专利名称：：血管老化预测因子及其使用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及血管老化预测因子及其使用。具体地，本发明涉及使用人载脂蛋白B100的特定巯基的谷胱甘肽化作为指标的血管老化预测因子及其检测方法。
背景技术：
：在预期将来将越来越流行的代谢综合征中，代谢综合征的基础疾病糖尿病(葡萄糖耐量低减)、高血压、高脂血症、肥胖症等通常起着血管老化的促进因子作用。血管老化通过形成动脉硬化、动脉阻塞等引起心肌梗塞和脑梗塞。然而，可利用的血管老化的客观指标是那些通过形态学的测量(例如颈动脉的超声波诊断)而获取的客观指标，并且还没有建立起利用患者血清作为样品的简单测量方法。即，至今尚未建立起预测脑阻塞、心肌梗塞、阻塞性动脉硬化等发病的因子，所述脑阻塞、心肌梗塞、阻塞性动脉硬化等是代谢综合征继发的严重且不可逆的组织损伤。氧化应激被认为是包括生活方式相关疾病在内的许多病症以及衰老的原因之一。还已知氧化应激起到血管老化的促进因子作用。作为氧化应激的标记，蛋白质羰基化的免疫测定法以及用于测定脂质过氧化的TBAS方法通常为大家所熟知。然而，当使用血清作为样品时，这些方法存在特异性和重复性的问题。同时，近年来，已经开发出使用特异性抗体抗LDL中的脂质和蛋白质片段的氧化变性的方法。所述氧化变性表示其中蛋白质和脂质经历不可逆的变性和降解的过程，已知其与动脉粥样硬化的发展有关。然而，某种程度上可以不认为氧化变性是血管老化的较早症候的指标。通过氧化应激以非酶的方式对蛋白质的巯基进行氧化修饰，其形成分子内交联的蛋白质并引起酶蛋白的失活，由此进行蛋白质的功能变化。有时氧化巯基，以形成不可逆的修饰。S-谷胱甘肽化(蛋白质-SSG，谷胱甘肽化)在保护蛋白质的功能和结构不受这种不可逆的氧化修饰中起作用。换句话说，过氧化氢修饰蛋白质的半胱氨酸的巯基，并促进与次磺酸(-SOH)、进一步与亚磺酸(-S02H)和磺酸(-S03H)的不可逆变性过程。用谷胱甘肽修饰巯基是可逆的变化，还受还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的浓度的调节。这称为"氧化还原"。氧化还原是与活有机体或细胞的功能或活性相关的重要机制，并控制细胞分化增殖以及细胞死亡。换句话说，蛋白质巯基的氧化修饰表明活有机体的氧化还原状态的失衡。氧化还原的衰竭引起组织细胞的凋亡和进一步的重塑，并且被认为与血管老化的机制密切相关。到目前为止，已经报道了经谷胱甘肽修饰的蛋白质的巯基的测定方法。1)使用抗谷胱甘肽化牛白蛋白抗体的免疫学方法(非专利文献1)。这种方法具有与特异性和测量灵敏度有关的问题，且不适合于实际应用。2)使用生物素化的谷胱甘肽S-转移酶的方法(非专利文献2)。这是谷胱甘肽S-转移酶通过酶反应识别谷胱甘肽化巯基的事实的应用，但是这种方法涉及与灵敏度和特异性相关的许多问题。一种血管老化预测因子，其包含具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100;或者含有该谷胱甘肽化区域，且由至少IO个氨基酸残基组成的载脂蛋白B100的一部分；根据上述11的预测因子，其中所述栽脂蛋白B100及其一部分至少包含序列号2表示的氨基酸序列，其中所述谷胱甘肽化区域为该氨基酸序列中的半胱氨酸的巯基；[3一种检查由血管老化引起的损伤的方法，其包括使用生物样品测定具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白B100;的方法，其中所述生物样品为血液；51根据上述[3]或4]的方法，其中所述由血管老化引起的损伤伴随着选自以下的病症糖尿病、脑血管障碍、心血管障碍、阻塞性动脉硬化、痴呆、动脉粥样硬化、高血压、肥胖症等；—种用于由血管老化引起的损伤的诊断试剂或诊断试剂盒，其包含特异性识別具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100的抗体。发明的效果根据本发明，由于已经阐明了具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白B100与血管损伤之间的相关性，因而可以将其中巯基被修饰的载脂蛋白B100或其一部分用作血管老化的预测因子。使用这种预测因子作为指标的本发明的检查方法可以简单并高精度地判定存在由血管老化引起的损伤或存在血管老化的风险，并有用于血管老化引起的损伤的诊断、随访、预后展望、临床前诊断、携带者诊断等。另外，的检查方法的工具加以使用，附图简述图1是显示通过SDS板凝胶电泳对谷胱甘肽化载脂蛋白B100进行免疫测定的图。在(A)中，使用来自健康受试者的对照血清和来自ASO患者的血清作为样品，用抗栽脂蛋白B100抗体对其染色。泳道l:对照血清+5mMDTT，泳道2:患者血清+5mMDTT，泳道3:对照血清，泳道4:患者血清。在(B)中，使用来自健康受试者的对照血清和来自ASO患者的血清作为样品，用抗谷胱甘肽化栽脂蛋白B100抗体对其染色。泳道l:对照血清+5mMDTT，泳道2:患者血清+5mMDTT，泳道3:对照血清，泳道4:患者血清。在(C)中，来自健康受试者的对照血清中产生的谷胱甘肽化栽脂蛋白B100经抗栽脂蛋白B100抗体(上面一排)和抗谷胱甘肽化载脂蛋白B100抗体(下面一排)染色。泳道l:加入5%P-ME，泳道2:未加p-ME，泳道3:加入5mM谷胱甘肽+0.5mM过氧化氢，泳道4:加入10mM谷胱甘肽+0.5mM过氧化氢。图2是显示对ASO患者血清中的谷胱甘肽化栽脂蛋白B100进行测定的图(对照(n-10)平均值0.92士0.43;1(n-6)平均值2.96士1.08;II(n=27)平均值3.18土1.47;III、IV(n=18)平均值3.97±1.73),图3是显示对糖尿病患者血清中的谷胱甘肽化栽脂蛋白B100进行测定的图(对照(n-10)平均值1.07士0.18;没有DM并发症(n=12)平均值0.91士0.41;DM、ASO(-)和其它并发症(n=52)平均值2.24士1.90;DM、ASO(+)(n=26)平均值2.71±1.49)。图4是显示对用纯化的谷胱甘肽化栽脂蛋白B100作为抗原，并使用抗谷胱甘肽化载脂蛋白B100抗体的免疫反应进行定量研究的图。(A)是显示蛋白质印迹方法的测量结果的电泳照片。(B)是显示(A)的结果的量化图。图5是显示对糖尿病患者血清中的蛋白质进行检测的图，通过免疫沉淀法分离所述蛋白质。(A)表示抗谷胱甘肽化栽脂蛋白B100抗体，(B)表示抗栽脂蛋白B100抗体，图6是显示来自ASO患者的血清中的巯基转移酶活性的图，实施发明的最佳方式本发明提供了新颖的血管老化预测因子。本发明的目标是经历可逆氧化修饰的区域而非通过认为显著加速血管老化的"氧化应激"而不可逆变化的修饰蛋白，活有机体具有高的还原能力，并因此保护它们自身不发生氧化应激。这种应激的传感器例如为蛋白质的巯基。因此，本发明所关注的是血液蛋白中的巯基并尝试测定它的修饰。栽脂蛋白B100是构成低密度脂蛋白(LDL)的蛋白质，例如在人中，它是由序列号1所表示的氨基酸序列组成的蛋白质。氧化应激在载脂蛋白B100中引起不可逆的修饰而成为变性LDL,通过血管内皮细胞或血管巨噬细胞的细胞表面上表达的清除受体将变性LDL摄入这些细胞，在血管中形成斑块，并由此促进动脉硬化损伤的发展。另外，氧化应激引起包括血管老化在内的各种损伤。如后迷实施例中所记载的，与无血管损伤的糖尿病患者的血清中的蛋白质相比，在有血管损伤的糖尿病患者的血清中，观察到具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白BIOO显著增加。因此，具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白B100可以是优异的血管老化预测因子。本发明的预测因子的特征在于它包含具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100,或者含有该谷胱甘肽化区域、且由至少IO个氨基酸残基组成的载脂蛋白B100的一部分。具体地，优选含有其中至少序列号2表示的氨基酸序列(VPSCKLDFRE)中半胱氨酸的巯基被谷胱甘肽化的氨基酸序列的多肽。本文所使用的"巯基的谷胱甘肽化"表示由于氧化应激等，栽脂蛋白B100的半胱氨酸的巯基从通常的还原状态(-SH)成为可逆的-S-SG状态，这不同于通过氧化应激被进一步不可逆修饰的状态血管老化包括由于年龄增加而引起的血管(动脉)的生理变化，以及由高血压、高脂血症、肥胖症、糖尿病、吸烟、肝硬化、自身免疫疾病等诱导的血管的病理学变化。另外，本发明涉及由血管老化引起的损伤的检查方法，其特征在于，使用生物样品来检测具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100。本发明的方法不仅可以检查由血管老化引起损伤的可能性，而且还可以检查由血管老化引起损伤的风险。在由血管老化引起的损伤中，诸如血管内皮细胞的损伤、血栓形成、内膜增厚、血管阻塞和斑块形成等动脉硬化性变化得以识别。作为伴随由血管老化引起的损伤的病症，可列举糖尿病、脑血管障碍、心血管障碍、阻塞性动脉硬化、痴呆、动脉粥样硬化、高血压、肥胖症等。虽然可以应用本发明检查方法的受试者优选为人，但是也可以使用其它非人哺乳动物。这些哺乳动物例如可列举小鼠、大鼠、兔、犬、猫、马、绵羊、牛、山羊、猪、小型猪、无毛猪、猿猴等，本发明的检查对象没有特别的限定，对于人，可以是那些经受一般医疗检查的人、那些有血管老化风险的人或者那些具有由血管老化引起的损伤的人等。"那些具有血管老化风险的人"优选为具有糖尿病、高血压、高脂血症、肥胖症或代谢综合症的人等。对本发明方法适用的生物样品为可存在栽脂蛋白B100的组织或体液，优选血液样品，就血液而言，可以使用全血、血清、血浆中的任一种，这些可通过处理血液恰当地获得，所述血液通过常规方法取自受试者。虽然不受特定限制，但血液样品优选为血清。具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白B100既可以以"包含具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白B100的LDL(谷胱甘肽化LDL)"的形式存在，又可以以及具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白B100的形式存在，而通过本发明方法可测定任一种形式。在本发明中，对分离自人的血液样品中的具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白B100的检测没有特定限制，例如，可以使用诸如免疫化学方法等方法。其中，优选通过免疫化学方法进行检测，所述免疫化学方法使用特异性识別具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100的抗体。同时，本文所使用的"具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100的检测"不仅表示大于一定浓度的具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100的定性检测，还表示具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100的浓度的定量测定。用于测定血液样品中具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100的浓度的免疫化学方法没有限制，可列举常规已知的方法，例如斑点印迹测定法、蛋白质印迹法、酶免疫测定法(ELISA)、乳胶凝集试验法、免疫色谱法、放射性免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FLA)和用于测定浊度(所述浊度为伴随抗原-抗体复合体形成的浊度)的比浊法。其中，优选通过蛋白质印迹法或斑点印迹测定法根据显色的差别来确定具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100的浓度，同时用已知浓度的抗原作为对照，当检测出血液样品中的具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100大于一定水平时，可以判断该血液样品来源的受试者患有由血管老化引起的损伤或具有血管老化的风险。在这种情况下，该血液样品中具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100的浓度越高，则受试者患有损伤的可能性或风险就越高。另外，当检测出血液样品中的具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100大于某个浓度时，可以判断在该血液样品来源的受试者体内还原活有机体中谷胱甘肽化载脂蛋白B100的能力降低。在这种情况下，血液样品中具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白B100的浓度越高，则降低还原能力的可能性就越高。另一方面，当检测出血液样品中的具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100低于一定水平时，可以判断该血液样品来源的受试者患有由血管老化引起的损伤的可能性或风险较低，并且可以判断提高或维持了还原活有机体中谷胱甘肽化载脂蛋白B100的能力。当血液样品中检出具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白B100时，并且当该血液样品中具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白B100的数量较多时，可以判断与所述数量较少的情况相比，患有由血管老化引起的损伤的可能性或风险更高，并且活有机体中谷胱甘肽化栽脂蛋白B100的还原能力降低的可能性更高。另外，本发明提供一种用于由血管老化引起的损伤的诊断试剂，其包含用于检测具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100的物质。就该物质而言，只要是在上述方法中能够检出具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白B100的物质即可，没有特別的限定，但是优选特异性识别具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白B100的抗体(下文称之为"本发明抗体")。本发明"抗体"包括天然抗体，例如多克隆抗体和单克隆抗体(mAb);可使用基因重组技术制备的嵌合抗体；人源化抗体和单链抗体；可使用产生人抗体的转基因动物等制备的人抗体；通过Fab表达库制备的抗体片段；以及它们的结合片段，但并不限于此。所述诊断试剂中所包含的本发明抗体可以为多克隆抗体或单克隆抗体，只要它与来源于哺乳动物(优选来源于人)的栽脂蛋白B100特异性结合，所述载脂蛋白B100中的巯基被谷胱甘肽化。所述结合片段是指上述抗体的部分区域，具体地，例如可列举F(ab，)2、Fab，、Fab、Fv(抗体可变区片段)、sFv、dsFv(二硫键稳定性Fv)、dAb(单域抗体)等(Exp.Opin,Ther,Patents,Vol.6，No.5，p*441-456，1996)。抗体的种类没有特别限制，包括具有任何同种型(如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等)的抗体。优选为IgG和IgM，当考虑到纯化的容易度等时更优选IgG。可以通过现有的常规制备方法制备多克隆抗体或单克隆抗体。即，例如给予哺乳动物免疫原和所需的弗氏佐剂用于免疫接种，所述哺乳动物在多克隆抗体的情况下，例如为小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、猫、犬、猪、山羊、马或牛，优选为小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、山羊、马或兔，在单克隆抗体的情况下，为小鼠、大鼠或仓鼠。如果需要，使用与栽体交联的免疫原。就栽体而言，例如可列举为BSA、KLH等。另外，可以使用来源于被免疫动物的蛋白质(如血清蛋白等)作为栽体，对于用于制备本发明抗体的免疫原，使用序列号1表示的氨基酸序列或具有其部分序列的多肽。优选地，所述多肽包含其中序列号2(VPSCKLDFRE)中的半胱氨酸的巯基被谷胱甘肽化的氨基酸序列或其部分序列。具体地，用于制备本发明抗体的免疫原是由序列号2(VPSCKLDFRE)表示的氨基酸序列或其部分序列组成的肽。所述部分序列的长度不受限制，只要它作为表位具有免疫原性即可，但是长度优选不少于6个氨基酸，更优选不少于8个氨基酸，进一步优选10个氨基酸。为了将上述肽与栽体交联，可以附加(add)—个或多个氨基酸，虽然被附加氨基酸(aminoacidtobeadded)的数量不受特定限制，但考虑到所要制备的抗体的特异性，所述氨基酸数量优选为1至10个，更优选为1至5个，进一步优选为l至2个，最优选为l个。虽然被附加氨基酸的位置可以为多肽的N末端或C末端，但是优选将所述氨基酸附加到N末端。虽然被附加氨基酸的类型可以为本身已知的20种氨基酸的任一种，优选地，在被附加氨基酸中包含至少一个半胱氨酸。更优选地，被附加氨基酸由半胱氨酸组成。具体地，可以下述方法制备多克隆抗体即，经由皮下、肌内、静脉内、足垫内或腹腔内，对小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、山羊、马或兔(优选山羊、马或兔，更优选兔)一次至数次注射免疫原，使所述哺乳动物敏化。通常，在初次免疫接种后大约每1至14天进行1次至5次免疫接种，并且在最后免疫接种后大约1至5天从敏化哺乳动物获取血清。虽然可使用该血清作为多克隆抗体，但是优选地，通过以下方法分离和/或纯化所述抗体饱和硫酸铵、优球蛋白沉降法、己酸法、辛酸法、离子交换色谱法(DEAE或DE52等)、抗免疫球蛋白柱或蛋白A/G柱或者使用其中交联有免疫原的柱等的亲和柱色谱。通过以下方法制备单克隆抗体由得自上述敏化动物的抗体产生细胞与无自身抗体产生功能的骨髓瘤细胞(骨髓瘤细胞)制备杂交瘤(融合细胞)，克隆所述杂交瘤，并选择产生单克隆抗体的克隆，所述单克隆抗体对用于哺乳动物免疫接种的免疫原具有特异的亲和力。具体地，可以通过以下方法制备所述单克隆抗体即，通过皮下、肌内、静脉内、足垫或腹腔内途径一次或数次注射免疫原或通过移植免疫原，使小鼠、大鼠或仓鼠(包括为产生来源于其它动物的抗体而制作的转基因动物，如产生人抗体的转基因小鼠)敏化.通常，在初次免疫接种后大约每1至14天进行1次至4次免疫接种，并且在最后免疫接种后大约1至5天从敏化哺乳动物获取血清。可以根据Kohler和Millstein(Nature，Vol.256，p.495-497，1975)所提出的方法和与该方法一致的修改方法对分泌单克隆抗体的杂交瘤(融合细胞)进行制备。换句话说，使抗体产生细胞和无自身抗体产生功能的骨髓瘤细胞进行细胞融合，以制备这种杂交瘤细胞，其中所述抗体产生细胞包含在从上述敏化哺乳动物获取的脾脏、淋巴结、骨髓或扁桃体等中，优选包含在脾脏中；并且所述无自身抗体产生功能的骨髓瘤细胞优选来源于哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔或人，更优选来自小鼠、大鼠或人，有关用于细胞融合的骨髓瘤细胞，可以使用例如来源于小鼠的骨髓瘤P3/X63-AG8.653(653;ATCCNo.CRL1580)、P3/NSI/l-Ag4-l(NS-l)、P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)、SP2/0-Agl4(Sp2/0，Sp2)、PAI、F0或BW5147;来源于大鼠的骨髓瘤210RCY3-Ag.2丄；或者来源于人的骨髓瘤U-266AR1、GM1500-6TG-A1画2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11或CEM-T15,可以通过以下方法对产生单克隆抗体的杂交瘤克隆进行歸选在例如微量滴定板中培养杂交瘤，通过酶免疫测定法(如RIA或ELISA等)对观察到增殖的孔中的培养上清抗免疫原(用于上述敏化)的反应性进行测定。可以通过以下方法制备来自杂交瘤的单克隆抗体体外培养杂交瘤或在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、或兔等体内(优选小鼠或大鼠体内，更优选在小鼠的腹水等中)培养杂交瘤，并从所得的培养上清或哺乳动物的腹水中分离抗体。进行体外培养时，为满足诸如所培养的细胞种类的特征、试验和研究的目的以及培养方法等各种条件，将杂交瘤增殖、维持并保存，可以使用已知的培养基，如那些用于在培养上清中产生单克隆抗体的培养基或从基础培养基诱导制备的任何培养基。优选类似于上述多克隆抗体，对单克隆抗体进行分离和/或纯化。可通过参考如"ExperimentalMedicine(Extraedition),Vol.6,No,10，1988，，、JP-B-H03-73280制备嵌合抗体；可以通过参考如JP-T-H04-506458、JP-A-62-296890制备人源化抗体；以及可分别通过参考如NatureGeneticsVol.15，第146-156页(1997)、NatureGeneticsVol.7，第13-21页(1994)、JP-T-H04-504365、W094/25585、"NikkeiScience,June,第40-50页(1995)，，、NatureVol.368，第856-859页(1994)、JP-T-H06-500233制备人抗体。分别用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶(均为蛋白水解酶)处理免疫球蛋白，可制备F(ab，)2和Fab,,通过上述方法制备的本发明抗体能够以极度高的灵敏度和特异性识别具有谷胱甘肽化巯基的人载脂蛋白BIOO，因此对来源于人的生物样品中具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白BIOO的检测和定量确定非常有用。本发明抗体以游离的状态、被标记的状态或被固相化的状态包含在诊断试剂中。使用本发明的诊断试剂，使得通过上述方法可以诊断由血管老化引起的损伤。还可以将本发明的诊断试剂用作由血管老化引起的损伤的诊断试剂盒，该试剂盒还包含在上述检测方法中使用的试剂等。就所述试剂等而言，具体可列举为用于稀释试剂和生物样品的緩冲溶液、荧光染料、反应容器、阳性对照、阴性对照、描述检查规程的使用说明书等。这些要素根据需要可以提前混合。使用该试剂盒，可以使根据本发明的由血管老化引起的损伤的诊断变得简单。本文所引用的包括专利说明书在内的所有出版物的内容，通过引用整体结合入本文，如同它们各自被完全阐述，虽然将在下文以实施例详细阐述本发明，但是本发明不限于以下实施例。以下，在实施例中，将"具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白BIOO"简称为"谷胱甘肽化栽脂蛋白BIOO"。实施例合成含有反应性巯基的栽脂蛋白BIOO蛋白质碳末端10个氨基酸残基(VPSCKLDFRE:序列号2)(SIGMA)。在合成的肽溶液中加入谷胱甘肽(lOOmM)，然后在过氧化氢(0.5mM)的存在下于37"C孵育15分钟，使所述巯基谷胱甘肽化。通过还原试剂的还原处理，使谷胱甘肽化消失，因此确认所述巯基处于成为可逆-S-SG(谷胱甘肽化)的状态。在家兔中制备抗具有谷胱甘肽化巯基的肽的特异性抗体(参见SusanneMohr等，TheJournalofBiologicalChemistry,vol.274(14)，第9427-9430页(1999);HjelleO.P.等，Eur.J.Neurosci"vol.6(5)，第793-804页(1994)和ChengG等，ArchivesofBiochemistryandBiophysics,vol.435，第42-49页(2005))'"血清中的谷胱甘肽化栽脂蛋白B100的定量测定"在不存在还原剂(例如j3-巯基乙醇(P-ME)或DTT(二硫苏糖醇))的情况下，使用人血清作为样品进行SDS板凝胶电泳。利用蛋白质印迹法，用抗谷胱甘肽化栽脂蛋白B100抗体和抗栽脂蛋白B100抗体进行染色，并测定巯基的谷胱甘肽化程度。试验结果1.利用SDS板凝胶电泳的免疫测定(图1)(A)将来自健康受试者的对照血清和来自阻塞性动脉硬化(ASO)患者的血清作为样品使用，并用抗载脂蛋白B100抗体(由SRLLtd.提供)进行染色。仅在没有DTT的情况下识别到栽脂蛋白B100相对应的条带(泳道3和4)。染色的程度在健康对照中为弱(泳道3)，在来自ASO患者的样品中为强(泳道4)。(B)用抗谷胱甘肽化栽脂蛋白B100抗体对相同的样品进行染色。在没有DTT存在的条件下用抗谷胱甘肽化栽脂蛋白B100抗体对其进行染色，虽然用ASO患者血清的片段化栽脂蛋白B100级分观察到巯基的谷胱甘肽化，但是在没有片段化的正常大小的载脂蛋白B100中也发生了谷胱甘肽化(泳道4)同时，已知在由氧化应激引起的氧化变性过程中载脂蛋白B100被片段化，并且还增加了脂质过氧化物(CushingSD等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.87，第5134-5138页(1990》，(C)使用来自健康受试者的对照血清制备谷胱甘肽化载脂蛋白B100在不存在P-ME的情况下，在对照血清中加入过氧化氢(0.5mM)和谷胱甘肽(5mM、10mM)，在37"C反应24小时，然后观察到在对照中存在着未被鉴定出来的谷胱甘肽化载脂蛋白B100(泳道3和4)。由此获得的结果表明，通过氧化应激使载脂蛋白B100的巯基谷胱甘肽化。2,ASO患者血清中的谷胱甘肽化载脂蛋白B100的测定(图2)使用ASO患者的血清作为样品来测定谷胱甘肽化栽脂蛋白B100,观察到与来自健康受试者的对照血清相比，ASO患者血清中谷胱甘肽化栽脂蛋白B100显著增加(p〈0.001)。虽然随着疾病状况的发展观察到谷胱甘肽化载脂蛋白B100有上升趋势，但是根据Fontain分类研究ASO患者的病理状况，结果显示没有显著的相关性。由此获得的结果表明，通过使用本发明抗体测定血清中的谷胱甘肽化栽脂蛋白B100的浓度，能够判别健康人和早期ASO患者。3.糖尿病患者的调查(图3)在有或没有血管损伤的情况下，调查糖尿病患者(DM)中的谷胱甘肽化栽脂蛋白B100,与没有血管损伤或将来较不易发生血管损伤的糖尿病患者的血清相比，具有血管损伤或将来极容易发生血管损伤的糖尿病患者的血清中谷胱甘肽化栽脂蛋白B100中观察到显著相关的增加。(表l)表1显著性差异(t-检验)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(数值表示无显著性差异的概率。*;p<0.05)4.免疫反应中抗谷胱甘肽化栽脂蛋白B100抗体和抗原(纯化的谷胱甘肽化载脂蛋白B100)的定量(图4)(A)通过使用抗谷胱甘肽化栽脂蛋白B100抗体的蛋白质印迹法定量测定纯化的谷胱甘肽化栽脂蛋白B100对相当于10ng至90ng的谷胱甘肽化载脂蛋白B100(GSH-apoB100)进行电泳，并用蛋白质印迹法进行测定。将抗谷胱甘肽化载脂蛋白B100抗体稀释5000倍，以用作抗体，并使之在室温下反应1小时。在谷胱甘肽化载脂蛋白B100级分的相应位置观察到强的条带。(B)(A)的数据的分析对(A)的结果进行定量，以获得标准曲线，作为结果，得到呈现依赖抗原浓度的线性的标准曲线。5.利用免疫沉淀方法提取与来自患者血清的抗栽脂蛋白B100抗体反应的蛋白质，并通过使抗谷胱甘肽化载脂蛋白B100抗体对上述蛋白质的作用来确定效果(图5)使患者血清与抗载脂蛋白B100抗体(SRLLtd.)反应，并且利用使用蛋白A琼脂糖凝胶的免疫沉淀法来分离和提取与抗栽脂蛋白B100抗体反应的蛋白质。在此之后，对起始血清(未处理)、不与抗栽脂蛋白B100抗体反应的蛋白质(没有被柱吸附)和与抗载脂蛋白B100抗体结合的蛋白质(被柱吸附)分别进行电泳，并使抗谷胱甘肽化载脂蛋白B100抗体(图5(A))及抗栽脂蛋白BIOO抗体(图5(B))起作用。对于抗谷胱甘肽化栽脂蛋白BIOO抗体和抗栽脂蛋白BlOO抗体两者，均在大约175kDa处检测到被抗栽脂蛋白B100抗体免疫沉淀的蛋白质，它们彼此大约一致。这种发现表明，用抗谷胱甘肽化载脂蛋白BlOO抗体特异性检测出由抗栽脂蛋白BIOO抗体所检测到的条带。由该所得结果可知，与常规方法相比，使用本发明抗体的测定方法具有优异的灵敏度和特异性。如果建立了作为应激传感器的测定方法，则将使作为新颖血管老化标志的广泛临床应用成为可能。6.提供血管老化预测因子以及由血管老化引起的早期损伤的检查方法调查了用作梗塞性动脉硬化的风险因子的谷胱甘肽化栽脂蛋白BIOO的测定意义。使用来自41名阻塞性动脉硬化患者以及38名对照的血清，测定谷胱甘肽化栽脂蛋白BIOO并用Yates连续性标准卡方检验进行研究(表2)。显然，与已知的在这种病症中升高的hs-CRP值以及评价为血管内皮细胞障碍(如心肌梗塞)的早期诊断标志的可溶性LOX-1(sLOX-1)值相比，谷胱甘肽化载脂蛋白BIOO是同时具有极高的灵敏度和特异性的评估因子。表2sLOX-l、hs-CRP和S-谷胱甘肽化蛋白质对ASO患者的灵敏度和特异性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>sLOX-l的截断水平为100pg/ml，hs-GRP的截断水平为4pil/ml,巯基#~饰的截断值为2.5相对强度。通过Yates连续性卡方检验确定x2，通过与非ASO患者的比较得到概率值。7.作为血液氧化还原能力(血管老化的基础)降低的指标的意义对活有机体中谷胱甘肽化栽脂蛋白B100反映了什么进行研究。血清中存在着抗氧化物质維生素类、谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶、氧化还原蛋白质硫氧还蛋白和谷氧还蛋白(GRX)等。虽然认为这些物质对谷胱甘肽化血清蛋白进行间接还原，但是它们并不直接还原谷胱甘肽化血清蛋白。本发明人将注意力集中在对谷胱甘肽化蛋白质中被氧化修饰的半胱氨酸基团具有直接还原作用的GRX上，并开发出一种用于测定血清中GRX依赖性(GRXdependent)巯基转移酶的活性的方法，该方法使用本发明人所发现的作为GRX基质的酪氨酸磷酸酶一低分子量蛋白酪氨酸磷酸酶(LMW-PTP)(Kanda，M，Kondo，T.等，J.Biol.Chem.，VoL281(39)，第28518-28528页，2006)。具体地，将LMW-PTP(100fiI/50照(2.8謂ols))和35S-GSH(5pi(2pmoles，50nmolsDTT))混合并放置在水上5分钟，然后加入GSSG(28nmoles)和H202(100nmols)(总量150pi),在4°C下静置混合物24小时，用旋转柱过滤，得到35S-GS-LM-PTP(PTP标记的)。将所得到的35S-GS-LM-PTP(5nl)与血清(0.5pl)混合，加入0.2MNaH2P04(1nl)(pH调整至7.0)和7.5mMGSH或PBS(-)(1[il)，37°C下放置30分钟，加入2xlaemmli，s溶液(7.5|nl)，得到测定混合物，进行放射标记的谷胱甘肽化LMW-PTP的半胱氨酸基团所释放的放射活性的测定。结果，与对照血液中GRX依赖性巯基转移酶的活性相比，所有患有阻塞性动脉硬化的患者血液中GRX依赖性巯基转移酶的活性均降低(图6)。这表明患者血清中的还原能力降低，蛋白质SH基团处于容易被氧化应激修饰的状态，并且还原那些被氧化修饰(谷胱甘肽化)的蛋白质的能力是低的。8.不能通过其它测量方法识别的血管损伤发展的预测作为血管损伤预测因子的谷胱甘肽化栽脂蛋白B100的评估虽然在损伤发展后，已经建立了通过血管造影术对阻塞性动脉硬化的明确诊断，但发病早期和初期阶段的预测完全不充分。在早期客观地评估了ABI检查。在患有阻塞性动脉硬化的患者中，观察到ABI水平和谷胱甘肽化栽脂蛋白BIOO水平之间存在极高的正相关。另外，糖尿病(这种疾病的初期病症之一)患者血清中的谷胱甘肽化载脂蛋白B100水平的测定显示，即使在那些没有显示任何明显症状或ABI水平变化的患者中也升高了谷胱甘肽化载脂蛋白B100的水平。认为他们处于初期阶段，并且将来需要仔细随访(数据没有显示)。同时，虽然在一个病例中，对主诉小腿有间歇性疼痛的糖尿病患者测定了谷胱甘肽化载脂蛋白B100的水平，发现处于正常。在这个病例中，患者明显并发高血压、肥胖症和高脂血症，并且高度怀疑患有阻塞性动脉硬化。然而，由于ABI水平也是正常的，强烈暗示其它病症的可能性。根据这个事件，预计，除单独的ABI测定之外，还利用谷胱甘肽化载脂蛋白B100水平的测定，能够达到更准确的诊断。工业实用性具有谷胱甘肽化巯基的血清栽脂蛋白B100蛋白(作为应激传感器)的测定方法被认为可以广泛用于临床应用中，作为新的血管老化标志。数量逐年不断增加的代谢综合症患者可能面临严重的生活方式相关疾病，其包括因血管老化引起的脑梗塞、心肌梗塞、阻塞性动脉硬化等。另外，血管损伤成为诸如失明和肾功能损害等糖尿病并发症的基础，目前还没有建立预测这些病症发病的因子。期望本发明所建立的血管老化标志的测定方法将对代谢综合症患者和糖尿病患者的预后确定做出巨大的贡献。另外，使用这种探针也可能开发出用于抗动脉硬化药剂的筛选系统。还期望本发明的测定方法将适用于痴呆的客观诊断和治疗效果判断，料想今后痴呆将成为严重的社会问题。本申请以在日本提交的2005-344630号专利申请(申请日2005年11月29曰)为基础，所述申请的内容通过引用整体并入本文。权利要求1.一种血管老化预测因子，其包含具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白B100；或者含有该谷胱甘肽化区域，且由至少10个氨基酸残基组成的载脂蛋白B100的一部分。2.权利要求1所述的预测因子，其中所述栽脂蛋白B100及其一部分至少包含序列号2所表示的氨基酸序列，其中所述谷胱甘肽化区域为该氨基酸序列中的半胱氨酸的巯基。3.—种检查由血管老化引起的损伤的方法，其包括使用生物样品测定具有谷胱甘肽化巯基的栽脂蛋白BIOO。4.权利要求3所述的方法，其中所述生物样品为血液。5.权利要求3或4所述的方法，其中所述由血管老化引起的损伤伴随着选自以下的病症糖尿病、脑血管障碍、心血管障碍、阻塞性动脉硬化、痴呆、动脉粥样硬化、高血压、肥胖症等。6.—种抗体，其特异性识别具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白B100;或者含有该谷胱甘肽化区域、且由至少IO个氨基酸残基组成的栽脂蛋白B100的一部分。7.—种抗体，其特异性识别序列号2所表示的氨基酸序列中半胱氨酸的巯基的谷胱甘肽化。8.一种用于由血管老化引起的损伤的诊断试剂或诊断试剂盒，其包含特异性识別具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白B100的抗体。全文摘要本发明提供了血管老化预测因子和由血管老化引起的早期损伤的检查方法。具体地，提供了血管老化预测因子，其包含具有谷胱甘肽化巯基的人载脂蛋白B100；由血管老化引起的损伤的检查方法，其包括测定血液样品中的具有谷胱甘肽化巯基的人载脂蛋白B100；特异性识别具有谷胱甘肽化巯基的载脂蛋白B100的抗体；用于由血管老化引起的早期损伤的诊断试剂和诊断试剂盒，其包含识别具有谷胱甘肽巯基的人载脂蛋白B100的抗体。文档编号C07K16/18GK101365718SQ20068005151公开日2009年2月11日申请日期2006年10月30日优先权日2005年11月29日发明者井原义人,后藤信治,河野贵明,浦田芳重,近藤宇史申请人:国立大学法人长崎大学