专利名称：：一种高纯度的人第Ⅸ凝血因子的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种高纯度的人第IX凝血因子的制备方法，特别涉及一种通过对包含第IX凝血因子的物质(取自人血浆或者重组的细胞培养基)进行离子交换层析和亲合层析来使病毒钝化或去除病毒的阶段，可制得几乎无掺杂蛋白质、比活性(specificactivity)在150IU/mg以上的安全的高纯度第K凝血因子。
背景技术：
：人第K凝血因子为凝血过程中不可缺少的的糖蛋白，在由于遗传因素或病理因素而血液中无第IX凝血因子或第IX凝血因子不足的情况下，会使血液中的凝血过程不完整，从而引发B型血友病。B型血友病主要通过遗传发生，在30,00050,000名男婴中1名男婴具有B型血友病，属于罕见的遗传性疾病。为治疗这些B型血友病患者而采用了将纯化及浓縮后的人体血液中第K因子提供给患者体的方法。在肝脏合成第K因子时所需的维他命K，具有多种与其他维他命K-依赖性糖蛋白共同的特征。参与凝血过程的维他命K-依赖性糖蛋白有第II因子、第VD因子、第X因子等。第IX因子为含有约17.5%的糖(4.7%己糖、6.8%N-乙酰基氨基己糖、6%唾液酸)的单体结构(monomer)的糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶(serineprotease)的一种。分子量由第K因子中的碳水化合物量所决定，其大小约为55,00075,000Da。根据氨基酸序列所计算的单独的蛋白质分子量约为47,054Da。在分子结构内的N末端附近存在具有12个Y羧基谷氨酸(carboxyglutamicacid)的区域，在活化时需要磷脂(phospholipid)和钙离子。由于以每1分子第K因子含有10分子左右含有属于酸性低聚糖(acidicoligosaccharide)的唾液酸(sialicacid)，因此具有很低的等电点(isoelectricpoint,pl)。根据第IX因子中存在的碳氢化合物的种类和量而表现出pi为4.04.6的多样性(JournalofchromatographyA,844，1999，119-128)。通过活化的第XIa因子(FactorXIa)水解第K因子的氨基酸Arg(145)Ala(146)之间和Arg(180)Val(181)之间，由35个氨基酸构成的活性縮氨酸(activationpeptide)脱离而活化，为与天然的第IX因子区别而将脱离活性縮氨酸的第K因子称为第IX因子的活性型(activeform)。并且也可通过包括活化的第VEa因子(FactorVEa)、组织因子(FactorIII)及钙离子(Ca2+)的磷脂复合物所活化(如图l所示)。存于人血浆内的第K因子的浓度为O.l(imol(5滞/W)，从而具有较低的浓度。由此，为治疗B型血友病患者的治疗需要提供大量的全血或血浆，同时会过量提供存于血浆内的纤维蛋白原(fibrinogen)等的其他蛋白质。为减少这些副作用，1950年代末首次开发出浓縮的第IX因子。该方法是通过将血浆中的第K因子吸附于硫酸钡(bariumsulfate)而沉淀后通过洗漆去除其他蛋白质，此后分离出吸附于硫酸钡的第IX因子。到后来，以无毒性盐类的三钙磷酸盐(tricalciumphosphate)代替了硫酸钡。这种通过吸附和沉淀的第K因子的浓縮工序中再浓縮第IX因子的同时，会同时浓缩其他维他命K-依赖性糖蛋白中的第n因子、第VD因子、第X因子。这种浓縮物称为第仅因子复合物(FactorKcomplex)。从1960年代开始，通过上述方式浓縮的第K因子复合物普遍用于B型血友病的治疗。一般通过现有的述低温乙醇分馏工序中分离出血浆中的白蛋白或球蛋白，但是通过该低温乙醇分离工序不能分离第K因子复合物，从而不适用于第K因子的制备。为解决上述缺点，开发出利用阴离子交换层析的柱层析工序。即，通过冷沉(Cryoprecipitation)去除具有丰富的第VID因子的冷凝蛋白质(cryoprecipitate)后，将去除冷凝蛋白质的、血浆中的第K因子吸附于阴离子交换树脂纯化浓縮的方法。但是在该方法中也同样导致第II因子、第VE因子、第X因子的浓縮。这种利用阴离子交换树脂所生产的第IX因子复合物到现在也常用于B型血友病的治疗。但是根据报告，在提供第IX因子复合物后存在静脉血栓症(venousthrombosis)禾口弥散性血管内凝血(disseminatedintravascularcoagulation,DIC)等症状(Thrombosis&Haemostasis,vol73，no.4,584-591，vol79,no.4,778-783)。据推测，这种副作用是由于与第K因子同时提供的过多的其他凝固蛋白质或者浓縮物中多余的凝血酶原成分(thrombogeniccomponents)所造成的(hypercoagulablestate)所产生的。在过多或长时间提供第IX因子复合物的情况下会使正常的第n因子量增加，使其在血浆中消失的时间变长。为降低第k因子复合物的副作用，从1990年开始生产高纯度第k因子，该高纯度第k因子去除了第n因子、第vn因子、第x因子。高纯度第仅因子，是通过进行阴离子交换层析，对浓縮的第k因子复合物进行肝素凝胶法(Heparingel)或单体隆抗体凝胶柱层析(monoclonalantibodygelcolumnchromatography)而去除了第II因子、第vn因子、第x因子，从而代替了以往来的第仅因子复合物。并且，1997年GeneticInstitute开发出利用CHOcell的遗传重组第IX因子，并以Benefix"名称销售。来源于血液的凝血因子的最大缺点是存在病毒感染的危险，该病毒是指有可能在血液中的HIV、HBV、HCV等。为确保来源于血液的凝血因子的病毒安全性，在纯化及浓縮中必须包括去除病毒的工序。一般通过S/D处理使病毒钝化，为进一步有效去除病毒公开有在钝化的同时进行亲和层析的工序。并且，也有利用纳米过滤(nanofilter,20nm)的更为有效的纳米过滤方法，但是在利用该纳米过滤时，需在事前对凝血因子进行高纯度浓縮的工序，以防止发生在利用未进行高纯度制备的凝血因子进行纳米过滤时过滤器堵塞而不能使用。虽然可通过单体隆抗体(monoclonalantibody)选择性分离第IX因子，但是由于生产抗体需使用动物细胞，但是不能排除来源于动物细胞的病毒感染。并且，也不能排除在进行层析工序中随同抗体洗提的免疫球蛋白(IgG)所引起的副作用。并且，也不能完全克服在从重组细胞培养基中分离第IX因子时的病毒问题。从而需要开发出一种可完全去除病毒，且纯度大于99%的安全的人第仅凝血因子的制备方法。
发明内容为解决上述问题的不足，本发明以提供一种可消除由血友病B患者的治疗中所提供的多余凝血蛋白质或浓縮物中多余血栓形成成分而引起的高凝状态(hypercoagulablestate)所致的静脉血栓症(venousthrombosis)或弥漫性血管内凝血(disseminatedintravascularcoagulation,DIC)等的副作用的高纯度的人第IX凝血因子的制备方法为目的。以下对本发明的高纯度的人第K凝血因子的制备方法进行说明。图2是本发明的人第K凝血因子制备方法的流程图。用于本发明的人血浆、凝血因子等溶液的样品并不限于特定形状的物质。本发明的人第K凝血因子的制备方法的原料优选为去除冷凝蛋白质(cryo)的人血浆，也包括包含第IX因子的血浆部分、重组的第K因子的细胞培养基或包含第IX因子的物质等。在本发明的一实施例中，在进行阴离子交换层析(anionexchangechromatography)来洗提包含第K因子的溶液后进行S/D(Solvent/Detergenttreatment)处理来钝化病毒后进行阴离子交换层析来再洗提后进行浓缩及过滤来制备人第K凝血因子的方法中，进一步包括，对通过阴离子交换层析洗提的溶液，进行肝素亲合层析进行洗提，而后通过进行阳离子交换层析收集非吸附液，进行纳米过滤(nanofiltration)去除病毒的工序。具体为，在本发明中为去除以上述阴离子交换层析制备的血浆蛋白溶液中残留的其他掺杂蛋白质，进行以对凝血因子具有亲合性的肝素(heparin)为配合基的肝素亲合层析，来收集未吸附于阳离子交换柱的非吸附液来去除其他杂质。上述肝素亲和性层析中的由于配合基用了肝素(heparin),其载体(树脂)可利用琼脂糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺等多种树脂，但并不限于此。最优先使用广泛使用的肝素琼脂糖凝胶6FF柱(heparinsepharose6FF)。在本发明的肝素亲和性层析中，在适用包含第IX因子的溶液前所使用的平衡缓冲液的离子强度(ionicstrength)和包含第K因子的溶液的离子强度为20mS/cm以下，pH为5.09.0，洗涤吸附于树脂的其他蛋白质时的洗涤缓冲液的离子强度为1020mS/cm，而后洗提包含第IX因子的溶液时的洗提缓冲液的离子强度为2050mS/cm。并且，其中所述阳离子交换层析(cationexchangechromatography)的柱官能团(functionalgroup)选自弱阳离子(weakcation)中的的羧甲基(carboxymethyl-,CM-)、羧基(carboxy-,C-)、强阳离子(strongcation)中的磺基(sulfo-,S-)、磺酸甲基(sulfomethyl,SM-)、磺乙基(sulfoethyl-，SE-)、磺丙基(sulfopropyl-,SP-)、二氧磷基(phospho-,P-)等，且并不限于此。柱树脂(resine)选自琼脂糖凝胶(Sepharose)、葡聚糖(Sephadex)、琼脂糖(agarose)、葡聚糖纤维素(Sephacel)、聚苯乙烯(Polystyrene)、聚乙烯(Polyacrylate)、纤维素(Cdlulose)、Toyoperl等，且并不限于此。本发明中的上述阳离子交换层析优选在pH3.06.0条件下进行，且通过收集未吸附于柱而漏出的非吸附液来制备。阳离子交换层析中的平衡缓冲液可根据条件以多种方式使用，在适用包含第K因子的溶液之前所使用的平衡缓冲液的离子浓度(ionicstrength)和使用包含第K因子的溶液的离子浓度优选为1050mS/cm。本发明涉及一种高纯度的人第K凝血因子的制备方法，特别涉及一种通过对包含第IX凝血因子的物质(取自人血浆或者重组的细胞培养基)进行离子交换层析和肝素亲合层析来使病毒钝化或去除病毒的阶段，可制得几乎无掺杂蛋白质、比活性(specificactivity)在150IU/mg以上的安全的高纯度第IX凝血因子制剂。图1是表示内源性凝血途径和外源性凝血途径的示意图。图2是本发明的高纯度的人第K凝血因子制备方法的示意图。图3是表示在非还原(A)状态及、还原(B)状态下、对通过本发明所制备的高纯度第XI凝血因子制剂和市场销售的第XI凝血因子制剂进行的SDS-PAGE结果的示意图。M:标准标号(阻凝蛋白；198，牛乳糖；115，BSA;93，卵清蛋白；49.8，碳酸酐酶；35.8，大豆胰蛋白酶抑制剂；29.2，溶解酵素；21.3，抑肽酶；6.4);Lanel:根据表2的方法的高纯度第XI凝血因子；Lane2:根据表3的方法的高纯度第XI凝血因子；Lane3:根据表4的方法的高纯度第XI凝血因子；Lane4:Facnyne(株式会社绿十字)；Lane5:Mononine(ZLBBehring公司)；Lane6:Octanyne(Octapharma公司)；Lane7:BerininHS600(ZLBBehring公司)；Lane8:ImmunineSTIMplus600(Baxter公司)图4是表示根据竣甲基-琼脂糖凝胶FF的按pH的活性(activity)安全性结果示意图。具体实施方式实施例l:利用阴离子交换层析的纯化(传统工序)以去除冷凝蛋白质的血浆或重组第IX因子的细胞培养基为原料，将该原料与二乙氨基一乙基-葡萄糖凝胶A-50(DEAE-SephadexA-50)混合，用缓冲液预洗(prewash)后，在4"C温度条件下搅拌2个小时。然后对吸附有第仅因子的胶进行过滤及圆心分离的方式进行分离。在预洗(washing)后，第K因子通过高盐浓度的缓冲液洗提。将上述洗涤液的pH值适当调节到7.5左右，而后进行透析、浓缩而在-70°C条件下保存。并且，另行对浓縮液进行取样(aliquot),通过KFDA(KoreaFoodandDrugAdministration)规定的血液制剂及重组制剂的标准及实验方法测定了浓度。对包含第K因子的部分进行S/D处理来完成病毒纯化工序。将完成纯化工序后的溶液吸附于2次纯化用DEAE-toyopearl650M柱后，按照工序收集洗提液。实施例2:利用肝素琼脂糖凝胶(Heparinsepharose)6FF柱层析的纯化将通过上述实施例1所纯化制备的第IX凝血因子复合物溶液10ml调节到离子强度20mS/cm以下、pH7.0后，在肝素琼脂糖凝胶6FF柱(柱条件:直径lcm、高度18cm、流速(flowrate)1.0ml/min、常温)流入平衡缓冲液(20mM柠檬酸钠、pH7.0)来维持平衡，并且使样品装样(loadingsample)流过而吸附，通过以与平衡缓冲液相同的溶液进行一次洗涤，一0.1M的氯化钠进行二次洗涤后，以0.25M的氯化钠洗提。对上述洗提液进行蛋白质浓度测定后进行了SDS-PAGE(BSAstandard(2mg/ml，PIERCE))，利用Amdung公司的CoagulationtimerKC10测定了浓度。对实施例1的2次阴离子柱洗涤液和实施例2的肝素琼脂糖凝胶6FF柱洗提液的比活性进行比较，发现肝素琼脂糖凝胶6FF柱工序中的比活性为80-90IU/mg,为实施例1的洗提液浓度的14倍以上。实施例3:利用阳离子交换层析(CM-s印haroseFF)的纯化将通过上述实施例2所纯化的第K凝血因子复合物10ml调节到离子强度20mS/cm以下、pH4.0后，适用于以平衡缓冲液(0.30-0.4M氯化钠中柠檬酸盐占20mM、pH4.0)维持平衡的CM-sepharoseFF柱(柱条件直径lcm、高度5cm、流速(flowrate)1.0ml/min)后收集了非吸附液。对上述非吸附液进行蛋白质浓度测定后进行了SDS-PAGE，发现比活性最低为150IU/mg以上。图3是表示为确认通过本发明所制备的第XI凝血因子制剂和市场销售的其他产品的纯度的SDS-PAGE结果的示意图。如图3所示，根据本发明所纯化制备的第K凝血因子制剂具有与其他产品相比更少的掺杂蛋白质，从而可知本发明的第IX凝血因子具有更好的纯度。实施例46:第K凝血因子的大量纯化为确认大量生产本发明的高纯度第K凝血因子制剂的可行性，进行了多次扩大实验，并将各阶段的比活性、纯化倍、产量等列于下表16中。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表6<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如表16所示，重复进行了多次本发明，发现可制备包含第K凝血因子的最终浓缩液的比活性(specificactivity)最小约为150(IU/mg)以上的高纯度的第K凝血因子制剂。将该最终浓縮液按需放入小瓶后冻结干燥，从而用作长期安全性的实验试样和全临床试样。实施例7:细胞培养基中的第K凝血因子的纯化将己克隆第K因子的CHO细胞，在无血清培养基中培养后，将去除CHO细胞的5L培养液，按照上述实施例13所述的方法中除S/D(solvent/detergent)处理的方法来纯化制备第IX因子，该第IX因子的比活性、纯化倍、产量如表7所示。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例8:病毒的纯化(inactivation)及去除(removal)工序在病毒纯化工序及纳米过滤工序中进行了多方面的病毒去除实验(HIV;HumanImmunodeficiencyVirus,BHV;BovineHerpesVirus,BVDV;BovineViralDiarrheaVirus,HAV;HepatitisAVirus,EMCV;EncephaloMycarditisVirus,PPV;PorcineParvovirus),其试验结果如下表8、9所示。表8中的病毒去除值是指，在进行stock病毒的titer中去除titer的数据的LOG值，表9的病毒减小值是指将病毒stock刺突(spike)到目标病毒后，从进行刺突的数据中减去工序完成后的titer值的LOG值。表8来源于血浆的第K因子的病毒去除工序<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>本发明涉及一种高纯度的人第仅凝血因子的制备方法，其中对包含第K凝血因子的物质(取自人血浆或者重组的细胞培养基)进行离子交换层析和肝素亲合层析来使病毒钝化或去除病毒的阶段，可制得几乎无杂质、比活性(specificactivity)在150IU/mg以上的安全的高纯度的第K凝血因子。以上，对本发明的实施方式进行了详细说明，但本发明的权利要求范围不只限于上述范围，利用本发明的权利要求范围中所定义的基本概念的各种变形及改良形态也属于本发明的权利要求范围。权利要求1、一种人第IX凝血因子的制备方法，以包含第IX凝血因子的物质为原料来制备人第IX凝血因子，且包括如下步骤通过进行1次以上阴离子交换层析收集人第IX凝血因子的阶段；通过进行肝素亲合层析进行洗提的阶段；通过进行阳离子交换层析收集非吸附液的阶段；通过进行纳米过滤去除病毒的阶段。2、根据权利要求1所述的人第K凝血因子的制备方法，其中在所述通过进行肝素亲合层析进行洗提的阶段，在适用包含第K因子的溶液之前所使用的平衡缓冲液的离子强度(ionicstrength)和包含第K因子的溶液的离子强度为20mS/cm以下、pH为5.09.0，在洗漆吸附于缓冲液的其他蛋白质时的洗涤缓冲液的离子强度为1020mS/cm，在洗提包含第K因子的溶液时的洗提缓冲液的离子强度为2050mS/cm。3、根据权利要求1所述的人第K凝血因子的制备方法，其中所述阳离子交换层析的柱官能团选自羧甲基(carboxymethyl-，CM-)、羧基(carboxy-,C-)、磺基(sulfo-,S-)、磺酸甲基(sulfomethyl,SM-)、磺乙基(sulfoethyl-，SE-)、磺丙基(sulfopropyl-,SP-)、二氧磷基(phospho画，P-)，柱树脂(resine)选自琼脂糖凝胶(Sepharose)、葡聚糖(Sephadex)、琼脂糖(agarose)、葡聚糖纤维素(Sephacel)、聚苯乙烯(Polystyrene)、聚乙烯(Polyacrylate)、纤维素(Cellulose)、Toyopearl。4、根据权利要求1所述的人第K凝血因子的制备方法，其中所述通过进行阳离子交换层析收集非吸附液的阶段，是在pH3.06.0的条件下进行的。5、根据权利要求1所述的人第仅凝血因子的制备方法，其中在所述通过进行阳离子交换层析收集非吸附液的阶段，包含平衡缓冲液和第K因子的溶液的离子强度为1050mS/cm。6、根据权利要求1所述的人第K凝血因子的制备方法，包含第K凝血因子的物质为人血浆或重组的第IX凝血因子的细胞培养基。全文摘要本发明公开一种高纯度的人第IX凝血因子的制备方法，通过对包含第IX凝血因子的物质(取自人血浆或者重组的细胞培养基)进行阴离子交换层析(anionexchangechromatography)、肝素亲合层析(cationexchangechromatography)、阳离子交换层析(heparinaffinitychromatography)而制备人第IX凝血因子，并且包括进行S/D处理(Solvent/Detergenttreatment)使病毒钝化或者通过纳米过滤(nanofiltration)去除病毒的阶段，通过本发明的制备方法可制得几乎无掺杂蛋白质、比活性(specificactivity)在150IU/mg以上的安全的高纯度的第IX凝血因子制剂。文档编号C07K1/14GK101291951SQ200680039024公开日2008年10月22日申请日期2006年10月18日优先权日2005年10月18日发明者镛姜,孙基桓,崔龙云,成学模,李成来,许在旭,金基镕申请人:株式会社绿十字