用于治疗癌症的抑制性多核苷酸组合物和方法

专利名称：用于治疗癌症的抑制性多核苷酸组合物和方法
用于治疗癌症的抑制性多核苦酸组合物和方法 发明领域
本发明总的说来涉及用于诱导作为癌症治疗的药征(moda U t y ) 的RNA干扰的多核苷酸。更具体地，本发明涉及针对牵涉癌前细胞、 癌细胞或肿瘤细胞的增殖和/或转移的某些基因的靶寡核苷酸序列。
背景技术：
癌症或癌症前期增生(precancerous growth)通常是指恶性肿 瘤而非良性肿瘤。恶性肿瘤比良性肿瘤生长更快，并且它们渗透和破 坏局部组织。 一些恶性肿瘤可通过经由血液或淋巴系统转移扩散至全 身。不可预测的和不受控制的生长使得恶性癌非常危险并且在许多情 况下是致命的。
恶性癌的治疗在癌症发生的早期是最有效的。因此在早期肿瘤形 成中鉴定和确认治疗靶以及确定有效的肿瘤生长或基因表达抑制元件 或与其相关的因子是极其重要的。
RM干扰(RMi)是其中双链RNA (dsRM)以序列特异性的方式抑 制基因表达的转录后过程。RNAi过程以至少两个步骤发生在第一步 骤中，较长的dsRNA;R内源核糖核酸酶Dicer切成长度通常小于100-、 50-、 30-、 23-,或21-个核苷酸的较短的dsRM,称为"小干扰RM" 或siRNA。在第二步骤中，这些siRM被整合入称为RNA诱导的沉默 复合体(RISC; Hammond, S. M.,等人，Nature (2000) 404: 293-296) 的多组分核糖核酸酶(mult icomponent-ribonuclease ) 。 siRNA的一 条链保持与RISC结合，并且指导复合体朝向具有与RISC中的向导 ss-siRNA(guider ss-siRNA)互补的序列的关联RNA (cognate RM )。 该siRNA-指导的内源核酸酶降解RNA，从而使其失活。该RNAi效应可 通过向细胞中导入针对靶序列的较长的dsRM或较短的siRNA来获得。也已证明RNAi效应可通过导入产生与靼基因互补的dsRNA的质粒 来获得。关于有关各种生物中的RNAi的公开内容，参见，W0 99/32619 (Fire等人)；W0 99/53050 (Waterhouse等人)；WO 99/61631 (Heifetz等人)；Yang, D.， 等人，Curr. Biol. (2000) 10: 1191-1200), WO 00/44895 (Limmer);和DE 101 00 586.5 (Kreutzer 等人)。
RNAi已成功用于果绳(Kennerdell等人(2000) Nature Biotech 18: 896-898; Worby等人(2001) Sci STKE Aug 14， 2001 (95): PL1; Schmid等人(2002) Trends Neurosci 25 (2) :71-74; Ham瞧d等人 (2000). Nature, 404: 293-298)、线虫(Tabara等人(1998) Science 282: 430-431; Kamath等人(2000) Genome Biology 2: 2.1-2.10; Grishok 等人(2000) Science 287: 2494-2497)和斑马鱼 (Ke腸rdell等人(2000) Nature Biotech 18: 896-898)中的基因 功能确定。存在许多关于非人哺乳动物和人细胞培养物中的MAi效应 的才艮导(Manche等人 (1992). Mol. Cell. Biol. 12:5238-5248; Minks等人(1979). J. Biol. Chem. 254:10180- 10183; Yang等 人 (2001) Mol. Cell Biol. 21 (22): 7807-7816; Paddison等人 (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(3): 1443-1448; Elbashir 等人(2001) Genes Dev 15 (2): 188-200; Elbashir等人(2001) Nature 411: 494-498; Caplen等人(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9746-9747; Holen等人(2002) Nucleic Acids Research 30 (8): 1757-1766; Elbashir等人(200D EMBO J 20: 6877-6888; Jarvis等人 (2001) TechNotes 8(5): 3-5; Brown等人 (2002) TechNotes 9(1):3-5;Br画elkamp 等人 (2002) Science 296:550-553; Lee等人(2002) Nature Biotechnol. 20:500-505; Miyagishi等人(2002) Nature Biotechnol. 20:497- 500; Paddison 等人(2002) Genes & Dev. 16:948-958; Paul等人(2002) Nature Biotechnol. 20.505-508; Sui等人(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (6): 5515—5520; Yu等人(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA99 (9): 6047-6052)。 发明概述
本发明提供了用于治疗疾病例如癌症的组合物和方法。组合物通 过刺激基因表达的RM千扰的过程有效地沉默、下调或抑制经确认的 靶基因的表达。组合物和方法从而抑制肿瘤生长。本发明还提供了通 过使用中和抗体或小分子药物使经确认的靶基因产物失活以抑制肿瘤 生长来治疗疾病例如癌症的方法。
更具体地，组合物和方法针对哺乳动物中与靶基因的病理性表相 关的癌症或癌症前期增生，所述靶基因选自ICT-1053基因、或 ICT-1052基因、或ICT一1027基因、或ICT—1051基因、或ICT-1054 基因、或ICT-1020基因、或ICT-1021基因、或ICT-1022基因(本文 中的"耙基因")。当组合物被导入哺乳动物的组织时，其抑制靶基因 的表达。方法包括以有效抑制癌组织或器官中的靶基因表达的量给有 此需要的受试者施用本发明的组合物。
在第一方面，本发明提供了其长度为200个或更少的核苷酸的分 离的耙向性多核苷酸。该多核普酸包括靶向靶基因或其互补序列的第 一核苷酸序列。第一核苷酸序列或其互补序列是长度为15至30之间 的任何数目的核苷酸，并且在几个实施方案中长度为21至25个核苷 酸。
在另一个方面，前述段落中所述的本发明的多核苷酸还包括通过 环序列与第一核苷酸序列分隔的第二核苷酸序列；第二核苷酸序列
a) 具有与第一核苷酸序列大体相同的长度，和
b) 与第一核苷酸序列大体上互补，这样多核苷酸在适合于第一和 第二核苷酸序列杂交的条件下形成发夹结构。
在前面段落中描述的线性多核苷酸发夹多核苷酸的许多实施方 案中，第一核苷酸序列由下列序列组成
a)耙向选自SEQ ID NO: 7-76、 81-84和89-242的序列(本文中的
"耙序列")的序列；b) 比a)项中给出的靶向性序列更长并且包含其的延长的序列，其 中延长的序列靶向靶基因，并且靶向性序列靶向靶序列；
c) 靶向靶序列、长度至少为15个核苦酸，并且比选择的靶序列 更短的序列片段；
d) 其中与选择的靶序列相异多至5个核苷酸的靶向性序列；或
e) a)-d)中给出的序列的互补序列。
在一般的实施方案中，本文中描述的线性多核苷酸由靶序列组 成，并且任选地包含与选择的序列的3'结合的二核苷酸突出端 (overhang)。在相关的一般实施方案中，本文中描述的发夹多核苷 酸由第一选择的靼核苷酸序列、环序列和大体上与靶序列互补的第二 核苷酸序列组成。
在另外的实施方案中，多核苷酸是DNA、或RM，或多核苷酸包 含脱氧核糖核普酸和核糖核苷酸两者。
在另外的方面，本发明提供了包含本文中描述的第一靶向性线性 多核苷酸链和第二多核普酸链的双链多核苷酸，所述第二多核苷酸链 包含大体上与第一多核苷酸链的至少第一核苷酸序列互补和与其杂交 的第二核苷酸序列。
在另外的方面，本发明提供了多核苷酸的组合或混合物，所述組 合或混合物包含多个本文中描述的靶向性线性多核苷酸、双链多核苷 酸和/或发夹多核苷酸，其中各多核苷酸靶向一个或多个选择的靶基因 中的不同的选择的靶序列。
在另外的方面，本发明提供了包含本文中描述的靶向性线性多核 苷酸或靶向性发夹多核苷酸的载体。在普通的实施方案中，载体是质 粒、粘粒、重组病毒、逆转录病毒栽体、腺病毒载体、转座子或微型 染色体。
在载体的另外的一般实施方案中，控制元件与靶向性多核苷酸有 效连接，以有效地促进其表达。另外的方面提供了用一个或多个本文 中描述的线性多核苷酸转染的细胞或用一个或多个本文中描述的发夹 多核苷酸转染的的细胞或用所述多核苷酸的组合转染的细胞。在另外的方面，本发明提供了包含一种或多种本文中描述的线性 多核苷酸或发夹多核苷酸或其混合物和药学上可接受的载体的药物组 合物，其中各多核苷酸靶向靶基因的不同靶序列或其任何两个或更多 个靶序列。
在另外的方面，本发明提供了合成具有靶向本文中描述的靼基因
的序列的多核苷酸的方法。方法包括步骤
a) 提供包含活性反应末端且相应于序列的第一末端上的核苷酸 的核苷酸试剂，
b) 加入包含活性反应末端且相应于序列的相继位置的另外的核 苷酸试剂，以与来自前述步骤的活性反应末端反应并且使生长的多核 苷酸序列的长度增加1个核苷酸，然后除去不期望的产物和过量试剂， 和
c) 重复步骤b)直至已加入相应于序列的第二末端上的核苷酸的 核苷酸试剂；
从而提供完整的多核苷酸。
在另外的方面，本发明提供了抑制癌细胞生长的方法，该方法包 括在促进一种或多种多核苷酸并入细胞内的条件下，将细胞与包含一
其混合物的组合物接触。
在另外的实施方案中，本发明提供了促进癌细胞凋亡的方法，所 述方法包括在促进一种或多种多核苷酸并入细胞内的条件下，将细胞 与包含一种或多种本文中描述的乾向性线性多核苷酸或靼向性发夹多 核苷酸或其混合物的组合物接触。
在另一个方面，本发明提供了用于抑制哺乳动物组织中的癌症或 癌症前期增生的方法，其中方法包括将组织与和DNA或RNA相互作用 的本发明的抑制性靶向性多核苷酸接触，所述DM或RNA包含一种或 多种耙基因。耙向性多核苷酸抑制所述组织的细胞中的 一种或多种靶 基因的表达。在该方法的几个实施方案中，组织是乳腺组织、结肠组 织、前列腺组织、皮肤组织、骨组织、腮腺組织、胰腺组织、肾组织、子宫颈组织、淋巴结組织或卵巢组织。此外，抑制性靶向性多核苷酸
是核酸分子、诱饰分子、诱斜DM、双链DNA、单链DM、复合DNA(国plexedDM)、被封装的DM ( encapsulated DNA )、病毒DNA、质粒DNA、棵露的RNA、被封装的RM、病毒RNA、双链RNA、分子或其组合。
在另外的方面，本发明提供了本文中描述的靶向性线性多核苷酸或靶向性发夹多核苷酸或其两种或更多种的混合物在制造有效治疗受试者的癌症或癌症前期增生的药物组合物中的用途，其中各多核苷酸靶向靶基因。在该用途的几个实施方案中，癌症或增生见于选自乳腺组织、结肠组织、前列腺组织、皮肤组织、骨组织、腮、腺组织、胰腺组织、甲状腺组织、肾组织、子宫颈组织、肺组织、淋巴结组织、骨髓的造血组织或卵巢组织的组织。在另外的该用途的一般实施方案中，各多核苷酸中的第一核苷酸序列由下列序列组成
a) 耙向选自SEQ ID NO:7-76、 81-84和89-242的序列(本文中的"靶序列")的序列；
b) 比a)项中给出的靶向性序列更长并且包含其的延长的序列，其中延长的序列靶向靶基因，并且靶向性序列靶向靶序列；
c) 乾向耙序列的、长度至少为15个核苷酸，并且比选择的靶序列更短的序列片段；
d) 其中与选择的靶序列相异多至5个核苷酸的靶向性序列；或
e) a)-d)中给出的序列的互补序列。在另外的用途的实施方案中，受试者是人。在另外的方面，本发明提供了一种或多种抗靶基因的产物多肽的
抗体在制造有效治疗受试者的癌症、肿瘤或癌症前期增生的药物组合物中的用途。
附图概述


图1.本发明的多核苷酸的不同实施方案的图示。图A，线性多核苷酸的实施方案。长度为200个多核苷酸或更少，和15个核苷酸或更多。在b)中，指定的靶向性序列包含在更大的靶向性序列中。在d)中，更黑的直条图示被置换的核普酸。图B，总长度200个多核苷酸或更少的发夹多核苷酸的实施方案。
图2. MDA-MB-435异种移植物的肿瘤大小随时间响应使用ICT-1053 (PCDP10) siRNA、或对照siRNA的转染的变化的图示。数据表示为平均值+/- SE。
图3. MDA-MB-435异种移植物的肿瘤大小随时间响应使用ICT-1052 (cMet) siRNA或对照siRM的转染的变化的图示。数据表示为平均值+/- SE。
图4. A549异种移植物的肿瘤大小随时间响应使用ICT-1052(cMet) siRM或对照siRNA的转染的变化的图示。数据表示为平均值+/- SE。
图5.当用ICT—1052 siRNA或ICT-1053 siRNA或对照siRNA处理时，对培养物中的MDA-MB-4 35细胞的增殖的抑制的图示。数据表示为平均值。
图6.当用ICT-1052 siRNA或ICT-1053 siRNA或对照siRNA处理时，对培养物中的HCT116人结肠癌细胞的增殖的抑制的图示。数据表示为平均值+/- SE。
图7.当用ICT-1052 siRNA或对照siRNA处理时，对培养物中的A549人肺癌细胞的增殖的抑制的图示。数据表示为平均值+/-3￡。
图8. MDA-MB-435异种移植物的肿瘤大小随时间响应使用ICT-1027 (GRB2 BP) s iRNA或对照s iRNA的转染的变化的图示。数据表示为平均值+/- SE。
图9. 响应4吏用 ICT-1027 siRNA或对照siRNA的处理的MDA-MB-435细胞的细胞凋亡的诱导的图示。数据表示为平均值+/- SE。
图10. MDA-MB-435异种移植物的肿瘤大小随时间响应使用ICT-1051 (A-Raf) siRNA或对照siRNA的转染的变化的图示。数据表示为平均值+/- SE。
图11. MDA-MB-435异种移植物的胂瘤大小随时间响应使用ICT-1054 (PCDP6) siRNA或对照siRNA的转染的变化的图示。数据表示为平均值+/- SE。
图12. MDA-MB-435异种移植物的肿瘤大小随时间响应使用ICT-1020 (Dicer) siRNA或对照siRNA的转染的变化的图示。数据表示为平均值+/- SE。
图13. MDA-MB-435异种移植物的肺瘤大小随时间响应使用ICT-1021 (MD2蛋白)siRNA或对照siRNA的转染的变化的图示。数据表示为平均值+/- SE。
图14. MDA-MB-435异种移植物的肿瘤大小随时间响应使用ICT-1022 (GAGE-2) siRNA或对照siRNA的转染的变化的图示。数据表示为平均值+/- SE。
发明详述
本文中鉴定的所有专利、专利申请公开物和专利申请通过以它们的全文引用合并入本文，就如同在本文中逐字表现的那样。本文中鉴定的所有技术出版物也通过引用合并入本文。
在本发明的描述中，冠词"a" 、 "an"和"the"都同样地表示单数或复数。根据其中使用它们的上下文，这些冠词的特殊意义是显而易见的。
如本文中所使用的，术语"胂瘤"是指所有赘生性细胞的生长和增殖，无论是恶性的还是良性，以及所有癌症前期的细胞和组织及癌细月包和纟且织。
如本文中所使用的，"癌症前期的"是指具有与可导致恶性肺瘤或癌症的变化相关的特征的细胞或组织。
如本文中所使用的，术语"癌症"是指具有特征例如不受控制的增殖、特化功能的丧失、永生性、显著的转移潜能、抗细胞凋亡活性的显著增加、快速的生长和增殖速度以及某些特征性形态学和细胞标志物的细胞或组织。在一些情况下，癌细胞将以肿瘤的形式存在，此类细胞可局部存在于动物中，和在其他情况下，它们可以以独立的细胞形式例如白血病细胞在血流中循环。
如本文中所使用的，术语"草巴"序列以及相似的术语和短语涉及存在于癌细胞的核酸中的本发明的多核苷酸所针对的核苷酸序列。"靶基因"是指表达的基因，其中基因表达的水平或基因产物的活性水平的调控阻止和/或改善疾病的进展。特别地，本发明中的靶基因包括本文中描述的内源基因和它们的变体。
耙向性多核苷酸a)通过包含其互补序列与病原体的基因组中包含的特定子序列(称为靶序列)同源或同一的序列，或b)通过包含其本身与靶序列同源或同 一的序列来靶向癌细胞的核酸序列。在细胞内有效的輩巴向性多核苷酸是由a)和b)中指定的每种链的一条链组成的双链分子。据认为，这样靶向癌细胞的核酸序列的任何双链靶向性多核苷酸具有按照RNA干扰现象与靶序列杂交的能力，从而起始RNA干扰。
受试者中的靶基因可具有与在例如各种GenBank登录条目中和相似的数据库的条目中鉴定的野生型序列同一的序列；通常此类数据库是对公众公开的。然而，用于抑制靶基因表达的干扰RNA可以不与其耙完全互补，或者靶可以与被认为是野生型序列(由现有GenBank目录号提供的)的序列不同。例如，靶基因可包含一个或多个单多核苷酸多态性，从而与GenBank登录号中的序列略有不同。此外，靶基因可产生作为外显子的可变剪接的产物的mRNA，从而导致具有比染色体基因更少的外显子的成熟mRNA。这样的可变剪接的mRNA也可以是针对野生型基因的RNAi类别的靶。在本公开内容中，所有此类可能发生的事件包括在靶基因的概念内，并且经开发用于靶向野生型序列的任何RNAi类别潜在地革S向此类改变的或经修饰的转录物并且包括在耙向性序列的概念内。
通常，"基因"是基因组中能够被转录成具有调控功能、催化功能和/或编码蛋白质的RNA的区域。真核基因通常具有内含子和外显子，所述内含子和外显子可组织起来产生编码成熟蛋白质的可变形式的不同RNA剪接变体。本领域技术人员将认识到，本发明包括可发现的所有内源基因，包括由于可选的启动子位点或可选的多腺苷酸化位点而产生的剪接变体、等位基因变体和转录物。本文中描述的内源基因还可以是突变的内源基因，其中突变可以在编码区或调控区。
"反义RNA":在真核生物中，RNA聚合酶催化结构基因的转录，从而产生mRNA。可设计DNA分子使之包含RNA聚合酶模板，其中RM转录物具有与优选mRNA的序列互补的序列。该RNA转录物称为"反义RNA，，。反义RNA分子可抑制mRNA表达(例如，Rylova等人，CancerRes, 62 (3) :801-8， 2002; Shim等人，Int. J. Cancer, 94(1) :6-15，2001)。
"反义DM"或"DM诱辨"或"诱辨分子相对于笫一核酸分子，用其为笫一分子或其部分的互补序列或与第一分子或其部分的互补序列同源的序列产生的第二 DNA分子或第二嵌合核酸分子，称为第一分子的反义DM或DNA诱斜或诱斜分子。术语"诱饵分子"还包括核酸分子，所述核酸分子可以是单链或双链的，包括DM或PNA (肽核酸)(Mischiati等人，Int. J. Mol. Med. ， 9 (6) :633-9， 2002)，以及包含蛋白质结合位点(优选调控蛋白的结合位点和更优选转录因子的结合位点)的序列。反义核酸分子(包括反义DM和诱斜DNA分子)的应用在本领域内是已知的，例如，Morishita等人，Ann. N YAcad. Sci., 947:294-301， 2001; Andratschke等人，AnticancerRes， 21: (5)3541-3550， 2001。
"稳定的RNA":通过例如^f吏用在核糖的3'位置上被^夢饰(例如，通过包含如上定义的取代的或未取代的烷基、烷氧基、烯基、烯
酸类似物，使在本文中所描述的稳定的RNAi、 siRNA或shRNA免受核酸外切酶包括RNA酶的降解。还可通过包含3'-3'-连接的二核苷酸结构(0rtigao等人,Antisense Research and Development 2. 129-146(1992))和/或两个经#"饰的磷酯键(phospho bond)例如两个石危代磷酸酯键来稳定RNAi、 siRM或shRNA， ^f吏之3'末端免受外切核酸酶降"被封装的核酸"(包括被封装的DNA或被封装的RNA )是指微球或微粒中的核酸分子和用材料包被的核酸分子，所述材料是相对非免疫原性的且经历选择性酶促降解，例如通过材料例如明胶和硫酸软骨素的复凝聚法合成的微球或微粒(参见，例如美国专利6， 410， 517)。微球或微粒中的被封装的核酸以使其保留其诱导其编码序列表达的能力的方式进行封装(参见，例如，美国专利6， 406，719)。
"抑制剂"是指抑制和/或阻断已鉴定的功能的分子。任何具有抑制和/或阻断已鉴定的功能的潜力的分子可以是本文中描述的"受试分子"。例如，当提及乾基因的致癌功能或抗细胞凋亡活性时，可使用特定靶基因的体外和体内测定来鉴定此类分子。抑制剂是部分或完全阻断革G基因活性、减少、阻止或延迟它们的激活或使其细胞应答不敏感的化合物。这可通过直接结合靶基因产物(即蛋白质)或经由其他中间分子结合靶基因产物来实现。阻断靶基因的基因产物的活性(包括耙基因的致癌功能或抗细胞凋亡活性的抑制)的拮抗剂或抗体例如单克隆或多克隆抗体被认为是这样的抑制剂。根据本发明的抑制剂是siRNA、 RNAi、 shRNA、反义RNA、反义DNA、 i秀饰分子、i秀饰DNA、双链DM、单链DNA、复合DNA、被封装的DNA、病毒DM、质粒DNA、棵露的RNA、被封装的MA、病毒RNA、双链RNA、能够产生RNA干扰的分子或其组合。本发明的抑制剂种类还包括靶基因的经遗传修饰的形式，例如具有改变的活性的形式。因此所述种类包括天然存在的蛋白质以及合成的配体、拮抗剂、激动剂、抗体、小化学分子等。
"抑制剂的测定法，，是指实验方法，包括，例如，在体外，在细胞中表达耙基因，使用假定的抑制剂化合物，然后确定对靶基因活性或转录的功能效应。使用潜在的抑制剂处理包含或怀疑包含靶基因的样品。此类抑制剂包括基于核酸的分子，例如siRNA、反义核酸、双链RNA和DNA或双链RNA/DM、核酶和三链体(triplex )等；和基于蛋白质的分子，例如肽、合成的配体、截断的部分蛋白质、可溶性受体、单克隆抗体、多克隆抗体、胞内抗体(intrabody)和单链抗体等；以及以不同形式存在的小化学分子。通过将来自目的样品的活性测量值与对照样品相比较来检查抑制或改变的程度。确立阈水平以估量抑
制。例如，当与适当的对照相比，靶基因活性值为80%或更低时，则认为获得靶基因产物多肽的抑制。
如本文中所使用的，当第 一序列或子序列在序列或子序列的每一个位点上具有与第二序列或子序列相同的碱基时，第 一序列或子序列
与第二序列或子序列是"同一的"或具有"iooy。的同一性"，或用表
达100%的同一性的概念的术语或短语描述。在确定同一性中，任何T
(胸苷)或其任何衍生物、或u(尿苷)或其任何衍生物是相互等同的，
从而是同一的。对于为同一的第一和第二序列不允许存在缺口 (gap)。靶向性多核苷酸的序列或其互补序列可以与靶序列完全同一，或其可以在序列的特定位点包含错配的碱基。本文中详尽地描述了错配的掺入。不希望受理论束縛，据认为，错配的掺入为最优化对所述的特定靶序列的RN A干扰现象提供了期望的在生理条件下的杂交的稳定性程度。同一性的程度决定了两个序列中其碱基相互同一的位点的百分数。如下式所示计算"序列同一性的百分数"
。,门 ^ 同一的碱基的数目 inn%同一性 一 碱基的总数X 100
彼此低于100%的同一性的序列是彼此"相似的，，或"同源的"；
的百分数的同意术语。例如，彼此之间展示至少60%的同一性、或优选至少65%的同一性、或优选至少70%的同一性、或优选至少75%的同一性、或优选至少80%的同一性、或更优选至少85%的同一性、或更优选至少90%的同一性、或更优选至少95%的同一性的两个序列是彼此之间"相似的"或"同源的，，。可选地，关于siRM分子的寡核苷酸序列，相异5个或更少的碱基，或4个或更少的碱基，或3个或更少的碱基，或2个或更少的碱基或1个碱基的两个序列称为彼此"相似的"或"同源的"。
"同一性，，和"相似性"可另外地通过已知的方法容易地计算，所述方法包括但不限于Computational Molecular Biology, Lesk. A.M. ， ed. ， Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed. , AcademicPress, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, PartI. Griffin, A. M., 和Griffin, H. G. ， eds. Humana Press, NewJersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, vonHeinje, G. ， Academic Press, 1987; 以及Sequence Analysis PrimerGribskov, M. 和Devereux， J. ， eds. ， M Stockton Press. New York,1991;以及Carillo， H.，和Lipman， D. ， SIAM J. Applied Math.(1988) 48: 1073中描述的方法。用于比较的序列的比对的方法在本领域内是熟知的。用于比较的序列的最优比对可通过Smith和Waterman, Adv. Appl. Math. ， 2: 482， 1981的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch， J. Mol. Biol. ， 48: 443， 1970的同源性比对算法；通过Pearson和Lipman， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8:2444， 1988的相似性搜寻方法；通过这些算法的计算机化执行来进行，所述算法的计算化执行包括但不限于由Intelligenetics，Mountain View, California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL、Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(GCG)， 7 Science Dr. ， Madison, Wisconsin, USA的GAP、 BESTFTT、BLAST、FASTA和TFASTA;CUJSTAL程序由Higgins和Sharp, Gene， 73:237-244， 1988; Corpet，等人，Nucleic Acids Research, 16:881-901988; Huang, 等人，Computer Applications in the Biosciences,8: 1-6， 1992; 和Pearson, 等人，Methods in Molecular Biology,24: 7-331, 1994进行了详尽的描述。可用于数据库相似性检索的BLAST程序家族包括用于核苷酸查询序列对核苷酸数据库序列的BLASTN;用于核苷酸查询序列对蛋白质数据库序列的BLASTX;用于蛋白质查询序列对蛋白质数据库序列的BLASTP;用于蛋白质查询序列对核苷酸数据库序列的TBLASTN和用于核苷酸查询序列对核苷酸数据库序列的TBLASTX。参见，Current Protocols in Molecular Biology, 第19章 ， Ausubel， 等人 ， Eds.， Greene Publishing andWiley-Interscience， New York, 1995。
除非另外指出，本文中提供的序列同 一 性/相似性值是指利用BLAST 2.0软件套或它们的后继软件，使用缺省参数获得的值。Altschul等人，Nucleic Acids Res, 2:3389-3402， 1997。应理解，这些参数的缺省设置可在将来按需要容易地改变。
术语"充分同一性"或"同源的"在它们的各种语法形式中是指多核苷酸包含序列，通过使用所述比对程序中的一个，所述序列与参照序列相比，具有期望的同一性，例如，至少60%的同一性，优选至少70%的序列同一性，更优选至少80%的同一性，更优选至少90%和更优选至少95%的同一性。
如本文中使用的，术语"分离的"以及相似的词语，当用于描述核酸、多核苷酸或寡核苷酸时，涉及从其天然或原始状态分离的组合物。因此，如果其天然存在，其已从其原始环境分离。如果其是合成制备的，已将其从由于合成而产生的原始产物混合物取出。例如，天
""，、但与i少一种与其二起共存于天S状态中的4料分离的相同多
核苷酸是"分离的"，如同该术语在本文中所使用的。通常，至少一种共存的材料的去除构成了 "分离"核酸、多核苷酸、寡核苷酸。在许多情况下，可除去几种、许多种或大多数共存材料来分离核酸、多核普酸或寡核苷酸。作为合成法的结果，基本上分离作为体外合成方法或化学合成方法的产物的核酸、多核苷酸或寡核苷酸。在重要的实施方案中，处理此类合成的产物以除去使用的试剂和前体和由方法产生的副产物。
掺入其为非天然存在的组合物的组合物例如制剂、转染组合物、
语的含意(如其在本文中使用的)内仍然是分离的多核苷酸或多肽。如本文中所使用的，"核酸"或"多核苷酸，，以及相似的术语和
巧环核苷酸组成的聚合物。因此，如本文中所使用的，作为RNA的多核苷酸或作为DNA的多核苷酸或包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的多核苷酸可包含天然存在的部分例如天然存在的碱基和核糖或脱氧核糖环，或它们可由合成的或经修饰的部分例如下面描述的部分组成。用
或甚至三链碱基配对结构。
核酸和多核苷酸的长度可以为20或更多个核苷酸、或30或更多个核苷酸、50或更多个核苷酸、IOO或更多个核苷酸、1000或更多个核苷酸、数万或更多个核苷酸，或数十万或更多个核苷酸。siRNA可以是本文中定义的多核苷酸。如此处所使用的，"寡核苷酸"和基于
经修饰的核苷酸组成的聚合物，如在前述段落中所描述的。寡核苷酸的长度可以为IO或更多个核苷酸，或15、或16、或17、或18、或19、或20或更多个核普酸、或21、或22、或23、或24或更多个核苷酸、或25、或26、或27、或28或29、或30或更多个核苷酸、35或更多、40或更多、45或更多、达到大约50个核苷酸。在siRM中用作靶向性序列的寡核苷酸序列可具有15至30个核苷酸之间的任何数目的核苷酸。在许多实施方案中，siRNA可具有21至25个核苷酸之间的任何数目的核苷酸。寡核苷酸可以是化学合成的并且可用作siRNA、 PCR引物或探4十。
要理解，由于上述段落中提供的大小范围的重叠，术语"多核苷酸"和"寡核苷酸"在本文中可同义使用，指本发明的siRNA。
如本文中所使用的，"核苷酸序列"、"寡核苷酸序列"或"多核苷酸序列"以及相似的术语可互换地涉及寡核苷酸和多核苷酸具有的碱基的序列以及具有该序列的寡核苷酸或多核苷酸结构。核苷酸序
酸:'其中碱基的序列通过本领域内-常规^用的字母命名的碱i的特定
序列的描述或叙述来定义。
"核苷，，被领域例如生物化学、分子生物学、基因组学和与本发明的领域相关的相似领域内的技术人员常规理解为包括以糖苦键连接
至嘌呤或嘧啶碱基的单糖；而"核苷酸"包括核苷和至少一个通常添加在糖的3'或5'位置(对于戊糖)(但也可在糖的其他位置)的磷酸基团。核苷酸残基占据寡核苷酸或多核苦酸中的序列位点。核苦酸的修饰或衍生可发生在寡核苷酸或多核苷酸的任何序列位点。所有经修饰的或衍生的寡核苷酸和多核苷酸包括在本发明内并且落在权利要求的范围内。修饰或衍生可在磷酸基团、单糖或碱基中发生。
作为非限定性实例，下列描述提供了某些经修饰的或衍生的核普酸，其全部在本发明的多核苷酸的范围内。单糖可通过作为例如戊糖或己糖而非核糖或脱氧核糖来修饰。单糖还可通过用氢基或氨基取代羟基，通过烷基化或酯化另外的羟基等来修饰。2'位置上的取代，例如2'-0-曱基、2'-0-乙基、2'-0-丙基、2'-0-烯丙基、2'-0-氨烷基或2'-脱氧-2'-氟基提供了增强的对寡核苷酸的杂交性质。
寡核苷酸和多核苷酸中的碱基可以是"未修饰的"或"天然的，，碱基，包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟噤呤(G)，和嘧啶碱基，胸腺嘧咬(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。此外，它们可以是具有修饰和取代的碱
次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨曱基-2-硫代尿苷、5-羧曱基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、P-D-半乳糖Q核苷、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-曱基鸟嘌呤、l-甲基肌苷、2，2-二曱基鸟嘌呤、2-甲基腺噤呤、2-甲基鸟嘌呤、3-曱基胞嘧p定、5-甲基胞嘧啶、N6-腺噪呤、7-甲基鸟噤呤、5-曱基氨基曱基尿嘧咬、5-甲氧基氨基曱基-2-硫尿嘧啶、P-D-甘露糖Q核苷、5'-曱氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-曱基硫代-N6-异戊烯腺噤呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、 wybutoxosine、假尿嘧咬、Q核苷、2-硫胞嘧咬、5-甲基-2-硫尿嘧咬、2-硫尿嘧咬、4-硫尿嘧咬、5-曱基尿嘧咬、尿嗜咬-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v) 、 5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基噤呤、5-羟甲基胞嗜啶、黄嘌呤、次黄噤呤、2-氨基腺嘌呤、腺噤呤和鸟嘌呤的6-曱基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟噤呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧咬、5-囟代尿嘧咬、5-卣代-胞嘧啶、5-丙基-尿嘧啶、5-丙炔基-胞嘧咬和嘧咬碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮-尿嘧啶、6-偶氮-胞嘧啶、6-偶氮-胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卣代、8-氨基-、8-巯基-、8-硫代烷基-、8-羟基-和其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卣代特别地5-溴、5-三氟曱基和其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-曱基腺嘌呤、2-氟-腺噤呤、2-氨基-腺噤呤、8-氮杂鸟噤呤和8-氮杂腺噤呤、7-脱氮鸟嘌呤以及7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的经修饰的碱基包括三环嘧啶例如吩噁溱胞啶(1H -嘧啶并[5,4-b] [1,4]苯并噁溱-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞啶(1-嗜啶并[5， 4-b] [1， 4]苯并噻嗪-2 (3H)-酮)、G-型夹例如取代的吩噁嗪胞啶(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b] [1，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、味唑胞啶(2H-嘧咬并[4， 5-b]丐l哚-2-酉同)、吡啶并吲咮胞啶(H-吡淀并[3' ， 2': 4， 5]吡咯并[2， 3-d]嘧啶-2-酮)。经修饰的碱基还可包括其中用其他杂环例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮取代噪呤或嘧啶碱基的那些碱基。另外的碱基包括美国专利3, 687, 808中公开的碱基、The Concise Encyclopedia Of PolymerScience And Engineering, 第858-859页，Kroschwitz, J. I， ed.John Wiley & Sons, 1990中公开的碱基、由Englisch等人，Angewandte Chemie， International Edition (1991) 30， 613公开的碱基和由 Sanghvi， Y. S-， 第 15章，Antisense Research andApplications,第289-302页，Crooke， S. T.和Lebleu， B. , ed.，CRC Press, 1993 7>开的碱基。此类碱基中的某些碱基对于增加本发明的低聚化合物的结合亲和力特别有用。此类碱基包括5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、 N-6和0-6取代嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嗜啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示增加核酸双链体稳定性0.6-1.2.度(Sanghvi， Y. S. ， Crooke, S. T.和Lebleu， B. ， eds.， Antisense Research and Applications, CRCPress, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)并且是目前优选的碱基取代，当与2'-0-曱氧基乙基糖修饰组合时甚至更优选。参见美国专利6, 503,754和6，506， 735和其中引用的参考文献(通过引用合并入本文)。修饰还包括下列专利中公开的修饰，所述专利是美国专利5,1 38, 045和5,218,105，涉及缀合多胺的寡核苷酸；美国专利5, 212,295、 5,521,302、 5, 587,361和5， 599， 797，涉及掺入手性磷连接包括磷硫酰的寡核苷酸；美国专利5, 378, 825 、 5， 541， 307和5， 386, 023，涉及具有经修饰的主链的寡核苷酸；美国专利5， 457， 191和5, 459, 255,涉及经修饰的核碱基；美国专利5, 539,082，涉及肽核酸；美国专利5， 554， 746，涉及具有P-内酰胺主链的寡核苷酸；美国专利5，571，902，公开寡核普酸的合成；美国专利5， 578， 718，公开烷疏基核苷；美国专利5, 506, 351，涉及2'-O-烷基鸟嘌呤核苷、2，6-二氨基嘌呤和相关化合物；美国专利5， 587， 469，涉及具有N-2取代噤呤的寡核苷酸；美国专利5, 587, 470，涉及具有3-脱氮嘌呤的寡核苷酸；美国专利5, 223, 168和美国专利5, 608,046，涉及缀合的4'-脱甲基核苷类似物；美国专利5，602， 240和5，610， 289,涉及主链经修饰的寡核苷酸类似物；美国专利6,262, 241和5， 459,255，尤其涉及，合成2'-氟-寡核苷酸的方法。
核苷酸之间的连接通常是3'-5'磷酸连接(phosphate linkage),其可以为天然的磷酸二酯连接、石危代磷酸酯连接(phosphothioesterlinkage )和其他合成的连接。包含硫代磷酸酯主链的寡核苷酸具有增强的核酸酶稳定性。经修饰的主链的实例包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、曱基和其他烷基磷酸酯包括3'-亚烷基磷酸酯、5'-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯、次碌酸酉旨(phosphinate )、氛基碼酸酉旨(phosphoramidate )包括3'-
氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯( thionophosphoramidates ) 、 硫羧 烷 基 膦 酸 酉旨(thionoalkylphosphonates )、 石克羰烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters )、竭代磷酸酉旨(sele卿hosphates )和硼烷磷酸酯(boranophosphates)。另外的连接包括磷酸三酯连接、 硅氧烷连接、碳酸酯连接、羧甲基酯连接、acetamidate、氨基甲酸酯 连接、硫醚连接、桥接氨基磷酸酯连接、桥接亚甲基膦酸酯连接 (methylene phosphonate )、桥接硫代磷酸酯连接和砜核苷酸间 (sulfone internucleotide)连接。其他聚合连接包括这些连接的 2'-5'连接的类似物。参见美国专利6， 503， 754和6， 506， 735以及其中 引用的参考文献(通过引用合并入本文)。
任何修饰(包括上面说明书中所例举的修饰)可容易地掺入本发 明的靶向性多核苷酸和包括在本发明的靶向性多核苷酸的范围内。任
的核苷酸的用途，这为本领域技术人员所理解。所有等同的经修饰的 核苷酸都落在本文中公开的和请求保护的本发明的范围内。
如在本文和权利要求中所使用的，术语"互补的，，、"互补"、 "互补性"以及相似的单词和短语涉及两个序列，所述序列的碱基， 如领域例如生物化学、分子生物学、基因组学和与本发明的领域相关 的相似领域内的技术人员常规理解的那样，逐个碱基地形成互补碱基 对。具有互补序列的两个单链(ss)多核苷酸可在适当的緩冲液和温度 条件下彼此杂交，从而形成双链(ds)多核苷酸。作为非限定性实例， 如果考虑天然存在的碱基，A和(T或U)相互作用，以及G和C相互作 用。除非另外指出，"互补，，意欲表示"完全互补"，即，当两个多 核苷酸链彼此对准时，存在链的至少一部分，在链的该部分中， 一条 链中的连续碱基的序列的每一个碱基与相对链上的相同长度的连续碱 基的序列中的相互作用的碱基互补。
如本文中所用的，"杂交"、"杂交作用，，以及相似的单词和短 语涉及通过使链与互补序列彼此相互作用来形成核酸、多核苷酸或寡 核苷酸双链体的过程。相互作用通过每一条链上的互补碱基特异性相 互作用形成配对而发生。链的彼此杂交的能力取决于下面所示的许多 条件。当各链中足够数目的相应位点由可彼此相互作用的核苷酸占据 时，核酸链彼此杂交。彼此杂交的多核苷酸链可以是完全互补的。可选地，两条杂交的多核苷酸可以是彼此"大体上互补的，，，即它们具 有小数目的错配碱基。天然存在的碱基和经修饰的碱基例如本文中描 述的那些碱基，参与形成互补碱基对。本发明的领域内的技术人员(包 括非限定性实例例如生物化学家和分子生物学家)理解，形成双链体
的链的序列不必是彼此100%的互补才可特异性杂交。
如本文中所使用的，"核普酸突出端"以及相似的术语和短语涉
及延伸超过双链多核苷酸的双链体结构(此时双链体的一条链的3'末 端延伸超过另一条链的5'末端，或可作必要的变通)的未配对的核普 或核苷酸。相反地，"平齐的(blunt)"或"平端"以及相似的术语 和短语涉及在双链体的末端无未配对的核苷酸的双链体，即无核苷酸 突出端。
如本文中所使用的，"反义链"以及相似的术语和短语涉及多核 苦酸双链体的包含与靼序列大体上互补的区域的链。如本文中所使用 的，术语"互补性区域"是指与序列例如靶序列大体上互补的反义链 上的区域，如本文中所定义的。如果互补性区域与靶序列不完全互补， 那么错配在末端区域通常是耐受的并且，如果存在，通常在5'和/或 3'末端的6、 5、 4、 3或2个核苷酸内。
本文中所使用的术语"有义链，，以及相似的术语和短语涉及多核 苷酸双链体的包含与耙序列的反义链的区域互补的区域的链。因此， 有义链具有与靶序列同一的或大体上相似的区域。
如本文中所使用的，"片段，，以及相似的单词和短语涉及比全长 参照序列更短的核酸、多核苷酸或寡核苷酸的部分。片段的碱基序列 与参照序列的相应部分的序列相比未孝皮改变；与参照序列的相应部分 相比，片段中不存在插入或缺失。如本文中所涉及的，核酸或多核苷 酸的片段例如寡核脊酸长度为15或更多个碱基、或16或更多个、17 或更多个、18或更多个、或19或更多个、或20或更多个、或21或 更多个、或22或更多个、或23或更多个、或24或更多个、或25或 更多个、或26或更多个、或27或更多个、或28或更多个、或29或 更多个、或30或更多个、或50或更多个、或75或更多个、或100或更多个碱基，达到比全长序列短1个碱基的长度。
如本文中所使用的，术语"病理性表达"和"致病性表达
(pathogenic expression)，，以及相似的短语将一起称为"病理性表 达"，并且涉及与致病状态或病理状态相关的基因的差异表达。因此
的基因表达。在本公开内容中，病理性表达特别地涉及鉴定为靶基因 (即为RNAi治疗的耙的基因)的基因。因此，尽管病理性表达通常可 涉及基因的过表达和基因的表达不足，但被RNAi治疗靶向的基因的病 理性表达通常是过表达，并且RNAi治疗期望抑制或减少过表达。
功能的任何天然存在的剪接变体、等位基因变体、其他可选转录物、 剪接变体和所得的RNA分子。基因的片段可以是基因的任何部分，其 可以代表或可以不代表功能结构域，例如，催化结构域、DNA结合结 构域等。
"互补DNA" (cDNA)是通过逆转录酶从mRM才莫板拷贝(从而导致 与mRNA的序列互补的序列)的单链DNA。本领域技术人员也使用术语 "cDM"表示包含这样的单链DNA分子和其互补DM链的双链DNA分 子。
术语"有效连接"以及相似的术语和短语用于描述调控元件与基 因或其编码区之间的连接。即，基因表达通常由某些转录调控元件包 括组成型或诱导型启动子、组织特异性调控元件和增强子控制。这样 的基因或编码区从而被认为"有效地连接至"或"可操作地连接至" 或"有效地结合，，调控元件，表示基因或编码区在调控元件的控制下 或受其影响。
如本文中所使用的，术语"干扰"、"沉默，，和"抑制……的表 达"以及相似的术语和短语，就它们涉及靶基因而言，涉及对革巴表达 的部分或基本上完全的压制或抑制。通常这样的干扰表现为被抑制的 表型。在不同情况下，通过施用本发明的靶向性多核苷酸，靶基因的 表达被抑制至少大约10%、或大约20%、或大约30%、或大约40%、或大约50%、或大约60%、或大约70%、或大约80%。在有利的实施方案 中，通过施用靶向性多核苷酸，靶基因被抑制至少大约85%、或大约 90%、或大约95%或基本上被完全抑制。这样的干扰可在细胞培物的细 胞中、或组织外植体中或受试者的体内表现。
如本文中所使用的，术语"治疗"以及相似的术语和短语涉及对 具有疾病或病状、疾病的症状或对疾病的易感性的受试者应用或施用 治疗剂，或对来自受试者的分离的组织或细胞系应用或施用治疗剂。 治疗期望促进其痊愈或愈合，或緩和、减轻、改变、矫正、改善、好 转、或影响疾病、疾病的病状或对疾病的易感性。
如本文中的使用的，术语"治疗有效量，，和"预防有效量"分别 是指在疾病的治疗中提供治疗益处的量或有效地提供预防或减小疾病 的严重性的量。治疗有效的确切量可通过普通医生对被治疗的受试者 的反应进行评估来容易地测定，其可随本领域内已知的因素变化而变 化，所述因素例如疾病的性质、受试者的病史和年龄、疾病的分期以 及其他治疗剂的施用。
如本文中所使用的，"药物组合物，，涉及包含药理学有效量的輩巴
向性多核苷酸和药学上可接受的载体的组合物。如本文中所使用的，
"药理学有效量"、"治疗有效量"或简单地"有效量"是指有效地 产生期望的药理学、治疗性或预防性结果的抑制性多核苷酸的量。例 如，如果当与疾病或病症相关的临床参数存在至少最小的可检测的变 化时给定的临床治疗被认为是有效的，那么用于治疗该疾病或病症的 药物的治疗有效量是产生至少一定程度的参数变化所必需的量。
术语"药学上可接受的载体"是指用于治疗剂的施用的、至少生 理上可接受的且可由管理才几构(regulatory agency)批准的组合物。 还可修饰核苷酸以使之具有标记。具有荧光标记或生物素标记的 核苷酸，例如，可从Sigma (St. Louis， M0)获得。
RNA千扰
根据本发明，癌细胞中促进增殖和/或转移的靶的基因表达被RNA干扰减弱。特别地，本发明中被靶向的基因包括称为ICT-1052 、 ICT-1053、 ICT-1027、 ICT-1051、 ICT-1054、 ICT-1020、 ICT-1021和 ICT-1022的基因。靶基因的转录产物在细胞内被特异性双链siRNA核 苷酸序列革巴向，所述siRNA核苷酸序列与靶的至少片段互补，所述片 段包含15至30之间的任何数目的核苷酸，或在许多情况下，包含21 至25个核苷酸之间的任何数目的核苷酸。靶可存在于5'非翻译(UT) 区、编码区或3' UT区。参见，例如，PCT申请WO00/44895、W099/32619、 WO01/75164、 WO01/92513、 WO01/29058、 W001/89304、 WO02/16620和 W002/29858，各自以它们的全文通过引用合并入本文。
根据本发明的方法，使用siRNA抑制癌细胞基因的表达，从而抑 制癌细胞的复制。根据本发明的靶向性多核苷酸包括s iRNA寡核苷酸。 可通过与癌细胞靶序列同一或相似的核苷酸序列的化学合成来制备 siRNA。参见，例如，Tuschl， Zamore， Lehmann， Bartel和Sharp (1999) Genes & Dev. 13: 3191-3197，以其全文通过引用合并入本文。可选 地，可4吏用靶向性多核苷酸序列，例如通过在无细胞系统例如但不限 于果蝇提取物中降解癌细胞的核糖多核苷酸(ribopolynucleotide) 序列或通过转录重组双链癌细胞cRNA来获得靶向性siRNA 。
使用由与选择的靶序列互补(即反义)的15-30 nt的链和相同 长度的15-30 nt的有义链组成的siRNA双链体通常观察到有效的沉 默。在许多实施方案中，siRM双链体的各链额外地在3'末端具有1、 2、 3或4个未配对的核苷酸的突出端。在一般实施方案中，突出端的 大小为2nt。 3'突出端的序列为siRNA靶识别的特异性作出了额外的 小贡献。在一个实施方案中，3'突出端的核苷酸是核糖核苷酸。在可 选实施方案中，3'突出端的核苷酸是脱氧核糖核苷酸。3'突出端中3' 脱氧核糖核酸的使用提供了增强的细胞内稳定性。
包含靶向性序列的本发明的重组表达栽体，当被导入细胞时，被 加工从而提供包含siRNA序列的RNA，所述siRNA序列乾向在癌细胞 中牵涉细胞增殖和/或转移的基因。这样的载体是克隆入包含有效连接 的调控序列的表达载体的DNA分子，所述调控序列以允许靶向性序列表达的方式侧翼于靶向癌细胞的序列。通过第一启动子(例如，克隆
的DNA的启动子3')从载体转录与癌细胞RNA反义的RNA分子和通过 第二启动子(克隆的DNA的启动子序列5')从载体转录对于癌细胞RNA 靶是有义链的RNA分子。然后有义和反义链在体内杂交，从而产生靶 向癌细胞RM分子的siRNA结构以进行基因的沉默。可选地，可^f吏用 两个分开的构建体来产生siRM结构的有义链和反义链。此外，克隆 的DNA可编码具有发夹二级结构的转录物，其中单个转录物具有来自 靶基因的有义序列和互补反义序列。在该实施方案的实例中，发夹 RNAi转录产物包括与輩S基因的全长或一部分相似的第一序列和与第 一序列互补的第二序列，从而倾向于形成发夹双链体。在另一个实例 中，发夹RMi产物是siRNA。载体中侧翼于癌细胞序列的调控序列可 以是相同的或可以是不同的，这样它们的表达可被独立地调控或以时 间或空间方式调控。
在某些实施方案中，通过将癌细胞靶基因模板克隆入包含例如来 自核内小RNA (snRNA) U6或人RM酶P RNA Hl的RNA pol III转录 单位的载体来在细胞内转录siRNA。载体系统的一个实例是 GeneSuppressorTM RNA Interference试剂盒(可从Imgenex商购获 得)。U6和H1启动子是Pol III启动子的类型III的成员。U6样启动 子的+1核苷酸总是鸟噤呤核苷，而HI启动子的+1是腺嘌呤核苷。这 些启动子的终止信号由5个连续胸苷界定。转录物通常在第二尿嘧啶 核苷之后被切割。该位点上的切割在表达的siRNA中产生UU突出 端，其与合成的siRNA的3'突出端相似。长度小于400个核苷酸的任 何序列可通过这些启动子进行转录，从而它们理想地适合用于表达例 如大约50个核普酸的RNA发夹-环转录物中的大约21个核香酸的 siRNA。对可获得的核苷酸序列文库进行针对选择的siRNA序列的初始 BLAST同源性检索，以确保只有期望的优先在癌细胞中表达的靶而无 非被靶向的宿主基因被鉴定。参见，Elbashir等人2001 EMBO J. 20 (23): 6877-88。多核苷酸的合成
可通过标准的合成技术，例如使用自动化DNA合成仪制备相应于 耙向性核苷酸序列的寡核苷酸和包含靶向性序列的多核苷酸。用于合 成寡核苷酸的方法包括熟知的化学方法，包括但不限于核苷酸亚磷酰 胺至表面4汙生4匕的颗丰立的J侦次添力口， ^口由T. Brown and Dorcas J. S. Brown in Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach, F Eckstein, editor, Oxford University Press, Oxford, pp. 1—24 (1991)中描述的，其通过引用合并入本文。
合成法的实例〗吏用Expedite RNA亚石粦酰胺和胸苷亚磷酰胺 (Proligo， Germany),对合成的寡核苷酸进行去保护和凝胶纯化 (Elbashir等人(2001) Genes & Dev 15， 188-200)，然后进行Sep-Pak C18药液筒(Waters, Milford， Mass" USA)纯化(Tuschl等人(1993) Biochemistry, 32: 11658-11668)。将互补的ssRNA于90°C下在退火 緩沖液(IOO mM醋酸钾、30 raM HEPES-K0H于pH 7.4、 2 mM醋酸镁) 中温育1分钟，然后在37。C下进行1小时以与相应的ds-siRM杂交。
寡核苷酸合成的其他方法包括但不限于根据磷酸三酯和磷酸二 酯法(Narang，等人，(1979) Meth. Enzymol. 68: 90)和根据H-膦酸 酯法 (Garegg,P.J.，等人， (1985)"Formation of internucleotidic bonds via phosphonate intermediates", Chem. Scripta 25， 280-282， 和Froehler， B. C， 等人，(1986a) "SynthesisofDNAviadeoxynucleoside H-phosphonate intermediates", Nucleic Acid Res. ， 14， 5399-5407，等等)的固 相寡核苷酸合成和在支持物上的合成(Beaucage，等人 (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1862) 以及氨基磷酸酯技术 (Caruthers， M. H.，等人，"Methods in Enzymology，"第154巻，pp. 287-314 (1988)，美国专利5,153,319、 5,132,418、 4,500, 707 、 4, 458, 066、 4, 973, 679、 4， 668， 777和4， 415， 732以及在"Synthesis and Appl i cat ions of DM and RNA， " S. A. Narang， editor, Academic Press, New York, 1987和其中包含的参考文献中描述的其他技术和非亚磷酰胺法技术。固相合成有助于将寡核苷酸与杂质和过量的试剂 分离。在从固体支持物切割后，寡核苷酸可用已知的技术进一步分离。
本发明的抑制性多核苷酸
本发明的革巴向性多核苷酸可以是DNA、 RNA、混合的DNA-RM多核 苷酸链或MA-RNA杂交体(hybrid)。后者的实例是在3'末端以脱氧 二核苷酸序列例如d(TT)、 d(UU)、 d(TU)、 d (UT)以及其他可能的二核 苷酸终止的RNA序列。在另外的实施方案中，3'突出端可由具有上面 指定的碱基的核糖核苷酸或其他核苷酸组成。此外，寡核苷酸药物试 剂可以是单链或双链的。本发明的治疗性寡核苷酸的几个实施方案预 期为寡核糖核苷酸或具有d(TT)末端的寡核糖核苷酸。单链靶向性 多核苷酸，如果被施入哺乳动物细胞中，在进入后通过存在于细胞中 的内源酶活性容易地转变成双链分子。所得的双链寡核苷酸触发RNA 干扰。
耙向性序列可以是单链多核苷酸或双链多核苷酸。包含在多核苷 酸内的靶向性核苷酸序列可以完全由天然存在的核苷酸组成，或多核 苷酸的至少一个核香酸可以是经修饰的核苷酸或衍生的核苷酸。修饰 或衍生化可以实现目的例如多核苷酸稳定化、最优化链与互补链的杂 交、或增强RNAi过程的诱导。为分子生物学、细胞生物学、肿瘤学和 相关医学领域以及与本发明相关的其他领域内的技术人员所理解的包 含靶向性序列的所有等同的多核苷酸在本发明的范围之内。
本发明的多核苷酸包括靶向性序列，并且有效地抑制具有疾病或 病理特征的细胞的生长或复制。在本发明的重要实施方案中，第一核 苷酸序列或靶向性序列长度可以是至少15个核苷酸(nt)和至多100 nt。在某些实施方案中，长度可以是至多70 nt。在更重要的实施方 案中，第一核苷酸序列的长度可以是15 nt、或16nt、或l7 nt、或 18nt、或19nt、或20nt、或21 nt、或22nt、或23nt、或24nt、 或25 nt、或26 nt、或27 nt、或28 nt、或29 nt、或30 nt。
第一靼向性核普酸序列或其互补序列通常与其在靶基因中靶向的序列至少80%互补。因此，在前述段落中鉴定的那些实施方案(其 中靶序列的长度在15至30nt的范围内)中，与靶序列的互补性相差 可以不超过3或4或5个核苷酸。在重要的实施方案中，第一核苷酸 序列或其互补序列与靶序列至少85%互补、或至少90%互补、或至少 95%互补或至少97°/。互补。
第一核苷酸序列或其互补序列与其革巴序列充分互补，这样其诱导 RNA干扰现象，从而促进乾核酸被RM酶活性切割。任何等同的促进 致病性核酸的切割的第 一核普酸序列落在本发明的范围内。
短发夹RM (shRNA)预期包含在本发明的第一多核苷酸中。shRNA 包含靶向性笫一核苷酸序列、形成居间环的核苷酸序列(intervening loop—forming nucleotide sequence)和与第一乾向小生序歹'J互^卜的第 二耙向性核苷酸序列。不希望受理论的束縳，据认为包含第一靶序列、 环和与第 一靶序列互补的第二靶序列的多核苷酸环回形成分子内双链
"发夹"结构，其中第二互补序列与第一靶序列杂交。再次地，不希 望受理论束縛，据认为RNAi现象由与其靶序列形成复合体的双链RNA 序列诱导。shRNA的使用提供了用于提供有效地沉默被靶向的基因的 双链靼向性多核苷酸的最佳方法。
在重要的实施方案中，靶向性多核苷酸额外地包含与第一核苷酸 序列有效连接的，或在shRNA的情况下，与包含第一核苷酸序列、环 和互补的核苷酸序列的整个shRM构建体有效连接的启动子和/或增 强子序列。
载体。本发明提供了包含一个或多个本发明的第一多核苷酸的不 同载体。通过包含多个第一多核苷酸，载体携带针对多个致病性靶序 列的乾向性序列。致病性靶序列可以涉及患病受试者的细胞中的相同 基因或不同基因。有利地，本发明的任何载体包含分别与第一核苷酸 序列或shRNA序列有效连接的启动子、增强子或两者。
用于制备本发明的载体的方法在分子生物学、细胞生物学、肿瘤 学领域和相关医学领域和与本发明相关的其他领域中是广为人知的。 用于制备载体的方法的非限定性的实例描述于Molecular Cloning: ALaboratory Manual (第3版)(Sambrook， J等人(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), 和 Short protocols in molecular biology (第5版)(Ausubel FM等人 (2002) John Wiley & Sons, New York City)。
抗体
本文中所使用的术语"抗体"是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白 (Ig)分子的免疫活性部分，即，包含特异性结合(与抗原免疫反应) 抗原的抗原结合位点的分子。此类抗体包括但不限于多克隆抗体、单
克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab、Fab，和F(ab. )2片段抗体和Fab表
达文库。通常，从人获得的抗体分子涉及IgG、 IgM、 IgA、 IgE和IgD 的任何种类，其彼此间的不同在于存在于分子中的重链的性质。某些 种类还具有亚类，例如IgGh IgG2和其他亚类。此外，在人中，轻链 可以是K链或入链。本文中提及的抗体包括所有这样的种类、亚类和 类型的人抗体类别。
通过使用用于多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，期望用作抗 原、或其部分或片段的本发明的分离的蛋白质可用作免疫原来产生免 疫特异性结合该抗原的抗体。可使用全长蛋白质或可选地本发明提供 了抗原的用作免疫原的抗原肽片段。抗原肽片段包含全长蛋白质的氨 基酸序列的至少6个氨基酸残基，并且包含其表位，这样针对该肽产
物。优选，抗原肽包含至少10个氨基酸残基、或至少15个氨基酸残 基、或至少20个氨基酸残基或至少30个氨基酸残基。由抗原肽包含 的优选表位是蛋白质的位于其表面的区域；通常这些区域是亲水区域。 在本发明的某些实施方案中，由抗原肽包含的靶基因多肽的至少 一个表位是位于蛋白质的表面的多肽的区域，例如亲水区域。人蛋白 质序列的疏水性分析将表明多肽的哪个区域是特别亲水的，从而很可 能编码用于靶向性抗体产生的表面残基。作为用于靶向性抗体产生的 方法，显示亲水和疏水区域的亲水性图可通过本领域内熟知的任何方法来产生，所述方法包括例如使用或不使用傅里叶变换的Kyte Doolittle或Hopp Woods法。参见，例如，Hopp和Woods, 1981， Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte和Doolittle 1982， J. Mol. Biol. 157: 105-142，其各自以其全文通过引用合并入本文。 本文还提供了对于抗原性蛋白、或其衍生物、片段、类似物或同源物 内的一个或多个结构域是特异性的抗体。
本领域内已知的各种方法可用于产生抗本发明的蛋白质、或抗其 衍生物、片段、类似物、同源物或直系同源物的多单克隆或单克隆抗 体(参见，例如,Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E，和 Lane D， 1988， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY，其通过引用合并入本文)。下面论述这些抗体中的一些。
多克隆抗体
关于多克隆抗体的产生，可用天然蛋白质、其合成的变体或上述 蛋白的衍生物通过一次或多次注射来免疫各种合适的宿主动物(例如， 兔、山羊、小鼠或其他哺乳动物)。适当的免疫原性制剂可包含例如天 然存在的免疫原性蛋白质、代表免疫原性蛋白的化学合成的多肽或重 组表达的免疫原性蛋白。此外，可将蛋白质缀合至已知在被免疫的哺 乳动物中具有免疫原性的第二蛋白质。这样的免疫原性蛋白质的实例 包括但不限于钥孑L戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清 白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。制剂还可包含佐剂。 用于增加免疫反应的各种佐剂包括但不限弗氏(完全和不完全)佐剂、 矿物凝胶(mineral gel)(例如，氢氧化铝)、表面活性物质(例如， 溶血卵磷脂、复合多元醇、多聚阴离子、肽、油乳剂(oil emulsion)、 二硝基苯酚等)、可用于人的佐剂例如卡介苗(Bacille Calmette Guerin)和小才奉才干菌(Corynebacterium Parvum)或相似的免疫刺激 剂。可使用的佐剂的另外的实例包括MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A、合 成的海藻糖二霉菌酸酉旨(trehalose dicorynomycolate ))。
单克隆抗体如本文中所使用的，术语"单克隆抗体"(MAb)或"单克隆抗 体组合物"指只包含一种分子类别的由独特的轻链基因产物和独特的 重链基因产物组成的抗体分子的抗体分子的群体。特别地，单克隆抗 体的互补决定区(CDR)在群体的所有分子中是相同的。因此MAb包含能 够与抗原的特定表位免疫反应的、特征在于对于其的独特结合亲和力 的抗原结合位点。
可使用杂交瘤方法例如由Kohler和Milstein, Nature, 256: 495 (1975)描述的方法制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂 免疫小鼠、仓鼠或其他适当的宿主动物来激发淋巴细胞，所述淋巴细 胞产生或能够产生可特异性结合免疫剂的抗体。可选地，可体外免疫 -淋巴细胞。
免疫剂将通常包括蛋白质抗原、其片段或其融合蛋白。通常，如 果人来源的细胞是想要的，则使用外周血淋巴细胞，如果非人哺乳动 物来源是想要的，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用适当的融合 剂例如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化的细胞系融合，从而形成杂交瘤 细胞[Goding， Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]。永生化的细胞系通常是已转 化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。 通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可将骨髓瘤细胞培养在适当的 培养基中，所述培养基优选包含一种或多种抑制未融合的永生化的细 胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺乏次黄噤呤-鸟噤呤磷 酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常可包含 次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷("HAT培养基")，所述物质阻止HGPRT-缺陷型细胞的生长。
单克隆抗体还可通过重组DM法例如美国专利4， 816， 567中描述
的方法来制备。可使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编 码鼠抗体的轻链和重链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序编
码本发明的单克隆抗体的DNA。本发明的杂交瘤细胞用作此类DNA的 优选来源。 一旦分离，可将DNA置入表达载体，然后将该载体转染入不产生免疫球蛋白的宿主细胞例如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CH0) 细胞或骨髓瘤细胞，从而在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。
人源化抗体
此
类抗体适合于对人施用而不引起人对施用的免疫球蛋白的免疫反应。 抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或片段(例如 Fv， Fab、 Fab， 、 F (ab') 2或抗体的其他抗原结合子序列)，其主要由
人免疫球蛋白的序列组成，并且包含来源于非人免疫球蛋白的最小序 列。可按照Winter和同事(Jones等人，Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann等人，Nature,巡323-327 (1988); Verhoeyen等人， Science, 239: 1534-1536 (1988))的方法，通过用啮齿类动物CDR 序列置换人抗体的相应序列来进行人源化。(也参见美国专利 5， 225， 539)。人源化抗体最优地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常 为人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分(Jones等人，1986; Riechmann等人，1988; 和Presta， Curr. Op. Struct. Biol.， 2: 593-596 (1992))。 人抗体
完全人抗体基本上涉及其中轻链和重链(包括CDR)的整个序列 由人基因产生的抗体分子。此类抗体在本文中称为"人抗体，，或"完 全人抗体，，。可通过三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor, 等人，1983 Immunol Today 4: 72)和产生人单克隆抗体的EBV杂交 瘤技术(参见Cole,等人，1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss， Inc., pp. 77-96)来制备人单克隆 抗体。人单克隆抗体可用于本发明的实施和可通过使用人杂交瘤(参见 Cote，等人，1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026—2030)或通 过用EB病毒(Epstein Barr Virus )体外转化人B细胞(参见Cole,等 人，1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY. Alan R. Liss， Inc., pp. 77-96)来产生。此外，人抗体还可通过使用另外的技术包括噬菌体展示文库
(Hoogenboom和Winter, J. Mol. Biol. , 227:381 (1991); Marks等 人，J. Mol. Biol. ， 1^: 581 (1991))来产生。类似地，人抗体可通
过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物(例如其中已使内源免疫球 蛋白基因部分或完全失活的小鼠)来制备。在攻击后，观察到人抗体
产生，所述抗体在所有方面包括基因重排、装配和抗体i脊与在人中看 到的非常相似。该方法描述于例如美国专利5， 545， 807、 5, 545,806、 5,569, 825 、 5， 625， 126 、 5, 633, 425 、 5,661,016和Marks等人 (Bio/Technology 10, 779-783 (1992)); Lonberg等人(Nature 368 856-859 (1994)); Morrison ( Nature 368. 812-13 (1994)); Fishwild 等人(Nature Biotechnology H， 845-51 (1996)); Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996)); 以及Lonberg 和Huszar ( Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))中。
人抗体另外可使用转基因非人动物来产生，所述动物经改造响应
抗原引起的攻击而产生完全人抗体而非动物的内源抗体。(参见PCT
发明者F·Y·谢, M·C·伍德, P·Y·卢, 刘伊佳 申请人:因特拉迪格姆公司