专利名称：稻瘟病菌与产孢相关的基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及稻瘟病菌与产孢相关的 基因、产孢基因的敲除、功能互补及应用。
背景技术：
由稻瘟病菌Mag"a/ oW/^ (Herbert) Barr(无性世代gnkfl)侵染水稻引起的稻瘟病是水稻上最重要的病害之一 ，有 性世代是单倍体异宗配合的子囊菌。由于该病害的重要性和对稻瘟病菌传 统、分子遗传的可操作性，它己成为研究植物病原真菌与寄主互作较为理 想的模式系统之一。稻瘟病菌致病的分子生物学及其与水稻寄主的互作研 究是寻找新的防病途径的关键。稻瘟病菌以菌丝和分生孢子在病稻草、病谷上越冬，成为翌年的初侵 染来源。病稻草中越冬的菌丝，第二年春季日均温稳定上升到2(TC时， 若遇降雨，就能产生分生孢子。分生孢子借气流传播到稻田(秧田或本田)， 孢子接触稻株后，在适宜的温湿度条件下萌发，并直接从叶片表皮侵入， 也可从伤口侵入，则引起初侵染。病部产生的分生孢子又可借气流传播再 侵染。在有利条件下，重复侵染可以侵染多次。可见，孢子在稻瘟病菌的 侵染循环中起到重要的作用，能否产生孢子以及孢子产生的数量的多少， 在自然条件下直接影响了病害的发生发展。Hamer等[24]采用表型互补法首 次鉴定出几个分生孢子突变体并克隆了这一基因，但该突变体 只是产生异常形态的分生孢子，产孢数量并不发生变化。Shi与Leimg通 过化学诱导或插入突变的方法鉴定了 6个控制产孢途径各个步骤的基因 位点CCW7， OW2， COiW, CCW5， CCW6禾卩CCW7。每个基因的突变 子在产孢过程或孢子形态上都存在异常。王刚等利用稻瘟菌131株系的一 个突变体H6鉴定出一个控制产孢和生长的基因，该突变体产孢减少并生 长缓慢，推测该基因处于控制产孢和菌丝生长的基因的上游。另外，研究 表明cAMP和MAP激酶途径所调节两个信号途径对稻瘟病菌附着胞形成 及其功能的调节比对分生孢子萌发的调节更为重要。稻瘟病菌基因组全序列的测定已经完成，这为以功能基因组学方法从 全基因组水平研究其关键基因的功能奠定了基础。目前，研究某一个基因 功能的最直接简便的方法是构建该基因突变体，而要进行功能基因组学研究就必需构建覆盖整个基因组的突变体库作为基础。根癌农杆菌 "gra6ac^/wm /wme/ade似)Ti质粒基因转化系统是目前植物上研究最 多、理论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化途经，另外，对致病性 发生变异的分子标签插入的突变体，可以通过TAIL-PCR、质粒拯救和 RT-PCR法扩增分子标签的侧翼序列，测序后在全基因组数据库中进行 Blast,对被标签的相关致病基因进行快速分析与鉴定，为最终克隆致病相 关基因奠定基础。以此建立的稻瘟病突变库，将为在全基因组水平研究稻 瘟菌的致病性及其变异机制提供了快速而准确的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一个稻瘟病菌与产孢相关的基因，以及 所述基因在设计农药分子靶点中的应用。本发明提供一个稻瘟病菌与产孢相关的基因，该基因直接影响稻瘟病 菌的分生孢子的形成。在对稻瘟病菌进行鉴定与分析的过程中，首先随机 挑选已建成的T-DNA突变体库中的突变体，筛选到一个产孢量减少的突 变体，该突变体生长速度不发生变化，产孢量下降，萌发及附着胞形成延 迟，分生孢子形态与分生孢子梗分化不发生变化；相同浓度下(lx 105/cm2)接种对感病品种的致病性与野生菌株没有差别。在T-DNA突变 体中，大部分情况下由于T-DNA的插入而使某一基因失活，使突变体表 现为某一性状缺陷。因此，根据所观察到的突变体表型，可以确认该突变 体中被T-DNA标签的基因的功能与产孢量形成有关，而不影响附着胞形 成以及致病性。稻瘟病菌与产孢相关的基因，其特征在于具有SEQ ID1所示的核苷 酸序列和SEQ ID2所示的氨基酸序列。通过TAIL-PCR方法获得突变体 的T-DNA侧翼序列(T-DNA flaking s叫uence)，克隆测序，去除载体序列 后的核苷酸序列在稻瘟病菌基因组数据库(www.broad.mit.edu /annotation /fungi/ magnaporthe —grisea)中BLAST比X寸。比对结果表 明，其同源序列为MG08093.4的启动子区。因此，可以确认MG08093.4 为一个与产孢相关的基因，即SEQID1所示的核苷酸序列。稻瘟病菌与产孢相关基因的验证方法，其特征在于包括以T步骤(1) 用同源重组的方法，将野生稻瘟菌株中权利要求1所述的基因片段SEQ ID1敲除，则表现为产孢量减少，致病性下降；(2)采用人工构建的互补 载体转化被敲除而缺失所述SEQ ID1基因片段的稻瘟菌株，则所得的互补菌株产孢量恢复。具体操作方法首先用同源重组的方法，通过PEG介导的原生质体转化将MG08093.4替换成潮霉素转移酶基因。这种基因 缺陷型突变体也表现为产孢量减少，分生孢子梗分化不变，致病性方面孢 子可侵入但不扩展，不形成感病病斑。通过构建基因自带启动子与该基因 连接的互补载体，进行功能性互补实验，能够恢复T-DNA突变体与基因 敲除突变体的产孢量。通过以上验证方法，确认被替换的基因MG08093.4 的功能与产孢相关。本发明的稻瘟病菌与产孢相关的基因，其实用价值在于可根据其功能 域的结构和功能，设计新型农药的分子靶点。通过同源性比对，MG08093.4 具有一个Zn(2)Cys(6)的真菌转录因子结构。转录因子在蛋白质家族中具 有非凡的影响力，能够通过调控基因表达来决定细胞的显性特征。锌指性 转录因子家族的组分成分包括一些特定的片段，或是与特定DNA序列联 合的锌指示剂，可用于筛选进一步所调控的基因。筛选直接作用于 MG08093.4基因或作用于能与其互作的其他基因的药剂都能使稻瘟病菌 的分生孢子形成能力下降，而进一步起到田间防治稻瘟病的效果。
具体实施方式
实施例1:稻瘟病菌T-DNA突变体库的建立以及产孢量减少突变体的获 得本发明是在已有的稻瘟病菌T-DNA突变体库中进行筛选，得到一个 产孢量显著减少的突变体株T940001602-2。首先建立稻瘟病菌T-DNA突 变体库将农杆菌菌株AGL-1 (含pBHtl)，在基本培养基(含有 Kan50吗/mL)上28°C培养48h，吸取适量培养物离心，并用诱导培养基 洗两次，重悬于含有Kan和乙酰丁香酮的诱导培养基中，28。C振荡培养 6h;然后吸取IOO"L上述培养物与lOOliL稻瘟病菌的分生孢子悬浮液 (lC^个/mL)混合，涂布放在共培养基上的纤维素膜上，在28°C培养 36h。用2mL基本培养基洗膜，收集真菌和细菌培养物，然后涂布于含潮 霉素和头孢噻肟钠的选择培养基平板上，挑取单个转化子再转至含潮霉素 的米糠培养基上(米糠20g，琼脂18g，加水至1L， pH6.5)产孢，单孢 分离至酵母培养基上(淀粉10g，酵母粉2g，琼脂15g加水至lL)并保 存滤纸片。随机挑取突变体进行表型观察，各突变体以及野生型先在酵母培养基上生长，用直径0.7cm的打孔器在已长满菌丝的酵母淀粉培养基上打孔， 然后将圆形的菌块转接于直径9cm含米糠培养基的培养皿中，28T:光照 产孢14d，用lmL无菌水洗脱孢子，血球计数板测得分生孢子数，再换 算成单位面积产孢量；孢子萌发率、附着胞形态和形成率观察方法为在人 工疏水表面(为美国BMA公司生产的Gelbond膜)上，滴20jiL (104个 孢子/mL)孢悬液，28"C下培养8h时统计孢子萌发率，12h统计附着胞形 成率并观察记载形态是否正常。以上实验均3次重复，结果取平均值。通 过以上筛选方法，获得产孢量显著减少的突变体株T940001602-2。该突 变体产孢量减少，孢子萌发率和附着胞形成率延迟，但不影响该菌的致病 性，在lxl0Vcr^的接种浓度下，也能够形成感病病斑。提取该突变体基因组DNA，取大约8ug用限制性内切酶进行完全酶 解，以潮霉素基因(扩增引物为hph-S: 5'-CGACAGCGTCTC CGACCT GA-3，； hph-AS: 5，- CGCCCAAGCTGCATCATCGAA-3，)为探针进行 Southern杂交。Southern杂交结果显示该突变体T-DNA为单拷贝插入。 将该突变体与GUY11在燕麦培养基上光照对峙生长30d，对所形成的子 囊孢子进行分离，建立有性杂交后代群体。对该群体各后代菌株的产孢形 状和对潮霉素抗性进行分析，结果表明后代菌株的性状分离比例为1:1， 说明在该突变体中产孢性状由单基因控制。 实施例2:突变体T-:DNA侧翼序列获得及被标签基因定位通过TAIL-PCR的方法获得T940001602-2的T-DNA侧翼序列，所用 引物为LB1 : 5,-GGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATG-3, ; LB2 : 5，-CATGTGTTGAGCATATAAGAAACC CT-3，； LB3: 5'-GAATTAATTC GGCGTTAATTCAGT-3,; AD9: 5，-TCGTTCCGCA-3，。将TAIL-PCR第 二、三步产物经1.0%琼脂糖电泳后，回收第三步产物中的特异性片段。 将回收得到的片段连接到pGEM-T Easy Vector上，进行克隆。将克隆得 到的阳性转化子进行测序，所测得到的序列去除载体序列与T-DNA序列 后，在稻瘟病菌数据库进行比对。比对结果表明，该序列位于MG08093.4 的启动子区。其屮MG08093.4为SEQ ID1所示的基因片段，具有一个 Zn(2)Cys(6)的真菌转录因子结构。 实施例3:被标签基因5'末端敲除用同源重组的方法对MG08093.4进行敲除。首先构建含有所要敲除基因的上下游同源片段以及真菌筛选标记的重组质粒。分别设计扩增上游与下游同源片段的引物，两个片段的大小为500bp与300bp。用限制性内切 酶Sal I将含有启动子和终止子的潮霉素转移酶基因从pCSN43质粒上切 下，回收纯化后，将该片段与另外两个同源片段用T4连接酶进行体外连 接。连接产物用上游片段的5'端引物以及下游片段的3'端引物进行扩 增。扩增产物连接到T-载体上，进行克隆。提取克隆得到的阳性转化子 的质粒DNA，进行下一步的稻瘟病菌原生质体转化。提取野生型菌株的 原生质体，以PEG介导的方法，将重组质粒DNA导入原生质体中，于含 有潮霉素的培养基上进行筛选生长。生长得到的转化子进行PCR和 Southern杂交验证。原生质所得到的阳性敲除转化子，表现为产孢量减少，附着胞形成延 迟等性状。在致病性方面，表现为可侵入但不形成感病病斑。 实施例4: T-DNA突变体与敲除突变体功能互补由于T-DNA突变体的T-DNA插入于MG08093.4的启动子区，本发 明所构建的互补载体包含该基因5'末端以及基因前2kb的DNA序列。 首先，互补载体pBARKSl线性化，用限制性内切酶Spe I对pBARKSl 质粒DNA进行完全酶切进行去磷酸化处理，回收酶切片段后。对野生型 基因组DNA进行PCR扩增得到含有启动子区的目的基因片段，也进行 Spel处理后，与回收的载体片段用T4连接酶进行体外连接。连接产物 转化到大肠杆菌中，挑取阳性重组子，提取质粒进行下一步的原生质体转 化。分别提取T-DNA突变体与基因敲除突变体的原生质体，同样以PEG 介导的方法，将重组质粒DNA导入原生质体中，在含有除草剂的培养基 上进行筛选生长。所筛选得到的阳性转化子同样进行产孢量、附着胞形成 率以及致病性等方面的表型分析。结果表明，无论是T-DNA突变体的互 补转化子还是敲除突变体的互补转化子都能够恢复产孢量及其他性状的 缺陷。以上实施实例中的限制性内切酶酶切体系与连接体系皆按照各酶产 品说明书中的要求进行操作。Untitled. ST25SEQUENCE LISTING<110〉福建农林大学〈120>稻瘟病菌与产孢相关的基因及应用〈"o〉 〈u;o〉 2<170〉 Patentln version 3. 1<210> 1<211〉 897<212> DNA〈213> Magn即orthe grisea〈■> 13tggCt3Ctttcactgcactgaatggcggctcgcc犯aggcattggacatcgtg组ggc60ggtgttgccagcgagstga3gaggtccggatcagsggaactgccacgaaccgaggctgtc120gcgccgagatctcagcgagaacccacc犯caacaaagcatcaagaccggc，Cg3Cgtg1800g， ccgtctaggacagcagctgctgagaccg3C3ggggiacgtgcgaagcaaaatgcagcg240gaacttgatgagcgggagcggCggg￡igaaccgggcaggtcccgcttcaactgtcgac300cggccgcgtcatccttcgaccggcttttctg3tgtcg3cagcggcgcactaa犯cgcaag360agatctaattC3CC3g3C3Cccgctcaa(:cgcggaacccgctcatcgagaaacgtccgaa420cccaaggaaggtC3ggCgC3atctcgcccccgctcacgtgatc朋agcagtttxagtccc480acgcgacgtacgcagagaccggCC3Cg3g3ggagg咖gggC3gg3gC33540agcgtgaggaagtctctttttgggcctccgggagccagggatgattggggacca犯ctat600gagcaggcccattctgcaattccaagct(:t,gCC3tC3gCg3ggt3g3CCCcatgggtgac660agccttgccagggcgacgcagCgC3t33gCaatgacgatgagagggcc3gccclgatgat720atggatgattcacccatgacgccttaccca agcggctcatscaatgccgaacagcaacgc780gatgggctagttC3ttCgg3tccceiagaagagasagcgcaactttagcaatcggaccaag840acaggctgccttscctgcagg犯acgcaaa aagaagtgtgacgagggcca897CO〉 2 〈211〉 298 <212> PRT<213> Magnaporthe grisea"U0> 2Met Ala Thr Phe Thr Ala Leu Asn Glv Gly Ser Pro Lys Ala Leu Asp 15 10 15lie Val Asn Gly Gly Val Ala Ser Glu Met Lvs Arg Ser Gly Ser Glu 20 25 30Glu Leu Pro Arg Thr Glu Ala Val Ala Pro Arg Ser Gin Arg Glu Pro 35 40 45Thr Asn Asn Lys Ala Ser Arg Pro Ala Asp Asp Val Ser Pro Ser Arg 50 55 60Thr Ala Ala Ala Glu Thr Asp Arg Glu Arg Ala Lys Gin Asn Ala Ala 65 70 75 80<formula>formula see original document page 9</formula>
权利要求
1. 一种稻瘟病菌与产孢相关的基因，其特征在于具有SEQ ID1所示的核苷酸序列。
2、 根据权利要求l所述的一种稻瘟病菌与产孢相关的基因，其特征 在于氨基酸序列如SEQ ID2所示。
3、 一种稻瘟病菌与产孢相关基因的验证方法，其特征在于包括以下 步骤(1) 用同源重组的方法，将野生稻瘟菌株中权利要求1所述的基因 片段SEQID1敲除，则表现为产孢量减少，致病性下降；(2) 采用人工构建的互补载体转化被敲除而缺失所述SEQ ID1基 丙片段的稻瘟菌株，则所得的互补菌株产孢量恢复。
4、 利用如权利要求1或2所述的一种稻瘟病菌与产孢相关的基因作 为靶点基因制备新型农药。
全文摘要
稻瘟病菌与产孢有关的基因。通过T-DNA插入突变的方法，分离与鉴定，得到稻瘟病菌产孢基因MG08093.4。该基因影响稻瘟病菌的分生孢子的形成，分生孢子梗的分化形成不受影响；孢子萌发及附着胞形成延迟；不影响侵染能力。通过基因敲除和功能互补的方法确认该基因主要与产孢有关，而不影响附着胞形成与致病性。该基因可以作为新型农药设计的分子靶点。
文档编号C07K14/37GK101240283SQ20071000858
公开日2008年8月13日 申请日期2007年2月9日 优先权日2007年2月9日
发明者李宏宇, 艳 林, 潘初沂, 王宗华, 鲁国东 申请人:福建农林大学