专利名称：：用于产生结合配体的多聚体捕获试剂的方法
技术领域：
：本发明涉及在表面制造二聚体或更高级多聚体捕获试剂的新方法，通过新方法产生的捕获试剂，和所述捕获试剂的阵列。
背景技术：
：分子如肽的组合产生是公知的。该技术提供了有效的工具，能够产生可以用在如高通量筛选技术中的分子的大型文库。这些技术的实例以及它们在鉴定目的分子的应用公幵在例如J.Org.Chem(有机化学杂志).,63,8696，(1998)中，其中3-mers的1,000-肽文库在水中与丹酰'镊子'分子反应。3%的文库与'镊子，结合。在J.Comb.Chem.(组合化学杂志)，5，794,(2003)中，描述了用于分裂和混合合成的三脚cyclotriveratrylene支架，并且描述了具有~2,000个成员的文库。NatureBiotechnology(自然生物技术)，22，568,(2004),DarioNeri等描述了具有连接的DNA标记的有机分子粘合剂的两个文库。DNA互补性用于制备更高级多样性的文库。使用三链体形成还建立了进一步的文库。将24mer寡聚物用于复合组装。通过对连接的DNA标记进行测序或通过结合于寡核苷酸阵列完成了有机分子消巻积。对于蛋白质产生具有nM亲和性的粘合剂。BioconjugateChem(生物缀合物化学).，12,346,(2001)，描述肽微阵列和小分子微阵列的制备。该文献还公开了关于肽和玻片表面可以使用化学选择性连接。在该技术中，N端半胱氨酰残基与在玻片表面上的a酮醛反应以得到噻唑烷环。其它人使用了在游离硫羟基和马来酰亚胺之间的自由基迈克尔加成。此外，Chem.Commun.(化学通信)，581，(2005)描述了在表面上通过光刻法合成建立环肽的复合文库的策略。将不同的保护策略用于将侧链组合添加到预先制备的核心上。为了获得有义文库所需要的必要的多样性，已知方法需要采取大量的合成酶，因此增加了需要的时间，和产生所述文库所需的费用。
发明内容本发明的目的是提供生产具有需要的多样性的分子的文库的快速廉价的方法。根据本发明的第一个方面，提供用于制备结合配体的多聚体捕获试剂的方法，所述捕获试剂包含至少第一和第二单体单元。所述第一单体单元还包含第一配体结合部分,第一反应基和连接部分，所述第二单体单元还包含第二配体结合部分，和第二反应基，其中反应基对于每个单体单元可以是相同或不同的，所述方法包括下列步骤；a)使第一单体单元与第二单体单元反应从而使在单体单元上的反应基反应以形成多聚体部分；和b)在基底上通过连接部分固定第一单体单元，其中，步骤a)可以在步骤b)之前，同时或在其后进行。优选地，将所述捕获试剂组装在基底上。在图i，2和3中显示制备根据本发明的捕获试剂的可能的方法的图解表示，并且在实施例1中进行描述。在本发明的备选实施方案中，还提供制备用于结合配体的多聚体捕获试剂的方法，所述捕获试剂包含至少第一和第二单体单元，所述第一单体单元还包含第一配体结合部分，第一反应基和连接部分，所述第二单体单元还包含第二配体结合部分，和第二反应基，其中对于每个单体单元，反应基可以是相同或不同的，所述方法包括下列步骤；a)使第一单体单元与第二单体单元反应从而使在单体单元上的反应基反应以形成多聚体捕获试剂。优选地，该备选实施方案还包括将捕获试剂固定在基底上的步骤。现在，还将进一步描述本发明。在下面的部分中，更详细地定义本发明的不同的实施方案。这样定义的每个实施方案可以与任何其它的一个或多个实施方案组合，除非另外清楚地相反地指出。具体而言，可以将指出的优选的或有利的任何特征与指出的优选的或有利的任何其它一个或多个特征组合。在一个优选实施方案中，所述第一和第二单体单元是共价连接的。要理解的是，连接部分可以包含用于将捕获试剂固定在基底上的任何适合的方式。要理解的是，固定可以是，例如通过共价，离子，疏水，极性，链霉抗生物素-生物素，抗生物素蛋白-生物素，或其它高亲和性非共价相互作用进行的。优选地，连接部分包含用于将捕获试剂固定在基底上的共价或疏水方式。要理解的是，单体单元可以是任何适合类型的分子。优选地，单体单元是核苷酸或氨基酸。更优选地,单体单元是多核苷酸或多肽。最优选地,单体单元是多肽。所谓多核苷酸和多肽,分别指2个或更多核苷酸或氨基酸的链。优选地,第一和第二单体单元是合成的。更优选地，第一和第二单体单元在固相上合成并且可以是相同或不同的，甚至更优选地，单体单元在用于根据第一方面的方法前从固相上裂解下来。对于本领域技术人员，多核苷酸和多肽的合成是公知的。肽和它们的盐和衍生物的合成，包括固相和溶液相肽合成是充分建立的。见，例如Stewart，等(1984)SolidPhasePeptideSynthesis(2ndEd.)(固相肽合成(第2版))；和Chan(2000)"FMOCSolidPhasePeptideSynthesis,APracticalApproach,(FMOC固相肽合成，实用方法)，，OxfordUniversityPress(牛津大学出版社)。肽可以使用自动肽合成仪(例如，PioneerTM肽合成仪，应用生物系统(AppliedBiosystems),福斯特城，加利福尼亚)进行合成。例如，肽可以使用FMOC固相肽合成在Rink酰胺树脂上进行制备并且随后进行三氟乙酸(95%)去保护并从树脂上裂解下来。容易理解的是当捕获试剂包含肽多聚体时，所述第一肽和第二肽可以具有相同或不同的一级氨基酸序列。另外显而易见的是第一肽和第二肽可以从第一和第二氨基酸组进行合成并且每个氨基酸组可以是相同的或不同的。优选地，第一肽和第二肽为2-100个氨基酸长度，更优选地为2-50个氨基酸长度，最优选地长度为5-25个氨基酸长度。优选地，形成配体结合部分的每个氨基酸选自基本由少于20个氨基酸，更优选地少于12个氨基酸，甚至更优选地少于6个氨基酸和最优选地4个氨基酸组成的组。要理解的是，在所述组中的每个氨基酸可以是L-氨基酸，D-氨基酸，氨基酸模拟物，间隔氨基酸，3氨基酸或任何其他手性氨基酸单体。优选地，所述氨基酸是L-氨基酸和/或D-氨基酸。优选地，在所述组中的每个氨基酸基本上是对映体纯的。优选地，用于本发明的方法中的第一肽和第二肽分别包含10个或更少的配体结合残基，更优选地，8个或更少，更优选地，6个或更少，甚至更优选地4或更少，和最优选地3个或更少的配体结合残基。在优选的实施方案中，反应基可以在肽合成的过程中被保护并且在用于生产根据第一方面的捕获试剂前进行去保护。所述技术对于本领域技术人员是公知的，例如标准基于FMOC的固相肽组装。在该技术中，产生具有被保护的侧链和游离氨基末端的树脂结合肽。接着，N端氨基基团可以与任何相容的羧酸反应基缀合物在标准的肽合成条件下反应。例如，可以结合具有三苯甲基或甲氧基三苯甲基保护的硫羟基的半胱氨酸。用三氟乙酸进行的去保护在溶液中产生未受保护的肽。优选地，用于本发明的任何实施方案的所述反应基选自，但不限于，硫羟基，马来酰亚胺，环戊二烯，叠氮化物，膦硫酯(phosphinothioesters)，硫酯和(硝基)硫代吡啶基活化的硫羟基。更优选地，反应基是硫羟基。优选地，当所述反应基是硫羟基时，至少一个硫羟基是活化的硫羟基。优选地，所述硫羟基用硫代硝基吡啶基或硫代吡啶基活化。在图4中概括的反应路线显示产生包括各种反应基的肽的可能的路线。要理解的是，可以将任何适合的反应用在本发明的方法中以形成多聚体捕获试剂，例如在环戊二烯基官能化的肽和马来酰亚胺官能化的肽之间的第尔斯阿尔德反应，在硫羟基官能化的肽和马来酰亚胺官能化的肽之间官能化的肽和包含活化的硫羟基(用例如(硝基)硫代吡啶部分活化)的肽之间形成二硫键的反应，在叠氮化物官能化的肽和硫酯官能化的肽之间的斯托丁格连接，和在硫酯和N端半胱氨酸之间的天然化学连接。显而易见的是，根据在肽中存在的氨基酸残基，捕获试剂具有不同的特征。例如，侧链可以为配体结合提供正电荷。优选地，正电荷由赖氨酰残基(在肽链和正电荷之间的四个CH2基团)，鸟氨酰残基(在肽链和正电荷之间的三个CH2基团)或最优选地二氨基丁酰残基(在肽链和正电荷之间的两个CH2基团)提供。氨基酸可以备选地提供羟基基团，其能够充当配体结合的氢键供体和/或受体。优选地，羟基基团由丝氨酰残基(在肽链和OH基团之间的一个CH2基团)，或更优选地高丝氨酰残基(在肽链和OH基团之间的两个CH2基团)提供。氨基酸可以为配体结合提供疏水部分。优选地，丙氨酰残基(在肽链和甲基基团之间没有CH2基团)或更优选地，氨基丁酰残基(在肽链和甲基之间具有一个CH2基团)提供疏水部分。备选地，氨基酸可以为配体结合提供负电荷。优选地，负电荷由谷氨酰残基(在肽链和羧酸根基团之间存在两个CH2基团)，或更优选地，天冬氨酰残基(在肽链和羧酸根基团之间存在一个CH2基团)提供。优选地，肽由氨基酸组以组合方式产生，如本领域所公知，从而可以在所述组中产生存在的氨基酸的所有可能组合，例如，如果在所述组中存在N氨基酸并且所述肽的长度是L，那么完整的组包含NL个肽。在优选的实施方案中，使用可以从任何给定的氨基酸组中产生的可能的组合肽的子集。所述子集可以通过在肽的合成中包含具体的规则进行确定，例如可以提供在所述组中每个氨基酸的最大和最小水平，或可以提供结合的百分比疏水氨基酸的最大和最小水平。本发明的方法导致产生具有增加的多样性的捕获试剂。这来自这样的事实，即通过所述方法产生的组合制备的捕获试剂是多聚体。例如，如果多聚体捕获试剂是二聚体，由于两条肽链的存在，对于任何给定长度的配体结合部分的可能的多样性被平方。因此，进行减少数量的起始合成是必要的。在优选的实施方案中，肽被固定从而将侧链以对于配体结合有利的方式位于空间中。当所述捕获试剂通过共价相互作用被固定时，这可以通过例如合成具有交替的L-和D-氨基酸的肽实现，如在图5中所显示。备选地，所述肽可以使用包含P氨基酸的组进行合成，如在图6中显示，或可以使用任何其他手性氨基酸单体进行合成，其中每个肽重复单元具有相等数目的原子。在一个优选的实施方案中，所述肽是合成的从而使在配体结合区仅每隔一个氨基酸改变，如在图7中显示。该实施方案的有利之处在于侧链以对于配体结合最天然和有利的方式配置。对于本领域技术人员显而易见的是，每个肽可以包含一个或多个上述类型的氨基酸并且所用的具体组合影响包含不同的肽链的捕获试剂的特征。当捕获试剂固定在基底是通过共价连接进行时，捕获试剂可以排列在基底上，并且所述阵列可以采取任何方便的形式。因此，本发明的方法可应用于所有类型的"高密度"阵列，包括单分子阵列。优选地,通过第一方面的方法产生的共价固定的捕获试剂在空间上不连续的位于阵列上的编码位置上。优选地，在阵列的给定位置的所有的所述捕获试剂包含相同的肽对。更优选地，在阵列上的每个位置包含不同的捕获试剂。当指将分子(例如肽)固定于基底上时，将术语"固定"和"连接"在本文交替使用并且在该实施方案中，两个术语倾向于直接或间接涵盖共价连接，除非另外清楚地或通过上下文指出。本发明的某些实施方案可以使用包含惰性基底或基质(例如载玻片，聚合物珠等)的基底，其已经被"官能化"，例如通过应用包含反应基的中间体物质的层或涂层，所述反应基容许共价连接于生物分子如肽上。这些支持物的实例包括，但不限于，支持在惰性基底如玻璃上的聚丙烯酰胺水凝胶。在这些实施方案中，所述生物分子(例如肽)可以直接共价连接于中间体物质(例如水凝胶)，但是所述中间体物质其本身可以非共价连接于基底或基质(例如，玻璃基底)。因此，术语"共价连接于基底"被相应解释为包括这种类型的排列。在多个肽阵列中，在阵列上的独立区域包括多个肽分子。优选地，在阵列上的每个位点包括一个单独的肽二聚体的多个拷贝。对于将捕获试剂共价连接于基底的优选的反应路线包括，但不限于，在巯基和马来酰亚胺衍生的表面之间的反应，在马来酰亚胺衍生的表面和二烯官能化捕获试剂之间的第尔斯-阿尔德反应，叠氮化物和乙炔3+2环加成，噻唑烷环形成，和修饰的斯托丁格连接。备选地，可以以反转方式实现捕获试剂与基底的共价连接，例如通过在硫羟基衍生化的表面和马来酰亚胺取代的肽之间的反应。在特别优选的实施方案中，将在硫酯-衍生化的捕获试剂和半胱氨酸衍生化的表面之间存在于氨基和半胱氨酸巯基之间的天然化学连接用于将捕获试剂共价连接于基底。最优选的反应路线使用在具有N-端半胱氨酸的捕获试剂和硫酯衍生的表面之间的天然化学连接，如在图8中所显示。天然化学连接产生在肽的N-端半胱氨酸和表面连接的硫酯之间的肽键。本发明的该实施方案的特别的优势是不需要肽侧链的保护。本发明的该实施方案的另外的特别的优势是得到的表面连接肽具有内部半胱氨酸，其被研究用于通过二硫键形成，或在硫羟基和马来酰亚胺官能化的肽之间的反应形成二聚体受体。用于制备硫酯官能化玻璃表面的优选的反应路线显示在图9中。如果将捕获试剂组装在基底表面，优选的反应路线显示在图10中。在该实施方案中，第一肽通过在硫酯基团和N端半胱氨酸残基通过天然化学连接的反应共价结合于官能化的基底。通过在肽之间形成二硫键产生多聚体捕获试剂。用于制备硫酯表面的更优选的路线包括在胺化的表面和下面所显示类型的thiolane2,4-二酮之间的反应<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>硫酯表面还可以通过用下面显示类型的硫酯甲硅烷基氯缀合物衍生化羟基化表面而制备。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>当通过共价键将捕获试剂固定在基底时，可以构建二聚体，其中第一肽和第二肽分别具有硫羟基团(其可以被活化或可以不被活化)，其位于肽序列中这样的位点上，所述位点在配体结合位点的N端侧，或在配体结合位点的C端侧或位于由两部分构成的配体结合位点内部。在这些实施方案的任一个中，清楚的是所述硫羟基团部分可以具有与配体结合残基相同或相反的定向，并且在第一肽和第二肽中的每个硫羟基团的定位是独立的。在备选的实施方案中，所述捕获试剂通过捕获试剂和基底之间的疏水相互作用被固定在基底上。在该实施方案中，根据本发明的方法制备的捕获试剂包括至少两个单体单元，所述第一和第二单体单元分别包含至少一个疏水部分，至少一个反应基和至少一个配体结合部分。优选地，根据所述方法制备的捕获试剂包括至少两个肽，所述第一肽和第二肽分别包含至少一个疏水氨基酸残基，至少一个反应基，和至少一个配体结合部分，其中所述至少一个疏水氨基酸残基和至少一个配体结合部分位于肽一级结构中从而导致得到疏水面，和基本上非疏水的配体结合面。要理解的是，在本发明方法的该实施方案中，肽的疏水面形成连接部分。优选地，每个肽包含形成连接部分的多种疏水氨基酸。优选地，用于本发明方法的第一肽包含4-40个疏水氨基酸残基，更优选地6-25个和最优选地6-12个疏水氨基酸残基。优选地，配体结合部分包含至少一个氨基酸。更优选地，配体结合部分包含多种氨基酸。要理解的是，位于配体结合面上的氨基酸还可以包括疏水残基，例如,氨基丁酸酯残基。优选地，用于该实施方案的每个肽包含含有交替的疏水和非疏水氨基酸残基的一级结构，如在图11中所显示。本领域技术人员将理解的是可以容易地设计导致侧链分布从而产生疏水和基本非疏水面的其它的肽序列，例如在疏水残基之间可能存在三种非疏水氨基酸残基或奇数氨基酸的任何组合。备选地，所述肽可以包含例如L-，D-，和3氨基酸的组合从而导致疏水和基本非疏水面。优选地，被定位从而位于配体结合面上的每个氨基酸选自基本由下列各项组成的组少于20个氨基酸，更优选地少于12个氨基酸，甚至更优选地少于6个氨基酸和最优选地4个氨基酸。优选地，用于该实施方案的每个肽包含10%-90%的疏水氨基酸残基，更优选地，20%-80%,甚至更优选地，30%-70%,和最优选地40%-60%的疏水氨基酸残基。在特别优选的实施方案中，所述第一肽包含50%疏水氨基酸残基。优选地，疏水氨基酸选自由下列各项组成的组亮氨酸，异亮氨酸，正亮氨酸，缬氨酸，正缬氨酸，甲硫氨酸，酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸。更优选地，疏水氨基酸是苯丙氨酸。在一个优选的实施方案中，所述捕获试剂位于疏水基底上从而使得基本非疏水配体结合面易于配体结合。要理解的是，用在所述方法中的基底可以是任何适合的疏水基底，例如通过疏水有机硫醇处理修饰的金，通过表面处理修饰的玻璃，或塑料。.优选地，所述基底是塑料。备选地，所述基底可以在疏水化合物中涂布，其容许捕获试剂在基本水性溶剂的存在下固定在其上。在优选的实施方案中，用于本发明的该实施方案中的第二肽包含比第一肽更少的氨基酸，并且包含更少的疏水残基从而使肽和疏水面之间的相互作用相对更弱。对于本领域技术人员显而易见的是，第一肽和第二肽的长度以及被需要将它们保留在基底上的疏水氨基酸残基的数目将取决于表面的疏水性和在第一肽和第二肽中存在的疏水氨基酸，另外取决于结合的配体的性质。本领域技术人员还容易显而易见的是在基底保持的肽的量取决于对基底进行洗涤的严格性。优选地，在固定肽后，基底用例如在10mMtris-HCl(pH8.0)中的1.0MNaCl进行洗涤。优选地，第二肽在疏水面上包含1-6个疏水氨基酸残基，更优选地,2-5个,和最优选地2-4个疏水氨基酸残基。优选地，配体结合残基位于基本非疏水配体结合面上。当通过疏水相互作用将捕获试剂固定在基底上时，可以将反应基置于在第一肽和第二肽的一级肽结构的任意适合位置，例如可以将反应基位于一级肽序列中从而使它们位于肽的基本非疏水配体结合面并且位于配体结合位点的N端侧上。备选地，所述反应基可以位于第一肽和第二肽的一级肽结构中从而使它们位于肽的基本非疏水配体结合面上，并且在第一肽中，位于配体结合位点的N端侧上，和在第二肽中，在配体结合位点的C端侧。在另一个实施方案中，反应基可以位于第一肽和第二肽的一级肽结构中从而使在第一肽中，其位于肽的基本非疏水配体结合面上并在配体结合位点的N-端侧，并且在第二肽中，其位于配体结合位点相对(疏水)面并且在配体结合位点的C端侧。在优选的实施方案中，在第一肽上的反应基位于在基本非疏水配体结合面的一级氨基酸结构中，并且位于配体结合位点的N-端侧，并且在第二肽中，在疏水面中并且在配体结合位点的N-端侧，如在图10中所显示。优选地，在该实施方案中，捕获试剂结合于基底从而产生阵列。要理解的是所述阵列可以采取任何方便的形式。因此，本发明的方法可应用于所有类型的"高密度"阵列，包括单分子阵列。优选地，所述阵列包含许多不连续的可寻址空间编码位置。优选地,在阵列上的每个位置包含不同的捕获试剂，和更优选地，每个位置包含多个拷贝的捕获试剂。当提及将分子(例如肽)固定于基底上时，将术语"固定"和"连接"在本文交替使用并且两个术语倾向于包括疏水相互作用，除非另外清楚地或通过上下文指出。通常，所需要的是分子(例如，肽)在这样的条件下保持固定或连接于基底，在所述条件中倾向于使用所述基底，例如在需要肽配体结合的应用中。本发明的某些实施方案可以应用包含惰性基底或基质(例如玻璃载玻片，聚合物珠等)的固体支持物，其已经被官能化，例如通过应用包含反应基的中间体物质的层或涂层，其容许生物分子如肽的疏水连接。在多个肽阵列中，在所述阵列上的独立区域包含多个肽分子。优选地，在所述阵列上的每个位点包含一个单独的肽的多个拷贝。在特别优选的实施方案中，所述第一肽具有在SEQIDNol中提出的结构；(Phe-Gly)n-Phe-Cys-Phe-X-Phe-Y-Phe画Z-Phe-Gly-Phe其中X，Y，和Z是配体结合残基并且Cys提供用于二聚体形成的亲核硫羟基。所述第二肽具有在SEQIDNo2中提出的优选结构；CysS(N)P-X，-Phe-Y，-Phe陽Z，-Phe其中X',Y',和Z'是配体结合残基并且CysS(N)P是用于二聚体形成的活化的硫羟基(最优选地用硫代硝基吡啶基团或硫代吡啶基团活化)。要理解的是采用前述优选实施方案仅是举例而不是限制。对于本领域技术人员显而易见的是可以将许多其它反应基和活化基团用于本发明的方法中。在最优选的实施方案中，根据本发明的方法制备的捕获试剂被分配在适合的基底上以形成在组合上多样的二聚体的可寻址的空间编码阵列。优选地，使用非接触的分配器(PiezorraySystem,PerkinElmerLAS)将所述肽单独分配在基底上并原位组装。根据本发明的第二方面，提供根据本发明的第一方面的方法制备的捕根据本发明的第三方面，提供在其上固定至少一种根据第一方面的方法制备的捕获试剂的基底。优选地，捕获试剂通过共价或疏水相互作用固定。本发明还提供包含根据本发明的方法制备的多聚体捕获试剂和用于固定的适合的基底的试剂盒。备选地，所述试剂盒可以包含被产生用于本发明方法的第一和第二单体单元。优选地，所述试剂盒还包含适合的基底。根据本发明，还提供鉴定结合目标配体的根据本发明的方法制备的多聚体捕获试剂的方法，所述方法包括产生根据任何前述方面的组合捕获试剂的阵列，使目的配体与阵列接触，和鉴定配体结合的捕获试剂。当在任何实施方案中提及配体与固定的肽的结合时，术语结合倾向于包括直接或间接，共价或非共价连接，除非另外清楚地或通过上下文指出。在本发明的某些实施方案中，可以优选共价连接，但是通常所需要的是在这样的条件下配体仍然结合于固定的肽，在所述条件中倾向于使用基底，例如在需要另外的配体受体相互作用的应用中。对于本领域技术人员而言显而易见的是可以以本领域已知的多种方式鉴定配体与捕获试剂的结合，例如，配体或捕获试剂可以被标记从而可以鉴定配体结合于所述阵列的位置。该标记可以是，例如放射性或使用例如荧光团的荧光标记。备选地，目的配体与捕获试剂的结合可以通过本领域已知的多种其它技术进行检测，所述技术例如，量热法，吸收光谱法，NMR法，原子力显微镜和扫描隧道显微镜，电泳或色谱法，质谱法，毛细管电泳，表面等离子体共振检测，表面声波传感和许多基于微支架(microcantilever)的方法。要理解的是，可以将通过本发明方法生产的多聚体捕获试剂和多聚体捕获试剂阵列用于鉴定任何选择的分析物，因为将由捕获试剂结合的具体的配体将取决于形成捕获试剂的肽的长度和序列。在优选的实施方案中，所述配体包括真核细胞，原核细胞，病毒，噬菌体，朊病毒，孢子，花粉粒，变应原，核酸，蛋白质，肽，碳水化合物，脂质，有机化合物或无机化合物。所述配体优选地是生理或药理学代谢物，并且最优选地是在人或动物体液中的生理或药理代谢物，其可以用作诊断或预后的医疗保健标记。本发明的另外的目标，特点和重点将通过下面的说明书变得清楚。此外，本发明的优势将参考附图从下面的解释中变得显而易见。附图简述参考下列实验例和附图将进一步理解本发明，其中图1显示制备根据本发明的捕获试剂的第一种方法的图解表示。图2显示制备根据本发明的捕获试剂的第二种方法的图解表示。图3显示制备根据本发明的捕获试剂的另外的方法的图解表示。图4显示用于产生包含各种反应基的肽的可能的路径。图5显示包含交替的L-和D-氨基酸的肽。图6显示包含P氨基酸的肽。图7显示其中每隔一个氨基酸被改变的肽。图8图解显示在具有N端半胱氨酸的捕获试剂和硫酯衍生的表面之间的天然化学连接的方法。图9显示用于制备硫酯官能化玻璃的优选的反应路线。图10显示用于在基底表面制备二聚体捕获试剂的优选的反应路线。图11显示包含交替的疏水和非疏水氨基酸的肽。图12显示具有疏水面和基本非疏水配体结合面的二聚体捕获试剂的实例。图13是显示各种疏水捕获试剂在96孔板的定位的图解表示。图14显示指示各种肽在孔中的存在的图11的96孔板的荧光图像。图15显示图14的400V扫描的量化结果的图解表示。图16A显示指示多肽Pl-l到P1-5和P2-1到P2-2在聚丙烯表面上的保留的荧光图像。图16B显示指示多肽Pl-l到Pl-5和P2-l到P2-2在聚丙烯表面上的保留的荧光图像。图17显示图16A，B的量化结果的图解表示。图18显示指示在聚丙烯疏水表面上沉积的肽2DOS-2的pH抗性的荧光图像。图19显示图18的300V扫描的量化结果的图解表示。图20显示指示在水性缓冲液存在下，在聚丙烯疏水表面上沉积的肽2DOS-2的时间依赖性持续性的荧光图像。图21显示图20的300V扫描的结果的图解表示。图22是显示被加入平底和V底聚丙烯96孔板的各种疏水肽的位置的图解表示。图23显示图22的板的荧光图像，其显示在洗涤和未洗涤时疏水肽的保留。图24是对于V底板的图23的500V扫描的结果的图解表示。图25是对于平底板的图23的500V扫描的结果的图解表示。图26是显示被加入聚丙烯和聚苯乙烯V底96孔板的各种疏水肽的定位的图解表示。图27显示图26的板的荧光图像，其显示在洗涤和未洗涤时疏水肽的保留。图28是图解表示，其显示在洗涤后，在图26的聚丙烯和聚苯乙烯板中的各种肽的百分比保留。图29A显示来自使用'液相方法'的实验的微量滴定板的荧光图像。图29B是来自在表21中显示的荧光图像的数据的图解表示。图30A显示来自使用'共干燥'方法的实验的微量滴定板的荧光图像。图30B是来自在表22中显示的荧光图像的数据的图解表示。图31显示指示在聚丙烯板上产生二聚体形成的荧光图像。图32显示肽二聚体的256元件的微阵列的荧光图像。实施本发明的最佳方式用于本文时，术语间隔氨基酸指氨基酸，合成氨基酸，氨基酸类似物或氨基酸模拟物，其中侧链在配体结合中没有作用。用于本文时，术语捕获试剂指具有这样的结构的多聚体分子从而使当配体与捕获试剂接触时，其结合于捕获试剂。用于本文时，术语肽指包含两个或更多氨基酸残基，合成氨基酸，氨基酸类似物或氨基酸模拟物，或其任何组合的链。术语肽，寡肽和多肽在说明书中交替使用。用于本文时，术语寡核苷酸和多核苷酸指在该说明书中交互使用的两个或多个核苷酸的链。用于本文时，术语基本对映体纯的指残基包含基本上一种类型的异构体，其中任何其它异构体形式仅作为杂质存在。用于本文时，术语以有利于配体结合的方式定位于空间中指组成多聚体捕获试剂的肽的侧链这样定位从而使它们能够接触并与配体相互作用。用于本文时，术语基本非疏水意为包含的亲水性残基基本上比疏水残基更多。实施例1图1显示根据本发明生产捕获试剂的方法的图解表示。在固相上制备第一组单体单元(A)。所述单体单元包括配体结合部分(Rl-R4)和反应基X。如果需要，X可以在合成过程中被保护，接着在使用前去保护。第二组单体单元(B)在固相上制备。这些单体单元包括配体结合部分(R'l-R'4),和反应基Y,其可以在合成过程中被保护，接着在使用前去保护，和连接部分Z。如果需要，Z也可以在合成过程中被保护，并接着在使用前去保护。在组(A)中的每个单体单元被从固体支持物上裂解下来以在溶液中得到单体单元(C)。在组(B)中的每个单体单元从固体支持物上被裂解下来以在溶液中得到单体单元(D)。接着，在组D中的每个单体单元与固体支持物(E)的表面在阵列中空间编码的位置接触，从而使Z被用于与所述表面连接。接着进行反应，其中来自组D的表面结合的单体单元(F)与过量或等摩尔量的给定溶液相单体单元(C)反应从而使残基X与残基Y反应以形成与固相结合的二聚体结构(G)。接着，可以将排列的和空间编码的二聚体结构(G)用于结合将以适合的亲和性和选择性结合的目的配体。图2显示根据本发明生产捕获试剂的另外的方法的图解表示。在该实施方案中，在固相上制备第一组单体单元(A)。所述单体单元包含配体结合部分(Rl-R4)和反应基X，其可以在合成过程中被保护，接着在使用前去保护。还在固相上制备第二组单体单元(B)。这些单体单元包含配体结合部分(R'l-R'4)和反应基Y,其可以在合成过程中被保护，接着在使用前去保护,和连接部分Z。如果需要，Z也可以在合成过程中被j呆护并接着在使用前去保护。每个单体单元(B)从固体支持物上裂解下来以在溶液中得到单体单元(C)。接着进行反应，其中来自组(A)的给定的固相结合单体单元与过量的给定的溶液相单体单元(C)反应从而使残基X与残基Y反应以形成与固相结合的二聚体结构(D)。接着将结合于固相的每个二聚体结构(D)从固体支持物上裂解下来以得到溶液相二聚体结构(E)。最终每个溶液相二聚体结构(E)与固体表面(F)在阵列中空间编码的位置接触，从而使组Z被用于将二聚体结构连接于所述表面。接着，可以将排列的和空间编码的二聚体结构(G)用于结合将以适合的亲和性和选择性结合的目标配体。X,Y，和Z在图中的位置仅是举例说明的并且应该不被视为对本发明的限制。图3显示根据第三个方面生产捕获试剂的另外的方法的图解表示。在固相上制备第一组单体单元(A)。所述单体单元包含配体结合部分(Rl-R4)和反应基X。如果需要，X可以在合成过程中被保护，并接着在使用前去保护。第二组单体单元(B)在固相上制备。这些单体单元包含配体结合部分(R'l-R'4)，反应基Y，其可以在合成过程中被保护，接着在使用前去保护,和连接部分Z。如果需要，Z也可以在合成过程中被保护并接着在使用前去保护。在组(A)中的每个单体单元从固体支持物上裂解下来，以在溶液中得到单体单元(C)。在组(B)中的每个单体单元从固体支持物上裂解下来以在溶液中得到单体单元(D)。接着，将在组D中的每个单体单元与过量或等摩尔量的给定的溶液相单体单元(C)和固体支持物(E)的表面在阵列中空间编码的位置接触从而可以将Z用于连接到所述表面并且使残基X与残基Y反应从而形成与固相结合的二聚体结构(G)。可以接着将排列的和空间编码的二聚体结构(G)用于结合以适合的亲和性和选择性结合的目标配体。本发明最显著的优势是通过在阵列表面组合连接成对(或更多的数量的)单体单元来使序列多样性'平方'(或升高到更高的幂)。实施例2合成下面系列的肽从而示范将肽自我装配为有机溶剂层或装配在疏水表面上，所述自我装配是通过与所述有机溶剂层或疏水表面接触的水性溶剂中的熵效应驱动的。所有的肽用罗丹明染料TAMRA在N端标记。将5-TAMRA和6-TAMRA异构体的混合物用于标记。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在下述中，在纸平面前突出的残基侧链表示组合变化的'配体结合面，。在纸平面后突出的残基侧链表示'疏水面'(或阴性对照残基)。在肽2DOS-l到2DOS-8组中，已经使用了四种侧链(天冬氨酰，丙氨酰，丝氨酰，和赖氨酰)的混合物。在肽2DOS-9到2DOS-16的组中，已经使用了四条亲水性(天冬氨酰)链。在肽2DOS-l到2DOS-4的组和肽2DOS-9到2DOS-12的组中，已经将五种残基侧链用于'疏水面'(或阴性对照残基)。在肽2DOS-5到2DOS-8的组和肽2DOS-13到2DOS-16的组中，已经将三种残基侧链用于'疏水面，(或阴性对照残基)。对于肽2DOS-l，2DOS-5，2DOS-9，和2DOS-13,已经将正亮氨酰残基用于'疏水面，。对于肽2DOS-2，2DOS-6,2DOS-10,和2DOS-14，己经将苯丙氨酰残基用于'疏水面'。对于肽2DOS-3,2DOS-7，2DOS-ll,和2DOS-15,将丝氨酰残基用作'疏水面，的弱阴性对照。对于肽2DOS-4,2DOS-8，2DOS-12,和2DOS-16，已经将天冬氨酰残基用作'疏水面，的强阴性对照。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>使用标准的FMOC化学方法(奥塔生物科学(AltaBioscience))以2limol等级合成肽并且在50%(v/v)的水性乙腈中溶解到10pM。接着研究肽2DOS-l到2DOS-16在疏水表面上的保留(聚丙烯微量滴定板的孔)。将在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)用作肽和TAMRA的溶剂。将100pl等分试样的10pM肽2DOS-l到2DOS-16和10pMTAMRA置于Costar微量滴定板的孔中，如在图13中所显示将微量滴定板在200pm的解析度在TyphoonTrioPlus可变模式图像仪(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))上成像，所述图像仪具有绿色(532nm)激光和580BP30滤光器，成像在下面所指出的PMT电压和普通的灵敏性上进行。将扫描高度设定在+3mm并且在扫描过程中挤压样口叩o使肽在黑暗中过夜蒸发到干燥并再次将微量滴定板如上所述进行扫描。接着，用250pi的水将孔洗涤10次。最终，将残余的表面结合的肽重新悬浮在50。/。(v/v)水性乙腈中的100^的10mMtris-HCl(pH8.0)中并再次如上所述扫描微量滴定板。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))分析荧光图像。在实验的三个阶段，在600V，500V，400V,和300V的PMT电压扫描微量滴定板的荧光图像显示在图14中。将定量的数据(使用来自400V扫描的数据)在表2中给出并且在图15中图解显示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>在使用前，将聚丙烯板用50%(>/力的水性乙腈擦拭。使用Piezorray系统(PerkinElmer(铂尔金爱尔默)LAS)将8x重复的20nl体积的在二甲亚砜(DMSO)中的1,肽Pl-l到Pl画5和P2-l到P2隱2和TAMRA以1mm间隔分散在3"xl"xlmm聚丙烯板中。使用'附带槽(sideshoot)，选项将500滴预先分配并将调谐设定在72V30ps。将玻片在TyphoonTrioPlus可变模式图像仪(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))上以10pm解析度成像，其具有绿色(532nm)激光和580BP30滤光器，在600V的PMT电压和普通灵敏性上进行。在压盘(platen)中设定扫描高度并且在扫描过程中挤压样品。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))分析荧光图像。接着，将玻片的下半部分(包含测试阵列)在包含10mMtris-HCl(pH8.0)的100ml1MNaCl中洗涤1分钟，并如上所述进行再次扫描。接着，将玻片的相同的半部分在包含lOmMtris-HCl(pH8.0)的100ml的1MNaCl中洗漆第二次达30分钟并如上所述再次扫描。接着，将玻片的相同的半部分在100ml水中洗涤第三次达30分钟并如上所述再次扫描。将对于各种测定的荧光图像显示在图16A,B中。将在图16A,B中显示的各种排列的肽的荧光值显示在下面的表4-6中在第一次洗涤后表4a对照阵列，肽平均荧光校正的信号244,263,013..97,571,3"1200,280,129.53,588,457Pl-3192,743,46946,051,796Pl-4187,287,63040,595,958Pl-5199,347,48352,655,810平均玻片背景=146,69i,673,29表4b<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>第二次洗涤后:表5a<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表5b<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>在第三次洗涤后:表.<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表6b<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>这些结果在图17中图解显示。这些图清楚地显示对于肽增加的保留的梯度与增加的肽链长度相关。如可以清楚地观察到，具有19个氨基酸的链长度的肽Pl-5具有最高的保留。实施例3研究在聚丙烯疏水表面上沉积的肽2DOS-2(见上)的pH抗性将12个50pi的在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8,0)中的肽2DOS-2的等分试样在Costar微量滴定板的孔中干燥。使肽样品在黑暗中容许蒸发到干燥。根据在表3中显示的路线，将在最前面11个孔中的干燥的肽样品在室温用200pl的100mM磷酸缓冲液一起温育30分钟表7孔下列nl数的100mMNaH2PO4下列Hi数的100mMNa2HPO—4观察到的pH11,00004.51'2900謂5.653BOO2006.024700300'6.255600彻6.4765005006.627權6006."83007006-9892008007.181010D900'7..471101,0008.52移去全部上清液，并将所有12个孔中的残留表面结合肽最终重新悬浮在50^的在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)中并且在TyphoonTrioPlus可变模式图像仪(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))上以200解析度使微量滴定板成像，所述图像仪具有绿色(532nm)激光和580BP30滤光片，所述成像在下面指出的PMT电压和普通的灵敏性进行。将扫描高度设定在+3mm并且在扫描过程中挤压样叩o使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))分析荧光图像。在图19中显示这样的荧光图像，其中显示在聚丙烯上沉积的2DOS-2的pH抗性在表8中给出肽2DOS-2保留的量化数据(使用来自300V扫描的数据)并且在图19中图解地显示孔洗涤pH未处理的荧光保留的荧光.保留百分比14.51815,706681,01525-65815,706■582,482-7136.02815,706548,329674S.25815,706542,5956756.47815,706589,5287266.62815,706566,4966976.79815,706576,6557186.9881.5,706570,653'70.7.18815,706586,08372107.,7'815,70661"02875118，52'815,706661,781.81所述结果显示肽2DOS-2在聚丙烯表面上的保留因此在宽泛范围的PH值上是稳定的，其中最大保留在低和高的pH上并且最小保留在约pH6.5。实施例4研究在存在水性缓冲液时，沉积在聚丙烯疏水表面上的肽2DOS-2(见上)的时间依赖性的持续性，如下面所显示将12个100pl的在75%(v/v)的水性乙腈中的5mMtris-HCl(pH8.0)中的5肽2DOS-2的等分试样分配在Costar微量滴定板的顶排的孔中使肽样品在黑暗中蒸发到干燥。将在孔1-10中的干燥的肽样品与250pl的在10niMtris-HCl(pH8.0)中的1MNaCl在室温一起温育，温育的时间如下面所指示。温育后，将全部上清液上下吸移8次，接着移去上清液，并将其置于微量滴定板的底排的孔中。最终，将在全部12个孔中的残余表面结合的肽重新悬浮在50pi的在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)中并在TyphoonTrioPlus可变模式图像仪(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))上以200拜的解析度使微量滴定板成像，所述图像仪具有绿色(S32nm)激光和580BP30滤光片，所述成像在下面指出的PMT电压和普通的灵敏性进行。将扫33描高度设定在+3mm，并且在扫描过程中挤压样品。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))分析荧光图像。在图20中显示在存在水性缓冲液时，在聚丙烯疏水表面上沉积的肽2DOS-2的时间依赖性持续性的荧光数据在表9和图21中显示对于肽2DOS-2保留的量化数据(使用来自300V扫描的数据)表9<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>所述结果显示在延长的时间阶段，在1MNaCl/10mMtris-HCl(pH8.0)中，肽2DOS-2在疏水聚丙烯表面上的保留是稳定的。实施例5研究了肽2DOS-l到2DOS-16(见上)在不同几何形状的聚丙烯孔上的保留将在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)用作肽和TAMRA的溶剂。按照如在图22中所显示的下述路线，将1^等分试样的10肽2DOS-l到2DOS-16和10TAMRA移到CostarV底聚丙烯微量滴定板和Greiner平底聚丙烯微量滴定板的孔中使肽样品在黑暗中蒸发到干燥。接着在室温，在250pl的在10mMtris-HCl(pH8.0)中的1MNaCl中将微量滴定板的顶部两排中的肽样品温育15分钟。温育后，在去除上清液前，将洗涤缓冲液在孔中上下吸移8次。接着，将洗涤的和未处理的肽样品在50的在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)中重新悬浮。将微量滴定板在TyphoonTrioPlus可变模式图像仪(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))上，以200(im解析度成像，所述图像仪具有绿色(532nm)激光和580BP30滤光片，成像在下面指出的PMT电压上和普通灵敏性上进行。在压板设定扫描高度并且在扫描过程中挤压样品。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))分析荧光图像。将在600V和500V的PMT电压扫描的板的荧光图像显示在图23中。将对于V底孔的量化数据(使用来自500V扫描的数据)显示在表10和图24中。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>17,471,866998,3206将对于平底孔的量化数据(使用来自500V扫描的数据)显示在表ll35和图25中。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>所述结果显示肽2DOS-l5U2DOS-16在不同几何形状的聚丙烯孔上的保留是相当的，说明保留并不依赖具有V底几何形状的孔中的干燥。实施例6比较肽2DOS-l到2DOS-16(见上)在聚丙烯和聚苯乙烯表面上的保留将在75%(v/v)水性乙腈中的5mMtris-HCl(pH8.0)用作肽和TAMRA的溶剂。按照图26中显示的路线，将20^等分试样的5^iM肽2DOS-l到2DOS-16和5pMTAMRA吸移到CostarV底聚丙烯微量滴定板，GreinerV底聚丙烯微量滴定板和GreinerV底聚苯乙烯微量滴定板的孔中容许肽样品在黑暗中蒸发到干燥。接着，在室温将在微量滴定板的顶部两排中的肽样品在250^的在10mMtris-HCl(pH8.0)中的lMNaCl中温育15分钟。温育后，在去除上清中上下吸移8次。接着，将洗涤和未处理的肽样品重新悬浮在50)il的在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)中。在具有绿色(532nm)激光和580BP30滤光片的TyphoonTrioPlus可变模式图像仪(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))上，以200|im解析度，在下面指定的PMT电压和普通灵敏性上使微量滴定板成像。将扫描高度设定在+3mm并且在扫描过程中挤压样品。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))分析荧光图像。将在600V,500V,和400V的PMT电压扫描的玻片的荧光图像显示在图27中已经洗涤了板的上半部分的肽样品并且在板的下半部分的肽样品没有经过处理。将对于Costar聚丙烯V底孔的量化数据(使用来自400V扫描的数据)显示在表12中表12肽.未处理的荧光保留的荧光恢复百分比2DOS-16,458,3643,366,403'522DOS.-25,692,1345,349,601942DOS-3,5,660,618673,9401.2.2DOS-45,661,18174,1"12DOS".5,331,7631,651,850312DOS-65,733,0461,256,204'222DOS-75,139,578326,32862DOS-86,587,74193,4551.2DOS-97,102,2511,184,64817■2DOS-106,043,21/31,439,3752DOS-115,327,435102,04022DOS-124,432,09018,18002DOS-134,886,617387,73882DOS-.145,331,894595,959112DOS-156,488,13050,58412DOS-165,387,85016,194.0TAMRA11,786,211386,629.337将对于Greiner聚丙烯V底孔的量化数据(使用来自400V扫描的数据)显示在表13中表13<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>将对于Greiner聚苯乙烯V底孔(使用来自4Q0V扫描的数据)的量化数据显示在表14中表14<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>将这些数据图解显示在图28中该结果显示在所有的三种表面上观察到类似的肽表现，说明保留是肽的序列特异性性质而不是对于一种具体的塑料表面特有的性质。实施例7合成包含由7个苯丙氨酰残基组成的'表面-结合面，的四种肽。这些肽还包含由带电的和不带电的残基和可变的倒数第二个残基组成的中心区。所述可变的倒数第二个残基是丙氨酰，丝氨酰，半胱氨酰或硝基吡硫基(nitropyridylthio)活化的半胱氨酰。还合成另外的四种TAMRA-标记的荧光肽，其包含连接于甘氨酰残基的N端TAMRA荧光团，所述甘氨酰残基连接于可变的C端残基。可变的C端残基是丙氨酰，丝氨酰，半胱氨酰或硝基吡硫基活化的半胱氨酰。将显示在实施例1中的5-TAMRA和6-TAMRA异构体的混合物用于标记。将全部的8种肽的组显示于表15和16中表15<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表16<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>使用肽SB-l到SB-4和TLSP-1到TLSP-4以研究二聚体形成。使用两种不同的方法。在"液相，方法中，在聚丙烯表面上干燥SB肽。接着，在洗涤所述孔并分析保留的荧光物质之前在水溶液中加入TLSP肽。在'共干燥，方法中，将SB肽与TLSP肽混合并且接着在洗涤所述孔和分析保留的荧光物质前，将两者都在聚丙烯表面上进行干燥。本领域技术人员可以容易地实现另一种方法，其中将SB肽与TLSP肽在水溶液中混合并且使其反应以产生肽二聚体，接着将所述肽二聚体在聚丙烯表面上干燥。根据在表17中显示的方案，在'液相，方法中，将50^的在50%(v/v)水性乙腈中的1mMNaH2p04中的10|jM肽SB-l到SB-4加入CostarV底微量滴定板的孔中<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>将所述样品在黑暗中，在室温进行温育l小时。去除上清液并且将所述孔用200^的在10mMtris-HCl(pH8.0)中的1MNaCl洗涤2次。最终，将50jil的在50%(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)加入所述孔中。在具有绿色(532nm)激光和580BP30滤光片的TyphoonTrioPlus可变模式图像仪(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))上，以200解析度，在500V的PMT电压和普通灵敏性上使微量滴定板成像。将扫描高度设定在+3mm并且在扫描过程中挤压样品。使用ImageQuantTLv2003,03(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))分析荧光图像。根据在表19中显示的方案，在'共干燥'方法中，将50^的在50%(v/v)水性乙腈中的1mMNaH2P04中的10肽SB-l到SB-4加入CostarV底微量滴定板的孔中表19SB-lSB-2SB-3SB-4-——-——-SB-lSB-2SB-3SB-4————-—-—SB-lSB-2SB-3SB-4—-一—-一—一SB-lSB-2SB-3SB-4-———-一—-SB-lSB-2SB-3SB-4一———一一—-接着，根据在表20中显示的方案，将5(^1在50%(v/v)水性乙腈中的lmMNaH2P04中的lOOjiM肽TLSP-1到TLSP-4加入孔中表20TTjSP-1TLSP-1——-—-一-TliSP-2TXSP-2TIjSP-2TLSP-2TLSP-2———-—-—TLSP-3TLSP-3TIiSP-3TLSP-3TTjSP-3-—————TLSP-4TLSP-4TLSP-4TLSP-4TLSP-4——-一—————-j-—-———-—--————-一—-——-———--——-——--——-————————将样品在黑暗中干燥过夜。接着，将所述孔用200^的在10mMtris-HCl(pH8.0)中的1MNaCl洗涤2次。最终，将S0jil的在50。/。(v/v)水性乙腈中的10mMtris-HCl(pH8.0)加入孔中。在具有绿色(532nm)激光和580BP30滤光片的TyphoonTrioPlus可变模式图像仪(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))上，以200解析度，在500V的PMT电压和普通灵敏性上使微量滴定板成像。将扫描高度设定在+3mm并且在扫描过程中挤压样品。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))分析荧光图像。将来自使用'液相'方法的实验的微量滴定板的荧光图像显示在图29A43中。将'液相，方法的荧光数据在表21中给出:表21<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>将所述结果图解显示在图29B中将来自使用'共干燥，方法的实验的微量滴定板的荧光数据显示在图30A中。将'共干燥'方法的荧光数据在下面的表22中给出表22<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>将结果图解显示在图30B中通过荧光标记的肽的保留分析二聚体的产生，所述荧光标记的肽的保留受未标记的肽的存在调节，所述未标记的肽可以结合于聚丙烯表面和荧光标记的肽。与'共干燥方法'相比，对于'液相方法'，二聚体产率更低，但是对于二聚体形成的化学特异性更好。当表面肽具有游离硫羟基团并且溶解肽(solutionpeptide)具有S-硝基吡啶基活化的硫羟基时，观察到最大二聚体形成。当表面肽具有S-硝基吡啶基活化的硫羟基团并且所述溶解肽也具有S-硝基吡啶基活化的硫羟基团时；当表面肽具有游离硫羟基团并且溶解肽也具有游离硫羟基团时；并且当表面肽具有S-硝基吡啶基活化的硫羟基团并且溶解肽具有游离硫羟基团时，也观察到二聚体形成游离硫羟基与游离硫羟基的偶联可能是由于简单的需氧氧化，形成二硫键。S-硝基吡啶基活化的硫羟基与S-硝基吡啶基活化的硫羟基的偶联可能是由于不完全硫羟基活化的结果，使一些游离硫羟基能够与余下的s-硝基吡啶基活化的硫羟基反应，或由一些其它的机制引起。共干燥方法的结果与上述那些类似。用这种方法的二聚体产量通常更高，但是非特异性结合也更高。具体而言，在与表面连接的羟基化肽和包含游离硫羟基团和s-硝基吡啶基活化的硫羟基团的溶解肽之间观察到一些反应性。实施例8在该实施例中，使用压电阵列(Piezorray)(PerkinElmer(铂尔金爱尔默)LAS)非接触分配器在平面的塑料表面上制备肽二聚体。压电阵列(PerkinElmer(铂尔金爱尔默)LAS)进行了特殊的设计以将毫微升(nanolitre)体积吸移到密集阵列中。通过压电头(tip)控制液体体积。所述压电阵列系统包含源板固定器，超声波洗盆，计算机和监测器，和用于系统液体的瓶。聚丙烯板获自SBA塑料(http:〃www.sba.co.uk/,PropylexNatural聚丙烯板2440x1220x1mm)并且在使用前用50%(v/v)水性乙腈进行擦拭。根据表23中显示的方案，使用压电阵列系统将6个5nl的在50%(v/v)水性乙腈中的lmMNaH2P04中的lOO^M肽SB-1和SB-3的10x10阵列或溶剂对照分散到被切成3"xl"的1mm聚丙烯板。表23在50*(v/v)水性乙腈中的lmMNaH2P04在50%(v/v)ZK性乙腈中的1mMNaH2P04月太SB-1肽SB-1肽SB-3肽SB-345接着，根据表24中显示的方案，在以前的位置中，使用压电阵列系统，分配6个5nl的在50%(v/v)水性乙腈中的1mMNaH2P04或在50%(v/v)水性乙腈和10%(v/v)甘油中的1mMNaH2P04中的100肽TLSP-4的10x10阵列。表24_<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>将所述样品在黑暗中在室温温育30分钟。接着将玻片在100ml的在10mMtris-HCl(pH8.0)中的50mMNaCl中进行洗涤，随后用自来水流过玻片1分钟。在具有绿色(532nm)激光和580BP30滤光片的TyphoonTrioPlus可变模式图像仪(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))上，以10pm解析度，在400V的PMT电压和普通灵敏性上使微量滴定板成像。在压板设定扫描高度，并且在扫描过程中挤压样品。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))分析荧光图像。将聚丙烯玻片的荧光图像显示在图31中通过荧光标记的肽的保留分析二聚体的产生，所述荧光标记的肽的保留受未标记的肽的存在调节，所述未标记的肽可以结合于聚丙烯表面和荧光标记的肽二者。因此，当表面肽具有游离硫羟基团并且溶解肽具有S-硝基吡啶基活化的硫羟基团时，观察到二聚体形成。简单的方法(没有防止蒸发的甘油)产生更高产量的二聚体。实施例9在该实施例中，平行制备20个包含肽L1-P1-1到16和Ll-P2-1到16的二聚体的256个元件的微阵列。使用前，将1mm聚丙烯板切成136mmx80mm，用玻璃纸轻轻摩擦，并用50%(v/v)水性乙腈进行擦拭。使用压电阵列系统(PerkinElmer(铂尔金爱尔默)LAS)，如在表25中所指示，将18x6nl等分试样的Pl肽沿聚丙烯玻片的栏以0.72mm的间隔排列。表25<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>L1-P1-8.Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-GI乂-Phe^Gly-Phe-Gly-Phe-GiyTphe-Gly-Phe"Cys-Phe^Hse-Phe-Asp-Phe-Gly-PheL1-P1-9Phe-Gly-Phe-Gly-Ph&Giy-Phe-Gly-Phe-Gly'-Phe-Gly-Phe^Gly-Ph^Cys-Phe-Abu-PhB-DAB-Phe-Gly-PheU-P1-11Phe-Gly-PheGly-Ph&-Gly-Phe-G，y-Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gty-Phe-Cys-Phe-Abu-Phe-Abu-Phe-C3ly-PheL1-P1-12Ph&>Gly-Phe-Gly-PheGly-PheGly-Phe-Gty-Phe-(^y-Phe-Gy-Phe~Cys-Phe-Abu-Phe-Asf>-Phe:Gly-PheL1-P1-14Phe-Gly-Phe-Gly-Phe"Giy-Phe^(3ly-Ph&-Gly-Phe"ply-Phe-Gly-—he-Cys-Phe-Asp-Phe-Hset-Phe-Gly-PhePhe-Gly-Ph6"G^Ph—Gty-Phe-Gly-Ph屮Gly-Phe"Gly-Phe-t3ly隱Phe^Cys-Phe-Asp"Phe^Abu陽Phe'-G-Phe在样品蒸发后，使用压电阵列系统(PerkinElmer(铂尔金爱尔默)LAS)，如表26所显示，将90%(v/v)DMSO，1mMtris陽HCl(pH8.0)中的18x12nl等分试样的Ll-P2肽沿聚丙烯玻片的排以0.72mm的间隔排列。表26<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>P2肽的序列:丄P2-1CysSTP-DAB-Phe-DAB-Phe-GIy-PheLl-P2.-2CysSTP-DAB-Phe-Hse-Phe-Qly-PheLl-P2--3CysSTP-DAB-Phe-Atm-Phe-Gly-PheLl-P2--4CysSTP-DAB-Phe-Asp-Phe-Gly-PheLl-5CysSTP-Hse-Phe'-DAB-Ifhe-Gly-Phe-P2--6CysSTP-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-Phe-P2--7CysST.P-Hse-Phe-Abu-Phe二Gly-Phe-P2-■8CysSTP-Hse-Phe-Asp-Phe-Gly-Pheu--P2-.9CysSTP-Abu-Phe二DAB-Phe-Gly-Piie-P2-.10CysSTP-Abu-Phe-Hse-Phe-Giy-PheLl--P2-■11CysSTP-Abu-Phe-Abu-P.he-Gly-PheU'-P2-12.C"STP-Abu-Phe-Asp-Phe-Gly-PheU--P2-13CysSTP-Asp-Phe-DAB-Phe-Gly陽PheLl--P2-14CysSTP-Asp-Phe-Hse-Phe-Gly-PheLl--P2-15CysSTP-Asp-Phe-Abu-Phe-G'y-Phe-14.-P2-16CysSTP-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-PheLl--P2-17TAMRA-CysSTP-DAB-Phe-DAB-Phe-Gly，PheLl--P2-18TAMRA-CysSTP-Hse-Phe-Hse-Phe-Gly-PheLl--P2-19TAMRA-CysSTP-Abu-Phe-Abu-Phe-Gly-PheLl--P2-20TAMRA-.CysSTP-Asp-Phe-Asp-Phe-Gly-Phe样品蒸发后，将玻片在50ml的包含0.1%(v/v)吐温-20的10mMtris-HCl(pH8.0)中洗涤10分钟。在具有绿色(532nm)激光和580BP30滤光片的TyphoonTrioPlus可变模式图像仪(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))上，以lOiim解析度，在500V的PMT电压和普通灵敏性上使玻片成像。在压板设定扫描高度。使用ImageQuantTLv2003.03(阿莫仙生物科学(AmershamBiosciences))分析荧光图像。将一个18x18的二聚体阵列和对照点的荧光图像显示在图32中。可观察到分配在阵列中的每个Ll-Pl肽栏的荧光信号。这说明每个Ll-Pl肽己经成功分配，并且能够进行二聚体形成。还可以观察到分配到阵列中的每个L1-P2肽排的荧光信号。这说明，每个L1-P2肽己经成功分配并且能够进行二聚体形成。与对于用未标记的P2肽和TAMRA-标记的P2肽制备的16x16阵列的二聚体荧光比较，仅具有TAMRA-标记的P2肽的样品的二聚体荧光更大，所述未标记的P2肽和TAMRA-标记的P2肽与L1-P1肽硫羟基团竞争。这说明所有的L1-P2肽已经成功地与它们的TAMRA-标记的负体竞争并且因此成功地在所有的16种U-P1肽和所有的16种Ll-P2肽之间形成肽二聚体。因此对本发明进行了描述，清楚的是相同的方法可以以许多方式而不同。这样的变化并不被视为背离本发明的精神和范围，并且对于本领域技术人员而言显而易见的是意欲将所有的这样的修饰包含在下面的权利要求的范围内。工业应用性本发明提供具有增加的序列多样性的合成捕获试剂。所述捕获试剂可以使各种表面，例如玻璃或硅官能化，从而容许配体与表面结合或形成各种类型的阵列。50权利要求1.一种制备结合配体的多聚体捕获试剂的方法，所述捕获试剂包含至少第一和第二单体单元，所述第一单体单元还包含第一配体结合部分，第一反应基和连接部分，所述第二单体单元还包含第二配体结合部分，和第二反应基，其中所述反应基对于每个单体单元可以是相同或不同的，所述方法包括下列步骤；a)使所述第一单体单元与所述第二单体单元反应从而使在所述单体单元上存在的反应基反应以形成多聚体捕获试剂。b)通过连接部分将所述第一单体单元固定在基底上，其中可以将步骤a)在步骤b)之前，同时或之后进行。2.—种制备用于结合配体的多聚体捕获试剂的方法，所述捕获试剂包含至少第一和第二单体单元，所述第一单体单元还包含第一配体结合部分，第一反应基和连接部分，所述第二单体单元还包含第二配体结合部分，和第二反应基，其中对于每个单体单元，所述反应基可以是相同或不同的，所述方法包括；使所述第一单体单元与所述第二单体单元反应从而使在所述单体单元上的反应基反应以形成多聚体捕获试剂。3.权利要求2的方法，其还包含将所述多聚体捕获试剂通过连接部分固定在基底上的步骤。4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述至少第一和第二单体单元是合成的。5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述第一和第二单体单元是肽。6.根据权利要求5的方法，其中所述第一肽和第二肽分别从第一和第二氨基酸组产生。7.根据权利要求6的方法，其中每个氮基酸组是不同的。8.根据权利要求5-7中任一项的方法，其中每个氨基酸残基是基本上对映体纯的。9.根据权利要求5-8中任一项的方法，其中每个基本上对映体纯的氨基酸选自由少于20个氨基酸组成的组。10.根据权利要求5-9中任一项的方法，其中每个基本上对映体纯的氨基酸选自由4个氨基酸组成的组。11.根据权利要求5-10中任一项的方法，其中每个基本对映体纯的氨基酸选自由L-氨基酸，D-氨基酸，氨基酸模拟物，间隔氨基酸，P氨基酸或任何其它手性氮基酸单体组成的组。12.根据权利要求5-11任一项的方法，其中所述基本对映体纯的氨基酸是L-氨基酸和/或D-氨基酸。13.根据权利要求5-12任一项的方法，其中所述第一肽和第二肽具有不同的氨基酸序列。14.根据权利要求5-13任一项的方法，其中所述第一肽和第二肽分别包含2-50个氨基酸。15.根据权利要求5-14任一项的方法，其中所述反应基选自由硫羟基，马来酰亚胺，环戊二烯，叠氮化物，膦硫酯，硫酯和(硝基)硫代吡啶基活化的硫羟基组成的组。.16.根据权利要求5-15任一项的方法，其中所述反应基是硫羟基。17.根据权利要求5-16任一项的方法，其中所述硫羟基用硫代硝基吡啶基或硫代吡啶基活化。18.根据权利要求5-17任一项的方法，其中所述捕获试剂共价连接于基底。19.根据权利要求5-18任一项的方法，其中所述肽是合成的从而使在结合配体的捕获试剂的区域中，仅每隔一个氨基酸是改变的。20.根据权利要求5-19任一项的方法，其中所述捕获试剂通过在硫酯衍生的捕获试剂和半胱氨酸衍生的表面之间的天然化学连接连接于基底。21.根据权利要求5-19任一项的方法，其中所述捕获试剂通过在具有N端半胱氨酸的捕获试剂和硫酯衍生的表面之间的天然化学连接连接于基底。22.根据权利要求5-17任一项的方法，其中所述捕获试剂通过疏水相互作用固定在基底上。23.根据权利要求22的方法，其中所述第一肽和第二肽分别包含至少一个疏水氨基酸残基，其中所述疏水氨基酸残基和配体结合部分位于所述肽的一级结构上从而产生具有疏水面和基本非疏水配体结合面的捕获试剂。24.根据权利要求23的方法，其中所述第一肽和第二肽的疏水面形成所述连接部分。25.根据权利要求22-24任一项的方法，其中每个肽包含多个形成所述连接部分的疏水氨基酸。26.根据权利要求23-25任一项的方法，其中所述第一肽包含4-40个疏水氨基酸残基。27.根据权利要求23-26任一项的方法，其中所述第一肽包含6-12个疏水氨基酸残基。28.根据权利要求23-27任一项的方法，其中所述第一肽包含20%-80%的疏水氨基酸。29.根据权利要求23-28任一项的方法，其中所述第一肽包含含有交替的疏水和非疏水氨基酸残基的一级结构。30.根据权利要求23-29任一项的方法，其中所述第二肽包含1-6个疏水氨基酸残基。31.根据权利要求23-30任一项的方法，其中所述疏水氨基酸选自由下列各项组成的组亮氨酸，异亮氨酸，正亮氨酸，缬氨酸，正缬氨酸，甲硫氨酸，酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸。32.根据权利要求23-31任一项的方法，其中所述疏水氨基酸是苯丙氨酸。33.根据权利要求23-32任一项的方法，其中在所述第一肽上的反应基位于基本非疏水配体结合面的一级氨基酸结构中并且在配体结合位点的N-端侧，在所述第二肽中反应基位于疏水面中并且位于配体结合位点的N-端侧。34.根据权利要求5-33任一项的方法，其中所述第一肽包含10个或更少的配体结合残基。35.根据权利要求5-34的任一项的方法，其中所述第二肽包含10个或更少的配体结合残基。36.根据权利要求21-35任一项的方法，其中所述第一肽具有在SEQIDNo1中描述的序列。37.根据权利要求21-36任一项的方法，其中所述第二肽具有在SEQIDNo2中描述的序列。38.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述捕获试剂组装在基底上。39.根据前述权利要求任一项的方法生产的捕获试剂。40.—种基底，其上固定至少一种根据前述权利要求任一项的方法产生的捕获试剂。41.一种阵列，其上固定多种根据权利要求1-38任一项的方法产生的捕获试剂。42.根据权利要求41的阵列，其中所述阵列包含许多不连续的可寻址空间编码的位置。43.权利要求41或权利要求42的阵列，其中在所述阵列上的给定位置的基本所有的所述捕获试剂基本上是相同的。44.权利要求43的阵列，其中在所述阵列上的每个位置包含不同的捕获试剂。45.产生根据权利要求41-44任一项的阵列的方法，其包括将根据权利要求1-38任一项的方法产生的捕获试剂分配到适合的基底上以形成可寻址的空间编码阵列。46.—种鉴定结合目标配体的多聚体捕获试剂的方法，所述方法包括生产根据权利要求1-38任一项的方法产生的组合捕获试剂的阵列，使目标配体与阵列接触，和鉴定配体结合的捕获试剂。47.—种试剂盒，其包含根据权利要求2和4到17的任一项的方法产生的多聚体捕获试剂，和用于固定的适合的基底。48.—种试剂盒，其包含根据权利要求1，2和4-17任一项的方法产生的第一和第二单体单元。49.权利要求48的试剂盒，其还包含适合的基底。全文摘要本发明涉及制备结合配体的多聚体捕获试剂的方法，所述捕获试剂包含至少第一和第二单体单元，所述第一单体单元还包含第一配体结合部分，第一反应基和连接部分，所述第二单体单元还包含第二配体结合部分，和第二反应基，其中对于每个单体单元反应基可以是相同或不同的，所述方法包括下列步骤a)使第一单体单元与第二单体单元反应从而使在单体单元上存在的反应基反应以形成多聚体捕获试剂。b)将第一单体单元通过连接部分固定在基底上，其中所述步骤a)可以在步骤b)之前，同时或之后进行。文档编号C07K1/04GK101331400SQ20068004700公开日2008年12月24日申请日期2006年12月19日优先权日2005年12月20日发明者萨莉·安德森,迈克尔·A·里夫申请人:夏普株式会社