专利名称：1-氨基-乙内酰脲的免疫原及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种硝基呋喃类抗生素代谢物的免疫原及其制备方法，尤其涉及一种呋 喃妥因(Nitrofurantoin)代谢物l-氨基-乙内酰脲的免疫原及其制备方法与应用。属 硝基呋喃类抗生素药免疫检测领域。
背景技术：
下列定义适用于整个说明书和权利要求书
牛血清蛋白(Bovine Serum ALb咖in，简称BSA): Sigma公司产品 卵清蛋白(简称0VA): Sigma公司产品
磷酸缓冲液(Phosphate Buffered SaLine，简称PBS) : (0. 01 M, pH =7. 40) 1-氨基-乙内酰脲(l-aminohydantoin，简称AHD): Sigma公司产品 3 —羧基苯甲醛(3-carboxybenzaLbenzaLdehyde,简称CBA):上海点耀精细化工有 限公司产品
3 —羧基苯甲醛与l-氨基-乙内酰脲的偶联物(简称CPAHD):实验室合成 邻硝基苯甲醛(2-nitrobenzaldehyde，简称NBA):北京百灵威化学技术有限公司 邻硝基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物(简称NPAHD):实验室合成 乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(简称EDC) :Sigma公司产品 三正丁胺中国医药集团上海化学试剂公司产品 氯甲酸异丁酯上海飞翔化工厂产品
乙二胺广东 汕头西陇化工产品
透析膜bioshorp公司产品
N,N' -二甲基甲酰胺(DMF):天津市广成化学试剂有限公司产品
呋喃妥因(Nitrofurantoin)是一种重要的硝基呋喃类抗感染药，而1-氨基-乙内酰 脲(l-aminohydantoin)为呋喃妥因的代谢物。由于优良的抗菌性能和动力学性质，呋喃 类药物早已被广泛地应用于家畜、家禽和水产等养殖业的传染病预防与治疗，是一类广 谱抗菌药。但经过长期的动物实验研究结果表明，硝基呋喃类药物以及其代谢产物具有 致癌和致突变的特性。动物长期或大剂量服用呋喃类药物能引起毒性反应，表现为兴奋， 惊厥，瘫痪的急性神经症状以及全身出血和反刍消化障碍等慢性中毒反应。对于人体的 不良反应主要是胃肠反应，溶血性贫血，血小板减少性紫癜，多发性神经炎，眼部损害， 急性肝坏死和嗜酸性白细胞增多等过敏反应。
由于这些毒害作用，世界上很多国家都对硝基呋喃类药物的使用和残留实施了严格的规定。美国21CFR530.41规定食源性动物禁止使用呋喃妥因；澳大利亚于1992年 禁止在养殖业中使用硝基呋喃类药物；欧盟EEC2377/90规定动物食源性食品中不得 检出硝基呋喃(包括呋喃妥因)；欧盟在1995年6月开始规定动物源食品中不得检出硝 基呋喃(Commission ReguLation 1442/95);在我国，硝基呋喃药物是农业部严禁的抗 菌素。尽管如此，硝基呋喃类药物由于药效显著，价格低廉，难以检测，在我国的畜禽 水产养殖业中使用非常普遍,这给人们的健康安全带来巨大的隐患。我国出口欧盟的鱼， 虾，禽肉，兔肉，和肠衣均被检出过含有硝基呋喃类药物，尤其是兔肉和禽肉，常常导 致出口食品被迫就地销毁。这已严重影响我国动物源食品的出口，对国际贸易带来极大 的威胁。所以，硝基呋喃类药物残留的检测方法的开发研究己刻不容缓。
硝基呋喃类药物在动物体内代谢迅速，通过检测母体化合物并不能得知这类药物的 滥用情况。检测硝基呋喃类药物残留以杜绝使用这种违禁药物的最佳方法是检测其代谢 物而非母体化合物本身，因此，检测硝基呋喃类药物的残留就变成了检测这些与蛋白组织结合在一起的代谢物的残留。
在抗生素药物残留的检测中，仪器法如液相色谱和质谱以及液相质谱联用是应用最 广泛的方法。这些方法准确，稳定，可靠，可以作为标准方法。但仪器法价格昂贵，费 时较长，需要大型仪器设备，需要专门的技术人员，所以难于用于现场操作。酶联免疫 检测法(ELISA)提供了一种极好的扫描手段。该法具有快速，准确，简易，不需要专 门人员操作等优点，这使得ELISA法成为一种理想的，可用于常规扫描的检测方法。酶 联免疫检测法的核心是需要高质量的抗体。大多数抗生素包括硝基呋喃类药物都是小分 子有机化合物，不具有免疫原性，称之为半抗原。所以，必须把这些化合物转变成能引 发动物免疫系统产生抗体的免疫原(又称之为完全抗原)。
经检索，目前世界上尚未有关于呋喃妥因(Nitrofurantoin)代谢物1-氨基-乙内 酰脲的免疫原的合成的报道，基于1-氨基-乙内酰脲的免疫原(CPAHD-cBSA Conjugate) 可用来制备邻硝基苯甲醛与l-氨基-乙内酰脲的偶联物(NPAHD)特异反应抗体，因此研 究1-氨基-乙内酰脲的免疫原的合成及抗体制备有着重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种能引发动物免疫系统产生 针对邻硝基苯甲醛与l-氨基-乙内酰脲的偶联物(NPAHD)有特异反应的抗体的免疫原， 即1-氨基-乙内酰脲的免疫原(CPAHD-cBSA Conjugate)及其制备方法。同时，本发明 还提供了所述的l-氨基-乙内酰脲的免疫原(CPAHD-cBSA Conjugate)在制备邻硝基苯 甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物(NPAHD)特异反应抗体中的应用。
本发明所述1-氨基-乙内酰脲的免疫原，由3 —羧基苯甲醛与1_氨基-乙内酰脲形 成的偶联物半抗原与产生免疫原性的载体物质牛血清蛋白或卵清蛋白连接制成。
其中所述产生免疫原性的载体物质优选活化牛血清蛋白。
上述l一氨基一乙内酰脲的免疫原，优选的结构如通式(I )
<formula>see original document page 6</formula> (I)
式中cBSA为活化牛血清蛋白(Cationized Bovine Serum Albumin)，其分子量范 围是6. 7 6. 8 KDa;
n为与一个牛血清蛋白分子结合的3 —羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲形成 的偶联物(CPAHD)的分子数；所述n为整数l 10;
上述免疫原显示出如下物化特征
(1) 外观白色粉末固体；
(2) 紫外吸收光谱284 nm。
上述的l一氨基一乙内酰脲的免疫原结构通式中所述n优选整数5 8， cBSA分子 量优选6. 8 Kda 。
本发明所述l一氨基一乙内酰脲的免疫原的制备方法，其特征是将3 —羧基苯甲 醛与1-氨基-乙内酰脲形成偶联物(CPAHD)与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合 为具有诱发动物免疫系统产生抗体的免疫原，并保持该免疫原的生物活性不变。
上述l一氨基一乙内酰脲的免疫原的具体制备方法，由如下步骤完成
(1) 3 —羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物(CPAHD)的制备将l-氨基-乙 内酰脲的盐酸盐与间羧基苯甲醛按1: 1 3:1溶于20 30mL无水甲醇中，在65士5。C下 回流反应18 24小时，蒸干后用无水乙醇洗涤抽滤、干燥，得3 —羧基苯甲醛与1-氨 基-乙内酰脲的偶联物，备用；
(2) 活化牛血清蛋白(cBSA)的制备在0 4。C条件下，先将乙二胺溶于pH为7. 38 7.56、浓度为0.01 M 0.02 M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7. 38 7. 50,备用； 称取牛血清蛋白(BSA)和乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(EDC)，然后以乙二胺牛 血清蛋白乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺的摩尔比为15 25 : 1 : 15 25的量依次 加入上述溶液中，在2(TC土5'C条件下搅拌反应2 4h;将反应溶液在0 4匸条件下， 用上述磷酸缓冲液搅拌透析70 80h，然后改用蒸馏水透析20 30h，每6h更换一次透 析液；在0 4。C,以10000 13000r/min离心上述透析后的溶液10 15min,取上清液； 冻干上清液，得到白色粉末固体即活化的牛血清蛋白(cBSA)，备用；
(3) 1-氨基-乙内酰脲(CPAHD-cBSA)的制备 ① 溶液A的制备:称取3 —羧基苯甲醛与l-氨基-乙内酰脲的偶联物(CPAHD)溶 于 N，N' -二甲基甲酰胺(DMF)中，以3 —羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物(CPAHD)、 三正丁胺与氯甲酸异丁酯的摩尔比为1: 1 1.5: 4 6的量加入三正丁胺搅拌10min， 在冰浴条件下再加入氯甲酸异丁酯，反应l 2h，得溶液A，备用；
② 溶液B的制备称取活化的牛血清蛋白(cBSA)溶于N，N' -二甲基甲酰胺(DMF) 的水溶液中，得溶液B，其中以质量比计，N,N' -二甲基甲酰胺水二1:1 1:3;
③ 溶液C的制备将A溶液缓慢加入到B溶液中，于0 4'C条件下搅拌反应2 4h， 得溶液C，其中3 —羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物(CPAHD)与活化的牛血 清蛋白(cBSA)的摩尔比为100:1 150: 1;
(4) 用pH为7. 30 7.50、浓度为0. 01M 0. 02M的磷酸缓冲液在0 4。C下，搅拌 透析溶液C 70 80小时，然后改用蒸馏水透析20 30小时，每6 7小时更换一次透 析液；以12000 15000r/min离心透析后的溶液10 15min，取上清液，备用；
(5) 将步骤(4)所述上清液以常规方式冻干，得到1-氨基-乙内酰脲的免疫原粗品。
上述1一氨基一乙内酰脲的免疫原的制备方法中，优选的实施方式是
步骤(1)所述1-氨基-乙内酰脲的盐酸盐与间羧基苯甲醛的摩尔比为l : 1。
步骤(3)之③所述3 —羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物(CPAHD)与活化 的牛血清蛋白(cBSA)的摩尔比为120:1。
步骤(2)、 (4)所述磷酸缓冲液的pH为7.4，磷酸缓冲液的浓度为0.01 M。
本发明所述l一氨基一乙内酰脲的免疫原在制备邻硝基苯甲醛与l-氨基-乙内酰脲 的偶联物(NPAHD)特异反应抗体中的应用。
利用本发明的技术方案可以成功地把半抗原l一氨基一乙内酰脲与载体蛋白特别是 牛血清蛋白偶联起来，从而制备成能够在动物体内引发免疫反应，产生抗体的完全免疫 原即1-氨基-乙内酰脲的免疫原(CPAHD-cBSA)。
利用本发明所述的l-氨基-乙内酰脲的免疫原免疫新西兰大白兔，成功地获得了对 邻硝基苯甲醛与l-氨基-乙内酰脲的偶联物(NPAHD)有特异反应的抗体。经酶联免疫检 测实验鉴定，利用本发明所述的1-氨基-乙内酰脲免疫原制备的抗体对邻硝基苯甲醛与 1-氨基-乙内酰脲的偶联物(NPAHD)有特异性反应，其抗血清效价达到l : 1, 024， 000 以上，其最低检测限为O. l卯b， ICs。(转化为AHD)为10卯b。
本发明成功地把半抗原1-氨基-乙内酰脲与载体蛋白特别是牛血清蛋白偶联起来， 合成了能够在动物体内引发免疫反应，产生抗体的完全免疫原。利用此免疫原免疫兔， 鼠，鸡等动物可以得到对邻硝基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物(NPAHD)有特异反 应的抗体。把该抗体镀在微孔盘内，就可以用来检验动物源食品中呋喃妥因抗生素的残 留。由于本发明方法具有简易，快速，特异，准确的特点，所以可以用于食品检验检疫 中的初步扫描筛选之用。这样不但可以节省大量的检验时间，还可以用于现场操作，从 而补充仪器法的缺点。
本发明所述半抗原1-氨基-乙内酰脲与载体蛋白牛血清蛋白免疫原的合成为动物源食品中呋喃妥因抗生素的残留快速检验又提供了新的手段，为制备卜氨基-乙内酰脲的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。
图1紫外吸收光谱图
其中1: l-氨基-乙内酰脲的免疫原2: 3 —羧基苯甲醛3: 3 —羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物(CPAHD)4:活化牛血清蛋白(cBSA)
具体实施例方式
实施例1:
(1) 3 —羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物(CPAHD)的制备将1-氨基-乙 内酰脲的盐酸盐与间羧基苯甲醛按l:l溶于20 30mL无水甲醇中，在65士2。C下回流反 应20小时，蒸干后用无水乙醇洗涤抽滤、干燥，得3 —羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲 的偶联物，备用；
(2) 活化牛血清蛋白(cBSA)的制备:在0 4'C条件下，先将乙二胺溶于pH为7. 46、 浓度为0.01M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7.46，备用；称取牛血清蛋白(BSA) 和乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(EDC)，然后以乙二胺牛血清蛋白乙基[3-(二 甲胺基)丙基]碳二亚胺的摩尔比为20 : 1 : 20的量依次加入上述溶液中，在20。C士rC 条件下搅拌反应3h;将反应溶液在0 4'C条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析80h，然 后改用蒸馏水透析30h，每6h更换一次透析液；在0 4'C，以13000r/min离心上述透 析后的溶液15min，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体即活化的牛血清蛋白
(cBSA)，备用；
(3) l-氨基-乙内酰脲(CPAHD-cBSA)的制备
① 溶液A的制备称取3 —羧基苯甲醛与卜氨基-乙内酰脲的偶联物(CPAHD)溶 于N，N' -二甲基甲酰胺(DMF)中，以3—羧基苯甲醛与卜氨基-乙内酰脲的偶联物
(CPAHD)、三正丁胺与氯甲酸异丁酯的摩尔比为1: 1: 5的量加入三正丁胺搅拌10min， 在冰浴条件下再加入氯甲酸异丁酯，反应2h，得溶液A,备用；
② 溶液B的制备称取活化的牛血清蛋白(cBSA)溶于N, N' -二甲基甲酰胺(DMF) 的水溶液中，得溶液B，其中以质量比计，N，N' -二甲基甲酰胺:水=1:2;
③ 溶液C的制备将A溶液缓慢加入到B溶液中，于0 4'C条件下搅拌反应4h， 得溶液C，其中3 —羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物(CPAHD)与活化的牛血 清蛋白(cBSA)的摩尔比为120:1;
(4) 用pH为7. 45、浓度为0. 01M的磷酸缓冲液在0 4'C下，搅拌透析溶液C 80 小时，然后改用蒸馏水透析30小时，每6小时更换一次透析液；以14000r/min离心透 析后的溶液15min，取上清液，备用；
(5) 将步骤(4)所述上清液以常规方式冻干，得到1-氨基-乙内酰脲的免疫原粗
(6)通过紫外吸收光谱确定产物的吸收峰位于284nm。
实施例2:
U)3—羧基苯甲醛与卜氨基-乙内酰脲的偶联物(CPAHD)的制备将l-氨基-乙内 酰脲的盐酸盐(151nig)与间羧基苯甲醛(75mg)溶于20mL无水甲醇中。在65'C下回流反应 20小时。蒸干后用无水乙醇洗涤、抽滤、干燥，备用。
(2) 活化牛血清蛋白(cBSA)的制备在0 4X:条件下，先将乙二胺(13.5mg)溶于 pH为7.40，浓度为0.015 M磷酸缓冲溶液中，然后用浓盐酸调pH为7.40，备用；称 取牛血清蛋白(1000mg)和乙基[3- (二甲胺基)丙基]碳二亚胺(42mg)，然后加入上述溶液 中，在20。C条件下搅拌反应3h;将乙二胺与BSA的反应溶液在0 4'C条件下，用上述 磷酸缓冲液搅拌透析75h，然后改用蒸馏水透析25h，每6.5h更换一次透析液；在0 4 ℃，以13000r/min离心上述透析后的溶液10min，取上清液；冻干上清液，得到白色粉 末固体一活化牛血清蛋白(cBSA)，备用。
(3) l-氨基-乙内酰脲免疫原(CPAHD-cBSA)的制备
a) 溶液A的制备称取40mg CPAHD溶于10mL N, N' -二甲基甲酰胺(DMF)中。加 入66.7yL三正丁胺搅拌15min。在冰浴条件下加入93y L氯甲酸异丁酯，反应1. 5h， 备用。
b) 溶液B的制备称取65mg活化牛血清蛋白(cBSA)溶于15mL N,N' -二甲基甲酰 胺(DMF)的水溶液中(DMF:水-1: 1)。
c) 溶液C的制备将A溶液缓慢加入到B溶液中，于0 4'C条件下搅拌反应4h。
(4) 用pH为7. 40，浓度为0. 01M的磷酸缓冲液在0 4'C下，搅拌透析溶液C 75h， 然后改用蒸馏水透析25h，每6.5h更换一次透析液；15000r/min离心透析后的溶液 15min，取上清液。
(5) 冻干上清液，得到1-氨基-乙内酰脲免疫原粗品。
(6) 通过紫外吸收光谱确定产物的吸收峰位于284nm。
实施例3:
(1) 3—羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物(CPAHD)的制备l-氨基-乙内酰 脲的盐酸盐(151mg)与间羧基苯甲醛(50mg)溶于20mL无水甲醇中。在65℃下回流反应 25小时，蒸干后用无水乙醇洗涤、抽滤、干燥，备用。
(2) 活化牛血清蛋白(cBSA)的制备在0 4。C条件下，先将乙二胺(27mg)溶于pH 为7. 5，浓度为0. 02 M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7. 40，备用；称取牛血清 蛋白(1000mg)和乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(84mg)，然后依次加入上述溶液中， 在2(TC下搅拌反应4h;将乙二胺与BSA的反应溶液在0 4。C条件下，用上述磷酸缓冲 液搅拌透析80h，然后改用蒸馏水透析30h，每7h更换一次透析液；在0 4°C，以 10000r/min离心上述透析后的溶液15min，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体 cBSA，备用。(3) 1-氨基-乙内酰脲免疫原(CPAHD-cBSA)的制备
a) 溶液A的制备称取40mg CPAHD溶于10mL N，N' -二甲基甲酰胺(DMF)中。加 入66.7uL三正丁胺搅拌10min。在冰浴条件下加入93 u L氯甲酸异丁酯，反应1. 5h， 备用。
b) 溶液B的制备称取70mg活化牛血清蛋白(cBSA)溶于15mL N， N' -二甲基甲酰 胺(簡F)的水溶液中(DMF:水二1: 1)。
c) 溶液C的制备将制备的A溶液缓慢加入到B溶液中，于0 4'C条件下搅拌反 应4h。。
(4) 用pH为7. 40，浓度为0. 05M的磷酸缓冲液在0 4'C下，搅拌透析溶液C 80h， 然后改用蒸馏水透析30h，每7h更换一次透析液；高速离心，取上清液。
(5) 冻干上清液，得到1-氨基-乙内酰脲免疫原粗品；
(6) 通过紫外吸收光谱确定产物的吸收峰位于284nm。
实施例4:
(1) 3 —羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物(CPAHD)的制备将l-氨基-乙内 酰脲的盐酸盐(151mg)与间羧基苯甲醛(150mg)溶于20mL无水甲醇中。在65t下回流反 应18小时。蒸干后用无水乙醇洗涤、抽滤、干燥，备用。
(2) 活化牛血清蛋白(cBSA)的制备在0 4。C条件下，先将乙二胺(18mg)溶于pH 为7.40，浓度为0.01M磷酸缓冲溶液中，然后用浓盐酸调pH为7.40，备用；称取牛 血清蛋白(1000mg)和乙基[3- (二甲胺基)丙基]碳二亚胺(56mg)，依次加入上述溶液中， 在20。C条件下搅拌反应2h;将乙二胺与牛血清蛋白的反应溶液在0 4'C条件下，用上 述磷酸缓冲液搅拌透析70h,然后改用蒸馏水透析20h，每6h更换一次透析液；在0 4 °C，以13000r/min离心上述透析后的溶液15min，取上清液；冻干上清液，得到白色粉 末固体一活化牛血清蛋白(cBSA)，备用。
(3) 1_氨基-乙内酰脲免疫原(CPAHD-cBSA)的制备
a) 溶液A的制备称取40mgCPAHD溶于10mLN，N' -二甲基甲酰胺(DMF)中。加 入50uL三正丁胺搅拌10min。在冰浴条件下加入87nL氯甲酸异丁酯，反应lh，备用。
b) 溶液B的制备称取80mg活化牛血清蛋白(cBSA)溶于15mL N， N' -二甲基甲酰 胺(函F)的水溶液中(匿F:水二1: 1)。
c) 溶液C的制备将制备的A溶液缓慢加入到B溶液中，于0 4'C条件下搅拌反 应4h。
(4) 用pH为7. 40，浓度为0. 01M的磷酸缓冲液在0 4。C下，搅拌透析溶液C70h， 然后改用蒸馏水透析20h，每6h更换一次透析液；13000r/min离心透析后的溶液13min， 取上清液。
(5) 冻干上清液，得到1-氨基-乙内酰脲免疫原粗品；
(6) 通过紫外吸收光谱确定产物的吸收峰位于284nm。实施例5:
抗体的制备纯化及检测
1.抗体的制备
选择上述实施例l所制备的l-氨基-乙内酰脲免疫原进行动物免疫实验以制备抗体。 取lmg/mL的卜氨基-乙内酰脲免疫原的溶液lmL,加入等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化 后，经皮下多点注射给四只体重2kg的雄性健康新西兰大白兔，lmL/只，15天后以同量 抗原与弗氏不完全佐剂充分乳化后进行二免，二免以后，每隔15天加强免疫一次，抗原 量减半，共免疫5次。最后一次免疫7天后，心脏采血，室温静置lh， 0 4。C过夜， 13000r/min离心15min,收集血清，一20。C保存，备用。
2. 抗体的纯化
搅拌状态下向上述制备的抗血清中加入饱和硫酸铵至硫酸铵溶液的终浓度为体积 百分比是50%， 0 4。C放置过夜，有沉淀物析出；以13000r/min离心15min，弃上清液， 向沉淀物中加入0.01M、 pH7. 4的PBS至沉淀溶解，然后加入饱和硫酸铵溶液至硫酸铵溶 液的终浓度为体积百分比是33%， 0 4r放置过夜，有沉淀物析出；以13000r/min离 心15min，弃上清液，向沉淀物中加入0.01M、 pH7.4的PBS至沉淀溶解。将上述纯化物 用0.01M、 pH7.4的PBS， 0 4X:透析，换透析液3次，然后加入质量体积百分比为O. 02 %的叠氮化钠，一2(TC保存，备用。
3. 抗体的酶联免疫检测
(1)效价测定方法采用常规的间接酶联免疫吸附检测法 在96孔的酶标板上，用100yL/孔的l-氨基-乙内酰脲的包被抗原(10yg/mL)(戊 二醛方法合成)包被，0 4。C放置过夜，然后用PBST (1000mLpH7.4、浓度O. 01M的PBS屮 体积百分比是O. 05%Tween20)洗板四次；用250u L/孔封闭液(1000mLPBST十质量体积百 分比是1%卵清蛋白)封闭，室温放置3h，洗板；在洗去封闭液后，力口100uL/孔的抗血 清，室温放置2h，洗板；在洗去抗血清以后，每孔加入l : 1000的辣根过氧化物酶标记 的羊抗兔IgG100uL/孔，室温放置lh，洗板；加入底物邻苯二胺显色，室温放置10min， 再加入2MHC1终止。酶标仪A492nm检测。
经测定本发明所述l-氨基-乙内酰脲免疫原制备的抗体效价达l : 1,024,000。 效价的判定以P/N大于2 : l的血清最高稀释倍数为该抗体的酶联免疫检测效价。 其中P为代测血清在某一稀释倍数测定的吸光度值，N为阴性对照在相应稀释倍 数测定的吸光度值。
(2)特异性测定
测定步骤与效价测定类似，在上述最佳的包被抗原与抗体浓度条件下，加抗体的同时加入邻硝基苯甲醛与l-氨基-乙内酰脲的偶联物(NPAHD)(从100ppm-0. lppb)，与包 被抗原竞争结合有限的抗体，邻硝基苯甲醛与l-氨基-乙内酰脲的偶联物(NPAHD)的浓 度越高，抗体与包被抗原就结合得越少，从而显色越浅，吸光度值越低。再与空白对照 (只加抗体，未加邻硝基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物(NPAHD)的吸光度值)相 比较，以确定抗体特异性。
通过测定抗体特异性较好，其最低检测限可达到O. lppb, ICs。(转化为AHD)为10卯b。
实施例6
制备上述酶联免疫检测中所用1-氨基-乙内酰脲与卵清蛋白的偶联物
(1) 称取117mg卵清蛋白溶于10ml硼砂缓冲液(Ph=8.5)中。
(2) 称取15.8mg1-氨基-乙内酰脲加入(1)液中搅拌溶解。
(3) 向(2)液中滴加0.2ml25X的戊二醛，于0—4'C条件下搅拌反应4小时。
用pH7. 4、浓度0. 01M的PBS缓冲液0 — 4'C条件下，搅拌透析步骤(3)制得的溶液72
小时，然后改用蒸馏水透析30小时，每6小时更换一次透析液。
冻干上清液，得到淡黄色固体，即为l-氨基-乙内酰脲与卵清蛋白的偶联物；其结构图
如下<formula>see original document page 12</formula>
权利要求
1.一种1-氨基-乙内酰脲的免疫原，由3-羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲形成的偶联物半抗原与产生免疫原性的载体物质牛血清蛋白或卵清蛋白连接制成。
2. 如权利要求1所述1一氨基一乙内酰脲的免疫原，其特征是所述产生免疫原性的 载体物质是活化牛血清蛋白。
3. 如权利要求2所述1一氨基一乙内酰脲的免疫原，其结构如通式(I )式中cBSA为活化牛血清蛋白，其分子量范围是6.7 6.8 KDa;n为与一个牛血清蛋白分子结合的3 —羧基苯甲醛与l-氨基-乙内酰脲形 成的偶联物的分子数；所述n为整数l 10; 上述免疫原显示出如下物化特征(1) 外观白色粉末固体；(2) 紫外吸收光谱284 nm。
4. 如权利要求3所述1一氨基一乙内酰脲的免疫原，其特征是所述n为整数5 8， cBSA分子量是6. 8 Kda 。
5. 权利要求1 4中任一项所述1一氨基一乙内酰脲的免疫原的制备方法，其特征是 将3 —羧基苯甲醛与l-氨基-乙内酰脲形成偶联物与产生免疫原性的载体物质连接起来， 结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的免疫原，并保持该免疫原的生物活性不变。
6. 如权利要求5所述1一氨基一乙内酰脲的免疫原的制备方法，由如下步骤完成(1) 3 —羧基苯甲醛与l-氨基-乙内酰脲的偶联物的制备将1-氨基-乙内酰脲的盐酸盐与间羧基苯甲醛按l:l 3:l溶于20 30mL无水甲醇中，在65士5。C下回流反应18 24小时，蒸干后用无水乙醇洗涤抽滤、干燥，得3 —羧基苯甲醛与l-氨基-乙内酰脲的 偶联物，备用；(2) 活化牛血清蛋白的制备:在0 4。C条件下，先将乙二胺溶于pH为7. 38 7. 56、 浓度为0.01M 0.02M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7. 38 7.50，备用；称取牛 血清蛋白和乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺，然后以乙二胺牛血清蛋白乙基 [3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺的摩尔比为15 25 : 1 : 15 25的量依次加入上述溶液 中，在20。C土5'C条件下搅拌反应2 4h;将反应溶液在0 4C条件下，用上述磷酸缓 冲液搅拌透析70 80h，然后改用蒸馏水透析20 30h，每6h更换一次透析液；在0 4。C，以10000 13000r/min离心上述透析后的溶液10 15min，取上清液；冻干上清液， 得到白色粉末固体即活化的牛血清蛋白，备用；(3) 1-氨基-乙内酰脲的制备① 溶液A的制备称取3 —羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物溶于N， N'-二甲基甲酰胺中，以3—羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物、三正丁胺与氯甲酸 异丁酯的摩尔比为1:1 1.5:4 6的量加入三正丁胺搅拌10min，在冰浴条件下再加入 氯甲酸异丁酯，反应l 2h，得溶液A，备用；② 溶液B的制备称取活化的牛血清蛋白溶于N，N' -二甲基甲酰胺的水溶液中， 得溶液B，其中以质量比计，N，N' -二甲基甲酰胺:水=1:1 1:3;③ 溶液C的制备将A溶液缓慢加入到B溶液中，于0 4'C条件下搅拌反应2 4h，得溶液C，其中3 —羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲的偶联物与活化的牛血清蛋白的摩尔比为100:1 150: 1;(4) 用pH为7. 30 7. 50、浓度为0. 01M 0. 02M的磷酸缓冲液在0 4。C下，搅拌 透析溶液C 70 80小时，然后改用蒸熘水透析20 30小时，每6 7小时更换一次透 析液；以12000 15000r/min离心透析后的溶液10 15rain，取上清液，备用；(5) 将步骤(4)所述上清液以常规方式冻干，得到1-氨基-乙内酰脲的免疫原粗P口n 0
7. 如权利要求6所述1一氨基一乙内酰脲的免疫原的制备方法，其特征是步骤(1) 所述1-氨基-乙内酰脲的盐酸盐与间羧基苯甲醛的摩尔比为1 : 1。
8. 如权利要求6所述1一氨基一乙内酰脲的免疫原的制备方法，其特征是步骤(3)之③所述3 —羧基苯甲醛与l-氨基-乙内酰脲的偶联物与活化的牛血清蛋白的摩尔比为 120:1。
9. 如权利要求6所述1—氨基一乙内酰脲的免疫原的制备方法，其特征是步骤(2)、 (4)所述磷酸缓冲液的pH为7.4，磷酸缓冲液的浓度为0.01 M。
10. 权利要求1 4中任一项所述1一氨基一乙内酰脲的免疫原在制备邻硝基苯甲醛与 l-氨基-乙内酰脲的偶联物特异反应抗体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种通式(I)的1-氨基-乙内酰脲的免疫原，由3-羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲形成的偶联物半抗原与产生免疫原性的载体物质牛血清蛋白或卵清蛋白连接制成。本发明还公开了所述的免疫原的制备方法，即将3-羧基苯甲醛与1-氨基-乙内酰脲形成偶联物与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的免疫原。本发明的1-氨基-乙内酰脲的免疫原通过免疫新西兰大白兔，制备了效价达1∶1,024,000以上的抗血清，其最低检测限为0.1ppb，IC<sub>50</sub>(转化为AHD)为10ppb。本发明具有方法简便，快速，特异，准确的特点，为制备1-氨基-乙内酰脲的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。
文档编号C07K14/76GK101173007SQ20071001445
公开日2008年5月7日 申请日期2007年5月23日 优先权日2007年5月23日
发明者围 刘, 卢圣欣, 张玉兰, 赵承彪, 郗日沫 申请人:山东大学