蛋白的亲和纯化的制作方法

专利名称：蛋白的亲和纯化的制作方法
蛋白的亲和纯化
本发明涉及用于多肽的亲和纯化中的嵌合融合蛋白。
诸如蛋白的生物分子的亲和纯化为本领域已知且允许通过使用靶分
子对分子结合伙伴的结合亲和性来纯化分子。例如，葡萄球菌A蛋白结 合免疫球蛋白G且这已被用于从血清中纯化和/或浓缩抗体。"亲和标签" 的其它例子包括麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶、钓调蛋白结合蛋白 和将多组氨酸轨(polyhistidine tracks)工程化为随后通过在含镍基质上的 亲和纯化来纯化蛋白。在许多情况下，能够使用可商购的载体和/或试剂 盒融合感兴趣的蛋白和适当的亲和标签，然后转染至宿主细胞中表达以 及随后提取和在亲和基质上纯化。
基因组测序导致编码蛋白的基因的鉴定大量增加。在某些实例中， 简单地通过参考其线性序列不能明显得知基因的功能，期望确定这些未 确定功能的蛋白的功能以及在细胞中与它们相互作用的蛋白伙伴。确定 基因功能的逆向基因组方法费力且耗时。确定通过基因组测序筌定的蛋 白的靶蛋白的物理方法有吸引力，并且可能是通向确认未确定功能的开 ;改阅读框的功能的第一步。此外，在发现已知蛋白的新的潜在活性的努 力中，还可能期望确定已知蛋白的结合伙伴。
称为"双杂交"的经典技术被用来鉴定已知蛋白的结合伙伴，例如 在Battel and Fields 1997) The Yeast Two-Hybrid System, Oxford University Press New York中描述的。尽管这项技术已经成功地鉴定了给定蛋白的单 一相互作用伙伴，但其倾向于导致假阳性和假阴性的错误，并且由于该 系统不能鉴定细胞中有时存在的更高级结构而受到限制。
WO00/09716中描述了鉴定和分离蛋白复合物的系统。该技术^皮称为 串联亲和纯化(TAP)且使用两部分亲和纯化方法，该两部分亲和纯化方法 使用含有被可切割接头分开的两个不同亲和标签的融合蛋白，该亲和标 签例如A和B。通常，编码靶蛋白的核酸被亚克隆至所述亲和标签之一 的附近。这产生由NH靶蛋白亲和标签B -可切割接头-亲和标签A
COOH组成的融合蛋白。
融合构建体被转染至诸如酵母细胞的细胞中并表达。结合靶的蛋白 与融合蛋白相连，将细胞在非变性条件下破碎并将细胞提取物施加到标 签A与之结合的亲和基质上。然后在洗涂后通过切割接头使结合的复合 物从亲和基质上解离下来，所述接头通常为蛋白酶敏感的接头。然后使 用亲和标签B与之结合的第二亲和基质进行第二轮亲和纯化。洗涤第二 筛选步骤且从第二基质上洗脱以提供与把蛋白结合的蛋白的纯化的复合 物。所述两步筛选减少非特异性结合且允许分离蛋白复合物而非单一结 合伙伴。在WO00/09716中，所述第一和第二亲和标签是蛋白A和钙调 蛋白结合蛋白。WO03/095619描述了 TAP的其它实例。在这个例子中， 所述第一和第二亲和标签分别是具有生物素化识别基序的蛋白和六肽组 氨酸标签多肽。
希望鉴定对亲和基质有更高亲和力的其它亲和标签，以通过提高亲 合。、、'、土 、、 、 '、 '
大肠菌素是蛋白质抗生素家族，由肠杆菌科(Ewtera^"en'acae)在应 激期间产生。这些蛋白通过起离子载体的作用且去极化内层膜或通过在 周质或细胞质中的溶解(例如核酸酶)活性杀灭敏感细菌细胞。通常，大肠 菌素包含中心受体结构域、氨基末端转移结构域和羧基末端细胞毒结构 域。称为酶E型大肠菌素的一类大肠菌素通过与维生素B12受体和位于周 质中的Tol复合体的接触进入细菌细胞中，该Tol复合体引发大肠菌素向 细胞中的转移。已知E大肠菌素有9个群；El是形成离子载体的大肠菌 素，其余的是核酸内切酶或核糖核酸酶。例如，E3、 E4、 E5和E6大肠 菌素是核糖核酸酶，E2、 E7、 E8和E9是非特异性DNA酶。
E型大肠菌素在宿主细菌细胞中的表达是有困难的，因为宿主细胞必 须能够严格控制核酸酶的活性，否则宿主细胞核酸就会对核酸酶攻击敏 感。这通过所谓的"免疫蛋白"的共表达克服，"免疫蛋白"是大肠菌 素的抑制剂，其结合大肠菌素核酸酶结构域以中和其活性。免疫蛋白和 大肠菌素的复合物被分泌到细胞外环境中，且是此复合物结合耙细胞。 一旦转移开始，免疫蛋白解离，不再保护靶细胞免受大肠菌素的作用。 这类免疫蛋白的例子是以极高亲和力结合大肠菌素E9的核酸内切酶 (DNA酶)结构域的Im9,其中，在pH7和25。C下复合物的Kd为10"6M (Wallis et al (1995) Biochemistry 34， 13743)。另 一个例子是免疫蛋白Im3, 其结合大肠菌素E3的核糖核酸酶(RNA酶)结构域，其中在pH 7和25 。C 下复合物的Kd为1(T12M (Walker etal (2003) Biochemistry 42, 4161)。这些 非常高的亲和性使得核酸酶-免疫蛋白复合物成为理想的基于亲和性的 纯化模块。
在基于亲和性的纯化中使用大肠菌素DNA酶-Im蛋白复合物的其 它吸引因素是DNA酶结构域对其同源Im蛋白伙伴显示类似的高水平特 异性，而高度区别出非同源Im蛋白(Li et al (2004) J. Mol. Biol. 337, 743)。 例如，对大肠菌素E7的DNA酶结构域特异的Im7蛋白以约10—4M的 结合非同源的E9DNA酶结构域，该结合比相同条件下同源免疫蛋白Im9 弱12个数量级。因此，如下文中所述，能够构建双免疫蛋白融合物，其 中对大肠菌素核酸酶柱的结合是对同源伙伴关系特异的。
我们在本文中公开亲和纯化方法，其利用免疫蛋白对大肠菌素核酸 酶的非常高的亲和性和特异性。
根据本发明的方面，提供包含与至少一种异源多肽连接的免疫多肽 的嵌合融合蛋白。
优选地，所述免疫多肽与所述异源多肽通过接头分子连接。 在本发明的优选实施方案中，所述接头包含可切割的肽接头。 根据本发明的方面，提供编码嵌合多肽的核酸分子，该核酸分子包
含
i) 第一部分，其由

图1或图2所示的、编码至少一个多肽或其活性 结合部分的核酸序列组成，该多肽或其活性结合部分具有与免疫蛋白相 连的活性；或者其由变体核酸分子组成，该变体核酸分子与图1或图2 所示的、编码具有免疫多肽相关活性的多肽的核酸分子杂交；以及
ii) 第二部分，其由编码异源多肽的核酸序列组成，其中所述第一和 第二部分相连接。
在本发明的优选实施方案中，所述第一和第二核酸分子通过接头分 子连接。优选地，所述接头编码可切割的肽接头。
在本发明的其它优选实施方案中，所述杂交条件是严紧条件。 当两个互补核酸序列经历一定数量的相互的氢键结合时，发生核酸 分子的杂交。杂交的严紧性可以随围绕核酸的环境条件、杂交方法的性
质以及所用的核酸分子的组成和长度而变化。在Sambrook et al.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆实'睑室手册)(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY， 2001);和Tijssen， Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology — Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I， Chapter 2 (生物化学和分子 生物学中的实验室技术-使用核酸探针的杂交，第1部分，第2章) (Elsevier, New York, 1993)中讨论了关于获得特定严紧性程度所要求的杂 交条件的计算。Tm是50%的核酸分子给定链与其互补链杂交时的温度。 下文是示例性的杂交条件，且是非限制性的
非常高的严紧性(允许具有至少90%同 一性的序列杂交)
杂交5xSSC， 65。C下进行16小时
洗涤两次2xSSC，室温(RT)，每次15分钟
洗涤两次0.5xSSC， 65°C，每次20分钟
高严紧性(允许具有至少80%同一性的序列杂交)
杂交5x-6xSSC， 65°C-70°C下进行16-20小时
洗涤两次2xSSC， RT，每次5-20分钟
洗涤两次lxSSC， 55°C-70°C，每次30分钟
低严紧性(允许具有至少50%同 一性的序列杂交)
杂交6xSSC， RT至55。C下进行16-20小时
洗涂至少两次2x-3xSSC， RT至55。C，每次20-30分钟。
在本发明的优选实施方案中，所述第一部分包含由编码至少一种大 肠菌素DNA酶免疫多肽的核酸序列组成的核酸分子。
在本发明的优选实施方案中，所述免疫多肽由表1A所示的核酸序列 编码或是表1B所示的氨基酸序列。
优选地，所述免疫多肽选自Im2、 Im7、 Im8和Im9。
在本发明的其它优选实施方案中，所述第一部分包含由编码至少一 种大肠菌素RNA酶免疫多肽的核酸序列组成的核酸分子。
在本发明的优选实施方案中，所述免疫多肽由表2A所示的核^列 编码或是表2B所示的氨基断列。
优选地，所述免疫多肽选自Im3、 Im4、 Im5和Im6。
在本发明的其它优选实施方案中，所述核酸分子编码包含至少两种 免疫多肽的嵌合多肽，其中所述多肽为符合读框的翻译融合。
在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子编码两种结合类似大肠 菌素多肽的免疫多肽。
在本发明的其它优选实施方案中，所述核酸分子编码两种结合不类 似的大肠菌素多肽的免疫多肽。
在本发明的优选实施方案中，所述可切割的接头包含至少一个蛋白 S^:感位点。优选地，所述位点是烟草蚀紋病毒蛋白酶的切割位点。
根据本发明的其它方面，提供由本发明的核酸分子编码的嵌合多肽。
在本发明的优选实施方案中，所述嵌合多肽包括至少一个包含变体 M酸序列的部分。
变体多肽可以通过可以任何组合存在的一个或多个替代、添加、缺 失、截短而在氨基酸序列上不同。在优选的变体中有那些通过保守氨基 酸替代而与参照多肽不同的。这些替代是用另 一个具有相似特性的氨基 酸替代给定氨基酸。下文的非限制性氨基酸名单被认为是保守替换(相似 的)a)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺 和谷氨酰胺；d)精氨酸和赖氨酸；e)异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和缬氨 酸；以及f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。最优选的是保留或增强与参照 多肽相同的生物功能和活性的变体，所述变体是从该参照多肽变化而来 的。
在本发明的优选实施方案中，所述嵌合多肽序列与本文公开的多肽 具有40%或更高的序列同一性，且其保留与所述多肽相关的生物活性， 例如大肠菌素核酸酶活性或免疫蛋白活性。
本发明显示所述嵌合多肽序列的部分与本文公开的多肽序列或其片 段或功能等价多肽具有至少75%的同一性。在一个实施方案中，所述多 肽与本文公开的氨基酸序列具有至少85%的同一性，优选至少90%的同 一性，更优选至少95%的同一性，甚至更优选至少97%的同一性，最优
选至少99%的同一性且其保留要求的生物活性。
根据本发明的其它方面，提供包含本发明的核酸分子或多肽的组合物。
根据本发明的其它方面，提供包含本发明的核酸分子的载体。
在本发明的优选实施方案中，所述核酸分子与控制所述嵌合多肽的 表达的启动子可操作地连接。
优选地，所述核酸分子适应于真核表达。通常，所述适应包括，示 例但非限制，提供介导细胞/组织特异性表达的转录控制序列(启动子序 列)。这些启动子序列可以是细胞/组织特异性的、可诱导的或组成型的。 "启动子，，是本领域公认的术语，为了清楚的目的，包括以下仅为 示例性的特征。增强子是经常在基因的转录起始位点的5'发现的顺式作 用核酸序列(增强子还能够在基因序列的3'发现，或者甚至存在于内含子 序列中)。增强子作用以提高与增强子连接的基因的转录率。增强子活性 是响应反式作用转录因子的，已经显示反式作用转录因子特异结合增强 子元件。转录因子的结合/活性(请参见David S Latchman所著的Eukaryotic Transcription Factors (真核转录因子),Academic Press Ltd, San Diego)响应 许多生理/环境信号，其包括，示例但非限制，中间代谢物(例如葡萄糖)、 环境效应物(例如热)。
启动子元件还包括所称的TATA盒和起选择转录起始位点的RNA聚 合酶起始选择序列。这些序列也结合多肽，该多肽起辅助RNA聚合酶选 择转录起始的作用以及其它作用。
适应还包括提供选择标志物和辅助在真核细胞或原核宿主中保持所 述载体的自主复制序列。自主保持的载体被称为游离型载体。
列。这还包括提供内部核糖体进入位点(IRES)，其作用为最大化由载体编 码的、以双顺反子或多顺反子表达盒排列的基因的表达。
这些适应为本领域公知。有大量关于通常的表达载体构建和重组 DNA技术的出版文献。请参见，Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)，Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY及其中的参考文献；Marston， F (1987)
DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol III (DNA克隆技术实 践方法，第3巻)IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning (DNA克隆)F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (现4戈分子生4勿学手 册)，John Wiley & Sons, Inc. (1994)。
载体可以是基于病毒的且可以衍生自包括腺病毒、逆转录病毒、腺 相关病毒、疱渗病毒、十曼病毒、牛痘病毒和4干状病毒在内的病毒。 才艮据本发明的其它方面，提供经本发明的核酸或载体转染的细胞。 在本发明的优选实施方案中，所述细胞是真核细胞。 优选地，所述真核细胞是哺乳动物细胞。 在本发明的其它优选实施方案中，所述细胞是植物细胞。 在本发明的其它优选的实施方案中，所述细胞是酵母细胞。 在本发明的其它优选实施方案中，所述细胞是原核细胞。 根据本发明的其它方面，提供本发明的嵌合多肽在分离生物分子复 合物中的用途。
在本发明的优选实施方案中，所述生物分子复合物包括包含至少一 种蛋白的复合物。优选地，所述复合物是蛋白分子的复合物。
根据本发明的其它方面，提供从多种生物分子中分离生物分子复合 物的方法，该方法包括提供包含多种生物分子的制剂和至少一种本发明
件下孵育所述制剂，以及分离与所述嵌合多肽相连的生物分子的复合物。 才艮据本发明的其它方面，提供从多种生物分子中分离生物分子复合 物的方法，该方法包4舌
i) 提供包含多种生物分子的制剂和至少一种本发明嵌合多肽，并且 在允许所述制剂中的生物分子与所述嵌合多肽相连的条件下孵育所述制
剂；
ii) 将该混合物与包含所述嵌合多肽的结合伙伴的第 一亲和基质接 触以允许至少部分所述嵌合多肽与所述基质结合，并且洗涤所述基质以
除去与所述嵌合多肽和所述基质非特异结合的生物分子；
iii) 从所述基质洗脱结合的嵌合多肽和相连的生物分子；
iv) 将所述洗脱的嵌合多肽与包含所述嵌合多肽的第二结合伙伴的
第二亲和基质接触以允许所述嵌合多肽的不同部分与所述第二亲和基质
结合；以及
v)从所述第二基质洗脱所述嵌合多肽并且任选地释放与所述嵌合多 肽相连的所述生物分子。
对本领域技术人员来说显而易见的是可以通过本领域公知的方法 完成嵌合多肽和相连的生物分子的洗脱，例如，通过pH、离子条件的改 变或者通过与诸如化学试剂或蛋白酶的试剂 一起孵育，该蛋白酶将结合 的嵌合多肽从基质上切割下来。
在本发明的优选方法中，所述制剂包含适于表达本发明的嵌合多肽 的细胞，所述细胞提供所述多种生物分子。
在本发明的优选方法中，所述复合物包含至少一种蛋白分子。优选 地，所述复合物包含蛋白分子的复合物。
显而易见的是本发明的方法可以适于从混合物中分离生物分子的复 合物。这些复合物可以是蛋白复合物或，例如，蛋白和核酸的混合物， 例如染色质。所述方法还可以用于从复合物混合物中分离细胞器或者甚 至完整细胞或细胞膜。所述复合物还可以形成于从细胞提取物形成的体 外转录和/或翻译测定。
在本发明的优选方法中，所述第一亲和基质包含结合其同源免疫多 肽的大肠菌素多肽。
在本发明的其它优选的方法中，所述第二亲和基质包含与所述第一 亲和基质的大肠菌素多肽不同的大肠菌素多肽。
在本发明的优选方法中，通过与蛋白酶一起孵育获得所述洗脱，该 蛋白酶切割所述接头以释放与所述第 一基质结合的所述嵌合多肽。
在本发明的其它优选的方法中，所述嵌合多肽包括第二蛋白酶敏感 位点，对其的切割从所述第二亲和基质释放所述嵌合多肽。
在本发明的其它优选的方法中，所述大肠菌素选自E2、 E7、 E8和E9。
在本发明的其它优选的方法中，所述大肠菌素选自E3、 E4、 E5和E6。
根据本发明的其它方面，提供包含底物和与其相连的、交联的或结
合的至少一种多肽的亲和基质，该多肽由包含选自下列的核酸序列的核
酸分子编码
i) 由图5A或图5B所示的核酸序列组成的核酸分子；
ii) 由与(i)中的核酸分子杂交且编码具有核酸酶活性的多肽的核^ 列组成的核酸分子；
iii) 由于遗传密码的原因与上述(i)和(ii)定义的序列简并的核酸分子。 在本发明的优选实施方案中，所述核酸酶是大肠菌素DNA酶。 在本发明的优选实施方案中，所述大肠菌素DNA酶选自E2、 E7、
E8和E9。
在本发明的其它优选实施方案中，所述核酸酶是RNA酶。 在本发明的优选实施方案中，所述RNA酶选自E3、 E4、 E5和E6。 根据本发明的其它方面，提供将至少一种大肠菌素多肽与底物偶联 的方法，其包括步骤
i) 提供包含大肠菌素多肽和基质材料的制剂；以及
ii) 提供使得所述大肠菌素能够与所述底物相连、交联或结合的条件。
在本发明的优选方法中，所述底物是亲和基质材料。
根据本发明的其它方面，提供试剂盒，其包括本发明的核酸或载 体或本发明的多肽；切割本发明的所述嵌合多肽中的可切割接头的试剂； 以及分离所述嵌合多肽所需的亲和基质材料。
根据本发明的其它方面，提供包含与至少 一种异源多肽连接的大肠 菌素的嵌合融合蛋白。
根据本发明的其它方面，提供编码嵌合多肽的核酸分子，该核酸分 子包含
i) 第一部分，其由如图5A或5B所示的、编码至少一个多肽或其部 分的核酸序列组成，该多肽或其部分具有核酸酶活性；或者由变体核酸 分子组成，该变体核酸分子杂交如图5A或5B所示的、编码至少一种具 有核酸酶活性的多肽的核酸分子；以及
ii) 由编码异源多肽的核酸序列组成的第二部分，其中所述第一和第 二部分相连接。
在本发明的优选实施方案中，所述嵌合多肽是具有降低的核酸酶活 性的变体多肽。优选地，所述嵌合多肽是缺乏核酸酶活性的变体。
适用于包含免疫多肽的嵌合多肽的方面、实施方案、用途和方法等 同地适用于包含嵌合多肽的大肠菌素。
贯穿本说明书的描述和权利要求，词语"包含"和"含有，，以及诸
如"包含(comprising)"和"包含(comprises)"的该词语的变化指"包括 但不限于"，且不旨在(不)排除其它部分、添加物、组分、整体或步骤。
贯穿本说明书的描述和权利要求，除非上下文另行要求，则单数包 括复数，具体地，当使用不定冠词时，本说明书应当被理解为涉及复数 以及单数，除非上下文另行要求。
在本发明特定方面、实施方案或实例中描述的特征、整体、特性、
实施方案或实例，除非与它们不相容。
参考以下附图描述本发明的实施方案，该描述仅为示例性的
图1是编码DNA酶免疫蛋白Im9的核酸序列；
图2是编码RNA酶免疫蛋白Im3的核酸序列；
图3是双免疫蛋白标签的示意图，显示dlmP79的基因构建，其中Im7 和lm9被融合且被切割接头分开。trs:基于高度奸虫传播的TEV蛋白酶 的TEV蛋白酶识别序列；
图4显示在大肠菌素DNA酶(E9和E7)的存在下以及单独时(最后一 条泳道)TEV蛋白酶切割dlmP79的16% SDS-PAGE。 & Imp79和单独的 Imp79经受TEV蛋白酶切割；
图5A是大肠菌素DNA酶结构域E9的核酸序列；图5B是大肠菌素 RNA酶结构域E3的核酸序列；
图6显示使用Im9作为融合纯化标签的纯化步骤的16%SDS-PAGE。 1: pNC3/BL21 DE3的未诱导细胞；2:诱导的、过表达的融合至34个残 基的肽序列(Im9Gol)的Im9; 3&4:分别为细胞破碎后的沉淀和上清液。 将上清液(泳道4)上样到连接有E9 DNA酶的sepharose 4B柱上；5:上样 期间流出柱的流出液；6&7:柱的高盐洗出液；8:经洗脱和透析的蛋白 Im9Go1。 *，表示融合蛋白的降解产物；
表1A (M酸)和IB (DNA)图示说明DNA酶家族的免疫蛋白的比 对，基于Im9蛋白显示高于40%的序列同一性。显示每一亚家族的代表 性蛋白，例如OrfUl代表具有至少94%序列同一性的OrfUl蛋白的家族。 使用的程序是BLAST (在http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)和ClustalW (在http:〃npsa-pbil.ibcp.fr/cgi画bin/align clustalw.pl);
表2A (氨基酸)和2B (DNA)图示说明来自RNA酶免疫家族的蛋白的 比对，基于Im3蛋白显示高于40%的序列同一性。此家族还包括来自荧 光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的蛋白(比对未显示)， (http:〃npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/align clustalw.pl);
表3A (氨基酸)和3B (DNA)图示说明DNA酶家族的比对，基于E9 DNA酶蛋白显示高于40%的序列同一性。显示每一亚家族的代表性蛋白， 例如Uro—Ecoli代表具有至少78%序列同一性的致肾盂肾炎特异性蛋白的 家族。使用的程序是BLAST (在http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)和 ClustalW (在http:〃npsa画pbil.ibcp.fr/cgi-bin/align clustalw.pl); 以及
表4A (氨基酸)和4B (DNA)图示说明基于与E3 RNA酶的同源性的 RNA酶比对，其中根据具有高于40%同源性来鉴定蛋白。显示每一亚家 族的代表性蛋白，例如来自荧光假单胞菌的蛋白是该家族的典型。使用 的程序是BLAST (在http:〃w丽.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)和ClustalW (在 http:〃npsa-pbil.ibcp.fr/cgi画bin/align clustalw.pl)。
材料和方法
构建双免n因和变体
质粒pRJ347 & pRJ345 (分别编码z'mm7 & /mm9基因)被用作模板。双 标签的5'基因被工程化为包括符合基因读框的M/el和5amM限制性位 点。3'基因被设计为包括位于终止密码子后的Wal和I限制性位点。 设计引物以扩增基因，包括突出端以编码基于HAT TEV蛋白酶的中心 TEV蛋白酶识别序列。构建体的5'基因的终止密码子被除去，使得能够 直接连读。最初两轮PCR产物被用在后面的PCR中，其中两种产物均被 用来彼此退火。纯化最终PCR产物并克隆至Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen)中，并用来转化五.co/Z TOP 10感受态细月包
(Invitrogen)。 PCR菌落筛选鉴定了具有正确长度的基因片段。扩增这些 菌落并纯化质粒(Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit)。 DNA测序证实了序 列。为进一步减弱第二标签与E9 DNA酶树脂的任何可能的相互作用， 使用全质粒定点位点突变按照制造商的说明(Stratagene， Pfii Turbo DNA 聚合酶)构建标签的Im7变体(D52A, Im7编号)。通过此方法构建的基因 包括dlmP97 (!>ww9-trs-z>wm7)、 dlmP97a、 dlmp79和dlmP7a9。下文显示 基因构建的示意。
纯化和测定dlmP标签
通过使用A^/el、 fcoi I将基因从克隆载体中切出，连接到类似地限 制的pET22b (Novagen)中并转化感受态五.co/z' BL21 DE3，来测定dlmP 标签的体外存活性。通过菌落PCR筛选鉴别含有插入物的载体，并将这 些质粒命名为pIMP79、 pIMP7a9、 pIMP97和pIMP97a。在蛋白纯化前进 行蛋白表达的试-睑。dlmP蛋白产生在于37 。C下培养在LB-amp (100/ig/ml) 中且在对数生长期间用lmMIPTG诱导的五.co/z'中。收集细胞，声波处 理并就免疫蛋白来说基本纯化(Wallis et al., 1992)。纯化的蛋白被透析至 20mMTEA， pH 7.5中，急速冷冻并保存在-20。C。
在同源DNA酶结构域的存在或不存在下TEV蛋白酶切割dlmP
对E9-Imp79、 E7-Imp79 & Imp79进行蛋白酶切割以评估与同源DNA 酶组成复合体中的dlmP的切割。在30 。C下，在緩沖液(50 mM Tris-HCl， pH7.5, 100 mM NaCl)中，将约40 /xg的Imp79 (在与E7 DNA酶结构域组 成的复合体中、在与E9 DNA酶结构域组成的复合体中或单独)与20 U的 TEV蛋白酶一起孵育1小时40分钟。
交联E-DNA酶与琼脂糖
按照制造商指南将纯化的E9和E7 DNA酶结构域(Garinot-Schneider et al., 1996)交联至CNBr活化的Sepharose 4B珠(Amersham Biosciences)。 也以类似方式将Im9交联至树脂。 去污剂存在下的复合物
作为在去污剂存在下复合物形成的试验，在去污剂中
(j3-octylglucoside高至1% w/v; Triton X100高至1% v/v)进行了 E9 DNA 酶-Im9和E3 RNA酶-Im3复合物，并通过大小排阻层析分析了复合物 形成。去污剂不破坏核酸酶结构域与其免疫蛋白的复合物化。这些实验 显示复合物不净皮加入的去污剂破坏，并且当在复合物形成之前加入去污 剂时也形成复合物。对于E9DNA酶交联的琼脂糖使用去污剂NP40的緩 沖液溶液(高至0.5% v/v)并加入dlmP蛋白标签。在去污剂的存在下，该 标签依然与树脂结合。
免疫蛋白作为多肽的纯化融合标签
工程化/mm9基因以延伸其序列以包括TEV蛋白酶识别位点C末端。 设计基因构建体以包括用于将靶蛋白3，克隆至该蛋白酶位点的限制位 点。试验系统是Im9Go1融合蛋白，其中Gol是噬菌体排除系统的35个 氨基酸的多肽共活化物。限制位点是(5，-3，)
M/eI(>/ww9)(trs)^oIi/z> fflI(go/)^"wM。将该基因构建体连接至pETllc 和pET15b载体(Novagen)。使用阴离子交换层析或E9 DNA酶交联的树 脂进行*达产物的纯化。
权利要求
1.包含与至少一种异源多肽连接的免疫多肽的嵌合融合蛋白。
2. 根据权利要求1所述的蛋白，其中所述免疫多肽通过接头分子 与所述异源多肽连接。
3. 根据权利要求2所述的蛋白，其中所述接头包含可切割的肽接头。
4. 编码嵌合多肽的核酸分子，所述核酸分子包含i) 第一部分，其由图l或图2所示的、编码至少一种多肽或其活性 结合部分的核酸序列组成，该多肽或其活性结合部分具有免疫蛋白相关 活性；或者其由变体核酸分子组成，该变体核酸分子杂交图1A或图1B 所示的、编码具有免疫多肽相关活性的多肽的核酸分子；以及ii) 第二部分，其由编码异源多肽的核酸序列组成，其中所述第一和 第二部分相连接。
5. 根据权利要求4所述的核酸分子，其中所述第一和第二核酸分 子通过接头分子连接。
6. 根据权利要求5所述的核酸分子，其中所述接头编码可切割的 肽接头。
7. 根据权利要求4-6中任一权利要求所述的核酸分子，其中所述 第一部分包含由编码至少一种大肠菌素DNA酶免疫多肽的核酸序列 组成的核酸分子。
8. 根据权利要求7所述的核酸分子，其中所述免疫多肽选自Im2、 Im7、 Im8和Im9。
9. 根据权利要求4-6中任一权利要求所述的核酸分子，其中所述 第一部分包含由编码至少一种大肠菌素RNA酶免疫多肽的核酸序列 组成的核酸分子。
10. 根据权利要求9所述的核酸分子，其中所述免疫多肽选自 Im3、 Im4、 Im5和Im6。
11. 根据权利要求4-10中任一权利要求所述的的核酸分子，其编 码包含至少两种免疫多肽的嵌合多肽，其中所述多肽为符合读框的翻 译融合。
12. 根据权利要求11所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码两 种结合类似大肠菌素多肽的免疫多肽。
13. 根据权利要求11所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码两 种结合不类似的大肠菌素多肽的免疫多肽。
14. 根据权利要求6-13中任一权利要求所述的核酸分子，其中所 述可切割的接头包含至少一个蛋白酶敏感位点。
15. 才艮据;f又利要求14所述的核酸，其中所述位点是烟草蚀紋病毒 蛋白酶的切割位点。
16. 权利要求4-15中任一权利要求所述的核酸分子编码的嵌合多肽。
17. 包含权利要求1-16中任一权利要求所述的核酸分子或多肽的 组合物。
18. 包含权利要求4-15中任一权利要求所述的核酸分子的载体。
19. 经权利要求4-15中任一权利要求或权利要求18所述的核酸 或载体转染的细胞。
20. 根据权利要求19所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
21. 根据权利要求20所述的细胞，其中所述真核细胞是哺乳动物 细胞。
22. 根据权利要求20所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
23. 根据权利要求20所述的细胞，其中所迷细胞是酵母细胞。
24. 根据权利要求19所述的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
25. 权利要求1-3中任一权利要求或权利要求16所述的嵌合多肽 在分离生物分子复合物中的用途。
26. 根据权利要求25所述的用途，其中所述生物分子复合物包含 至少一种蛋白的复合物。
27. 根据权利要求26所述的用途，其中所述复合物是蛋白分子的 复合物。
28. 从多种生物分子中分离生物分子复合物的方法，包括提供 包含多种生物分子的制剂和至少一种权利要求1-3中任一权利要求或 权利要求16所述的嵌合多肽，以及在允许所述制剂中的生物分子与所 述嵌合多肽相连的条件下孵育所述制剂，以及分离与所述嵌合多肽相 连的生物分子复合物。
29. 从多种生物分子中分离生物分子复合物的方法，包括步骤i) 提供包含多种生物分子的制剂和至少一种权利要求1-3中任一 权利要求或权利要求16所述的嵌合多肽，并且在允许所述制剂中的生 物分子与所述嵌合多肽相连的条件下孵育所述制剂；ii) 将所述混合物与包含所述嵌合多肽的结合伙伴的第 一亲和基质 接触以允许至少部分所述嵌合多肽与所述基质结合，并且洗涤所述基质 以除去与所述嵌合多肽和所述基质非特异结合的生物分子；iii) 从所述基质洗脱结合的嵌合多肽和相连的生物分子；iv) 将所述洗脱的嵌合多肽与包含所述嵌合多肽的第二结合伙伴的 第二亲合基质接触以允许所述嵌合多肽的不同部分与所述第二亲和基质 结合；以及v) 从所述第二基质洗脱所述嵌合多肽并且任选地释放与所述嵌合 多肽相连的所述生物分子。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述制剂包含适于表达所 述嵌合多肽的细胞。
31. 根据权利要求29或30所述的方法，其中所述复合物包含至 少一种蛋白分子。
32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述复合物包含蛋白分子 的复合物。
33. 根据权利要求29-32中任一权利要求所述的方法，其中所述 第一亲和基质包含结合其同源免疫多肽的大肠菌素多肽。
34. 根据权利要求29-32中任一权利要求所述的方法，其中所述 第二亲和基质包含与所述第一亲和基质的大肠菌素多肽不同的大肠菌素多肽。
35. 根据权利要求29-34中任一权利要求所述的方法，其中通过与 蛋白酶一起孵育获得所述洗脱，所述蛋白酶切割所述接头以释放与所述 第 一基质结合的所述嵌合多肽。
36. 根据权利要求29-35中任一权利要求所述的方法，其中所述嵌 合多肽包括第二蛋白,感位点，对其的切割从所述第二亲和基质释放 所述嵌合多肽。
37. 根据权利要求33-36中任一权利要求所述的方法，其中所述大 肠菌素多肽选自E2、 E7、 E8和E9。
38. 根据权利要求33-36中任一权利要求所述的方法，其中所述大 肠菌素多肽选自E3、 E4、 E5和E6。
39. 包含底物和与其相连的、交联的或偶联的至少一种多肽的亲和 基质，所述多肽由包含选自下列的核酸序列的核酸分子编码i) 由图5A或图5B所示的核酸序列组成的核酸分子；ii) 由与(i)中的核酸分子杂交且编码具有核酸酶活性的多肽的核^ 列组成的核酸分子；iii) 由于遗传密码的原因与上述(i)和(ii)定义的序列简并的核酸分子。
40. 根据权利要求39所述的基质，其中所述核酸酶是大肠菌素 DNA酶多肽。
41. 根据权利要求40所述的基质，其中所述大肠菌素DNA酶多肽 选自E2、 E7、 E8和E9。
42. 根据权利要求39所述的基质，其中所述核酸酶是大肠菌素 RNA酶多肽。
43. 根据权利要求42所述的基质，其中所述RNA酶多肽选自E3、 E4、 E5和E6。
44. 将至少一种大肠菌素多肽与底物偶联的方法，所述方法包括步骤ii) 提供包含大肠菌素多肽和基质材料的制剂；以及iii) 提供使得所述大肠菌素能够与所述底物相连、交联或结合的条件。
45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述底物是亲和基质材料。
46. 试剂盒，其包括权利要求4-15中任一权利要求或权利要求 18所述的核酸或载体或权利要求1-3中任一权利要求或权利要求17所 述的多肽；切割所述嵌合多肽中的可切割接头的试剂；以及分离所述嵌 合多肽所需的亲和基质材料。
全文摘要
我们描述包含细菌免疫多肽的融合蛋白及其在蛋白复合物的亲和纯化中的用途。
文档编号C07K1/22GK101180309SQ200680017355
公开日2008年5月14日 申请日期2006年3月13日 优先权日2005年3月17日
发明者科林·克莱安杜斯, 西奥内·乔治乌 申请人:约克大学