专利名称：制备κ-角叉菜聚糖酶的方法
技术领域：
本发明涉及制备k-角叉菜聚糖酶的方法。更具体来说，本发明涉
及通过使用登记号为MTCC 5261的耐盐海洋革兰氏阴性细菌假单胞菌 (/^"domo打as sp.)制备角叉菜聚糖酶的方法。
背景技术：
和现有技术
/c-角叉菜聚糖酶的可能应用是获得低分子量碳水化合物、用于大 型海藻消化、通过控制红藻水华形成防止生物淤积、获得精细化学品 以及用于藻类生物技术。
角叉菜聚糖是从红藻纲(Rhodophyceae)某些种类的红色海藻获 得的天然成分(Greer, C.W.,和W. Yaphe.1984. Enzymatic analysis of carrageenans: Structure of carrageenan from五Mc/zewma (角叉菜聚
糖的酶法分析来自松叶麒麟菜的角叉菜聚糖的结构)Hydrobiologia. 116/117: 563-567)。角叉菜聚糖是线性多糖，由被称为A残基的1，3 位连接的/3-D-吡喃半乳糖和被称为B残基的通过1,4位连接的ce-D-吡 喃半乳糖的重复的二糖序列构成。角叉菜聚糖与琼脂的区别在于角叉 菜聚糖中的B单元是D型的，而在琼脂中它们是L型的。角叉菜聚糖 基本结构中的规则骨架被或多或少有序分布的硫酸半酯基团所打断。
角叉菜聚糖也可以含有一些甲氧基和丙酮酸基团。角叉菜聚糖的普通 来源是角叉菜属(CAo"^m)、麒麟菜属(卡帕藻属)(五wcAewwfl f7^; / a; A3;cwW)、杉藻属(G/gaWraa)和银杏藻Q〃Waea)的物种。
有三种基本类型的角叉菜聚糖可用。从角叉菜属、麒麟菜属和杉 藻属物种获得的Kappa (k)、 iota (i)和lambda (人)角叉菜聚糖，它们的 不同在于硫酸酯取代的数量和位置。k和i-角叉菜聚糖在K+、 Ca^或NH/的存在下形成热可逆的凝胶，但是在Na+型中不形成凝胶。
在/3-1，4连接处降解角叉菜聚糖的水解酶被称为角叉菜聚糖酶。已 经从不同的海洋细菌中分离到了三种类型的酶，即k、 i和人-角叉菜聚糖 酶。它们都是裂解角叉菜聚糖的0-1,4键产生新角叉菜二糖系列产物的 内切水解酶(Michel, G.， L. Chantlat， E. Fanchon, B. Henrissat, B. Kloareg， 禾口 0. Didweberg. 2001. The t- carrageenase of ^4//eTO柳owas/oW^. (强 壮交替单胞菌的t-角叉菜聚糖酶)Journal of Biological Chemistry. 276(43): 40202-40209) 。 k-角叉菜聚糖酶在未来几年中有大规模的应 用和工业需求(Ostgaard, K.， B.F, Wangen， S.H. Knutsen,和I.M. Aasen. 1993. Large scale production and purification of k-carrageenase from 尸5^c/画owfW camzgeewowra for applications in seaweed biotechnology.
(从食角叉菜假单胞菌大规模生产和纯化k-角叉菜聚糖酶用于海藻生
物技术)Enzyme and Microbial Technology. 15(4): 326-333 )。
Jhonston和McCandless在题为"角叉菜聚糖的氯化钾可溶性级份 的酶法水解来自食角叉菜假单胞菌的入-角叉菜聚糖酶的性质"的论文 中 ("Enzymic hydrolysis of the potassium chloride soluble fraction of carrageenan: properties of X-carrageenases from -i^ew^/owiowai1 carrageewovora，， ， Canadian Journal of Microbiology 19: (1973) p.p.779-788 )，报道了来自食角叉菜假单胞菌(尸wwc omo"w cwrag^Mowra)的角叉菜聚糖酶只对角叉菜聚糖的KC1可溶性级份即 入-角叉菜聚糖表现出活性。他们可以提高X-角叉菜聚糖酶的产量，但是 不能完全消除同时产生的k-角叉菜聚糖酶。此外，在使用多个复杂的 纯化步骤后，得到的比活仅仅为7半乳糖单位/mg蛋白，最适温度和 pH分别为28°C和6.2。该工作的缺点在于角叉菜聚糖酶只在酸性条件 和28°C的温度下有活性。因此它不能用于碱性条件以及升高的温度 下。此外，尽管使用了复杂的酶纯化步骤，该工艺没有产生显著的酶 纯化。Bellion等在题为"使用来自海洋细菌的t和K-角叉菜聚糖酶降解 异枝麒麟菜和耳突麒麟菜角叉菜聚糖"的论文中("The degradation of ￡i/cAewma ，Tjos画 and co"om' carrageenans by t and
K-carrageenases from marine bacteria" ， Canadian Journal of Microbiology 28(7): (1982) p.p. 874-880)中，己经报道了使用来自海洋
食角叉菜假单胞菌的l-角叉菜聚糖酶和K-角叉菜聚糖酶降解异枝麒麟
菜(_￡^c/2ewma s/ Z"cwMm)和耳突麒麟菜co"o/"7 )角叉菜 聚糖，并鉴定了水解产物。细菌在由NaC125、K2HPO40.1、MgSO4 7H20 5.0、 CaCl2 2H20 0.2、酪蛋白氨基酸2.5、角叉菜聚糖2.5 g. r1以及0.3 % FeS04 (10ml/升)组成的培养基中培养，最适培养温度为22°C。 缺点是用于这种细菌生产角叉菜聚糖酶的培养基由7种组分组成。此 外，使用的最适培养温度是22°C，这对于特别是夏天没有冷却设备的 温带国家培养这种类型的细菌是不可行的。
Sarwar等在题为"人工海水盐用于通过海洋噬纤维菌菌种生产角 叉菜聚糖酶的可能性"("Potentiality of artificial sea water salts for the production of carrageenase by a marine Cy鄉/wga species"， Microbiology and Immunology. 29(5): (1985) p.p.405-411)和"从海洋噬 纤维菌菌种中纯化k-角叉菜聚糖酶"的论文中("Purification of a k-carrageenase from marine species",Microbiology and
Immunology. 31(9): (1987) p.p. 869-877 )，在用于海洋噬纤维菌 (C^o;^aga)菌种生产角叉菜聚糖酶的培养基中使用了 8种组分。此 外，该培养需要适当的NaCl和MgCl2组合来生产角叉菜聚糖酶。最适 pH和温度分别为7.6和25。C。在经过复杂的纯化步骤之后，获得的活 性仅仅为5.0半乳糖单位/mg蛋白。该工作的缺点是对于角叉菜聚糖酶 的生产来说，培养基中必须存在NaCl和MgCl2，并且尽管使用了8种 培养基组分和复杂的纯化步骤，却仅仅获得了 5.0半乳糖单位/mg蛋白 的酶活性。这种低产率使酶的生产在商业上不经济。
Fleurence等在题为"使用酶法细胞壁降解改进从爱尔兰海藻、江蓠和掌状红皮藻尸a/ma〃'a ;^/mato中提取蛋白"的论文中("Use of enzymatic cell wall degradation for improvement of protein extraction from CAowdn m、/ ws, Gra"7脂'a vem/cosa and Pa/m肌'a pa/maW， Journal of Applied Phycology 7: (1995) 393-397)，报道了 zc-角叉菜聚 糖酶在pH 6.5-6.8和45°C下具有最大的活性，而在酸性和碱性条件下 活性较低。该工作的缺点是酶只在中性pH下有活性，因此不能用于酸 性和碱性条件下。此外，在较低温度下活性差使它的应用限制在较高 的温度下。
Dyrset等在题为"从食角叉菜假单胞菌生产zc-角叉菜聚糖酶的发 酵工艺的开发"的论文中("Development of a fermentation process for production of a K-carrageenase from i^ewc/owowfls carrageewovora，，， Enzyme and Microbial Technology 20(6): (1997) p.p. 418-423)，报道了 使用两种菌株的食角叉菜假单胞菌生产/c-角叉菜聚糖酶的发酵工艺。 用于该研究的培养基含有CaCl22H20 0.2、酪蛋白氨基酸6.8、 KC1 0.3、 K2HPO43.0、 MgSO47H2O0.5、 NaCl 20.0、 NH4C1 0.7、 (NH4)2SO45.0、 角叉菜聚糖2.5 gl"。培养基的pH是7,0，温度为20。C。该工作的缺点 是在培养基中需^多种组分以及高浓度的底物，并且用所有这些组分 维持pH7.0是困难的。此外，发酵工艺在20。C进行，需要特殊的装置 来维持这样低的温度。
Araki等在题为"来自海洋细菌弧菌菌种CA-1004的k-角叉菜聚 糖酶的纯化和性质"的论文中("Purification and characterization of K-carrageenase form a marine bacterium 附Wo sp. CA-1004" in Fisheries Science 65 (6): (1999) p.p. 937-942)，他们从海洋细菌弧菌 (WZ^/o)菌种中纯化和表征了可诱导的酶K-角叉菜聚糖酶，它的分子 量为35 KDa，在pH 8.0和温度40。C下有最高的酶活性。用于该研究 的培养基含有蛋白胨5.0、酵母提取物1.0、NaC130、MgSO4 0.5、K2HPO4 2.0、 KH2PO40.4、角叉菜聚糖15gr1。获得的粗角叉菜聚糖酶的活性 是0.949半乳糖单位/mg蛋白。该工作的缺点是含有7种组分的生产培养基产生的角叉菜聚糖酶的活性仅仅为0.949半乳糖单位/mg蛋白。这
样低的活性将必定使该工艺不经济和不可行。
授予Okita Yuji等的日本专利No. JP2001136961 (2001)公开描述 了 "控制细菌的角叉菜聚糖酶生产能力的方法"。在文中描述了通过 将角叉菜聚糖酶生产细菌在无角叉菜聚糖酶生产能力的细菌或其培养 产物存在的情况下进行培养，来控制它的角叉菜聚糖酶生产能力的方 法。该发明的缺点是角叉菜聚糖酶的生产仅仅通过将角叉菜聚糖酶生 产者与不产角叉菜聚糖酶者共培养来控制。
授予Araki Toshiyoshi的题为"新的K-角叉菜聚糖酶、生产它的微 生物、角叉菜聚糖酶的生产及其应用"("New k- carrageenase， microorganism for producing the same, production of carrageenase and its use")的日本专利No. JP 2000116376 (2000)中，公开了对K-角叉菜聚
糖具有分解活性的K-角叉菜聚糖酶。该酶将K-角叉菜聚糖分解成新角叉
菜二糖和新角叉菜四糖，最适pH为8.0。该发明的缺点是酶只有碱性 的最适pH，因此不能在酸性条件下使用。
授予Christian G等的题为"K-角叉菜聚糖酶的生产"("Production of k- carrageenase")的日本专利No. JP1006656 (1998)中公开了食角叉 菜假单胞菌、交替单胞菌(Jteram^M)和噬纤维菌的K-角叉菜聚糖 酶生产力，通过使用这些细菌同化的含氮的碱(氨水)控制培养基的 pH，得到了显著的提高。由此，1^角叉菜聚糖酶的生产可以从>=20半 乳糖单位/ml提高到40到60半乳糖单位/ml。该发明的缺点是在控制 pH后他们只获得了 3倍的纯化，没有商业可行性。
授予HaiginM等的题为"角叉菜胶分解代谢酶，它的制备方法和 应用" ("Carrageenin catabolic enzymes it's preparing process and application")的加拿大专利No. CNl544623 (2004)中，获得了能够降
解K-角叉菜聚糖以制备寡聚角叉菜聚糖并降解K-角叉菜聚糖的/3-l,4靛青苷键的酶，其分子量为30Kda。噬纤维菌在28-35摄氏度下培养， 离心获得粗酶，并使用40-80%的硫酸铰将其浓縮。将该方法与化学方 法进行比较；它具有简单的制备过程、高的产物产率以及稳定的质量， 确保了寡糖的活性研究和开发等。该发明的缺点在于仅使用了盐析方 法浓縮酶，没有给出显著浓縮/纯化的酶制备物。
发明目的
本发明的主要目标是提供用于制备ic-角叉菜聚糖酶的方法。
本发明的另一个目标是提供使用耐盐海洋革兰氏阴性细菌制备K-角叉菜聚糖酶的方法。
本发明的另一个目标是通过使用在具有最适浓度的新培养基组合 物中生长的耐盐海洋革兰氏阴性细菌，提供改进的K-角叉菜聚糖酶。
本发明的另一个目标是以涉及不太复杂的技术的简单方式，最大 化角叉菜聚糖酶的生产。
本发明的另一个目标是提供具有出色的K-角叉菜聚糖水解活性的 K-角叉菜聚糖酶。
本发明的另一个目标是获得在碱性和酸性条件下具有活性的K-角 叉菜聚糖酶。
本发明的另一个目标是获得温度稳定性较高的K-角叉菜聚糖酶。
本发明的另一个目标是获得底物特异性高的K-角叉菜聚糖酶。
本研究的另一个目的是获得具有延长的储存稳定性的K-角叉菜聚 糖酶。本研究的另一个目的是获得能够产生长心卡帕藻(尺app^^cw Wv"rez//)原生质体的K-角叉菜聚糖酶。
发明简述
本发明涉及可用于生产高活性的K-角叉菜聚糖酶的新的耐盐海洋
细菌，假单胞菌(尸"Wowo"w spp.)，登记号为MTCC 5261。为了以
简单的方式最大化K-角叉菜聚糖酶的生产，使用统计学优化方法确定了
具有最少组分以及它们的最适浓度的新培养基组合物，统计学优化方 法减少实验的数量、节省时间和化学物质，并且通过观察影响酶产生 的所有因素的组合效应，提高了结果的真实可靠性。
发明具体说明
因此，本发明提供了用于制备K-角叉菜聚糖酶的方法，其中所述 方法包括下列步骤
(i) 登记号为MTCC 5261的耐盐海洋细菌假单胞菌在液体培养基 中15-50"e生长16-72小时以获得培养物，所述培养基含有角叉菜聚糖、 酵母提取物、氯化钠、K2HP04和KH2P04，比例分别为0.1 : 1.0 : 50 : 1: 0.5到3.0 : 1.0 : 15.00.5 : .05;
(ii) 将从步骤(i)获得的培养物在5000-8000 rpm离心20-40分钟， 获得作为上清液的无细胞提取液；
(iv) 纯化来自步骤(ii)获得的上清液的粗酶，通过用硫酸铵在 3-15。C温度范围下处理上清液，并将混合物老化12-36小时的时间范 围，然后在3-15。C下以5000-8000rpm离心，得到含有K-角叉菜聚糖酶 的沉淀；
(v) 将从步骤(iv)获得的沉淀悬浮在Tris-HCl缓冲溶液中；
(v)将在步骤(v)中获得的悬浮液透析以除去附着的硫酸铵，然后
通过凝胶过滤得到所需的纯化的K-角叉菜聚糖酶。
在本发明的实施方案中，所述细菌，假单胞菌，具有下列特征n、哮±卜.
b)革兰氏阴性，显示出革兰氏染色可变性； C)游动好氧的杆菌；
d)它降解海藻多糖、即K-角叉菜聚糖。
在本发明的另一个实施方案中，所述K-角叉菜聚糖酶使用凝胶过
滤在Sepharose CL-4B上纯化。
此外，在本发明的另一个实施方案中，所述K-角叉菜聚糖酶的比
活在10-200半乳糖单位/mg蛋白的范围内。
在本发明的另一个实施方案中， 128Kda。
在本发明的另一个实施方案中，
K-角叉菜聚糖水解活性。
在本发明的另一个实施方案中， 性条件下具有活性。
在本发明的另一个实施方案中， 性较高。
在本发明的另一个实施方案中， 性高。
在本发明的另一个实施方案中， 储存稳定性。
在本发明的另一个实施方案中，
所述K-角叉菜聚糖酶的分子量为
所述K-角叉菜聚糖酶具有极好的
所述K-角叉菜聚糖酶在碱性和酸
所述K-角叉菜聚糖酶的温度稳定
所述K-角叉菜聚糖酶的底物特异
所述K-角叉菜聚糖酶具有延长的
所述K-角叉菜聚糖酶具有产生长心卡帕藻的原生质体的能力。
本发明提供了改进的K-角叉菜聚糖酶生产工艺以及制备它的方 法，包括从位于红藻和腐烂的产角叉菜聚糖原藻(carrageenophyte)附 近的海水和沉积物中分离海洋细菌培养物。将这些细菌生长在含有角 叉菜聚糖作为唯一碳源的固体培养基上。在上述固体培养基上产生坑 或洞的细菌菌落被进一步纯化，产生最大的凹陷的细菌被选择用于进 一步研究。
然后将纯化的细菌接种在液体培养基中进行培养，所述培养基中 含有的组分的优选浓度范围为(gl00mr1) : (i)角叉菜聚糖0.005-6.0 (ii)酵母提取物0.0051-3.0 (iii)氯化钠0.1-20.0 (iv) K2HP04 0.001-1.5 (v) KH2PO4 0.001-0.1。将接种的液体培养基在旋转震荡器上培养以生产 K-角叉菜聚糖酶，时间为12-90小时范围内，温度在10-60。C范围内。 然后将培养的培养悬液优选在4000-10000 rpm的范围下离心20-70分 钟，以获得作为上清液的细胞外粗K-角叉菜聚糖酶(无细胞提取液)。
然后通过盐析方法将细胞外粗酶'(上清液)部分纯化，优选使用 浓度范围为10-100% (wt/vol)的硫酸铵，温度在3-10。C的范围内，将 混合液老化12-36小时的一段时间，以除去大部分不想要的蛋白杂质。 将该含有硫酸铵沉淀的蛋白的悬浮液优选在4000-10000rpm的范围内 和3-10。C的温度下离心，以获得主要含有K-角叉菜聚糖酶的沉淀，将 含有其它蛋白杂质的上清液丢弃。将离心获得的沉淀(主要含有K-角叉 菜聚糖酶)重新悬浮在最小体积的优选5-40 mM的Tris HC1缓冲溶液 中。为了除去过量的硫酸铵和其它包括蛋白的低分子量杂质，使用截 留分子量为12,000的透析袋将部分纯化的K-角叉菜聚糖酶溶液对0.02 mM Tris HC1缓冲液进行透析。
为了进一步纯化硫酸铵沉淀的K-角叉菜聚糖酶，使用了 Sepharose CL-4B上的凝胶过滤技术，通过使用优选浓度范围为5-50mM的TrisHC1缓冲液进行洗脱，回收富含K-角叉菜聚糖酶的级份。纯化的K-角叉 菜聚糖酶级份的分子量的确定是通过重复凝胶过滤方法，记录其洗脱
体积(Ve)，计算其Ve/Vo (Vo是柱子的空隙体积)，并将其与标准 分子量蛋白标记物的分子量VsVe/Vo的对数图进行比较。
该酶的可能应用如下
为了改进多糖的物理性质，转化成寡糖可能是最好的选择。 角叉菜聚糖的酶法降解产生了具有高生物活性的新产品。
由海洋细菌产生的酶能够有效控制红藻水华污染。因此，它 通过作用于复合多糖层防止了海水下表面或管道的生物淤积。
这些酶是研究红藻细胞壁结构和装配的重要工具(Gall, Y. L., J.P.Braud禾口 B. Kloareg. 1990. Protoplast production in CAowt/rws cn's/ws gametophytes (Gigartinales, Rhodophyta).(在爱尔兰海藻配子体(红藻 门，杉藻目)中产生原生质体)Plant Cell Reports. 8: 582-585)。
这些酶可用于大型海藻的消化(Sarwar, G.， H. Oda, T. Sakata， 和D. Kakimoto. 1985. Potentiality of artificial sea water salts for the production of carrageenase by a marine C,pAflga species.(人工海zK盐 用于通过海洋噬纤维菌菌种生产角叉菜聚糖酶的可能性)Microbiology Immunology. 29(5): 405-411)。被消化的产物又可以用作细菌生长的碳 源。它们也可用于从这些藻类提取精细化学品。
大多数红色海藻具有高水平的蛋白(10-30%的干重)(Morgan, C.， J.L.C. Wright和J. Simpson. 1980. Review of chemical constituents of the red alga尸a/wan'fl pa/mWe (dulse).(红色海藻掌状红皮藻的化学成 分综述)Economic Botany. 34: 27-50; Mabeau， S.,和J. Fleurence. 1993. Seaweed in food products: biochemical and nutritional aspects.(食品中 的海藻生物化学与营养特点)Trends Foods Science & Technology. 4: 103-107)。这些蛋白可以通过水解酶例如角叉菜聚糖酶提取(Fleurence, J.， L. Massiani, O. Guyader,和S. Mabeau.1995. Use of enzymatic cell wall degradation for improvement of protein extraction from CT owd陋 cn'5^Mi1, Gnzcz7an.a ve777/cosa and _P<3/man'a pa/附afe. (4吏用酶^去细胞壁降解改进从爱尔兰海藻、江蓠和掌状红皮藻的蛋白提取)Journal of Applied Phycology. 7: 393-397)。例如，通过水解酶降解细胞壁多糖被 用于分离伸展蛋白， 一种与高等植物细胞壁多糖相连的蛋白(Lamport, D.T.A.1969. The isolation and partial characterization of hydrodyproline rich glycolipides obtained by enzymic degradation on primary celf walls.
(通过酶法降解原生细胞壁获得的富含羟脯氨酸的糖脂的分离和部分 表征)Biochemistry. 3: 1155-1163)。
它们可以用于分离原生质体，后者可以用于遗传工程实验以 产生改进的藻类菌株(Chen, L.C.M., J.S. Craigie，和Z.K. Xie. 1994. Protoplast production from P0/7 /^ra /z'wean、 using a simplified agarase procedure capable of commercial application.(使用育旨够商业化 应用的简化琼脂糖方法从线状紫菜产生原生质体)Journal of Applied Phycology. 6: 35-39)。
它们用于分子生物学以防止在藻胶存在下发生的严重的分离 问题。它们也用于生产用于药物学和免疫学的确定的藻胶寡聚物
(Dyrset， N., K.Q. Lystad，和D.W. Levine. 1997. Development of a fermentation process for production of a K-carrageenase from 尸WMJomo/ws cwrageewowra.(从食角叉菜假单胞菌生产k-角叉菜聚 糖酶的发酵工艺的开发)Enzyme and Microbial Technology. 20(6): 418-423)。
角叉菜聚糖酶为研究降解自缔合硫酸化多糖的水解酶的结构-功能关系提供了机会(Michel, G.， L. Chantlat， E. Fanchon, B. Henrissat, B. Kloareg,禾卩O. Didweberg. 2001. The t- carrageenase o"ten3腳"cw
(强壮交替单胞菌的i-角叉菜聚糖酶)Journal of Biological Chemistry. 276(43): 40202-40209)。
根据本发明，提供了本土的新耐盐海洋细菌，被鉴定为假单胞菌 (ftew&wo"M spp)，它具有将K-角叉菜聚糖降解成较低分子量物质
的能力。本发明还涉及用于最大化生产K-角叉菜聚糖酶的新的培养基 组合物，具有下列物理化学性质(1)最适底物浓度0.02%; (2)最适温度40°C; (3)热稳定性在20-50。C之间；(4)最适pH: 5.6和 7.7; (5)底物特异性对K-角叉菜聚糖高度特异，不水解X和i-角叉 菜聚糖和LMP琼脂糖；(6)储存稳定性储存在-20。C时为期15天； 对冻融敏感；(7)溶解性溶于水；(8)分子量分子量通过SDS聚 丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)测定，结果为分子量是128Kda。具
有这样高分子量的K-角叉菜聚糖酶还没有报道过。
此外，根据本发明，还提供了使用K-角叉菜聚糖酶制备长心卡帕
藻的原生质体的方法。
在本发明中，第一次从印度西海岸分离到了具有产生K-角叉菜聚 糖酶能力的新耐盐海洋细菌，假单胞菌。为了最大化K-角叉菜聚糖酶的
生产，使用统计学优化方法确定了具有最少组分以及它们的最适浓度
的新培养基组合物。通过统计学优化后，粗K-角叉菜聚糖酶的比活性
增加32倍是可行的。
在本发明中采用的创造性步骤是(i)工艺减少了对酶的多步骤纯 化的需要；(ii)在本发明中pH4到10的宽范围可用于获得高比活的K-角叉菜聚糖酶； (iii)培养基无需多种组分；(iv)工艺在培养基中使用 了酶的诱导所必需的最小浓度底物；(v)工艺不需要低温(20°C)以 最大地回收k-角叉菜聚糖酵；(vi)在25。C到50。C之间的广泛温度范围
内可以最大量地回收到K-角叉菜聚糖酶；(Vii)培养基中的组分不需要 将角叉菜聚糖产生者与角叉菜聚糖酶不产生者共培养来控制K-角叉菜
聚糖酶的生产。
给出了下面的实施例用以对本发明进行说明，它们不应被解释为 限制了本发明的范围。
实施例l
将分离的假单胞菌接种到含有100ml液体培养基的250ml锥形瓶中，所述培养基含有(g.l00m1—1)角叉菜聚糖-0.003、酵母提取物-0.01、 氯化钠-0.3、磷酸氢二钾-0.04和磷酸二氢钾-0.003， pH 6.3。将它在旋 转震荡器上在30。C以180rpm (转/分钟)培养28小时。将悬浮液以 8000 rpm离心15分钟后，获得了作为无细胞提取液的粗角叉菜聚糖 酶。通过用50%硫酸铵(重量/体积)在温度为4。C下处理，并将混合 物老化24小时，对该粗角叉菜聚糖酶部分纯化。孵育后，将溶液在4°C 以8000 rpm离心15分钟，获得沉淀蛋白的沉淀。将获得的沉淀重新 悬浮在10mMTris-HCl缓冲液中，并用同样的缓冲液进行透析。使用 凝胶过滤技术将部分纯化的酶进行进一步纯化，获得比活为9.2半乳 糖单位每/mg蛋白。
实施例2
将分离的假单胞菌接种到含有100ml液体培养基的250ml锥形瓶 中，所述培养基含有(g.lOOmr1)角叉菜聚糖-0.03、酵母提取物-0.01、 氯化钠-0.3、磷酸氢二钾-0.004和磷酸二氢钾-0.03， pH 8.4。将它在旋 转震荡器上在30°C以180 rpm (转/分钟)培养28小时。将悬浮液以 8000rpm离心15分钟后，获得作为无细胞提取液的粗角叉菜聚糖酶。 通过用40%硫酸铵(重量/体积)在温度为4。C下处理:并将混合物老 化24小时，对粗角叉菜聚糖酶部分纯化。孵育后，将溶液在4°C以8000 rpm离心15分钟，获得沉淀蛋白的沉淀。将获得的沉淀重新悬浮在15 mMTris-HCl缓冲液中，并用同样的缓冲液进行透析。使用凝胶过滤技 术将部分纯化的酶进一步纯化，获得的比活为8.4半乳糖单位/mg蛋 白。
实施例3
将分离的假单胞菌接种到含有100ml液体培养基的250ml锥形瓶 中，培养基含有(g.lOOmr1)角叉菜聚糖-0.03、酵母提取物-0.1、氯化 钠-0.3、磷酸氢二钾-0.004和磷酸二氢钾-0.003， pH5.1。将它在旋转震 荡器上在35。C以180rpm (转/分钟)培养28小时。将悬浮液以8000 rpm离心15分钟后，获得作为无细胞提取液的粗角叉菜聚糖酶。通过用55%硫酸铵(重量/体积)在温度为4。C下处理，并将混合物老化24 小时，对该粗角叉菜聚糖酶部分纯化。孵育后，将溶液在4。C以8000 rpm 离心15分钟，获得沉淀蛋白的沉淀。将获得的沉淀重新悬浮在20mM Tris-HCl缓冲液中，并用同样的缓冲液进行透析。使用凝胶过滤技术将 部分纯化的酶进一步纯化，获得的比活为24.2半乳糖单位/mg蛋白。
实施例4
将分离的假单胞菌接种到含有100ml液体培养基的250ml锥形瓶 中，培养基含有(g.l00m1—1)角叉菜聚糖-0.03、酵母提取物-0.1、氯化 钠-3.0、磷酸氢二钾-0.004和磷酸二氢钾-0.003， pH8.0。将它在旋转震 荡器上在40。C以180rpm (转/分钟)培养28小时。将悬浮液以8000 rpm离心15分钟后，获得了作为无细胞提取液的粗角叉菜聚糖酶。通 过用70%硫酸铵(重量/体积)在温度为4。C下处理，并将混合物老化 24小时，对该粗角叉菜聚糖酶进行部分纯化。孵育后，将溶液在4°C 以8000 rpm离心15分钟，获得沉淀蛋白的沉淀。将获得的沉淀重新 悬浮在25 mM Tris-HCl缓冲液中，并用同样的缓冲液进行透析。使用 凝胶过滤技术将部分纯化的酶进一步纯化，获得的比活为10.5半乳糖 单位/mg蛋白。
实施例5
将分离的假单胞菌接种到含有100ml液体培养基的250ml锥形瓶 中，培养基含有(g.lOOmr1)角叉菜聚糖-0.003、酵母提取物-0.1、氯 化钠-3.0、磷酸氢二钾-0.04和磷酸二氢钾-0.003, pH 8.4。将它在旋转 震荡器上在25°C以180 rpm (转/分钟)培养28小时。将悬浮液以8000 rpm离心15分钟后，获得了作为无细胞提取液的粗角叉菜聚糖酶。通 过用30%硫酸铵(重量/体积)在温度为4。C下处理，并将混合物老化 24小时，对该粗角叉菜聚糖酶进行部分纯化。孵育后，将溶液在4°C 以8000 rpm离心15分钟，获得沉淀蛋白的沉淀。将获得的沉淀重新 悬浮在15mMTris-HCl缓冲液中，并用同样的缓冲液进行透析。使用 凝胶过滤技术将部分纯化的酶进一步纯化，获得的比活为16.2半乳糖单位/mg蛋白。 实施例6
将分离的假单胞菌接种到含有100ml液体培养基的250ml锥形瓶 中，培养基含有(g.l00m1—1)角叉菜聚糖-0.03、酵母提取物-0.01、氯 化钠-3.0、磷酸氢二钾-0.04和磷酸二氢钾-0.03， pH7.1。将它在旋转震 荡器上在25。C以180 rpm (转/分钟)培养28小时。将悬浮液以8000 rpm离心15分钟后，获得作为无细胞提取液的粗角叉菜聚糖酶。通过 用40%硫酸铵(重量/体积)在温度为4。C下处理，并将混合物老化24 小时，对该粗角叉菜聚糖酶进行部分纯化。孵育后，将溶液在4°C以 8000 rpm离心15分钟，获得沉淀蛋白的沉淀。将获得的沉淀重新悬浮 在15 mM Tris-HCl缓冲液中，并用同样的缓冲液进行透析。使用凝胶 过滤技术将部分纯化的酶进一步纯化，获得的比活为14.8半乳糖单位 /mg蛋白。
实施例7
将分离的假单胞菌接种到含有100ml液体培养基的250ml锥形瓶 中，培养基含有(g.lOOml'1)角叉菜聚糖-0.03、酵母提取物-0.1、氯化 钠-0.3、磷酸氢二钾-0.04和磷酸二氢钾-0.03， pH9.0。将它在旋转震荡 器上在40°C以180 rpm (转/分钟)培养28小时。将悬浮液以8000 rpm 离心15分钟后，获得了作为无细胞提取液的粗角叉菜聚糖酶。通过用 75%硫酸铵(重量/体积)在温度为4。C下处理，并将混合物老化24小 时，对该粗角叉菜聚糖酶进行部分纯化。孵育后，将溶液在4°C以8000 rpm离心15分钟，获得沉淀蛋白的沉淀。将获得的沉淀重新悬浮在30 mMTris-HCl缓冲液中，并用同样的缓冲液进行透析。使用凝胶过滤技 术将部分纯化的酶进一步纯化，获得的比活为8.9半乳糖单位/mg蛋 白。
实施例8
将分离的假单胞菌接种到含有100ml液体培养基的250ml锥形瓶中，培养基含有(g.l00mr1)角叉菜聚糖-O.O(B、酵母提取物-0.1、氯 化钠-3.0、磷酸氢二钾-0.004和磷酸二氢钾-0.03， pH7丄将它在旋转 震荡器上在30。C以180 rpm (转/分钟)培养28小时。将悬浮液以8000 rpm离心15分钟后，获得作为无细胞提取液的粗角叉菜聚糖酶。通过 用65%硫酸铵(重量/体积)在温度为4。C下处理，并将混合物老化24 小时，对该粗角叉菜聚糖酶进行部分纯化。孵育后，将溶液在4°C以 8000 rpm离心15分钟，获得沉淀蛋白的沉淀。将获得的沉淀重新悬浮 在25 mM Tris-HCl缓冲液中，并用同样的缓冲液进行透析。使用凝胶 过滤技术将部分纯化的酶进一步纯化，获得的比活为11.4半乳糖单位 /mg蛋白。
实施例9
将分离的假单胞菌接种到含有100ml液体培养基的250ml锥形瓶 中，培养基含有(g.lOOml'1)角叉菜聚糖-0.03、酵母提取物-0.01、氯 化钠-3.0、磷酸氢二钾-0.04和磷酸二氢钾-0.003， pH 6.3。将它在旋转 震荡器上在3(TC以180 rpm (转/分钟)培养28小时。将悬浮液以8000 rpm离心15分钟后，获得作为无细胞提取液的粗角叉菜聚糖酶。通过 用55%硫酸铵(重量/体积)在温度为4。C下处理，并将混合物老化24 小时，对该粗角叉菜聚糖酶进行部分纯化。孵育后，将溶液在4°C以 8000 rpm离心15分钟，获得沉淀蛋白的沉淀。将获得的沉淀重新悬浮 在15mMTris-HCl缓冲液中，并用同样的缓冲液进行透析。使用凝胶 过滤技术将部分纯化的酶进行进一步纯化，获得的比活为11.8半乳糖 单位/mg蛋白。
实施例10
将分离的假单胞菌接种到含有100ml液体培养基的250ml锥形瓶 中，培养基含有(g.lOOml")角叉菜聚糖-0.003、酵母提取物-0.1、氯 化钠-0.3、磷酸氢二钾-0.04和磷酸二氢钾-0.03， pH5.1。将它在旋转震 荡器上在35。C以180rpm (转/分钟)培养28小时。将悬浮液以8000 rpm离心15分钟后，获得了作为无细胞提取液的粗角叉菜聚糖酶。通过用35%硫酸铵(重量/体积)在温度为4。C下处理，并将混合物老化 24小时，对该粗角叉菜聚糖酶进行部分纯化。孵育后，将溶液在4°C 以8000 rpm离心15分钟，获得沉淀蛋白的沉淀。将获得的沉淀重新 悬浮在25 mM Tris-HCl缓冲液中，并用同样的缓冲液进行透析。使用
凝胶过滤技术将部分纯化的酶进行进一步纯化，获得的比活为17.3半 乳糖单位/mg蛋白。
实施例11
将分离的假单胞菌接种到含有100ml液体培养基的250ml锥形瓶 中，培养基含有(g.l00m1—1)角叉菜聚糖-0.003、酵母提取物-0.01、氯 化钠-3.0、磷酸氢二钾-0.004和磷酸二氢钾-0.03， pH 4.5。将它在旋转 震荡器上在40。C以180 rpm (转/分钟)培养28小时。将悬浮液以8000 rpm离心15分钟后，获得作为无细胞提取液的粗角叉菜聚糖酶。通过 用70%硫酸铵(重量/体积)在温度为4。C下处理，并将混合物老化24 小时，对该粗角叉菜聚糖酶进行部分纯化。孵育后，将溶液在4°C以 8000 rpm离心15分钟，获得沉淀蛋白的沉淀。将获得的沉淀重新悬浮 在30mMTris-HCl缓冲液中，并用同样的缓冲液进行透析。使用凝胶 过滤技术将部分纯化的酶进一步纯化，获得的比活为5.9半乳糖单位 /mg蛋白。
实施例12
将分离的假单胞菌接种到含有100ml液体培养基的250ml锥形瓶 中，培养基含有(g.lOOmr1)角叉菜聚糖-0.003、酵母提取物-0.01、氯 化钠-0.3、磷酸氢二钾-0.004和磷酸二氢钾-0.003， pH5.1。将它在旋转 震荡器上在35。C以180 rpm (转/分钟)培养28小时。将悬浮液以8000 rpm离心15分钟后，获得作为无细胞提取液的粗角叉菜聚糖酶。通过 用40%硫酸铵(重量/体积)在温度为4。C下处理，并将混合物老化24 小时，对该粗角叉菜聚糖酶进行部分纯化。孵育后，将溶液在4°C以 8000 rpm离心15分钟，获得沉淀蛋白的沉淀。将获得的沉淀重新悬浮 在15mMTris-HCl缓冲液中，并用同样的缓冲液进行透析。使用凝胶过滤技术将部分纯化的酶进一步纯化，获得的比活为17.4半乳糖单位 /mg蛋白。
实施例13
将分离的假单胞菌接种到含有100ml液体培养基的250ml锥形瓶 中，培养基含有(g.lOOmr1)角叉菜聚糖-0.3、酵母提取物-0.04、氯化 钠-3.0、磷酸氢二钾-0.03和磷酸二氢钾-0.01， pH5.6。将它在旋转震荡 器上在35°C以180rpm (转/分钟)培养28小时。将悬浮液以8000 rpm 离心15分钟后，获得了作为无细胞提取液的粗的角叉菜聚糖酶。通过 用60%硫酸铵(重量/体积)在温度为4°C下处理，并将混合物老化24 小时，对该粗角叉菜聚糖酶进行部分纯化。孵育后，将溶液在4°C以 8000 rpm离心15分钟，获得沉淀蛋白的沉淀。将获得的沉淀重新悬浮 在20mMTris-HCl缓冲液中，并用同样的缓冲液进行透析。使用凝胶 过滤技术将部分纯化的酶进一步纯化，获得的比活为188.8半乳糖单 位/mg蛋白。
优点
本发明的主要优点是
1. 为了以简单的方式最大化K-角叉菜聚糖酶的生产，使用统计 学优化方法，确定了具有最少组分以及它们最适浓度的用于生长新细 菌的新培养基组合物，统计学优化方法减少实验的数量、节省时间和 化学物质，并且通过观察影响酶产生的所有因素的组合效应，提高了 结果的真实可靠性。
2. 本发明提供了具有高达200半乳糖单位/mg蛋白的高比活zc-角叉菜聚糖酶。
3. 本发明的K-角叉菜聚糖酶的分子量为128Kda。
4. 本发明的K-角叉菜聚糖酶具有极好的K-角叉菜聚糖水解活性。
5. 本发明的K-角叉菜聚糖酶在碱性和酸性条件下具有活性。
6. 本发明的/c-角叉菜聚糖酶的温度稳定性较高。7. 本发明的/C-角叉菜聚糖酶的底物特异性高。
8. 本发明的/C-角叉菜聚糖酶的储存稳定性延长。
9. 本发明的K-角叉菜聚糖酶具有产生长心卡帕藻《a/^叩—c^ a/vawzz'/的原生质体的能力。
权利要求
1. 用于制备κ-角叉菜聚糖酶的方法，其中所述方法包括下列步骤(i)将登记号为MTCC 5261的耐盐海洋细菌假单胞菌(Pseudomonas sp.)在15-50℃培养于液体培养基中16-72小时以获得培养物，所述培养基含有角叉菜聚糖、酵母提取物、氯化钠、K2HPO4和KH2PO4，比例范围分别为0.1:1.0:50:1:0.5到3.0:1.0:15.0:0.5:.05；(ii)将从步骤(i)获得的培养物在5000-8000rpm离心20-40分钟，获得作为上清液的无细胞提取液；(iii)从步骤(ii)获得的上清液中纯化粗酶，是通过用硫酸铵在3-15℃的温度下处理上清液，将混合物老化12-36小时的一段时间，然后在3-15℃下以5000-8000rpm离心，得到含有κ-角叉菜聚糖酶的沉淀；(iv)将从步骤(iii)获得的沉淀悬浮在Tris-HCl缓冲溶液中；和(v)将在步骤(iv)中获得的悬浮液透析以除去附着的硫酸铵，然后通过凝胶过滤得到所需的纯化κ-角叉菜聚糖酶。
2. 权利要求1中要求的方法，其中所述细菌假单胞菌具有下面的特点a) 嗜盐；b) 革兰氏阴性，显示出革兰氏染色可变性； C)游动的好氧杆菌；d)它降解海藻多糖，即k-角叉菜聚糖。
3. 权利要求1中要求的方法，其中所述k-角叉菜聚糖酶的比活在10-200半乳糖单位/mg蛋白的范围内。
4. 权利要求1中要求的方法，其中所述k-角叉菜聚糖酶的分子量 为128KDa。
5.基本上按照本文的描述并参考实施例和本说明书附图
制备K-角 叉菜聚糖酶的方法。
全文摘要
从腐烂的海藻分离到的嗜盐海洋革兰氏阴性细菌能够水解κ-角叉菜聚糖。为了以成本合算的方式最大化κ-角叉菜聚糖酶的生产，通过统计学优化方法确定了具有最少组分和它们的最适浓度的新培养基。因此开发出了新的培养基组合物，用于通过新的耐盐海洋细菌假单胞菌提高κ-角叉菜聚糖酶的生产。
文档编号C07K14/21GK101415722SQ200680054085
公开日2009年4月22日 申请日期2006年8月29日 优先权日2006年3月28日
发明者卡尔帕纳·哈瑞西·莫迪, 布哈瓦纳斯·杰哈, 雅斯闵·纳杰姆丁·克哈姆布哈提 申请人:科学和工业研究委员会