专利名称：：生物测定法的制作方法生物测定法此处公开的发明涉及编码生物测定法(Moassay)受体的载体和使用所述生物测定法受体来评估目的化合物的体外生物测定法。特别地，所述生物测定法为比较不同配体在目的化合物存在和/或不存在下与其各自受体或结合伙伴的结合提供了通用平台。很大程度上考虑到利用抗体-抗原相互作用的高度特异性和亲和力的组合，抗体很久以来就被视为通过把向的药物递送进行治疗干预的潜在试剂。可通过就抗体与抗原例如配体或其受体的结合来检验生物测定法的输出，测量抗体的结合。因此，常规的体外生物测定法依赖于且受限于内源性的细胞表面表达的受体的数目。事实上，必需鉴定表达所选择的受体的合适的细胞系。此外，依赖于所考虑的细胞类型和受体，受体数目变化很大。必须通过生物测定法来评估潜在的治疗性抗体。然而，通常，对于每种产物开发出不同的测定法。许多测定法具有长的数据读出(read-outs),从而极可能出错。合适的生物测定法数据读出在类型、时间点和对所牵涉的生物学的理解水平方面变化很大。因此比较具有不同数据读出的此类测定法通常是无意义的。通用测定法平台使得能够开发出对于每种潜在的治疗性抗体产物来说基本上相似的强有力的测定法形式(assayformat),从而有助于更好地理解产物的稳定性和允许直接、有意义地比较不同批次的产物。这样的通用测定法平台可用于产物的最初筛选、产物效力的分析、产物的稳定性和批次间重现性的监测。最有利地，这样的通用测定法平台将允许比较针对相同抗原而产生的不同抗体的功效。通用测定法也有助于报告提交和管理部门的理解。此处公开的发明克服了上述困难，并且提供了使用表达重组目的受体的细胞的标准化体外生物测定法。特别地，本发明的测定法提供了用于使用本发明的生物测定法受体来体外评估配体结合的通用平台，并允许评估拮抗或激动所述结合的试剂。因此，提供了编码生物测定法受体的载体，所述生物测定法受体包含(a)能够结合配体的细胞外配体结合区；(b)跨膜区；(c)一个或多个能够传递信号的细胞内信号传导区，其中所述细胞外配体结合区和细胞内信号传导区非天然地融合在一起；和(d)报告子区；其中当所述栽体在适合于表达的条件下在所选择的宿主细胞中表达为膜结合蛋白时，配体与细胞外配体结合区的结合导致从报导子区产生可检测的信号。本领域技术人员将理解，如果使用信号序列将细胞外区域靶向宿主细胞的细胞表面，那么所述信号序列将存在于所述生物测定法受体的N-末端，其后接着是细胞外配体结合区、跨膜区和细胞内信号传导区。任选地，可通过在DNA密码中整合入间隔子序列而将一个或多个区域与邻近区域分开。例如，在构建编码生物测定法受体的栽体的过程中，一个或多个限制位点可在将区域衔接在一起时在区域之间留下一个或多个间隔子氨基酸残基。在一个实施方案中，通过间隔子序列将各区域与其相邻的区域分开。间隔子序列可以是2个氨基酸或3、4、5、6、7、8、9、IO或更多个氨基酸。细胞外配体结合区包括能够结合配体的任何蛋白质(或编码此类蛋白质的核酸)。最优选地，配体是可溶性配体。本发明的生物测定法受体的膜结合细胞外配体结合区包括表面膜受体，例如激酶受体，G蛋白偶联受体(GPCR)，生长因子受体，细胞因子受体例如白细胞介素受体，例如IL-1R(I和II型)，IL-2R(ot,P和Y亚基)，IL-3R，IL-4R,IL-5R，IL-6R;gpl30，IL-8R,IL-13Rocl，IL-4Rot，IL-15R(ot，P和Y亚基)，IL-17R;TNF受体(TNF-RI和TNF-RII);IL-P，IL-2，IL-IO，IL-15，G-CSF,CSF-1，M-CSF，GM-CSF，HGF，EGF,PDGF，IGF，FGF，TGF-0，IP-IO，ITAC，MIG和VEGF的受体；CD标记物例如CD2，CD4，CD5，CD7，CD8，CDlla，CDllb，CDllc，CDlld，CD16，CD19，CD20，CD22，CD24，CD28，CD33，CD40，CD48，CD69，CD70，CD122和CD244;和ICOS-L，OX-40-L，CD40L和CD137-L的受体。生物测定法受体的膜结合细胞外配体结合区还可以包括作为通常未在细胞膜上或细胞膜中发现的结合区的分子，例如胞质蛋白或可溶性蛋白，例如但不限于，通常被分泌的蛋白质。因此，细胞外配体结合区还可以包括SOST，和LDL相关蛋白例如LRP5和LRP6，趋化因子，细胞因子，和生长因子，其依靠跨膜区而呈现在细胞外。本领域技术人员将会理解，在编码生物测定法受体的栽体的DNA序列中包含将细胞外配体结合区靶向细胞表面的信号序列。此类信号序列在本领域内是已知的，并且包括与细胞外配体结合区天然相连的序列(信号序列/前导序列)。在将细胞外配体结合区靶向细胞表面的过程中信号序列通常将被加工和除去。在一个实施方案中，可以选择细胞外配体结合区，从而使其与一个或多个其他细胞外配体结合区相互作用以获得能够识别(结合)配体的多联(multiply-associated)细胞外配体结合区。因此，在一个实施方案中，本发明的生物测定法受体包含超过一个的膜结合细胞外配体结合区。更优选地，可在宿主细胞中表达包含不同配体结合区的两种或更多种生物测定法受体以获得能够识别(结合)配体的多联细胞外配体结合区。跨膜区通常用于将生物测定法受体锚定至细胞膜(从而细胞外配体结合区是膜结合的)并且包括任何蛋白质(或编码此类蛋白质的核酸)。这样的区域可以来源于各种来源，例如T细胞受体(TCR)的ot、P或C链(TCR)，CD28,CD4，CD5，CD8，CD3s，CD16,CD22，CD23，CD45,CD80,CD86,CD64,CD9,CD37,CD122,CD137或CD154,细胞因子受体例如白细胞介素受体，TNF-R,酪氨酸激酶受体或干扰素受体，或集落刺激因子受体的全部或一部分。备选地，跨膜区可以是合成的。合适的合成的跨膜区将主要包含疏水氨基酸例如亮氨酸和缬氨细胞内信号传导区包括任何蛋白质(或编码此类蛋白质的核酸)，所述蛋白质可以参与导致直接或间接产生细胞内信使系统的信号的产生。特定的细胞内信使系统包括一个或多个激酶途径例如酪氨酸激酶途径、MAP激酶途径或蛋白激酶C途径；G蛋白或磷脂酶介导的途径；钙介导的途径；cAMP或cGMP介导的途径；或一个或多个牵涉一种或多种细胞因子例如白细胞介素(例如IL-2)或转录因子例如NFkB、NFAT或AP-1的合成的途径。最优选地，这样选择细胞内信号传导区域，即使得它们协同作用。细胞内信号传导区可来源于一种或多种天然发生的蛋白质信号传导序列。合适的实例包括但不限于，来源于TCR的序列例如C、n或s链的部分，和包括TCR;链的第一(TCR;1)、第二(TCR;2)和第三(TCR;3)免疫受体的基于酪氨酸的激活基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif)(ITAM)，FcHy例如FcRIIIy或FcRIy，FcRp例如FcRI卩；CD3y;CD38;CD3s;和CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d。特别优选的ITAM包括来源于TCR;1、TCR;2、TCR;3和FcsRIy;CD4;CD8;和Fc受体的Y链的那些。还包括SB28(GSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAGS;SEQIDN0:1)和SB29(GSMIETY曙SPRSAATGLPISMKGS;SEQIDNO:2);可在每个序列的任一端省略一个或两个GS连接体。特别希望细胞内信号传导区包括合成的信号传导区，例如基于上述细胞内信号传导区中的任一个的序列的合成区域。合成的ITAM和合成的信号传导区以及制备其的方法描述于W000/63372和W000/132867中，所述申请通过引用以其整体合并入本文(作为例子参见表l)。可如W000/63372和W000/132867中所描述的，使用这些信号传导基序的组合。还包括例如来自下列的信号传导组分细胞因子受体例如IL-ip、TNF-RI和TNFRII，和干扰素受体；Tol1样受体(TLR)例如TLR4;集落刺激因子例如GMCSF;酪氨酸激酶例如ZAP-70、fyn、lyk、ltk、syk和其结合性组分例如Vav、Crk、LAT和Grb-2;磷脂酶C和磷酸肌醇-3激酶；粘着分子例如LFA-1和LFA-2、B29、MB-1、CD35、CD3y、CD5、CD2和CD154,以及共刺激分子例如CD28、IC0S、CD134和CD137。还包括免疫受体的基于酪氨酸的抑制基序UTIM)。ITIM的特定实例包括FcyR(例如FcyRIIB)、CD22、EP0R、IL-2ssR和IL-3pR。表1.特别地用于本发明的主要信号传导基序的来源和氨基酸序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>正如本领域技术人员将会意识到的，可根据生物测定法受体的要求，从天然序列产生氨基酸缺失、插入和/或突变以改变所述区域的准确性质(precisenature)。正如对于本领域技术人员来说是很清楚的，细胞内信号传导区的组合可以在分开的生物测定法受体内使用，或者可以在单个生物测定法受体内以串联的方式使用。最优选地，以串联的方式使用它们。在一个实施方案中，生物测定法受体的细胞内信号传导区包含来源于CD28的一个细胞内信号传导区和来源于TCR的组分例如TCRC或来源于与所述信号传导区相关联的信号传导级联反应的组分的第二个细胞内信号传导区。在另一个实施方案中，一个细胞内信号传导区来源于CD28，第二个细胞内信号传导区导致直接或间接产生信使。细胞内信号传导区的最优选组合包括CD28和TCR;，ICOS和TCR;，CD134和TCR;,以及CD28和来源于一种或多种上述ITAM的合成信号传导区。报告子区包括能够产生可测量的(可检测的)信号的化合物，例如但不限于萤光素酶、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。因此，报告子区信号测量包括测量光的发射、荧光或碱性磷酸酶产生。最优选地，所测量的信号是萤光素酶产生或SEAP产生。依赖于由细胞内信号传导区产生的信号，还可使用本领域已知的方法来测量用于评估目的化合物的信号.优选的信号包括测量细胞因子产生(例如，IL-2产生)、细胞增殖或凋亡。在一个优选的实施方案中，用于表达本发明的生物测定法受体的载体包含编码IL-17R的细胞外区域、CD28跨膜区、CD28细胞内信号传导区和TCR^信号传导区以及编码萦光素酶的报告子区的DNA序列。在另一个优选的实施方案中，编码生物测定法受体的载体包含编码KDR(VEGF受体)的细胞外结合区、CD28跨膜区、CD28细胞内信号传导区和TCR^信号传导区以及任选的编码萤光素酶的报告子区的DM序列。在最优选的实施方案中，本发明的方法的栽体包含编码来源于CD28的跨膜区(SEQIDNO:28)、来源于CD28的细胞内信号传导区(SEQIDNO:29)和来源于TCR的C链的细胞内信号传导区(SEQIDNO:30)以及来源于TNF-ot、IL-17受体或KDR的细胞外配体结合区的DNA。CD28跨膜区和细胞内信号传导区和TCR的^链可以用间隔子序列进行连接，如SEQIDNO:31中所示。优选地，报告子区是萤光素酶或SEAP。最优选地，所述DNA编码细胞外配体结合区的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含或由SEQIDNO:24或25的IL-17受体序列组成，或者包含或由SEQIDNO:26或27的KDR序列組成。本发明还提供了包含至少一种编码本发明生物测定法受体的栽体(即第一载体)的哺乳动物宿主细胞。宿主细胞可以是可被转染或转化的任何细胞或细胞系，包括Jurkat细胞、HEK293、CH0、NIH3T3、NSO、Cos-7、Hela、MCF-7、HL-60、EL4、A549和K562细胞。最优选地，使用Jurkat细胞。在优选地实施方案中，哺乳动物宿主细胞包含编码生物测定法受体的额外载体(即与本发明的第一载体不同的载体)，所述受体包含(e)细胞外配体结合区；(f)跨膜区；(g)—个或多个能够传递信号的细胞内信号传导区，其中所述细胞外配体结合区和细胞内信号传导区非天然地融合在一起；和任选地(h)报告子区；其中当所述DNA序列在适合于载体表达的条件下在所选择的宿主细胞中表达时，配体与细胞外配体结合区的结合导致从细胞内信号传导区产生信号，和当存在时，导致从报告子区产生可检测的信号。在一个实施方案中，部分(h)的报告子区与存在于第一栽体中的报告子区相同。备选地，该报告子区是不相同的。因此，例如，一个报告子区可以是萤光素酶，而另一个可以是SEAP。最优选地，当宿主细胞包含2种均包含报告子区的本发明生物测定法受体时，所述区域不相同。例如，一个可以是萤光素酶报告子区，第二个可以是SEAP报告子区。备选地，它们可以是相同的报告子区。可使用任何常规技术例如电穿孔、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转介(transvection)、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、刮擦加栽(scrapeloading)、射弹引入或转染(ballisticintroductionorinfection)(参见，例如Davis等人，BasicMethodsinMolecularBiology,1986;和Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarbourlaboratoryPress,CpldSpringHarbour,NY，1989)，用本发明的载体转染哺乳动物宿主细胞。用于在宿主细胞内诱导载体表达的合适条件在本领域内是熟知的。转染可以是瞬时的，或者备选地，可产生稳定表达生物测定法受体的细胞系，如本领域内已知的。特另'j地，参见MethodsinMolecularBiology7.GeneTransferandExpressionProtocols.EditedEJ.Murray1991。因此，本发明还提供了多肽，所述多肽包含(i)能够结合配体的细胞外配体结合区；(j)跨膜区；(k)一个或多个能够传递信号的细胞内信号传导区，其中所述细胞外配体结合区和细胞内信号传导区非天然地融合在一起；和(1)报告子区；其中配体与细胞外配体结合区的结合导致从报告子区产生可检测的信号。在一个实施方案中，细胞外配体结合区来源于细胞因子受体、细胞表面受体或可溶性蛋白。在优选的实施方案中，细胞因子受体是IL-17R。在另一个优选的实施方案中，细胞表面报告子是KDR本发明还提供了包含至少一个编码在上面(a)至(d)中定义的生物测定法受体的载体的哺乳动物细胞。进一步提供了包含在上面(i)至(l)中描述的多肽作为表面膜蛋白的哺乳动物细胞。优选地，哺乳动物细胞是人细胞，最优选地是Jurkat细胞。本发明还提供了用于评估目的化合物的方法，其包括使用任何一种或多种本发明的栽体。因此，提供了用于评估目的化合物的方法，该方法包括(i)提供哺乳动物细胞，其包含编码在上面(a)至(d)中和任选地在上面(e)至(h)中定义的生物测定法受体的本发明载体；(ii)提供包含配体的第一样品；(iii)提供包含目的化合物的第二样品；和Uv)测量由细胞内信号传导区产生的信号和/或由报告子区产生的可检测的信号。该方法是特别有利的，因为其允许开发对于每种潜在的治疗性抗体产物来说基本上相似的强有力的测定法形式，从而有助于更好地理解产物的稳定性和允许直接、有意义地比较不同批次的产物。之前，重组受体被公开为有助于细胞激活过程的手段，其中可通过对有此需要的患者进行施用来将激活的细胞用作治疗剂；参见例如，W097/23613、W099/57268、EP0517895、W096/23814和WO0132709;但其中没有暗示，在那里所描述的受体可用于强有力的且可重现的生物测定法方法中。在最优选的实施方案中，本发明的方法的栽体包含编码来源于CD28的跨膜区(SEQIDNO:28)、来源于CD28的细胞内信号传导区(SEQIDN0:29)和来源于TCR的C链的细胞内信号传导区(SEQIDNO:30)以及来源于TNF-ot、IL-17受体或KDR的细胞外配体结合区的氨基酸序列的DNA。CD28跨膜区和细胞内信号传导区和TCR的^链可可以用间隔子序列进行连接，如SEQIDN0:31中所示。优选地，报告子区是萤光素酶或SEAP。最优选地，所述DNA编码细胞外配体结合区的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含或由SEQIDNO:24或25的IL-17受体序列组成，或者包含或由SEQIDN0:26或27的KDR序列组成。在一个实施方案中，本发明的方法另外还包括下述步骤在根据上面的部分(iii)提供第二样品之前测量由细胞内信号传导区产生的信号和/或由报告子区产生的可检测的信号。所述配体包括任何目的核酸、蛋白质或抗原，例如但不限于，CD标记物配体例如CD48，CD40L，CD40,CD122，细胞因子和趋化因子例如IL-2，IL-12,IL-13,IL-15，IL-17，IL-6，TNF-ot，IL-P，IL-IO，IP-IO，ITAC,MIG，VEGF，共同刺激配体例如IC0S-L，OX-40-L，CD137-L，信号传导途径的组分，和事实上，任何目的抗原。所述配体还包括抗体。在本发明的方法中，所述配体最优选地是可溶性配体。所述方法还可用于呈现在哺乳动物细胞、细菌、病毒、酵母细胞或其他颗粒例如合成的颗粒(例如琼脂糖珠或磁性珠)的表面上的配体。对于本领域技术人员来说很清楚的是，这样的配体具有至少一个结合伙伴，为本发明的目的，所述结合伙伴是在宿主细胞表面上表达的生物测定法受体的细胞外配体结合区。第二样品包含或由目的化合物组成，所述目的化合物与配体竟争结合细胞外配体结合区或者备选地结合配体。因此，"目的化合物"包括抗体，小分子(例如NCE)和其他药物，蛋白质，多肽和肽，肽模拟物(peptidomimetics)，脂质，碳水化合物和核酸。最优选地，存在于第二样品内的目的化合物是抗体。因此，在一个优选的实施方案中，第二样品包含与生物测定法受体的细胞外配体结合区特异性地相互作用的抗体，在第二个优选的实施方案中，第二样品包含特异性地与配体结合的抗体。"与...特异性地相互作用"(例如识别或结合)是指，目的化合物，最优选抗体，对于所选择的细胞外配体结合区或配体具有比对于其他区域或配体更大的亲和力。抗体可以与生物测定法受体的细胞外配体结合区直接或间接相互作用。要理解，第二样品还可用作对照、标准或比较样品。因此，可多次进行本发明的方法以允许进行样品的比较。此处使用的术语"抗体"包括完整的抗体和其功能活性片段或衍生物，并且可以是但不限于单链抗体，二、三或四价抗体，Bis-scFv,双抗体，三链抗体，四链抗体，单结构域抗体，改造的Fab片段，Fab片段，Fat/和F(ab')2片段和上述任一种的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson,2005，NatureBiotech.23(9):1126-1136)。在一个实例中，抗体是具有天然的或经修饰的铰链区的Fab'片段。已在例如US5,677,425、W09915549和W09825971中描述了许多经修饰的铰链区，所述参考资料通过引用合并入本文。在另一个实例中，抗体包括在W02005003169、WO2005003170和WO2005003171中描述的那些。抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即包含特异性地结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任一类(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亚类。可选择与所提出的抗体分子功能，特别是可能需要的效应器功能相关的恒定区结构域(如果存在)。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。特别地，当抗体分子希望用于治疗性用途且需要抗体的效应器功能(例如依赖抗体的细胞毒性(ADCC)和/或依赖补体的细胞毒性(CDCC))时，可使用人IgG恒定区结构域，特别是IgGl和IgG3同种型的恒定区结构域。备选地，当抗体分子希望用于治疗目的但不需要抗体的效应器功能时，可使用IgG2和IgG4同种型。可通过本领域内已知的任何合适的方法来产生用于本发明的抗体。此类抗体包括但不限于多克隆、单克隆、人源化、噬菌体展示来源的抗体或嵌合抗体。可通过本领域内已知的任何方法例如杂交瘤技术(Kohler&Milstein，Nature,1975，256:495-497)、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，ImmunologyToday,1983，4，72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，"MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy",pp.77-96，AlanR,Liss，Inc.，1985)来制备单克隆抗体。还可使用单淋巴细胞抗体法，通过克隆和表达免疫球蛋白可变区cDNA来产生用于本发明的抗体，所述cDNA是使用例如由Babcook，J.等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(15)，7843-7848;W092/02551;WO2004/051268和WO2004/106377描述的方法从被选择用于产生特异性抗体的单个淋巴细胞产生的。嵌合抗体是由免疫球蛋白基因编码的那些抗体，所述免疫球蛋白基因已进行了基因工程改造从而轻链和重链基因由属于不同物种的免疫球蛋白基因区段组成。人源化抗体是具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人克疫球蛋白分子的构架区的抗体分子(参见，例如，US5,585，089)。用于产生和制造重组抗体的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Boss等人，US4，816，397;Cabilly等人，US6，331，415;Simmons等人，2002，JournalofImmunologicalMethods,263，133-147;Shrader等人，W092/02551;0rlandi等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86，3833;Riechmann等人，1988，Nature,322，323;Queen等人，US5,585,089;Adair,WO91/09967;Mountain和Adair，1992，Biotechnol.Genet.Eng.Rev，10，1-142;Verma等人，1998，J.Immunol.Methods,216:165-181;Holliger和Hudson,2005，NatureBiotech.23(9):1126-1136)。用于本发明的抗体还可以使用本领域内已知的各种噬菌体展示方法来产生，并且包括由Brinkman等人，1995，J.Immunol.Methods,182:41-50;Ames等人，1995，J,Immunol.Methods,184，177-186;Kettleborough等人1994，Eur，J.Immunol.，24，952-958;Persic等人，1997，Gene,187，9-18;和Burton等人，1994，AdvancesinImmunol.，57，191-280;W090/02809;W091/10737;W092/01047;WO92/18619;WO93/11236;WO95/15982;和WO95/20401;和US5,698,426;5,223,409;5，403，484;5,580,717;5,427,908;5，750，753;5，821，047;5,571,698;5，427，908;5,516,637;5,780,225;5,658,727;5,733,743;和5，969，108/>开的那些。此外，还可使用转基因小鼠或其他生物(包括其他哺乳动物)来产生抗体(参见例如US6，300，129)。本发明的栽体可包含对于在宿主细胞中表达本发明的生物测定法受体来说所必需的所有必需基序和信号。因此，栽体将包含转录起始区、启动子区和终止区。启动子区将与包含生物测定法受体的编码区有效连接，并且可以是可诱导的或具有组成型活性。如果想要，可提供非编码区，例如以稳定mRNA。可使用标准的克隆和筛选技术从cDNA文库获得编码本发明生物测定法受体的组分的核酸，所述cDNA文库是使用表达序列标签(EST)分析(Adams，M.等人，1991，Science,252:1651-1656;Adams,M.等人，1992，Nature355:632-634;Adams,M.等人，1995，Nature,377:Suppl:3-174)从人细胞中的mRNA产生的。还可从天然来源例如基因组DNA文库获得编码本发明生物测定法受体的组分的核酸，或可使用熟知的和商购可获得的技术合成编码本发明生物测定法受体的组分的核酸。图l显示了表达盒，其被克隆入pBluescriptIISK(+)的大的Notl和XhoI限制性片段从而产生生物测定法受体穿梭栽体。图2显示了IL-17诱导的来自IL-17R/CD28-TCRG生物测定法受体的安光素酶应答。图3显示了抗-IL-17抗体在用500ng/ml浓度的IL-17处理的细胞中阻断萤光素酶产生。图4显示了VEGF诱导的来自KDR/CD28-TCRC生物测定法受体的萤光素酶应答。(■)表示在hVEGF不存在的情况下处理的细胞。图5显示了抗-KDR抗体在用200ng/ml浓度的hVEGF()和不用hVEGF(■)处理的细胞中阻断萤光素酶产生。还分别用(▲)和()显示在抗体不存在的情况下(即，只使用hVEGF,和只使用培养基)处理的细胞。图6显示了具有前导序列(图板(a)(SEQIDNO:24))和不具有前导序列(图板(b)(SEQIDNO:25))的IL-17细胞外区域的氨基酸序列.图7显示了具有前导序列(图板(a)(SEQIDNO:26))和不具有前导序列(图板(b)(SEQIDNO:27))的KDR细胞外区域和跨膜区域的氨基酸序列。图8显示了所使用的CD28跨膜区(图板(a)(SEQIDNO:28))、CD28细胞内区域(图板(b)(SEQIDNO:29))和TCR^细胞内区域(图板(c)(SEQIDNO:30))的氨基酸序列。图9显示了通过以粗体显示的间隔子序列连接的CD28跨膜区、CD28细胞内区域和TCRC细胞内区域的氨基酸序列(SEQIDNO:31)。实施例实施例1:生物测定法表达克隆盒和穿梭栽体的构建为了有助于构建不同的生物测定法受体，设计了中间穿梭栽体。该穿梭栽体包含对于生物测定法受体的表达来说所必需的完整表达盒。该载体包含先前在J.Immunol.2004，172:l(H中描述的设计在pBluescriptSK(+)(Stratagene)中的克隆盒。该克隆盒的5'是HCMV启动子，和该克隆盒的3'是SV40多腺苷酸化信号。所述克隆盒由细胞外结构域(BCD)结合组分(细胞外配体结合区)、跨膜组分和信号传导区组分构成，并且有助于各单个组分的容易的交换。组合下列DM片段，从而产生穿梭栽体(a)pBluescriptIISK(+)(Stratagene)的栽体主链，以Notl至Xhol片段的形式；(b)上面和图1中所描述的克隆盒，以HindIII至EcoRI片段的形式；(c)HCMV启动子，以Notl至HindIII片段的形式；和(d)SV40多腺苷酸化信号，以EcoRI至XhoI片段的形式。该穿梭载体用于从在实施例2中描述的结合、跨膜和信号传导组分片段产生各种不同的生物测定法受体。然后将完整的生物测定法受体表达盒亚克隆入在实施例3中描述的报告基因栽体中。实施例2:结合、跨膜和信号传导区域片段的构建A)作为HindIII至Narl片段的人IL-17受体细胞外配体结合区使用寡核普酸5'-cgggaagcttccaccatgggggccgcacgcagcccgccgtccgctgtcccggggcccctgctggggctgctcctgctgctcctgggcgtgctggccccgggtggtgcctccctgcgactcctggaccac-3'(SEQIDNO:22)和含全长人IL-17受体基因的质粒中PCR克隆出包含人IL-17受体的前导序列和细胞外区域残基1至320(GenBankref:NM014339)的片段。SEQIDNO:22寡核苷酸导入5'HindIII位点和Kosak序列，并且除去NarI限制位点。SEQIDNO:23寡核苷酸导入了3'Narl位点。然后，用限制酶HindIII和Narl消化PCR产物。所使用的IL-17受体的氨基酸序列显示于图6中。本领域技术人员将会理解可使用通常在表达时被切割的不同的前导序列，和将能够使用公知的技术整合编码此类前导序列的DNA。B)作为HindIII至MluI片段的人KDR细胞外配体结合区和跨膜区通过合成(GENEART)产生包含人激酶插入结构域受体(KDR)的前导序列、细胞外结构域和跨膜结构域残基1至789(GenBankref:丽00002253)的片段，其中除去了任何天然的内部HindlII、MluI、BamHI、EcoRI、BglII、Narl、NotI和SpeI位点。用限制酶HindIII和Mlul从提供的质粒(042016pPCR-Script)中消化出该片段。所使用的KDR的氨基酸序列显示于图7中。本领域技术人员将会理解可使用通常在表达时被切割的不同的前导序列，和将能够使用公知的技术整合编码此类前导序列的DNA。C)作为Narl至EcoRI片段的人CD28跨膜区和细胞内信号传导区和人TCRC细胞内信号传导区用限制酶NarI和EcoRI从先前描述的质粒(J.Immunol.2004，172:104)中消化出包含人CD28跨膜区和细胞内信号传导区的残基135至202以及人TCRC细胞内信号传导区的残基31至142的片段。所使用的CD28跨膜区、CD28细胞内信号传导区和TCR《细胞内信号传导区的氨基酸序列显示于图8中。使用间隔子序列进行连接的所有3个区域的氨基酸序列(包括间隔子序列)显示于图9中。D)作为Mlul至EcoRI片段的人CD28信号传导区和人TCRC细胞内信号传导区使用限制酶NarI和EcoRI从先前描述的质粒(J.Immunol.2004172:104)中消化出包含人CD28细胞内信号传导区的残基162至202和人TCR^细胞内信号传导区的残基31至142的片段。所使用的CD28细胞内信号传导区和TCRC细胞内信号传导区的氨基酸序列显示于图8中。实施例3:生物测定法受体报告基因栽体的构建然后，将通过在实施例1中描述的穿梭栽体内组合实施例2中描述的组件而产生的各生物测定法受体的全长表达盒亚克隆入报告基因载体pNifty2-Luc或pNifty2-SEAP(Invivogen)中。后面所述的载体包含在NF-kB诱导型启动子的控制下的萤光素酶报告基因(pNifty2-Luc)或分泌型碱性磷酸酶报告基因(pNifty2-SEAP)。除此以外，它们还包含用于在大肠杆菌(Aco//)和哺乳动物中进行选择的选择标记Zeocin。以Notl至Notl片段的形式从穿梭栽体(实施例1)中取出生物测定法受体表达盒，然后克隆入pNifty2-Luc或pNifty2-SEAP的Notl位点中。可以以任一方向克隆表达盒，并选择和分析两个方向的实例。实施例4:稳定的生物测定法受体报告基因细胞系的产生按照厂商说明书(AmaxaBiosystems)，使用AmaxaNucleofector装置将如实施例3中所述而产生的载体的质粒DNA转染入人T细胞白血病细胞系JurkatE6.1中。然后，通过在浓度为200、300或400ng/ml的ZeocinTM中进行培养而产生稳定的细胞系。实施例5:使用IL-17R/CD28-TCRC生物测定法受体来分析抗人IL-17抗体产生表达生物测定法受体的稳定细胞系，所述生物测定法受体包含人IL-17受体细胞外配体结合区组分、人CD28跨膜区和细胞内信号传导区以及人TCRC细胞内信号传导区组分。向这些细胞中加入一定滴度的人IL-17，4小时后按照厂商说明书使用LucLite测定法试剂盒(PerkinElmer)确定产生的萦光素酶的量(参见图2)。对于表达IL-17R/CD28-TCR^生物测定法受体的各种不同细胞系所进行的分析表明，以与报告基因盒相反的方向包含生物测定法受体表达盒的载体更为有效。从该滴定(图2)中选择出IL-17的浓度，并用于评估抗IL-17抗体阻断经由IL-17R/CD28-TCRC生物测定法受体而发生的萤光素酶产生的能力(参见图3)。实施例6:使用KDR/CD28-TCR^生物测定法受体来分析抗人KDR抗体产生表达生物测定法受体的稳定细胞系，所述生物测定法受体包含人KDR(VEGF受体)细胞外配体结合区组分和跨膜区、人CD28细胞内信号传导区以及人TCRC细胞内信号传导区组分。向这些细胞中加入一定滴度的人VEGF-A(hVEGF)，4小时后按照厂商说明书使用LucLite测定法试剂盒(PerkinElmer)确定产生的萤光素酶的量(参见图4)。对于表达KDR/CD28-TCR^生物测定法受体的各种不同细胞系所进行的分析显示，以与报告基因盒相反的方向包含生物测定法受体表达盒的载体更为有效。从该滴定(图4)中选择出hVEGF的浓度，并用于评估抗KDR抗体阻断经由KDR/CD28-TCR^生物测定法受体而发生的萤光素酶产生的能力(参见图5)。权利要求1.编码生物测定法受体的栽体，所述生物测定法受体包含(a)能够结合配体的细胞外配体结合区；(b)跨膜区；(c)一个或多个能够传递信号的细胞内信号传导区，其中所述细胞外配体结合区和细胞内信号传导区非天然地融合在一起；和(d)报告子区；其中当所述DNA序列在适合于载体表达的条件下在所选择的宿主细胞中表达时，配体与细胞外配体结合区的结合导致从报导子区产生可检测的信号。2.权利要求1的栽体，其中膜结合的细胞外配体结合区来源于细胞因子受体、细胞表面受体或可溶性蛋白。3.权利要求2的载体，其中所述细胞因子受体是IL-17R。4.权利要求2的栽体，其中所述细胞表面受体是KDR。5.权利要求1至4中任一项的载体，其中所述DNA序列编码两个细胞内信号传导区，所述区域之一来源于CD28。6.权利要求5的栽体，其中第二个细胞内信号传导区来源于TCR;。7.权利要求5的栽体，其中第二个细胞内信号传导区来源于合成的信号传导区。8.权利要求7的栽体，其中所述合成的信号传导区基于ITAM。9.权利要求1至8中任一项的栽体，其中所述跨膜区来源于CD28。10.权利要求1至9中任一项的栽体，其中所述报告子区是萤光素酵o11.权利要求1至9中任一项的载体，其中所述报告子区是SEAP。12.包含权利要求1至11中任一项的栽体的哺乳动物细胞。13.包含权利要求1至9中任一项的栽体的哺乳动物细胞，所述宿主细胞另外还包含编码第二生物测定法受体的载体，所述第二生物测定法受体包含(a)细胞外配体结合区；(b)跨膜区；(c)一个或多个能够传递信号的细胞内信号传导区，其中所述细胞外配体结合区和细胞内信号传导区非天然地融合在一起；和任选地(d)报告子区；其中当所述DM序列在适合于载体表达的条件下在所选择的宿主细胞中表达时，配体与细胞外配体结合区的结合导致从细胞内信号传导区产生信号，和当存在时，导致由报导子区产生的可检测的信号。14.权利要求13的哺乳动物细胞，其中所述细胞是人Jurkat细胞。15.多核苷酸，其包含(a)能够结合配体的细胞外配体结合区；(b)跨膜区；(c)一个或多个能够传递信号的细胞内信号传导区，其中所述细胞外配体结合区和细胞内信号传导区非天然地融合在一起；和(d)报告子区；其中配体与细胞外配体结合区的结合导致从报导子区产生可检测的信号。16.用于评估目的化合物的体外方法，所述方法包括(a)提供权利要求12至14中任一项的哺乳动物宿主细胞；(b)提供包含配体的第一样品；(c)提供包含目的化合物的第二样品；和(d)测量由细胞内信号传导区产生的信号和/或由报告子区产生的可检测的信号。17.权利要求16的方法，所述方法另外还包括下述步骤在根据部分(c)提供第二样品之前测量由细胞内信号传导区产生的信号和/或由报告子区产生的可检测的信号。18.权利要求16或17的方法，其中所述目的化合物是抗体。全文摘要本发明涉及编码生物测定法受体的载体和使用所述生物测定法受体来评估目的化合物的体外生物测定法。特别地，所述生物测定法为比较不同配体在目的化合物存在和/或不存在下与其各自受体或结合伙伴的结合提供了通用平台。文档编号C07K14/435GK101313069SQ200680044009公开日2008年11月26日申请日期2006年11月21日优先权日2005年11月24日发明者A·D·G·劳森,H·M·芬尼申请人:Ucb医药有限公司