋白分子频繁进入和吸附材料表面密切接触。这些通道的特征在于它们的平均内部宽度或它们的平均直径。实施例2:流体床反应器中的活性炭颗粒悬液为了证明本发明的成功不是通过研磨方法扩大活性炭的外表面积而是通过调节颗粒材料之间的通道优化平均通道直径所致，在另一实验中，对具有相同外表面积仅通道宽度不同的吸附材料进行了检测。此例中合适的实验载体是流体床，床中装有用搅拌、振荡或对流或涡流形成的精细微粒吸附材料悬液。在此流体床中，悬液中均匀分布的颗粒之间形成的空隙形成了让白蛋白流过的通道。流体床中的通道直径可用以下公式(II)给出良好的近似值<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其中DK是颗粒之间的平均通道直径，Dp是颗粒本身的平均直径，n是颗粒数，VwB是流体床体积。具有所需平均通道直径的流体床容量可根据公式(II)推导，用以下公式(IIa)给出容量<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>为了确定通道直径，只有改变流体床体积、颗粒数和颗粒尺寸才能获得所需的通道直径。估计团块中的颗粒数目所需要的平均颗粒直径Dp和堆密度可由制造商提供或用简单的标准方法测定。实践中，干粉的颗粒数n可用以下公式(III)以堆密度(填装的)和粒径测定n=[VTS033/(0.86*Dp)]3(III)其中n是干粉的颗粒数，VTs是填装的干粉体积，Dp是平均颗粒直径。如果给出了某具体吸附材料的干粉密度，也可用干粉密度除质量计算出体积VTS。由于实践中，颗粒并不总是完美的球形，大小也不总是一样，实践中，对大小分布范围很广的颗粒，必须假设吸附剂流体床悬液中的空隙分布取决于吸附剂颗粒大小的分布。具体对粉末吸附剂(例如NoritCExtraUSP)而言，规则是给出颗粒大小分布的特征性数目，即大小分布的—分数值例如D10和D90。利用此D10和D卯值，可描述出包括约80%颗粒的大小分布范围。因此，实践中流体床颗粒的重量或干粉体积确定时可估计其分布体积，来产生所需通道直径的良好近似值。这种情况下，可利用D10值代替Dp，D90值代替Dp来计算流体床容量，以确定在本发明吸附颗粒(通道宽度)之间进行本发明最佳分离的流体床容量的上限和下限。可根据D90值的计算出去除配体使白蛋白结合能力(ABiC)确实有效地提高的(上下限的)最大差异。如下测定通道宽度的影响。将不同体积的lg活性炭/lg白蛋白(活性炭:购自NoritNederlandBV，荷兰的NoritCExtraUSP;商品化白蛋白，每毫摩尔白蛋白含稳定剂5.2毫摩尔辛酸和5.2毫摩尔N-乙酰色氨酸)的活性炭-白蛋白混合物加入NaCl溶液的流体床中室温搅拌30分钟。处理后，离心分离活性炭颗粒与白蛋白溶液。然后检测白蛋白、辛酸和N-乙酰色氨酸的浓度和ABiC，观察与获得的通道宽度的关系。结果见表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>n50、n10、n90=粒径，以d50、D10或D90百分数值作为平均颗粒直径根据公式(in)计算。Dk50、DklO、Dk卯=平均通道直径，以d50、D10或D90百分数值作为平均颗粒直径根据公式(II)计算。Oct/Alb=辛酸与白蛋白的摩尔比。NAC/Alb-N-乙酰色氨酸与白蛋白的摩尔比。结果清楚地显示流体床中平均通道直径(Dk50)增加导致辛酸和N-乙酰色氨酸去除效力和白蛋白结合能力降低，因为颗粒类型和数目恒定时以上公式(II)中平均通道直径的增加与流体床容量的增加直接相关联，而与吸附材料的外表面积无关。类似地，此表显示了本发明优选实施方式所制造的规律dm[pm]/4[pm/min]S接角虫时间[min]Sdm[|im)/0.3[|am/min]，当选好最短所需接触时间的上限不超过30分钟的通道宽度时，可在30分钟内获得最佳去除效果(试验1)。这种情况下，对于平均通道直径5.2pm的最短所需接触时间的上限是17.3分钟，而最大去除NAC和辛酸时，ABiC达到数值110%。在试验2-6中，最短接触时间不超过此上限值。因此，可观察到非常优良的去除效果和ABiC改善，而试验1中未实现最佳值。实施例1和2显示有效去除稳定剂所需的白蛋白溶液与吸附材料之间的接触时间强烈依赖于吸附材料中通道的平均直径。选择与之相配的吸附材料通道平均直径可影响到所需接触时间，(例如)也影响装填有吸附材料的柱内白蛋白溶液的流通速率。实施例3:将吸附剂固定于纺织物、开孔泡沫或混合粉末中在下述实施方式中，本发明吸附颗粒之间的距离，即通道宽度，被固定在网格内，可仔细观看。因此，吸附材料的颗粒，例如活性炭可利用支撑纺织物(例如聚合物纤维)、开孔聚合物泡沫结构(例如开孔聚氨酯泡沫)或简单通过混合高度多孔颗粒作为"间隔"制成固体床反应器形式，为吸附材料颗粒彼此间提供足够的间距，以此提供本发明的通道宽度。还可同时或依次固定于高度多孔、开孔聚合泡沫中通过钻孔方法形成通道。这些通道宽度应满足本发明确定的通道宽度与最短所需接触时间之间相关性的规律。在此实施方式中，最好用纺织物或支撑聚合物来获得"疏松"填塞，使对高黏稠白蛋白溶液产生的灌注反压较低。此外，留住微粒的过滤所需灌注压不像上述实施方式那么大。而且，当将吸附剂固定于纺织物、开孔泡沬或混合粉末时，公式(IV)给出了平均通道直径的最接近近似值Dk=[V033-(n033*Dp)]/n0'33(IV)其中Dk是颗粒之间通道的平均直径，Dp是颗粒本身的平均直径，n是颗粒数，V是终末期纺织物、混合粉剂或泡沫的容量。确定了所需通道直径后，对于已知颗粒数目和已知颗粒直径，可用公式(IVa)计算其相应的容量V=[(n033*Dp)+(n033*DK)]3(IVa)对优选的吸附剂重量和最终容积的组合的基础计算对应于实施例2的基础计算。在一实施例中，将2g平均粒径23nm(D50)(Dl(^5^n，D9(^82^im)的活性炭(购自NORITNederlandBV的NoritCExtraUSP,荷兰)与纤维聚合物(本例中为纤维素)和有交联倾向的聚合物(例如树脂、聚氨酯、聚丙烯酰甲基丙烯酯)形成的水悬液/溶液混合，通道宽度设为3.6pm，可在不到12分钟的接触时间内实现恰当的脱配体作用。根据本发明的公式dm[pm]/4[>m/min]S接触时间[min〗^dm|>m〗/0.3[pm/min]，最短接触时间的上限是12分钟。用公式(IVa)，重量是2g时，得到的与该混合物最终总容量相对应的容量是12.5ml。将此混合物加入表面积约25cn^的的封闭筛网中，筛孔足够小到可留住吸附剂颗粒而让液体通过交联支撑聚合物(例如5pm网筛)。将该混合物分置于筛网上，通过压力梯度(latm)引流，获得物干燥后的厚度为5mm。所制备的此吸附材料最终具有的总容量为12.5ml。用以上公式(IV)以粒径d50为23pm计算出的平均通道直径Dk是3.6pm。使10ml的20%商品化含稳定剂的白蛋白溶液以lml/min速率垂直通过商品过滤装置筛网表面吸附材料流动方向与干燥时的压力梯度相同。用此方法在IO分钟内除去了稳定剂，经处理白蛋白溶液的白蛋白结合能力从45%提高到100%以上。辛酸和N-乙酰色氨酸与白蛋白的比率小于0.2毫摩尔/毫摩尔。实施例4:临床应用在临床试验中，研究了本发明白蛋白结合能力提高的白蛋白溶液的效果。随机选择30名慢性酒精中毒肝硬化和丙2型肝炎肝功能衰竭，胆红素水平超过20mg/dl并且蛋白质合成受限(INR升高)和伴有血循环低渗和肌张力过度疾病的患者，将其分成两组。一组用本发明白蛋白结合能力提高的白蛋白溶液治疗，对照组不用。试验期间定期监测循环血液参数和肾脑的终末器官功能，观察时间为2周。结果见以下附图所示图1显示治疗前和2周后这两个试验组的血白蛋白浓度；图2显示治疗前和2周后两个试验组血液白蛋白的白蛋白结合能力；图3显示治疗前和2周后两个试验组的平均动脉压变化；图4、5、6显示治疗前和2周后两个试验组的收縮压、扩张压和心率；图7显示治疗前和2周后通过肌酸酐检测对两个试验组的肾功能影响；图8显示治疗前和2周后两个试验组因流入大脑的血液和搜寻白蛋白的量受限，毒素所导致的血流改变对肝脑病的影响。这些临床试验的结果显示白蛋白结合能力(ABiC)的改善伴有平均动脉压的改善，显然这是由于扩压升高而非心率增加所致。此结果在医学上证明了肝病中血管扩张压降低通常是由对白蛋白具有亲和力的扩血管物质所造成的。利用改善的白蛋白结合能力固定它们就能改善循环功能、肾和脑功能。最终，除了改善血压状况外，还可改善与直接引起神经毒性的物质(这些物质也结合ABiC改善的白蛋白)的结合。权利要求1.一种从含有能占据白蛋白结合位点的稳定剂分子的原料白蛋白溶液制备白蛋白水溶液的方法，所述方法中，为了提高对其它分子的白蛋白结合能力(ABiC)，要从原料白蛋白溶液的白蛋白中去除至少一部分稳定剂分子并使它们与原料白蛋白溶液分离，该方法包括a)使原料白蛋白溶液与固体吸附材料接触，所述固体吸附材料对至少一部分、优选所有的所用稳定剂分子的亲和力高于所述白蛋白对相应稳定剂分子的亲和力；其中所述方法在pH＞3时进行；和b)使白蛋白与吸附材料分离。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在pH5-9的范围，优选在pH6-8范围内，特别优选在pH6.9-7.5的范围内进行。3.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。4.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述待除去的稳定剂分子包括N-乙酰色氨酸和/或辛酸或它们的阴离子。5.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤a)中通过使原料白蛋白溶液流经含有吸附材料的柱子(层析柱)或流经由吸附材料形成的床而使原料白蛋白溶液与吸附材料接触。6.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤b)中使白蛋白溶液通过颗粒过滤器过滤实现白蛋白溶液与吸附材料的分离，选择能让白蛋白通过而固体吸附材料留下的颗粒过滤器。7.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，重复步骤a)和b)多次，优选2-6次，每次将步骤b)获得的经过处理的白蛋白溶液返回给步骤a)，并在步骤a)中采用再生的和/或新鲜的吸附材料来去除稳定剂分子。8.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，选择与原料白蛋白溶液中的白蛋白浓度相当的吸附材料用量和/或步骤a)中原料白蛋白溶液与吸附材料的接触时间，从而使根据Klammt等的方法检测得到的白蛋白溶液的白蛋白结合能力(ABiC)至少是60%，优选至少70%，特别优选至少80%和更特别优选至少90%。9.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，选择与原料白蛋白溶液中的白蛋白浓度相当的吸附材料用量和/或步骤a)中原料白蛋白溶液与吸附材料的接触时间，从而使原料白蛋白溶液中结合和未结合的稳定剂分子，具体是N-乙酰色氨酸和/或辛酸或它们的阴离子的浓度降到低于其初始浓度的70%，优选低于50%，更优选低于30%和特别优选低于10%。10.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述吸附材料是装填在柱内或床上或支撑基质上的颗粒材料，能在吸附材料颗粒之间形成载流通道，其中覆盖所有所用吸附材料颗粒之间形成的通道全长的平均通道直径为100nm-1000pm，优选小于500nm，更优选小于300pm和特别优选小于200pm，还要优选小于100jim。11.如权利要求IO所述的方法，其特征在于，覆盖由所有吸附材料颗粒形成的通道全长的通道的平均直径是100nm-60|um，特别优选小于10pm。12.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，如下选择步骤a)中原料白蛋白溶液与吸附材料的最短接触时间dm[[im]/10[nm/min]^接角虫时间[min]Sdm[|im]/0.1[pm/min]，其中"dm"指覆盖所用的所有吸附材料颗粒之间形成的通道全长的平均通道直径。13.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，如下选择步骤a)中原料白蛋白溶液与吸附材料的最短接触时间dm[[im]/4[|im/min]S接触时间[min]Sdm[pm]/0.3[(im/min]，其中"dm"指覆盖所有吸附材料颗粒之间形成的通道全长的平均通道直径。14.如上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述吸附材料是活性炭。15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述活性炭的糖蜜值(IUPAC)是100-400，优选200-300。16.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述活性炭的亚甲基兰吸附(IUPAC)值是每100克活性碳1-100克，优选每100克活性碳10-30克。17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述活性炭的碘值(IUPAC)是500-3000，优选800-1500。18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述活性炭的内表面总面积(BET)(IUPAC)是每克活性碳100-5000m2，优选每克活性炭800-1400m2。19.一种吸附材料，其具有如上述任一权利要求所述的特征，可用于实施上述任一权利要求所述的方法。20.如权利要求19所述的吸附材料在实施权利要求1-18中任一项所述方法中的应用。21.如权利要求1-18中任一项所述方法制备的白蛋白水溶液在制备治疗底白蛋白血症制剂中的应用。22.如权利要求1-18中任一项所述方法制备的白蛋白水溶液，在制备血浆替代液或血浆扩充剂或在制备利用血浆分离置换或白蛋白透析进行体外血液纯化的溶液中的应用。23.利用权利要求1-18中任一项所述的方法制备的白蛋白水溶液在制备改善患者循环功能、肾和/或脑功能的制剂中的应用。24.—种根据权利要求1-18中任一项所述方法制备的白蛋白溶液。全文摘要本发明涉及一种从含有能占据白蛋白结合位点的稳定剂分子的原料白蛋白溶液制备白蛋白水溶液的方法，所述方法中，为了提高对其它分子的白蛋白结合能力(ABiC)，至少要去除一部分原料白蛋白溶液中白蛋白上的稳定剂分子并使它们与原料白蛋白溶液分离。为了实施此方法，可用更简单、快速、便宜的和对白蛋白温和的方式除去稳定化商品化原料白蛋白中的大部分稳定剂分子而提高白蛋白结合能力，所述方法包括以下步骤使原料白蛋白溶液与固体吸附材料接触，所述固体吸附材料对至少一部分优选所有的稳定剂分子的亲和力高于含相应稳定剂分子的白蛋白；使所述白蛋白与吸附材料分离；其中所述方法在pH＞3时进行。文档编号C07K1/22GK101175766SQ200680016267公开日2008年5月7日申请日期2006年5月11日优先权日2005年5月13日发明者K·施坦格申请人:奥布泰克有限公司