疟原虫肝期抗原的制作方法

专利名称：：疟原虫肝期抗原的制作方法
技术领域：
：本发明涉及由肝期疟原虫(户h^o^i/迈)寄生虫特异性表达的蛋白质，以及它们在预防、诊断和治疗疟疾中的用途。
背景技术：
：疟疾对人的健康具有巨大的影响，每年造成数百万人死亡，并且该疾病是痴疾流行地区，特别是撒哈拉沙漠以南的非洲国家的社会和经济发展的一个主要障碍。当雌性按蚊将感染性子孢子注入哺乳动物宿主中时，瘙疾感染就开始了。子孢子穿过不同的细胞，之后停留在它们最终的宿主肝细胞中。子孢子进入通过肝细胞质膜内陷产生的寄生泡中。在这种区室中，子孢子转变进入肝期。肝期快速生长，并进行多轮的核分裂。成熟的肝期释放成千上万的裂殖子，其将建立红细胞感染。据预测，肝期表达许多不同的蛋白质，一些可能是该时期所特有的，但是目前仅鉴定了那些独特的分子中的少数。肝期特异性分子的鉴定很重要，因为已经在辐射减毒的子孢子疫苗模型中以及最近在基因工程减毒的子孢子疫苗模型中将受感染的肝细胞确立为不育性保护性免疫应答的主要耙标(在Matuschewski(2006)O/rr.//鹏M0/.18:1-9中综述)。此外，可以在人诊断样品中检测到的肝期分子可能可用于诊断早期痴疾。本领域需要保护免于疟疾感染和疾病的疫苗。本领域还需要关于疟疾的诊断标记物。本发明解决了这些和其他的需要。发明概述本发明的一个方面提供了分离的肝期疟原虫多肽。在一些实施方案中，分离的肝期疟原虫多肽包含选自SEQIDNO:1-48的氨基酸序列。在一些实施方案中，肝期痴原虫蛋白质优先被与保护免受疟原虫感染相关的免疫应答所靶向。本发明的分离的肝期疟原虫多肽可以是重组的或合成的多肽。在一些实施方案中，本发明的多肽是包含选自SEQIDNO:1-48的氨基酸序列的多肽的免疫原性衍生物。此类免疫原性衍生物包括但不限于，包含选自SEQIDNO:49-52的氨基酸序列的肽。本发明的另一个方面提供了分离的核酸分子，其编码本发明的肝期痴原虫多肽。因此，一些实施方案提供了分离的核酸分子，其编码包含选自SEQIDNO:1-48的氨基酸序列及其免疫原性衍生物的多肽。本发明的另一个方面提供了包含一种或多种本发明的肝期疟原虫多肽和药学上可接受的载体的组合物。因此，一些实施方案提供了包含肝期疟原虫多肽和药学上可接受的载体的免疫原性组合物，其中肝期疟原虫多肽包含选自SBQIDN0:1-48的氨基酸序列及其免疫原性衍生物。在一些实施方案，本发明的组合物是用于诱导免疫应答的免疫原性组合物，例如疫苗组合物。在另一个方面，本发明提供了用于诱导针对痴原虫寄生虫的免疫应答的方法，该方法包括施用含有有效量的一种或多种本发明的肝期疟原虫多肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于在哺乳动物受试者中诱导针对恶性瘙原虫(户/M边^/y咖尸a/c/pari/迈)的免疫应答的方法，该方法包括将含有有效量的至少一种肝期痴原虫多肽的组合物施用给哺乳动物受试者，所迷肝期痗原虫多肽选自SEQIDNO:1-48及其免疫原性衍生物。本发明的另外一个方面提供了用于治疗有此需要的哺乳动物受试者的方法，该方法包括将含有有效量的一种或多种本发明的肝期疟原虫多肽的免疫原性組合物施用给有此需要的哺乳动物受试者。因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗有此需要的人受试者的方法，该方法包括将含有至少一种分离的选自SEQIDNO:l-48的多肽及其免疫原性衍生物的免疫原性组合物施用给人受试者。此外，本发明提供了基因工程减毒的子孢子，从所迷子孢子中已经除去了至少一种编码本发明的肝期多肽的基因。因此，在一些实施方案中，本发明提供了基因工程减毒的疸原虫子孢子，所述子孢子缺少编码选自SEQIDNO:1-48的肝期多肽的基因。本发明还提供了编码本发明的肝期疟原虫多肽的表达载体，含有此类表达载体的宿主细胞，特异性地结合本发明的肝期疟原虫多肽或其免疫原性衍生物的抗体，以及用于检测本发明的肝期疟原虫多肽或编码它们的核酸分子的存在的诊断测定法。优选实施方案的详细描述在一个方面，本发明提供了由肝期疟原虫寄生虫表达的新型蛋白质。这些蛋白质中的一些在肝期寄生虫中特异性表达，如实施例1-3中所显示的(见表2和3，SEQIDNO:1-28)。一些本发明的肝期蛋白质在子孢子和肝期寄生虫中都表达，但在血液期寄生虫中以显著更^f氐的水平表达，如实施例3中所显示的(见表4，SEQIDNO:29-48)。在一些实施方案中，肝期疟原虫蛋白质优先被与保护免受疾原虫感染相关的免疫应答所靶向。例如，肝期蛋白质或其免疫原性衍生物可以是与保护相关的T细胞免疫的抗原靶标，如实施例4中所显示的。相比于来自免疫前或未免疫的受试者的血清，本发明的肝期痴原虫蛋白质也可以优先被来自已经获得对于疟原虫感染的免疫力的受试者的血清识别(参见，例如Doolan等人，(2003)户roc.力cad.5"c/.〃W100(17):9952-7;Sundaresh等人，(2006)刃io2'/2尸or迈"/cs22(14):1760-6)。因此，本发明的一个方面提供了分离的肝期疟原虫多肽。在一些实施方案中，所述分离的肝期疟原虫多肽包含选自SEQIDN0:1-48的氨基酸序列。这些蛋白质的序列、编码它们的核苷酸序列以及注解信息可以以表l-4中提供的蛋白质/基因ID号从疟原虫基因组数据库(PlasmodiumGenomeDatabase)(http://plasmodb.org/;Kissinger等人，(2002)419:490-492)中荻得，并且将其通过提及而并入本文。本发明的分离的肝期痴原虫多肽可以是重組的或合成的全长多肽或其免疫原性衍生物，如下面更进一步描述的。因此，本发明的一些实施方案提供了分离的疟原虫多肽，其包含选自SEQIDNO:1-48的氨基酸序列及其免疫原性衍生物。例如，分离的多肽可以是选自SEQIDNO:11-44的恶性痴原虫多肽及其免疫原性衍生物。如在此使用的，术语"多肽"指氨基酸聚合物并且不是指特定长度的产物；因此，肽、寡肽以及蛋白质包括在多肽的定义内。该术语也包括该多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。包括在该定义内的是，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸、PM等)的肽，具有经取代的键以及天然的和非天然的本领域已知的其他修饰的多肽。本发明的肝期疟原虫多肽可以是全长多肽，全长多肽的免疫原性衍生物或结构域，或者其免疫原性变体。如此处使用的，术语"免疫原性"指多肽无论是单独地还是与载体相连接，在存在还是不存在佐剂时，引发体液和/或细胞免疫应答的能力。因此，本发明的全长肝期疟原虫多肽的免疫原性部分指能够引发针对相应的全长多肽的免疫应答的全长多肽的一部分。术语"免疫原性衍生物或结构域"包括任何包含至少5-8个氨基酸(例如，10-50个氨基酸、30-200个氨基酸或100-500个氨基酸)并且能够诱导针对全长多肽的免疫应答的多肽。因此，免疫原性衍生物包括全长多肽的截短形式、表位或其他衍生物。术语"表位"指沿蛋白质表面排列的3-10个氨基酸的线性队列。在线性表位中，氨基酸依次连接并且遵循该蛋白质的一级结构。在构象表位中，残基不依次连接，而是由于该蛋白质的构象(折叠)而沿着表面线性展开。关于构象表位，确定表位的序列的长度可以有很大变化。定义表位的残基之间的抗原一级结构部分可能对于该构象表位的结构不是关键的。例如，这些间插序列的缺失或置换可能不会影响构象表位，只要对该表位构象关键的序列得以保留(例如参与二硫键成键的半胱氨酸、糖基化位点等)。构象表位也可以由同寡聚体或异寡聚体的亚基的两个或更多个必需区域形成。其他免疫原性衍生物可以通过氨基酸的添加、删除、置换或重排或者通过它们的化学修饰来制备。肝期疟原虫多肽的示例性的表位在实施例1和4中描述。因此，免疫原性衍生物包括但不限于，包含选自SEQIDNO:49-52的氨基酸序列的肽。预测多肽中的免疫原性区域的方法是本领域熟知的。例如，多肽序列可以通过使用几种算法来分析，包括根据Kyte-DoolitUe方法预测亲水性，根据Emini方法预测表面概率，和根据Jameson-Wolf方法预测抗原性(例如，可从DNASTAR，http:〃www.dnastar.com/获得的Protean软件)。其他表位预测方法是本领域已知的(参见，例如Moise&DeGroot(2006)"/otec/wo人24(7):791-2)。在一些实施方案中，本发明的肝期疟原虫蛋白质的免疫原性衍生物含有包含选自SEQIDNO:1-48的氨基酸序列的全长多肽的5-10、10-50、20-200、40-300或100-600个连续氨基酸。示例性的本发明多肽的免疫原性衍生物在实施例1和4中描述，并且包括但不限于，包含选自SEQIDN0:49-52的氨基酸序列的肽，包含SEQIDNO:13的氨基酸59-300、SEQIDNO:14的氨基酸72-230、SEQIDNO:17的氨基酸1-545或氨基酸660-1073、SEQIDNO:18的氨基酸28-184、SEQIDNO:20的氨基酸151-326、SEQIDNO:21的氨基酸6-529或氨基酸587-842、SEQIDNO:23的氨基酸1-346、SEQIDNO:25的氨基酸92-587、SEQIDNO:30的氨基酸76-130、SEQIDNO:31的氨基酸415-885、SEQIDNO:33的氨基酸84-229、SEQIDNO'.34的氨基酸22-291、SEQIDNO:35的氨基酸208-512或氨基酸716-1026、SEQIDNO:36的氨基酸1-135、SEQIDNO:39的氨基酸181-306或氨基酸47-457、SEQIDNO:40的氨基酸585-1018、SEQIDNO:41的氨基酸230-843、SEQIDNO:44的氨基酸236-683、SEQIDNO:45的氨基酸26-182和SEQIDNO:48的氨基酸23-459或氨基酸488-813的多肽。适的:因片段或通过肽合成来制备，、其中;用本领域:知的:以下进一步描述的方法。用于重组表达本发明的免疫原性衍生物的示例性方法在实施例6中提供。免疫原性衍生物可以是含有额外序列的融合多肽，所述额外序列编码一种或多种其他痦原虫免疫原或其他非疟原虫免疫原的表位。备选地，本发明的免疫原性衍生物可以融合至栽体多肽(例如乙型肝炎表面或核心抗原)或者融合至另一种载体，所述另一种载体具有免疫刺激性质(如在佐剂的情形中)，或另外增强对该蛋白质或其衍生物的免疫应答，或在表达、纯化或配制该蛋白质或其衍生物中有用。肝期疟原虫蛋白质或其免疫原性衍生物可以用常规的连接剂例如戊二醛而化学缀合至大分子上(Geerlings等人，(l988)/./迈边W70人Z/eWo"106:239-244)。在一些实施方案中，本发明的肝期疟原虫多肽包括与SEQIDNO:1-48中所定义的序列具有大于80%的氨基酸序列同一性(例如大于90%的序列同一性、大于95%的氨基酸序列同一性或大于99%的序列同一性)的免疫原性衍生物。在两个或更多个氨基酸序列的情况下，术语"同一的"或"同一性，，百分比指，如使用下述序列比较算法之一或通过手工比对和目测检查所测量的，当在比较窗上就最大一致性进行比较和比对时，相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列。应该认识到，不相同的氨基酸位置通常差异在保守性氨基酸置换，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换并因而不会改变该分子的功能性质。如果序列的差异在于保守置换，则可以上调序列同一性百分比以就该置换的保守性质进行校正。用于进行这种调整的手段是本领域技术人员所熟知的。保守性置换的评分可以根据例如Meyers&Millers(1988)Co迈pyfer^7/7〃c.A/o/.4:11-17的算法来计算。"比较窗"是指连续位置，例如大约25至大约600个位置、或大约50至大约200个位置、或大约100至大约150个位置的区段，在两个序列进行最佳比对后，可在该区段上将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述来进行例如，局部同源性算法(Smith&Waterman(1981)Jc^.J/7/7人^"力.2:482);总体比对算法(Needle歸n&Wunsch(1970)/.艇肠7.48:443);相似性搜索方法(Pearson&Lipman(1988)户roc.iW.丄85:2444;Altschul等人(1997)^wc人/(c/"Aes.25(17):3389-402);这些算法的计算机化实施(例如，WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,Wis.中的GAP,BESTFIT，FASTA和BLAST)，通常使用默认设置；或手工比对和目测检查(参见，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(1994)Ausubel等人编辑)。例如，BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序(得分-50，字长-3)来进行，以获得与SEQIDNO:1-48的氨基酸序列具有大于80%的同一性的氨基酸序列。一个有用算法实施的例子是PILEUP。PILEUP使用渐进的成对比对而由一组相关序列产生多重序列比对。它还可以绘制显示出用于产生比对的聚类关系的树状图。PILEUP使用Feng&Doolittle(1987)/.^Vo/.35:351-60的渐进比对方法的简化形式。所使用的方法类似于由Higgins&Sharp(1989)(^^7^5:151-3描述的方法。多重比对操作从两个最相似序列的成对比对开始，产生两个经比对的序列的聚簇(cluster)。这个聚簇随后可以与下一个最相关序列或经比对的序列的聚簇进行比对。两个序列聚簇可以通过两个独个序列的成对比对的筒单延伸来进行比对。在每一次重复时包括不相似性渐增的序列和序列聚簇的一系列此类成对比对产生了最终的比对。在一些实施方案中，本发明的肝期痴原虫多肽包括野生型多肽的变体。这些变体属于以下三种类型中的一种或多种置换变体、插入变体或缺失变体。这些变体可以是天然的等位基因变体或种间变体(例如来自不同的恶性疟原虫林系的变体)，或者它们可以通过编码蛋白质的DNA中的核苷酸的位点特异性诱变来制备。位点特异性诱变可以用盒式诱变或PCR诱变或者本领域所熟知的其他技术来进行，以产生编码该变体的DNA，并随后在重组细胞培养物中表达该DM。具有多至大约100-150个氨基酸残基的变体靶蛋白片段可以用已建立的技术通过体外合成来制备。提供功能相似的氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的(Henikoff&Henikoff(1992)Wa〃.K51.丄89:10915-9)。氨基酸置换通常是单个残基。插入通常将会处于大约1至大约20个氨基酸的级别上，尽管可以耐受明显更长的插入。缺失的范围是大约1至大约20个残基，尽管在一些情形中，缺失可以长得多。置换、缺失和插入或其任意组合可以用于获得最终的衍生物。在一些实施方案中，本发明的肝期痴原虫多肽是重组多肽。术语"重组多肽"是指通过重组表达方法产生的多肽，例如，在原核或真核宿主细胞中，或者在无细胞的体外表达系统中，如下面详细描述的。本发明的肝期疟原虫多肽通常使用表达载体来表达并进行纯化。表达载体可以是自我复制的染色体外载体或整合入宿主基因組中的载体。通常，表达栽体包含与编码靶蛋白的核酸有效连接的转录和翻译调控核酸序列。术语"控制序列"指对于在特定的宿主有机体中表达有效连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适合于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。当将核酸序列置于与另一核酸序列处于功能性关系的状况时，该核酸序列是"有效连接的"。例如，如果其被表达为参与多肽分泌的前蛋白质，则将前序列或分泌前导序列的DNA有效连接至该多肽的DNA;如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则将启动子或增强子有效连接至该编码序列；或者，如果安置核糖体结合位点有助于翻译，则将核糖体结合位点有效连接至编码序列。有效连接的DNA序列可以是连续的或不连续的。用于连接DNA序列的方法是本领域所熟知的，并且包括使用聚合酶链式反应和连接反应。转录和翻译调控核酸将通常适合于用于表达靶蛋白的宿主细胞；例如，来自大肠杆菌(Aco7/)的转录和翻译调控核酸序列优选用于在大肠杆菌中表达靶蛋白。对于各种宿主细胞，本领域已知许多类型的合适表达栽体以及合适的调控序列。用于表达多肽的方法是本领域熟知的(例如，Sambrook等人，(1989)"o/7//^,JZa6or"or/第2版，vol.l-3，ColdSpringHarborLaboratory;Berger和Kimmel(1987)6Wc/eto#o/ecu/ar7e由2',s,MethodsinEnzymology，vol.152，AcademicPress,Inc.，SanDiego，CA;Ausubel等人(1995)CVrre/^户r由co/i//A/Wo^r,JohnWiley&SonsInc.，NY)。通常，转录和翻译调控序列可以包括但不限于，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。启动子序列编码组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然启动子或杂合启动子。组合了多于一种启动子的元件的杂合启动子是本领域熟知的。表达载体可以包含其他的元件。例如，表达载体可以具有两种复制系统，因而使得其能在两种生物体中维持，例如在哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达并在原核宿主中克隆和扩增。此外，对于整合型表达栽体，该表达载体含有至少一个与宿主细胞基因组中的序列同源的序列，以及优选两个在该表达构建体侧翼的同源序列。可以通过选择合适的同源序列以包含于该栽体中而将整合型载体导向宿主细胞中的特定基因座。用于整合型栽体的构建体是本领域所熟知的。另外，表达载体可以包含选择标记基因以使得能选择转化的宿主细胞。选择基因是本领域所熟知的，并且将取决于所使用的宿主细胞而不同。本发明的肝期疟原虫多肽可以通过下述方式而产生在合适的条胞，^诱导或引起所述肝期i原虫多肽^表达。适合于蛋白质表达的条件随所选的表达栽体和宿主细胞而变化，并且可以容易地由本领域技术人员采用常规的试验来确定。例如，对于在表达载体中使用组成型启动子，可以对宿主细胞的生长和增殖进行优化，和对于使用诱导型启动子，可以提供用于诱导的合适生长条件。此外，在一些实施方案中，收获的时间很重要，例如，在使用杆状病毒系统时。本领域技术人员将认识到，可以对于在所选宿主细胞中的表达来优化编码序列。合适的宿主细胞包括酵母、细菌、古细菌、真菌、昆虫细胞和动物细胞，包括哺乳动物细胞(例如人细月包和细^i系)。因此，宿主细胞包括但不限于，黑腹果蝇("/o^o/7A/7a历eh/7o^2We/)细胞、四膜虫(re"a力y迈e/za)、酉良酒酵母(Sacc力aro迈ycesce/er/s/ae)及其他酵母、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(&c///wssu6〃7/"、Sf9细胞、C129细胞、293细胞、脉孢菌(y^"ro^7ora)、BHK、CH0、C0S、HeLa细胞、HepG2细胞、THP1细胞系(巨噬细胞细胞系)和人胚肾细胞系(例如，HEK293)。在一些实施方案中，肝期痴原虫多肽在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达系统是本领域所熟知的，并且包括逆转录病毒系统。来自病毒基因的启动子常常用于哺乳动物表达系统中，因为病毒基因通常是高度表达的并且具有广泛的宿主范围。实例包括SV40早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子、单纯疱渗病毒启动子和CMV启动子。通常，由哺乳动物细胞识别的转录终止和多腺苷酸化序列是位于翻译终止密码子3，的调控区域，并因此与启动子元件一起在编码序列的侧翼。转录终止子和多腺苷酸化信号的实例包括来源于SV40的那些。学方法来克隆，包括DNA扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)方法(参见例如，Sambrook等人，(1989)#o7ecw/arC7o/2//^,^Za6or"07y他/zwa7，第2版，ColdSpringHarbour,N.Y.;Berger&Kimmel(1987)淑A油Vol.152:6Wcefo#o/ecw/ar670/7//7g7ec力//《wes，AcademicPress,Inc.，SanDiego，CA;Co等人，(1992)/./迈顶w/o人148:1149)。因此，例如，编码肝期恶性疟原虫多肽的核酸分子可以用含有一个限制性位点的有义引物和含有另一个限制性位点的反义引物进行PCR扩增。这将产生编码具有末端限制性位点的所需序列或子序列的核酸。然后可以将这种核酸连接入具有合适的相应限制性位点的载体中。合适的PCR引物可以容易地由本领域技术人员基于待表达的序列进行选择。合适的限制性位点也可以通过定点诱变来添加(参见Gillman&Smith(1979)Ce/ze8:81-97;Roberts等人(1987)jV由re328:731-4)。将外源核酸引入宿主细胞中的方法是本领域所熟知的，并且将随着所使用的宿主细胞而变化。合适的技术包括但不限于，葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、病毒感染、将核酸包囊于脂质体中以及将核酸直接显微注射入细胞核中。在一些实施方案中，本发明的肝期疟原虫多肽在细菌系统中表达。细菌表达系统是本领域所熟知的。也可以使用来自噬菌体的启动子，并且其是本领域所熟知的。此外，合成的启动子和杂合启动子也是有用的；例如，tac启动子是trp和lac启动子序列的杂合体。此外，细菌启动子可以包括非细菌起源的天然启动子，该启动子具有结合细菌RNA聚合酶并起始转录的能力。除了功能性启动子序列外，有效的核糖体结合位点也是需要的。表达载体还可以包含信号肽序列，其提供了在细菌中表达的蛋白质的分泌。表达的蛋白质可以分泌入生长培养基中(例如革兰氏阳性细菌)或分泌入位于细胞的内膜和外膜之间的周质间隙中(革兰氏阴性细菌)。细菌表达载体还可以包含表位标签，其提供了靶蛋白的亲和纯化。细菌表达载体还可以包含选择标记基因以使得能够选择已转化的细菌菌抹。合适的选择标记包括使得转化的细菌对于药物(例如氨节青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素、新霉素和四环素)具有抗性的基因。选择标记还包括生物合成基因，例如在组氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途径中的那些。将这些组分组装成表达栽体。用于细菌的表达载体是本领域所熟知的，并且尤其包括用于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酪链球菌(iYre;^ococc^c,e历o"'s)和浅青紫链球菌(S"一ococci/s7/>油/7<)。使用本领域所熟知的技术例如氯化钙处理、电穿孔等，将细菌表达载体转化入细菌宿主中。用细菌表达系统表达本发明的胎盘恶性疟原虫多肽的示例性方法在实施例5中描述。本发明的肝期疟原虫多肽也可以在昆虫细胞中产生。用于昆虫细胞的转化的表达载体，以及特别是基于杆状病毒的表达载体，是本领域所熟知的。肝期疟原虫多肽也可以在酵母细胞中产生。酵母表达系统是本领域所熟知的，并且包括用于酿酒酵母、白色假丝酵母(a76/ca/3S休麦牙糖假丝酵母(C.迈a〃^a人多形汉逊酵母(i^/^e""7a/oAK历or/7力aj、脆壁克鲁维酵母(A7wj^eroinyces/Vag/7/sJ和乳酸克鲁维酵母(f季也蒙毕赤酵母(？/^/3^"//7"/历0/^/2和巴斯德毕赤酵母(,./7aWoWsJ、粟酒裂殖酵母(Sc力/zosacc力aro迈7cesj90迈6eJ和解月旨耶氏酵母(J^r/^iw'a//po7/〃ca,的表达载体，明的肝期痴原虫夕肌口j体外表达来说合适的条件下，使用含有编码肝期痴原虫多肽的核酸的表达载体，在体外在无细胞的表达系统中产生。无细胞的体外表达系统是本领域所熟知的。如果必要，可以为无细胞系统定制用于共翻译硫化物-硫化物交换和二硫键的正确折叠的条件(Lyubov等人，(1993)胁tec力/20入15(1):79-84)。用无细胞体外表达系统来表达本发明的胎盘恶性疟原虫多肽的示例性方法在实施例5中描述。历史上，发现恶性疟原虫蛋白质在异源生物体中的表达是相当有挑战性的。恶性疾原虫基因组是任何已知基因组中最富含A+T的其中一种。因此，恶性疾原虫使用一整套不同的密码子，这可能导致在异源系统中的低水平表达。此外，在酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母中，序列的某些富含A+T的链段可以作为多腺苷酸化或转录终止信号，导致低水平的表达或截短的mRNA(Romanos等人，(1991)^"c人Jc/^i".19(7):1461-7)。在过去七年获得的进展已经使得情况大有改进。对于一些疟原虫蛋白质，过去有挑战性的且成功率低的费劲工作现在成为了常规的、主流的分子生物学实践。例如，可以合成具有合适的密码子使用和增加的G+C含量的痴原虫编码序列。产生合成基因的原则在(Withers-Martinez等人，(1999)户rWe//2f/2f12(12):1113-20)中有明确的描述。这些原则包括(1)降低整体的A+T含量以消除潜在的转录终止信号，(2)消除可导致稳定的发夹结构的回文序列，以及(3)最小化可能产生非特异性引发的串联重复序列或反向重复序列(长度〈lGbp)。另外，在合成步骤中除去推定的N-联糖基化位点以模拟缺乏任何糖基化的恶性痴原虫多肽结构。在巴斯德毕赤酵母中已经成功表达了很多恶性疟原虫蛋白质(参见例如，Withers—Martinez等人，(1999)尸ro^/;7A/^12(12):1113-20;Milek等人，(2000)Fa"/刀e18(14):1402-11;Brady等人，(2001)尸rote//2尸wr/尸.23(3):468-75;Kocken等人，(2002)//7尸eC//zm/"/7.70(8):4471-6;Zhang等人，(2002)/."/o人C力e迈.277(51):49767-75;Yadava&Ockenhouse(2003)//2尸ecL/迈M//7.71(9):4961-9;Wang等人，(2005)5/otec力/70/.S/oe"g.90(7):838-47;Pan等人，(2004)/./迈顶u/70入172(10):6167-74;Tsai等人，(2006)/.A/Wec力i70/.121(4):458-70)。此外，可以纯化在巴斯德毕赤酵母中产生的疾疾蛋白质来产生临床等级的产品(参见例如，Malkin等人，(2005)T//ec/.73(6):3677-85)。描述了如何在巴斯德毕赤酵母中克隆和表达蛋白质的详细方案可从Invitrogen作为BasySelect尸/c力/aExpressionKit(产品编号K1740-01)的一部分而获得。这种商购可得的试剂盒有助于以DNA序列开始到以表达的蛋白质结束的整个表达过程。用于表达本发明的肝期疟原虫多肽的示例性方法在实施例6中描述。细菌表达是另一种产生临床等级的重組疟原虫蛋白质以用于潜在的疫苗应用的有前途的方法(参见例如，Dutta等人，(2006)//尸e".//z/迈w2.70(6):3101-10;Shimp等人，(2006)户,ofei刀June27，2006[印刷前电子出版];Hillier等人，(2005)/"/ecf.//z/迈w.73(4):2109-15;Darko等人，(2005)Zo/eW./迈/Pw.73(1)287-97;Nardin等人，(2004)///eC/迈迈肌73(11):6519-27;Chen等人，(2004)「acc//7e22(21-22):2701-12;Zhou等人，(2004)户ro"//2i^pr.尸"r/尸.34(1):87-94;Singh等人，(2003)/"/e".力zm7w/.71(12):6766-74)。与酵母表达类似，重新合成所述基因以优化密码子表现度(codonrepresentation)提高了重组蛋白质的产率和可溶性(Hillier等人，(2005)/迈迈u".73(4):2109-15)。重组蛋白质的重折叠可以用于产生功能性表位。本发明的肝期疟原虫多肽及其免疫原性衍生物也可以用本领域所熟知的技术而制成融合蛋白质。例如，肝期疟原虫多肽可以制备为融合蛋白质以增加表达或将其与提供表位的标签多肽连接，抗-标签抗体可以选择性地结合所述表位。通常将表位标签置于靶蛋白的氨基末端或羧基末端。表达的蛋白质的这种具有表位标签的形式的存在可以使用针对所述标签多肽的抗体来检测。因此，表位标签使得表达的蛋白质能够容易地通过亲和纯化来纯化，所述亲和纯化使用抗-标签抗体或结合该表位标签的其他类型的亲和基质。各种标签多肽和它们各自的抗体是本领域所熟知的。示例性的标签包括但不限于聚组氨酸(poly-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Field等人，(1988)Wo入8:2159-65);c-myc标签和针对其的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan等人，(1985)Ce/人A/o/.5:3610-6);以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等人，(1990)3(6):547-53)。其他的标签多肽包括Flag-肽(Hopp等人，(1988)Siorec力"o7.6:1204-10);KT3表位肽(Martin等人，(1992)5^/e"ce255:192-4);微管蛋白表位肽(Skinner等人，(1991)/.飾/.C力e迈.266:15163-6);以及T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth等人，(1990)户潔.5W.咖87:6393-7)。肝期痴原虫多肽(包括其免疫原性衍生物)的共价修饰包括在本发明的范围内。共价修饰的一种类型包括将蛋白质的被靶向的氨基酸残基与能与该蛋白质的所选侧链或者N-或C-末端残基反应的有机衍生化试剂反应。用双官能试剂进行衍生化可用于例如将蛋白质与水不可溶性支持基质或表面交联以用于筛选测定法中。通常使用的交联剂包括但不限于，1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如，与4-叠氮基水杨酸形成的酯)，同基双功能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚氨基酯例如3，3，-二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)，双功能马来酰亚胺例如二-N-马来酰亚胺基-l，8-辛烷，以及诸如甲基-3-[(p-叠氮基苯基)联硫基]propioimidate的试剂。本发明的肝期疟原虫多肽(包括其免疫原性衍生物)可以在表达后进行纯化或分离。术语"分离的"、"纯化的"或"生物学上纯的"指这样的材料，所述材料实质上或基本上没有在其天然状态中发现通常与其伴随的组分。纯度和同质性通常使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色傳法来测定。作为制备物中存在的主要种类的蛋白质被认为是基本上纯化的。术语"纯化的"表示蛋白质在电泳凝胶上基本上产生一条带。例如，其表示，蛋白质具有至少85%的纯度，例如至少95%的纯度或至少99%的纯度。术语"分离的多肽"也包括在重组宿主细胞内原位的多肽，因为该多肽天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常地，使用至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。取决于哪些其他组分存在于样品中，本发明的肝期疾原虫多肽可以以各种本领域技术人员已知的方法进行分离或纯化。标准的纯化方法包括电泳、分子、免疫学和色谦技术，包括离子交换、疏水、亲和和反向HPLC色谦法以及色谦聚焦。例如，蛋白质可以用抗体柱来纯化。超滤和渗滤技术，与蛋白质浓缩一起，也是有用的。合适的纯化技术在本领域中是标准的(通常参见R.Scopes(1982)/Vote/"/^r/77cs〃o/z,Springer-Verlag,N.Y.;Deutcher(1990)//e由c^//7j^/l^r顶0/(^"/fo7.7<2.'Cw/defo^P/7fe//7户wri尸ycaf/'o刀,AcademicPress,Inc.N.Y.)。需要的纯化程度将取决于多肽的用途而不同。在一些情形中，可以不需要纯化。本发明的一些实施方案提供了合成的肝期疟原虫多肽。具有多达大约100-150个氨基酸残基的多肽可以使用已建立的技术通过体外合成来制备。合成的多肽可以使用本领域已知的方法，例如在Merrifield等人，(1964)/.J迈.C力e迈.85:2149;Houghten等人，(1985)#"7.Sc人f/^，82:51:32;和Stewart&Young(1984)Solidphasepeptidesynthesis,PierceChemCo.，Rockford,III中描述的那些方法，通过化学合成(例如固相肽合成)来制备。可以合成在氨基末端具有或不具有甲硫氨酸的此类多肽。化些参考文献中列出的方法i行氧化以形成二硫;。此外，^T以制备在结构和/或功能上类似于多肽具体表现的肽模拟物(peptidomimetics)。已经描述了用于制备类似于多肽的肽^=莫拟物的几种方法(参见，例如美国专利号5，288，707;5,552,534;5，811，515;5，817，626;5,817,879;5，821，231和5，874，529)。本发明的另一个方面提供了分离的核酸分子，其编码本发明的肝期疟原虫多肽。因此，一些实施方案提供了分离的核酸分子，其编码包含选自SEQIDN0:1-48的氨基酸序列及其免疫原性衍生物的多肽。例如，所述核酸分子可以编码选自SEQIDNO:11-44的恶性痦原虫多肽及其免疫原性衍生物。术语"分离的核酸分子，，指已经从其天然环境中移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，对于本发明来说，认为包含于载体中的重组核酸是分离的。分离的核酸分子的实例包括在异源宿主细胞中维持的重组DNA分子或在溶液中的纯化的(部分或基本上纯化的)DM分子。分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的核酸分子进一步包括通过合成产生的此类分子。本发明的分离的核酸分子包括包含编码肝期疟原虫多肽或其免疫原性衍生物的开放阅读框(0RF)的DM分子。这些核酸分子的序列可以不同于编码本发明的肝期疾原虫多肽的任何天然序列，但是，由于遗传密码的简并性而仍然编码肝期疟原虫多肽。当然，遗传密码是本领域熟知的。因此，对于本领域技术人员来说产生此类简并变体是常规的。本发明的另一个方面提供了编码本发明的肝期疟原虫多肽的表达载体。本发明的另一个方面提供了包含编码本发明的肝期痴原虫多肽的表达栽体的宿主细胞。本发明的另外一个方面提供了特异性地结合本发明的肝期疟原虫多肽(包括其免疫原性衍生物)的抗体。术语"抗体"指完整的免疫球蛋白，或指免疫球蛋白的抗原结合部分，其与完整抗体竟争特异性结合本发明的蛋白质或蛋白质的片段。示例性的抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、双特异性的和异缀合的抗体。本发明的免疫球蛋白的抗原结合部分可以通过各种技术产生，包括但不限于重组DNA技术和完整抗体的酶促或化学切割。如此处使用的，"分离的抗体"是这样的抗体，其(1)不与天然与其结合的组分(包括在其天然状态中与其伴随的其他抗体)相结合，(2)没有来自相同物种的其他蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。术语"特异性地结合，，和"特异性的结合"指本发明抗体结合第一种分子种类优先于结合其他分子种类的能力，其中所述其他分子种类与该抗体和第一种分子种类相混合。当抗体可以特异性地结合第一种分子种类时，该抗体被认为是特异性地"识别"所述第一种分子种类。在本发明中，第一种分子种类是本发明的肝期疟原虫多肽。用于制备多克隆抗体的方法是技术人员已知的。多克隆抗体可以在哺乳动物中产生，例如通过一次或多次注射免疫剂，如果需要，还有佐剂。通常，免疫剂和/或佐剂将通过多次皮下或腹膜内注射而注射入哺乳动物中。免疫剂可以包括本发明的全长肝期疟原虫多肽或其免疫原性衍生物。将免疫剂缀合至已知在待免疫的哺乳动物中具有免疫原性的蛋白质可以是有用的。此类免疫原性蛋白质的实例包括但不限于，匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质A、合成的棒杆菌分枝菌酸海藻糖)。免疫方案可由本领域技术人员进行选择而不需要过度的试验。单克隆抗体可以用杂交瘤方法，例如由Kohler&Milstein(19")^&re256:495描述的那些方法来制备。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂来免疫小鼠、仓鼠或其他合适的宿主动物来引出产生或能够产生将特异性地结合所述免疫剂的抗体的淋巴细胞。备选地，可体外免疫淋巴细胞。用于产生单克隆抗体的合适的永生化细胞系是本领域所熟知的(参见，例如Goding(1986)MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress,pp.59-103;Kozbor(1984)/.133:3001;Brodeur等人，(1987)MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,MarcelDekker，Inc.,NewYork,pp.51-63)。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀或通过体外结合测定法例如放射免疫测定法(RLA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。这些技术和测定法是本领域所熟知的。单克隆抗体的结合亲和性可以例如通过Munson和Pollard(1980)j/2a人肠c力e瓜107:220所描述的斯卡查德分析(Scatchardanalysis)来测定。单克隆抗体可以通过常规的免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白A-sepharose、羟磷灰石色镨、凝胶电泳、透析或亲和色谱从培养基或腹水中分离或纯化。单克隆抗体也可以通过重组DNA方法，例如U.S.Pat.No.4，816，567(通过提及并入本文)中描述的那些方法来制备。单克隆抗体可以4吏用噬菌体展示文库来分离(Hoogenboom&Winter(1991)/.#0/.万/oA227:381;Marks等人，(1991)/.222:581)。本发明的抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法是本领域所熟知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰的重链的重组表达。通常在Fc区中的任意位点处将重链截短以防止重链交联。备选地，将有关的半胱氨酸用另一种氨基酸残基置换或将其删除以防止交联。体外方法也适合用于制备单价抗体。可使用本领域已知的常规技术来消化抗体以产生其片段，特别是Fab片段。抗体也可以是人或人源化抗体、双特异性抗体或异缀合抗体(heteroconjugateantibodies)。用于制备人或人源化抗体、双特异性抗体或异缀合抗体的方法是本领域所熟知的，并且例如在Desnoyers等人，U.S.Pat.No.7,084,258(通过提及并入本文)中描述。特异性地结合本发明的肝期疟原虫多肽的抗体可以用于诊断测定法以例如检测肝期痴疾寄生虫的存在，或者可用作治疗性或预防性试剂以用于治疗或预防痴原虫感染。术语"治疗性试剂"指能够治疗疟疾感染的试剂。术语"预防性试剂，，指能够预防恶性疟原虫感染的试剂。在一些实施方案中，所述抗体可用于通过被动免疫来治疗处于发展出或患疟疾的风险中的受试者。通常，这将包括将治疗或预防有效量的一种或多种本发明的抗体施用给易患疟疾的受试者或表现出痴疾感染的受试者。可以施用该抗体的任何活性形式，包括Fab和F(ab')2片段。治疗具有疟疾感染的个体可以包括施用治疗有效量的本发明抗体。施用的抗体的剂量将取决于诸如患者的年龄、体重、高度、性别、一般医学状况、既往病史等的因素以及本领域技术人员已知的其他因素而变化。合适的有效量可以仅使用常规的试验而容易地确定。用于治疗或预防应用的有效量和施用途径在下面进一步描述。本发明的另一个方面提供了包含一种或多种本发明的肝期疟原虫多肽和药学上可接受的栽体的组合物。因此，一些实施方案提供了包含肝期疟原虫多肽和药学上可接受的载体的免疫原性组合物，其中所述肝期疟原虫多肽包含选自SEQIDNO:1-48的氨基酸序列及其免疫原性衍生物。例如，分离的多肽可以是选自SEQIDNO:11-44的恶性痴原虫多肽及其免疫原性衍生物。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含至少两种选自SEQIDNO:1-48的肝期疟原虫多肽及其免疫原性衍生物。在一些实施方案，本发明的组合物是用于诱导免疫应答的免疫原性组合物，例如疫苗组合物。"疫苗"是能够引发针对疟原虫寄生虫感染和/或疟疾的保护作用的免疫原性组合物，无论是部分还是完全。用于治疗受感染的个体的疫苗可以称为治疗性疫苗。本发明的免疫原性组合物也可以用于在恶性痴原虫不能感染的物种中引发抗体，例如在兔或小鼠中产生抗体。除了一种或多种本发明的肝期疟原虫多肽外，本发明的组合物还可以包含其他抗原。例如，所述组合物可以包含基于疟原虫环子孢子蛋白质的抗原，其目前在RTS，S疫苗中使用(参见MatuschewskiU006)to\r.Op./薦/20/.18:1-9)。本发明进一步提供了用于通过将一种或多种本发明的恶性疟原虫多肽悬浮或包装在合适的药学上可接受的栽体中来制备免疫原性組合物的方法。合适的药学上可接受的载体包括无菌水或无菌生理盐水溶液，特别是磷酸盐緩沖盐水(PBS),这是本领域所熟知的。本发明的免疫原性组合物通常还包含佐剂。合适的佐剂是本领域所熟知的(参见例如，Kscc/"e/es/g/2—7力e57/6y""a/dJf/y"p^/^/f/7/roac力(1995)PharmaceuticalBiotechnology,Volume6(eds.Powell,M.F.，&Newman,M.J.)PlenumPress,NewYorkandLondonISBN0-306-44867-X)。示例性的佐剂包括不在人中使用的弗氏完全佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂UFA)、角藍烯、角鲨烷和明矾(例如Alhydrogel,Superfos,Denmark)，这些佐剂是本领域所熟知的材料并且可从多个来源商购获得。其他的示例性佐剂包括在Lanar等人，美国专利号7，029，685和美国专利公开号2006/0073171(通过提及而引入本文)中描述的佐剂。在一些实施方案中，免疫原性組合物是疫苗组合物。疫苗制备在NewTrendsandDevelopmentsinVaccine(eds.Voller等人)，UniversityParkPress,Baltimore,Md.，U.S.A.,1978中进行了全面描述。包嚢在脂质体内例如由Fullerton，美国专利号4，235，877进行了描述。蛋白质与大分子的缀合例如由Likhite，美国专利号4，372，945以及由Armor等人，美国专利号4，474，757所公开。每份疫苗剂量中存在的免疫原的量被选择为诱导免疫应答而无明显不利副作用的量。术语"免疫应答"措获得的和程度增强的针对疟原虫感染或痗疾的保护性免疫力，例如在随后暴露于疟疾寄生虫后完全或部分的针对感染或疾病的保护作用。每剂中存在的免疫原的量取决于采用哪些特异性免疫原以及其他因素而变化。通常，期望每剂包含总共1-1000微克的蛋白质，例如1-200微克或10-100微克或5-50微克的蛋白质。在初次疫苗接种后，受试者将通常接受一次或多次加强免疫。关于特定疫苗的最佳量以及加强免疫的数目和频率可以通过标准研究(包括观察受试者中的免疫应答)根据经验来确定。本发明的疫苗组合物可以通过本领域已知的任何合适的施用方法进行施用，包括但不限于，皮内、皮下、肌内、腹膜内、口服、眼(例如作为眼喷雾剂)和静脉内。常规地，疫苗通过注射例如皮下或肌内注射而经肠胃外施用。适于其他施用方式的另外制剂包括栓剂，以及在一些情形中，口服制剂或鼻喷雾剂。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可以包括例如聚烷撑二醇或甘油三酯。口服制剂包含通常采用的赋形剂，例如，药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。在一些实施方案中，本发明的疫苗组合物是包含编码一种或多种本发明肝期恶性疟原虫多肽的核酸分子的DNA疫苗。因此，一些实施方案提供了包含編码多肽的核酸分子和药学上可接受的载体的免疫原性组合物，其中所述多肽包含选自SEQIDN0:l-48的氨基酸序列及其免疫原性衍生物。例如，所述核酸分子可以编码选自SEQIDN0:11-48的恶性痴原虫多肽及其免疫原性衍生物。所述免疫原性组合物可以额外包含编码其他抗原的核酸，所述其他抗原例如为基于疟原虫环子孢子蛋白质的抗原，其目前在RTS，S疫苗中使用(参见Matuschewski(2006)Cwrr.化/鹏歸/.18:1-9)。用于制备和施用表达痴原虫蛋白质的DNA疫苗的方法是本领域已知的，并且先前已有描述(参见，例如000比11&HoffmanQOOl)/W././^a"7o入31:753-62;Narum等人，美国专利号7，078，507，通过提及而并入本文)。在一些实施方案冲，本发明的疫苗組合物是包含编码一种或多种本发明的肝期恶性痴原虫多肽的病毒栽体的病毒疫苗。用于本发明的疫苗组合物的示例性病毒载体包括但不限于，痘苗病毒栽体(例如基于经修饰的痘苗病毒或禽痘病毒的载体)、腺病毒栽体和黄热病毒载体(参见，例如Imoukhuede等人，(2006)&cc//ie，//7;7ress;Miao等人，(2006)Facc//7e，2'刀；ress;Tao等人，(2005)/.^t.201:201-9)。用于制备和施用表达疟原虫蛋白质的病毒疫苗的方法是本领域已知的，并且先前已有描述(参见，例如，Imoukhuede等人，(2006)Facc//7e，///re^;Miao等人，(2006)racc//7e，//7;7,e5^;Tao等人，(2005)/.五;r;7.￥e《201:201-9)。用于制备编码本发明的肝期疟原虫多肽的DNA疫苗的示例性方法在实施例7中提供。在另一个方面，本发明提供了基因工程减毒的子孢子，从所述子孢子中已经除去了至少一种编码本发明的肝期多肽的基因。因此，在一些实施方案中，本发明提供了基因工程减毒的痗原虫子孢子，所述子孢子缺少编码选自SEQIDNO:1-48的肝期多肽的基因。编码肝期多肽的基因可以是编码选自SEQIDNO:11-44的恶性疾原虫多肽的基因。用于制备基因工程减毒的缺少肝期基因的痴原虫子孢子的方法先前已经有描述(参见例如，Mueller等人，(2005)#a433:164-7;Mueller等人，(2005)户roc,Jca丄Sci.^S^102:3022-7;Kappe等人，美国专利公开号2005/0226896，通过提及而并入本文)。本发明的另一个方面提供用于诱导针对肝期恶性疟原虫寄生虫的免疫应答的方法，该方法包括施用含有有效量的一种或多种本发明的肝期恶性痗原虫多肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于在哺乳动物受试者中诱导针对恶性疟原虫的免疫应答的方法，该方法包括将含有有效量的至少一种分离的多肽的组合物施用给哺乳动物受试者，所述多肽选自SEQIDNO:1-48及其免疫原性衍生物。例如，所述分离的多肽可以是选自SEQIDNO:11-44的恶性疾原虫多肽及其免疫原性衍生物。如此处使用的，术语"哺乳动物受试者，，包括但不限于，人、山羊、兔和小鼠。在一些实施方案中，哺乳动物受试者是人受试者。本发明的另一个方面提供了用于治疗有此需要的哺乳动物受试者的方法，包括将含有有效量的一种或多种本发明的肝期恶性疟原虫多肽的免疫原性組合物施用给有此需要的哺乳动物受试者。因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗有此需要的人受试者的方法，包括将含有至少一种分离的选自SEQIDNO:l-48的多肽及其免疫原性衍生物的免疫原性组合物施用给人受试者。例如，所述分离的多肽可以是选自SEQIDNO:11-44的恶性疟原虫多肽及其免疫原性衍生物。法，该方法包括施用活的、基因工程减毒的疟原虫生物体，所述疟原肽的基因。用于施用活的、基因工程减毒的痴原虫生物体和诱导针对疟原虫寄生虫的免疫应答的方法先前已经有描述(参见，例如，Mueller等人，(2005)yY""re433:164-7;Mueller等人，(2005)户藩.Sc/.KW102:3022-7;Kappe等人，美国专利公开号2005/0226896，通过提及而并入本文)。术语"处理，，指治疗性处理和预防性或保护性措施，其中目标是防止或减緩(减轻)所耙向的病理状态或疾病。需要处理的那些受试者包括已经患有疾病的那些受试者以及倾向于患有疾病的那些受试者或其中疾病有待阻止的那些受试者。在一些实施方案中，待处理的受试者是患有疟疾例如肝期疟疾的人受试者。在一些实施方案中，待处理的受试者是有感染疟疾风险的人受试者。待处理的受试者先前可能有或可能没有被痴原虫寄生虫感染。用于治疗性或预防性处理的术语"有效量"指足以在被施用了组合物的个体中诱导所需的应答(例如免疫应答)的组合物的量或剂量。优选地，有效量是足以实现如上定义的处理的量。施用特定治疗性或预防性处理的有效量和方法可以基于患者个体和疾病的阶段以及本领域技术人员已知的其他因素而变化。此类化合物的治疗功效和毒性可以通过标准的药学程序在细胞培养物或试验动物中测定，例如测定ED50(在50%的群体中治疗上有效的剂量)和LD50(50%的群体致死的剂量)。毒性效果与治疗效果的剂量比是治疗指数，并可表示为比率LD50/ED50。表现出大的治疗指数的药物组合物是优选的。将从细胞培养测定法和动物研究中获得的数据用于制定一定范围的用于人的剂量。此类化合物的剂量优选处于一定的循环浓度范風内，所述循环浓度范围包括具有小的毒性或无毒性的ED50。取决于所采用的剂型、患者的敏感性和施用途径，剂量可以在该范围内变化。确切的剂量由独个医生根据待处理的患者而选择。调节剂量和施用以提供足够水平的活性成分或维持所需的效果。可以考虑的其他因素包括恶性疟原虫在患者的地理邻近区的流行状况、患者的疾病状态的严重度、患者的年龄和体重、饮食、施用的时间和频率、药物联用、反应敏感性和对治疗的耐受性/响应。合适的有效量可以仅用常规的试验而容易地确定。每个个体可能需要几次剂量以获得足够的应答从而实现处理。关于初次施用和随后施用(例如，加强注射)的合适的给药方案也可以变化，但是典型的是进行初次施用，相隔一段时间(数周或数月)后进行后继施用。通过处理而引发的抗体产生很容易通过下述方式来确定从施用了免疫原性组合物的受试者中获得血浆或血清样品，并就它们结合用于引发针对恶性疟原虫寄生虫(例如肝期寄生虫)的免疫应答的多肽的能力来对其中的抗体进行检定。示例性的方法包括但不限于，本领域所熟知的ELISA测定法、免疫焚光测定法(IFA)或其他免疫测定法如Western印迹法。针对本发明的一种或多种肝期恶性疟原虫寄生虫的抗体可以使用众所周知的技术从哺乳动物受试者的血液中分离，然后重构入用于被动免疫的第二种疫苗中，这也是众所周知的。类似的技术用于人的广球蛋白免疫。例如，来自一位或许多位经免疫的受试者的抗血清可以在含水硫酸铵(通常40-50°/的饱和度)中沉淀，并且通过色谱法(例如亲和色谱)纯化经沉淀的抗体。在另一个方面，本发明提供了诊断和筛选试剂和测定法，其可以是基于蛋白质的或基于核酸的。这些试剂和测定法可以用于检测本发明的肝期疟原虫多肽或编码它们的核酸分子的存在，以便确定患者是否正患有或可能患有疟疾。可以使用许多技术，包括但不限于，ELISA、夹心测定法、免疫沉淀、免疫印迹法、杂交技术和PCR。在一些实施方案中，本发明的肝期疟原虫多肽用于检测哺乳动物受试者中的抗体。在一些实施方案中，针对本发明肝期疟原虫多肽的抗体用于检测这些多肽的存在，诊断性免疫测定法程序在本领域中是标准的(参见例如，A2Wca/d"2'//cW7iz迈W3070《/(1991)第7版，Stites，D.，&Terr，A.)。示例性的方法可以例如使用固相支持物或免疫沉淀。大多数测定法涉及使用经标记的抗体或多肽。此类标记可以是，例如酶标记、荧光标记、化学发光标记、放射性标记或染料分子。放大来自免疫复合物的信号的测定法也是已知的，例如利用生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的测定法，以及酶标记和介导的免疫测定法，例如ELISA测定法。一些实施方案提供了用于体外诊断可能被恶性痴原虫感染的受试者中的疟疾的方法，该方法包括(a)使来自哺乳动物受试者的含有抗体的生物样品与一种或多种本发明的肝期恶性痴原虫多肽在一定条件下接触，所述条件使得所述多肽和所述抗体之间能够形成抗原/抗体复合物，并且(b)检测抗原/抗体复合物的形成。可以用于执行该方法的生物样品的实例是红细胞、白细胞、血清或尿。使得能够形成抗原/抗体复合物的条件是本领域所熟知的。本发明还提供了用于监控针对由恶性疟原虫引起的感染或疾病而进行疫苗接种的受试者的免疫状态的方法，该方法包括(a)使来自受试者的含有抗体的生物样品与一种或多种本发明的肝期恶性疟原虫多肽在一定条件下接触，所述条件使得所述多肽和所述抗体之间能够形成抗原/抗体复合物，并且(b)检测抗原/抗体复合物的形成。在上面描述的诊断和监控方法中，可以进一步将所述生物样品与一种或几种来源于其他痴原虫抗原的抗原肽接触。在一些实施方案中，诊断和筛选试剂和测定法是基于核酸的。用于基于核酸的测定法的示例性诊断和筛选试剂包括与编码本发明的恶性痴原虫多肽的核酸分子互补的核酸探针。基于核酸的诊断和筛选测定法是本领域所熟知的。用于本发明该方面的示例性诊断和筛选测定法在Scherf等人，美国专利号6，855，323(通过提及而并入本文)中描述。本发明还提供了可用于实现本发明的试剂盒。所述试剂盒可以包括第一容器装置，该容器装置含有本发明的多肽、核酸分子、组合物和/或抗体。所迷试剂盒还可以包括其他容器装置，所迷其他容器装置含有实现本发明所必需的或便于实现本发明的溶液。所述容器装置可以由玻璃、塑料、或箔制成，并且可以是管形瓶、瓶、嚢、管、袋等。所述试剂盒还可以包含书面信息，例如用于实现本发明的程序，或分析信息，例如第一容器装置中所包含的试剂的量。所述容器装置可以与书面信息一起在另一容器装置例如盒子或袋子中。M"i兌明了顿.A者虔、用千实战太劳曰/方案，但是不应理解为限制本发明实施例1本实施例描述了在肝期发育过程中差异表达的新的保守的约氏疟原虫(/Vas/z70cT/咖yoe"2')蛋白质的鉴定。有关肝期生物学的最重要的问题之一是该阶段是否差异地表达独特的一组蛋白质。然而，由于肝期难以通过试验进行追踪，因而该问题仍然远没有解决。本实施例描述了在体内在啮齿动物疟疾的约氏疟原虫的肝期中差异表达的基因及其蛋白质产物(PyLSPl)。生物信息学分析、PCR和RT-PCR阐明了完整的基因结构并鉴定了在恶性疟原虫中的PyLSPl直向同源物。RT-PCR和免疫测定法显示，PyLSPl表达在体内晚肝期被上调，但在子孢子和寄生虫血液期中其未显著表达。材料和方法微阵列研究使用Trizol(Invitrogen)从感染了〉3百万个约氏疟原虫野生型子孢子的BALB/c小鼠肝脏中分离肝总RNA。在寄生虫血症达到5%时，从Swiss-Webster小鼠中的血液期感染物中获得血液期RNA。用DM酶(Invitrogen)处理RNA以除去基因組DNA污染物。将大约20微克总RNA用于cDNA合成，并使用购自Stratagene的Fairplay标记试剂盒用荧光Cy3或Cy5染料间接进行标记。将经Cy3和Cy5标记的cDM与由DrexelUniversity的LawrenceBergman小组制备的定制的65-mer寡核苷酸阵列杂交过夜，该阵列具有双倍的关于约氏疟原虫全部~6500个有注解的基因的探针。洗涤后，用GenePix扫描仪扫描该微阵列载片，并用Acuity软件分析结果。将每个点的信号强度标准化，并与具有随机寡核苷酸(阴性对照)的点进行比较。将检测表达的基因的阈值设定为阴性对照的信号强度的4倍。对来自感染后40小时的受感染的肝脏、未感染的肝脏和混合的血液期的总RM进行微阵列分析。如下选择用于分析的我们的候选基因在感染40小时的肝脏中高度表达；在混合的血液期中低水平表达或不表达；可能与恶性痴原虫基因直向同源；和存在信号肽。信号肽的存在是由该基因编码的蛋白质可被分泌并因而可在宿主-寄生虫相互作用中起重要作用的指示。然后，通过定量实时PCR来分析候选基因，如实施例2中所描迷的。蛋白质表达研究推定的免疫原性肽的定位用在网络上可获得的用于蛋白质二级结构预测的各种程序来鉴定。肽2(KDDYSKNNGKDSLVCC，SEQIDNO:49)和肽5(CNLKYLLLHHTNAFLC，SEQIDNO:50)由商业公司(Sigma-Genosys)合成。通过SigmaGenosys，将两只新西兰白兔用于抗体的产生。按照77-天时间表(每只动物6次免疫和4次放血)，与弗氏佐剂一起皮下注射所述肽。使用标准方案，将所述肽抗体用于LSP1的免疫荧光和免疫印迹分析。结果LSP1的鉴定和表达利用微阵列基因表达谱，我们鉴定了仅在40小时的体内约氏痴原虫LS发育时表达的基因(表1和2)。一个独特表达的基因是编码具有~380kDa的预测分子量的假定蛋白质的户j^S厶约氏痴原虫基因产物含有预测的可切割的信号肽和跨膜结构域。分别使用PlasmoDB和SangerCenter数据库，用PyLSPl氨基酸序列进行BLAST同源性搜索以鉴定在恶性疟原虫和柏氏疟原虫(尺6erg力ei)中的直向同源基因。在恶性痴原虫和柏氏痦原虫寄生虫中都发现了潜在的直向同源物。约氏痴原虫PyLSPl的基因识别号是PY04499(SEQIDNO.1)，恶性痦原虫PyLSPl的基因识别号是Pf14—0179(SEQIDNO:11),和柏氏痴原虫PyLSPl的基因识别号是gi68075600。LSP1在晚肝期表达我们用特异性引物通过RT-PCR和qRT-PCR研究了户/丄57^在不同的寄生虫发育阶段的表达。在感染后40小时提取的受感染肝脏样品中检测到了尸/i^尸7。这些结果也显示，PyLSPl在子孢子、早肝期和血液期中被下调(参见下面的表1)。为了研究PyLSPl的蛋白质表达模式，我们产生了针对两种独立的肽的抗血清，所述两种独立的肽处于在具有高度的预测的抗原性的区域中。免疫共定位分析显示，在感染后44小时提取的肝脏切片中PyLSPl由LS高度表达。在感染后24小时在LS中存在淡的内部染色。PyLSPl看起来位于寄生泡中。在子孢子、血液期或早LS中检测不到表达。免疫共定位数据与RT-PCR数据一致，PyLSPl存在于晚LS中但不存在于早LS中。实施例2本实施例描述了在肝期发育过程中差异表达的新的约氏疟原虫蛋白质的鉴定。材料和方法a.RNA制备根据生产商的说明书，用Trizol(InvUrogen)从混合的血液期、唾液腺子孢子和约氏疟原虫感染的小鼠肝脏中制备总RNA。来自混合的血液期和被感染的小鼠肝脏的总RNA用Turbo-freeRNA酶(Ambion)处理，而来自子孢子的总RNA用无RNA酶的DM酶(Invitrogen)根据生产商的说明书进行处理。经处理的RM用RNeasymini试剂盒(Qiagen)进行净化。RAN浓度通过分光光度法进行测量，和RAN品质用AgilentBioanalyzer来检验。b.引物设计用引物分析软件PrimerExpressv2，0和v3.0(AppliedBiosystems)来设计引物。i殳计是基于可从PlasmoDB获得的基因的mRNA序列。将扩增子设定在IOO至250bp。c.常规和实时RT-PCR:对于常规的RT-PCR,将2.5微升稀释的cDNA用于每个25微升的PCR反应，该反应具有2.5微升稀释的cDM、25皮摩尔每种引物和12.5孩吏升BiolineRedPCRmix(Bioline)，使用以下循环条件最初在95。C下变性3分钟；9VC下30秒、55匸下"秒和"。C下1分钟，进行30个循环；以及最后在72。C下延伸7分钟。实时PCR分析在ABIprism7300SequenceDetectionSystems上用SYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems)来进4亍。PCR反应体系由12.5微升SYBRGreenPCRMasterMix、20皮摩尔正向和反向引物以及5微升稀释的cDNA组成，总体积为25微升。PCR循环条件使用ABIPrism7300SDSSoftware的默认条件进行。为了验证PCR扩增产物是独特的，在PCR后增加解离方案，从65'C升至95。C。对于每种引物对，包括了无模板对照，感染40小时的肝脏+混合的血液期cDNA混合物的4种系列稀释物的标准曲线，以及每种测试cDNA(混和的血液期，12、24、40小时的肝脏，和唾液腺子孢子)。d.正规化(normalization)和相对定量用相对标准曲线方法(RelativeStandardCurveMethod)(AppliedBiosystems公报)将五种不同的RM样品正规化至约氏疟原虫的18S和14-3-3蛋白持家基因。标准品从来自混合的血液期和被感染的小鼠肝脏(1:1)的总RM混合物中制备。第一条链的cDM从这种总RNA混合物中制备。将得到的cDNA的1:1、1:5、1:10、1:25和1:50的稀释物用作每种引物对的实时PCR的模板。来自测试cDNA的每种扩增的基因产物的相对量从相应的标准曲线上内插得到。由于定量被正规化至18S和14-3-3持家基因，因而产生了耙基因和参考基因(18S和14-3-3)的标准曲线。每种靶基因的正规化的量被表示为靶基因的相对量与每种参考基因的比率，从而得到不同的正规化的值。然后，通过得到在不同测试cDM中每种基因的正规化表达值与在混合的血液期中该基因的正规化表达值的比率，计算出与混合的血液期相比较的倍数变化表达(即，将混合的血液中的倍数表达设定为1的值)。结果发现IO种约氏疟原虫基因在肝期中特异性表达。这些基因中的9种在恶性痴原虫中具有直向同源物，如表1中所显示的。这IO种基因在肝期中的表达模式显示于表2中。表l.在实施例1和2中鉴定的肝期基因<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表2.在实施例l和2中鉴定的肝期基因的表达模式<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>实施例3本实施例描述了在肝期发育过程中差异表达的新的恶性痴原虫蛋白质的鉴定。我们优化了恶性疟原虫寄生虫对HC-04肝细胞的体外感染并采用RNA的无偏扩增以便获得足够的材料用于微阵列研究。我们将这些材料施加至微阵列上，并比较未感染的和受感染的HC-04肝细胞的基因表达谱以鉴定被肝期寄生虫独特转录的基因。我们用生物信息学工具来分析这些基因以确定哪些可能是肝期寄生虫所特有的。这些基因编答来预防恶性痗原虫i染，、或用于开发靶向肝^寄生虫的药物或诊^剂。材料和方法a.恶性痴原虫对HC04肝细胞的体外感染的优化将人肝细胞系HC-04接种于6-孔组织培养板中，并在用在空气中的10%0)2平衡的潮湿培养箱中于37。C，在补充有抗生素和胎牛血清的培养基中维持直至汇合。将在铜养后3周手工剖出的恶性痴原虫子孢子以2:1(子孢子细胞)的比率加入至HC-04细胞中。在子孢子接种后3小时改变培养基，然后每48小时改变培养基，直至观察到红细胞外裂殖子(参见Sattabongkot等人，(2006)J瓜/.7>o/.74(5):706-7)。肝期寄生虫的检测用吉姆萨染色来进行。b.微阵列研究微阵列试验如先前描述的(Bozdech等人，(2003)^"o/weWo人4(2):R9)来进行。将未经修饰的70-mer寡核苷酸印在CorningUltraGaps聚-L-赖氨酸载片上。在用硼酸中和的l-甲基-2-吡咯烷酮中用琥珀酸酐封闭载片。使用PureLinkMicro-to-MidiTotalRNAPurificationSystem(Invitrogen，产品目录号12183-018)并根据生产商的说明书来分离RM。使用Ambion'sAminoAllylMessageAmpIIaRNAKitAmplification(Ambion，产品目录号1753)并根据生产商的说明书来扩增RNA。在存在0.1MNaHC03pH9.0的情况下，将得到的含有aa-dUTP的cDNA偶连至CyScribeCy3或Cy5(Amersham，Piscataway，NJ)单官能染料。将偶联反应体系在室温下孵育最少1小时。杂交介质含有3xSSC、1.5mg/mlpoly(A)腿和0.5%SDS。杂交在65°C下进行8-16小时。在室温下将阵列在2xSSC/0.2%SDS中洗涤并然后在0.lxSSC中洗涤。使用GenePix4000扫描仪来扫描所述微阵列，并^f吏用GenePix软件(AxonInstruments,UnionCity,CA)来分析图象。c.qPCR:用96-孑L形式的7000SequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems)在lxSYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems，产品目录号4334973)中，在存在500nM每种正向和反向引物的情况下以0.050ml的体积进行qPCR反应。典型的qPCR条件是5(TC下2分钟，95。C下10分钟，随后进行45个循环的扩增。每个扩结果、'、^'在4个完成的微阵列中的两个或更多个中被检测为上调(在感染的对未感染的HC04细胞中)的恶性疟原虫基因的比例实质上并且显著地大于非疾疾(人或酵母)基因的比例。这确立了我们的标准在我们的4个阵列中的2个或多个中被检测为上调的基因是候选肝期抗原。由肝期寄生虫转录的基因已经通过定量PCR(qPCR)进行了证实。肝期基因的qPCR检测用下面的质量控制程序来进行以确保特异性鉴定和定量a)每种基因用两个独立的引物对/qPCR反应来检测；b)qPCR-扩增的基因片段通过琼脂糖凝胶上的大小来证实；c)将受感染的HC04细胞的qPCR与未感染的HC04细胞的qPCR进行比较以显示特异性；d)将肝期基因的qPCR正规化至持家基因的qPCR以定量丰度；e)比较肝期寄生虫和其他阶段(子孢子期、晚环状体期、晚营养子期和晚裂殖体期)之间的基因的qPCR以证实转录的阶段特异性。表3显示了在用一组持家基因进行正规化后，与子孢子期、晚环状体期、晚营养子期和晚裂殖体期相比较，通过qPCR鉴定为在肝期期间过表达的恶性疟原虫基因的表达的相对量(以log2为刻度)。0(零)的值反映了在生物学上无意义的转录的估计值，这基于比持家基因转录水平的几何平均值低1"70倍的水平。表3中的基因有可能对于肝期寄生虫是独特的。其表达被发现在肝期中相比于其他阶段有所升高的其他基因包括PFE0935c、PFB0610c、PF11一0480、PFD0270c、PFL1995c、PFA0170c、PF08—0054和PFI0875w。这些基因的序列以及由它们编码的蛋白质可以从疟原虫基因组数据库(http:〃plasmodb.org/;Kissinger等，(2002)^a,"re419:490-492)获得，并且在此通过提及而并入本文(于2006年9月28日获取的版本)。所有上述基因以及苗，或者作为药物和诊断剂的靶标。位于恶性疟原虫基因座PFE0305w的基因(SEQIDNO:20)具有类似于转录起始因子TFIID(—种结合TATA的蛋白质)的序列。我们表明，这种转录起始因子是肝期特异性的。因此，敲除该基周可能提供了一种产生减毒的疟疾寄生虫的有力的策略。表3.肝期特异性基因的相对表达模式<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>LS-晚裂殖体期表4显示了在子孢子期寄生虫(在侵入肝细胞前)中过表达的恶性疟原虫基因表达的相对量(以1og2为刻度)，所述基因在肝期寄生虫发育期间继续表达，但是在血液期发育期间不表达或在血液期发育期间以显著更低的水平表达。用一组持家基因将表达正规化。O(零)的值反映了在生物学上无意义的转录的估计值，这基于比持家基因转录水平的几何平均值低170倍的水平。这些基因也是用于寄生虫的基因敲除减毒，用于药物和疫苗设计，以及用于开发诊断剂的重要靼标。表4.与血液期相比较，在肝期中过表达的基因的相对表达模式<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>SP=子孢子LR=晚环状体期LT=晚营养子期LS=晚裂殖体期实施例4本实施例描述了作为保护性免疫的靶标的两种肝期恶性疟原虫蛋白质的鉴定。针对肝期疟疾的完全保护性免疫可以用减毒的寄生虫来诱导(在Matuschewski(2006)Cwrr./迈迈wo/.18:1-9中做了综迷)。这最初用已经通过辐射减毒的疟原虫得到证明，并且更近一些时候用已经通过除去关键的毒力基因而基因工程减毒的寄生虫得到证明。在这些模式系统中，已经将保护性免疫与产生IFN，的T细胞相关联(Kurtis等人，(2001)7re油尸ara"7o人17(5):219-23;Hoffman等人，(2002)/./力尸e".嵐185:1155-64;Berenzon等人，(2003)/.//MW30人171(4):2024-34),尽管还未清楚谁是该特异性T细胞的抗原華&标。我们使用了由减毒的寄生虫诱导的保护性免疫的啮齿动物模型，标。通过静脉内注射用已经在子孢子期(即在蚊子的唾液腺中)经辐射减毒的柏氏疟原虫寄生虫对小鼠接种三次。该免疫接种包括75，000个减毒的寄生虫以用于引发，随后为"，000和W，000个寄生虫以用于每次加强。在最后的免疫接种后7天用10，000个野生型寄生虫攻击啮齿动物，并且显示出为完全保护的。在攻击后5周我们从受保护的啮齿动物的肝脏和脾脏中收集了免疫细胞，并检查它们针对肽的特异性应答，所述肽代表恶性疟原虫抗原的柏氏疟原虫直向同源物。将肝单核细胞与单独的培养基、与来自恶性瘙原虫肝期蛋白质PFE305w(SEQIDNO:20)的柏氏疟原虫直向同源物的肽12(INLQNLNYI，SEQIDNO:51)、或与来自PF11—0480(SEQIDNo:19)的柏氏疸原虫直向同源物的肽4(IAVENCNNI，SEQIDNO:52)—起培养。我们证明，来自受保护的啮齿动物的肝脏T细胞而不是脾脏T细胞作为对于肽12和4的响应而表达IFN-y。这些数据确定，肝期蛋白质PFE0305w(SEQIDNO:20)和PF11一0480(SEQIDNo:19)为与保护作用相关的免疫力的抗原耙标，以及为由肝期痴疾寄生虫表达的免疫原性抗原。实施例5本实施例描述了重组肝期痴原虫蛋白质的表达。材料和方法a.蛋白质序列的分析不能表达为全长蛋白质的大分子量蛋白质可以表达为预测的免疫原性结构域。此类免疫原性结构域从在实施例1-3中鉴定的蛋白质的序列中预测，并用于动物免疫接种研究。蛋白质序列用DNASTAR程序通过几种算法来分析，包括根据Kyte-Doolittle方法预测疏水性，才艮据Emini方法预测表面概率，和才艮据Jameson-Wolf方法预测抗原性(DNASTAR，Inc)。b.蛋白质在大肠杆菌中的表达蛋白质在原核载体pET28b中的表达通过下列方式来进行培养细菌至对数生长期，用1mMIPTG诱导重组蛋白质的表达，并继续培养细菌培养物至饱和。离心培养物并将细菌细胞粒状沉淀在溶液A(50mMTris、10mMEDTA、5mMDTT、2%TritonX-IOO、500mMNaClpH7.5)中洗涤3次。将蛋白质在溶液B(6M盐酸胍、50mMTrispH8.0、5mMDTT)中溶解2小时。通过离心除去细胞碎片，并根据生产商的说明书(Novagen)将蛋白质溶液上样至镍柱上以纯化His-标记的重组蛋白质。c.体外蛋白质表达由于一些疟疾抗原可能难以在细胞系统中表达并且是依赖构象的，所以还将一种备选方法用于表达在实施例1-3中鉴定的蛋白质，这通过使用由CellFreeSciences生产的无细胞体外蛋白质合成系统(ENDEXTTechnology)来进行。该方法使用无转录抑制剂的麦胚裂解产物，其使得能够稳定地翻译真核蛋白质，包括构象依赖性的疟疾抗原。将编码这些蛋白质的基因克隆入pEU-E01-His-TEV-MCS载体(CellFreeSystems,Inc.)中，随后根据生产商的说明书(CellFreeSciences)来合成蛋白质。使用抗-His珠并根据生产商的说明书(Dynal)来纯化His-标签蛋白质。d.蛋白质的免疫识别就它们被来自免疫的和未免疫的个体的T细胞和血清所识别来分析重组蛋白质，例如如在实施例4中，在Doolan等人，(2003)A^〃.JcaASc/.〃W100(17):9952-7中，和在Sundaresh等人，(2006)A/o/z7/謹"ic5122(14):1760-6中所描述的。预期用于免疫兔的蛋白质是具有免疫原性的，并且引发识别疟原虫肝期的抗体，如实施例l中所描述的，和/或引发T细胞应答，如实施例4中所描述的。以相比于来自未免疫的个体的T细胞和/或血清而言显著更高的水平与来自免疫的个体的T细胞和/或血清反应的蛋白质被预期是用于痴疾疫苗的好的免疫原。实施例6本实施例描述了重组肝期恶性疟原虫蛋白质及其免疫原性衍生物在巴斯德毕赤酵母中的表达。a.免疫原性结构域的鉴定蛋白质序列用DNASTAR程序通过几种算法来分析，包括根据Kyte-DooliUle方法预测疏水性，根据Emini方法预测表面概率，和根据Jameson-Wolf方法预测抗原性(DNASTAR，Inc)。为了改善重组蛋白质的溶解性，在表达结构域中不包含高度疏水的区域。b.肝期痴原虫蛋白质在巴斯德毕赤酵母中的表达根据描述了如何在巴斯德毕赤酵母中克隆和表达蛋白质的详细方案(可从Invitrogen作为EasySelectPichiaExpressionKit(产品编号K1740-01)的一部分而获得)来表达蛋白质。c.高分子量肝期恶性疟原虫蛋白质的表达不能表达为全长蛋白质的高分子量蛋白质可以表达为预测的免疫原性结构域。在实施例1-3中鉴定的大的肝期疟原虫蛋白质中的一些在它们的序列中没有显示任何明显的结构PF14—0179(SEQIDNO:11)是预测的423kDa蛋白质，PFD0260c(SEQIDNO:12)是预测的233.7kDa蛋白质，MAL13P1.66(SEQIDNO:15)是预测的345.7kDa蛋白质，PF11—0480(SEQIDNO:19)是预测的348kDa蛋白质，PFC0195w(SEQIDNO:26)是预测的170.5kDa蛋白质，PFC0960c(SEQIDNO:27)是预测的231.8kDa蛋白质，PFE1070c(SEQIDNO:42)是预测的162kDa蛋白质，和PFE1200w(SEQIDNO:43)是预测的147.8kDa蛋白质。将这些蛋白质表达为许多部分重叠的多肽，每个40-70kDa。d.小分子量和中等分子量的肝期恶性疟原虫蛋白质的表达将下列小分子量和中等分子量的蛋白质表达为全长蛋白质PF10—0027(SEQIDNO:16)是预测的49.7kDa蛋白质，PF11-0230(SEQIDNO:22)是预测的19.7kDa蛋白质，PF14—0534(SEQIDNO:24)是预测的55kDa蛋白质，PF13-0112(SEQIDNO:28)是预测的9.2kDa蛋白质，PF08-0073(SEQI譜:29)是预测的44.8kDa蛋白质，PFll-0221(SEQIDNO:32)是预测的7.1kDa蛋白质，PFB0690w(SEQIDNO:37)是预测的29.7kDa蛋白质，和PFD0205c(SEQIDNO:38)是预测的19.6kDa蛋白质。e.所选择的肝期恶性疟原虫蛋白质的表达PFI112k(SEQIDNO:13)是分子量为33kDa的推定的3-氧酰基-(酰基-载体蛋白)还原酶。全长蛋白质和包含氨基酸59-300的保守结构域都被表达。PF13—0128(SEQIDNO:14)是分子量为26kDa的P-羟基酰基-acp脱水酶的前体。全长蛋白质和包含氨基酸72-230的保守结构域都被表达。MAL8P1.201(SEQIDNO:17)是分子量为128.6kDa的保守的假定蛋白质。该蛋白质表达为两个结构域第一个结构域包含氨基酸1-545,第二个结构域包含氨基酸660-1073。这两个结构域都是亲水的并且含有多个抗原表位。PFE1450c(SEQIDNO:18)是分子量为22kDa的保守的假定蛋白质。表达了在推定的跨膜结构域后于氨基酸28处开始的该蛋白质的一个结构域。PFE0305w(SEQIDNO:20)是分子量为38kDa的转录起始因子TFIID(—种结合TATA的蛋白质)。表达了全长的蛋白质，以及包含氨基酸151-326的保守结构域。MAL7P1.164(SEQIDNO:21)是分子量为100kDa的推定的适体相关蛋白(adapter-relatedprotein)。该蛋白质表达为两个结构域第一个结构域包含氨基酸6-529，笫二个结构域包含氨基酸587-842。第一个结构域与衔接蛋白(Adaptin)的N-末端区域具有广泛的序列同源性。笫二个结构域是亲水性的并且含有多个抗原表位。PF14-0113(SEQIDNO:23)是分子量为113kDa的假定蛋白质。基于抗原表面概率，表达了包含氨基酸1-346的结构域。PF11-0118(SEQIDNO:25)是分子量为72.5kDa的j艮定蛋白质，其与转录延伸调控剂1，TBP-相关因子基本上同源。基于序列同源性，表达了包含氨基酸92-578的结构域。PF10-0164(SEQIDNO:30)是假定的膜蛋白。表达了包含氨基酸76-130的亲水性非膜部分。PF10-0214(SEQIDNO:31)是分子量为168kDa的假定蛋白质。基于抗原表面概率，表达了包含氨基酸415-885的结构域。PF13-0012(SEQIDNO:33)是分子量为26.8kDa的假定蛋白质。该蛋白质从氨基酸84表达，没有推定的跨膜结构域。PF14-0044(SEQIDNO:34)是分子量为33.5kDa的假定蛋白质。该蛋白质从氨基酸22表达，没有推定的信号肽。PF14—0050(SEQIDNO:35)是分子量为124kDa的假定蛋白质。该蛋白质表达为两个结构域第一个结构域包含氨基酸208-512，第二个结构域包含从716至羧基末端的氨基酸。这两个结构域均是亲水性的并且含有多个抗原表位。PFA0200w(SEQIDNO:36)是分子量为19kDa的假定的膜蛋白。这种蛋白质表达为包含氨基酸1-135的亲水性非膜部分。PFD0215c(SEQIDNO:39)是分子量为56kDa的pf52蛋白。该蛋白质表达为两个结构域第一个结构域包含氨基酸181-306,第二个结构域包含氨基酸47-457。第一个结构域与性阶段抗原s48/45结构域具有广泛的序列同源性。第二个结构域没有疏水性跨膜区并且含有多个抗原表位。PFD0285c(SEQIDNO:40)是分子量为280.9kDa的推定的赖氨酸脱羧酶，其与Lys/Arg脱羧酶的主结构域基本上同源。基于序列同源性，表达了包含氨基酸585-1018的结构域。PFD0430c(SEQIDNO:41)是分子量为94.7kDa的假定蛋白质。基于抗原表位表面概率，表达了从氨基酸230开始至C-末端的结构域。PFE1550w(SEQIDNO:44)是分子量为85kDa的假定的膜蛋白。这种蛋白质表达为包含氨基酸236-683的亲水性非膜部分。PFD0800c(SEQIDNO:45)是分子量为20kDa的4艮定蛋白质。在推定的跨膜结构域后于氨基酸26开始表达该蛋白质。PFD0425w(SEQIDNO:48)是分子量为113kDa的假定蛋白质。该蛋白质表达为两个结构域第一个结构域包含氨基酸23-459，第二个结构域包含氨基酸488-813。第一个结构域与衔接蛋白的N-末端区域具有广泛的序列同源性。这两个结构域均是亲水性的并且含有多个抗原表位。f.蛋白质的免疫识别就它们被来自免疫的和未免疫的个体的T细胞和血清所识别来分析重组蛋白质，例如如在实施例4中，在Doolan等人，(2003)100(17):9952—7中，和在Sundaresh等人，(2006)"/oZ/7尸or迈a〃cs22(14):1760-6中所描述的。预期用于免疫兔的蛋白质是具有免疫原性的，并且引发识别疟原虫肝期的抗体，如实施例l中所描述的，和/或引发T细胞应答，如实施例4中所描述的。以相比于来自未免疫的个体的T细胞和/或血清而言显著更高的水平与来自免疫的个体的T细胞和/或血清反应的蛋白质被预期是用于痴疾疫苗的好的免疫原。实施例7本实施例描述了编码肝期痴原虫多肽的DM疫苗的制备。研发有有前途的方法之一。作为疫苗的DNA由Ulmer等人，(1993)Sc/e/"259:1745-9首先报道，其报道了在注射编码病毒蛋白质的质粒DNA后诱导了针对流感的保护性免疫。正在评估DM或核酸疫苗针对一系列寄生虫病(包括疟疾)的效力。来自在啮齿动物模型系统中的研究的数据已经提供了下述原理的证据DNA疫苗在诱导针对各种候选疫苗抗原的体液和T细胞应答方面是有效的。特别是，诱导有效的细胞应答通常使DNA疫苗接种相对于亚基蛋白质疫苗接种具有免疫学优势。已经在许多系统中证明了针对寄生虫攻击的保护作用。最近已经使用302种恶性疟原虫基因(Aguiar等人(2004)Ge層"es.14(10B):2076-82)、192种约氏痗原虫子孢子基因(Haddad等人(2004)J/2尸ecL/边迈M.70(8):4329-35)和~2000种柏氏疟原虫全长cDM(Shibui等人(2005)阮c/刀e23(34):4359-66)评价了DNA作为疫苗的用途。材料和方法(改编自Shibui等人，(2005)ra"/ze23(34):4359-66)。将编码全长基因的cDNA插入表达载体中。根据生产商的说明书，提取质粒DM,进行纯化，并以2微克DNA/mg金的加载率在存在亚精胺的情况下用CaCh沉淀至1微米的金颗粒上。将氦基因枪系统用于以这些包被有DNA的金颗粒来接种小鼠。通过三次注射金颗粒来对小鼠进行免疫，每次注射间隔l周。在1周后，用血液期寄生虫或从受感染的蚊子中剖出的感染性子孢子攻击经免疫的小鼠。将在此引用的每一篇科学或专利参考文献通过提及而并入本文。尽管已经举例说明并描述了本发明的优选实施方案，但应该理解，可以在其中做各种改变而不背离本发明的精神和范围。权利要求1.分离的多肽，其包含选自SEQIDNO11-44的氨基酸序列及其免疫原性衍生物。2.免疫原性组合物，其包含分离的多肽和药学上可接受的载体，其中所述分离的多肽包含选自SEQIDNO:11-44的氨基酸序列及其免疫原性4汁生物。3.分离的核酸分子，其编码包含选自SEQIDNO:11-44的氨基酸序列及其免疫原性衍生物的多肽。全文摘要本发明提供了分离的肝期疟原虫多肽，该多肽包含选自SEQIDNO1-48的氨基酸序列及其免疫原性衍生物。本发明还提供了分离的编码本发明的肝期疟原虫多肽的核酸分子，包含一种或多种本发明的肝期疟原虫多肽的组合物，用于诱导针对肝期疟原虫多肽的免疫应答的方法，和用于治疗和诊断肝期疟疾的方法。文档编号C07K14/445GK101321778SQ200680045159公开日2008年12月10日申请日期2006年9月29日优先权日2005年9月30日发明者A·塔伦,I·巴西克,J·W·温德勒,L·W·伯格曼,P·达菲,S·H·I·卡普,U·克日奇,V·A·马尔科夫,小D·G·赫普纳申请人:西雅图生物医学研究所;由沃尔特·里德军队研究院军队秘书处为代表的美利坚合众国;费城健康教育公司，D/B/A爵硕大学药学院"Ducom"