专利名称：吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明是一种净化血液及血液制品的吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，及该吩噻 嗪类染料修饰的磁性微粒的制备方法及其用途。
技术背景输血是治病救人的有效治疗手段，但输血也伴随着艾滋病、乙型肝炎以及丙型肝炎等病毒性疾病传播的危险。据统计，目前全世界被艾滋病毒(HIV)感染的人 数大于三千万，被乙肝病毒(HBV)感染的人数大约3. 7亿，被丙肝病毒(HCV) 感染的人数大约1. 8亿，而被HIV感染总数的5-10%源于不安全的输血！血液中的病毒主要存在于白细胞中，还有一部分游离于血浆之中。由于在一般 的输血过程中白细胞没有实际的功效，且易引起发热反应和携带病毒的高风险，所 以近年来医学家建议从输血用血液中除掉白细胞。白细胞的分离及过滤技术目前已 经非常成熟，通常经过简单的离心和过滤就可除去血液中99.99%的白细胞。但该 去白过程会部分破坏血液中的正常成分。血浆占全血的55%，血浆的输注在各种血 液成分的输注中占有很大的比例。杀灭和去除血浆中的病毒是提高血浆输注安全性 亟待解决的问题。目前，血液及血液制品中所含病毒的处理主要有灭活和去除两种形式。灭活方 法中，巴斯德消毒法对一些耐热病毒的灭活效果不佳。有机溶剂结合表面活性剂 (S/D)法，对非脂包膜病毒无效，且工艺复杂，成本高。干热灭活法，虽安全有 效，但仅适用于冻干制剂的病毒灭活。光化学灭活法，是目前被视为颇有前景的血 液净化的热点研究方向，不仅可以灭活血浆中游离的病毒，而且可以灭活细胞内整 合的病毒，故可用于全血、血浆及血细胞等各种血液成分及血液制品的消毒。已使 用的化学光敏剂主要有血卟啉衍生物、补骨脂素衍生物及吩噻嗪类染料亚甲蓝等。 亚甲蓝光化学法灭活法具有效率高、成本低、起效快、操作简单的优点，灭活 后的血浆副作用小，血浆蛋白的免疫原性无变异，主要用于血浆中HIV、 HBV及 HCV的灭活；且亚甲蓝是FDA批准的临床用药，毒副作用较小。对亚甲蓝光化学 法作用机理的研究表明，亚甲蓝既可与病毒脂包膜上的脂质和蛋白质结合，又可与 核酸，尤其是富含GC碱基区域结合，经一定波长的光照后，光敏剂形成单态氧和 氢氧自由基，破坏了病毒脂包膜，使得鸟嘌呤发生氧化，核酸发生断裂，从而可阻 止病毒的复制。该方法目前主要用于新鲜冰冻血衆中病毒的净化，而其它的一些对核酸具有更高亲和力并可杀灭细胞内病毒的亚甲蓝衍生物已用于全血及红细胞悬 液中病毒的灭活研究。1993年起在欧洲一些国家的红十字会输血中心开始使用该 方法灭活新鲜冷冻血浆中的病毒，至今未发现明显的负面反应。我国近年来也将采 用该法灭活的血浆用于临床治疗，取得了良好的效果。但该法主要的缺点是亚甲 蓝残留在血液中，导致血液颜色变化，会使受血者产生心理抗拒。尤其是残留的亚 甲蓝在人体内会积累，存在潜在的致突变的危险。虽然可以用吸附剂法去除亚甲蓝， 但去除率通常只能达到85%左右，且该过程会影响血液制品中的正常成分。上述灭 活病毒的方法，均无法将灭活后的病毒从血液或血液制品中去除。临床使用表明， 没有一种病毒灭活方法能保证血液制品绝对无传播病毒的危险。比较成熟的病毒去除方法中色谱法耗时太长，且去除病毒不彻底。膜法易损 伤细胞成分。免疫吸附柱法尚处于研发之中，可用于血液制品中病毒的彻底去除， 但耗时较长且特异性太强，故实际应用的范围很窄。申请号为200410026221.2的中国专利，公开了一种将抗体固定于磁性微粒表 面，禾拥抗原抗体间的特异性结合及磁性微粒的磁性分离性能去除血液中病毒的方 法。但由于抗体的稳定性较差，产品不易保存，故实际应用受到很大限制。综上所述，现存的血液净化方法，有的只能杀灭病毒而无法去除被杀灭的病毒， 致使异源蛋白/核酸虽无活性但依然存在于血液或血液制品中，而这种存在本身就 有潜在的危险；有的虽能去除病毒，但无法确保病毒被完全去除。磁性微粒是由有机或无机基质与磁性金属、金属氧化物等磁性超细粉末复合形 成的纳米或微米级胶态颗粒。该材料的超顺磁性使其在胶体溶液中具有稳定性，其 磁响应性可保证在外加磁场中颗粒与悬浮介质的分离，在撤去外磁场时微粒本身会 重新悬浮分散而不聚集，即不具有磁记忆性。更有意义的是，通过高分子或有机试 剂与磁性颗粒的复合，可在颗粒表面引入氨基、羧基、巯基、羟基等功能基团，通 过共价作用将酶、抗体、细胞、核酸及寡核苷酸等生物分子固定在表面，可应用于 细胞分选、酶的固定化、免疫检测、药物载体及核酸的纯化与分离、肿瘤的耙向治 疗研究等生物、医学领域。目前，国内在该领域大多处于研究阶段。中科院成都有机所较早利用单体聚合 法进行了磁性聚苯乙烯微粒的合成，并用于固定化中性蛋白酶的研究。南开大学高 分子化学所研究了磁性葡聚糖毫微粒的合成，并探讨了固定化酶的条件。天津大学 生物工程研究中心、第四军医大学等单位在磁性载药颗粒的靶向治疗方面开展了研 究。本申请发明人日前做出的一种核/壳型超顺磁性复合微粒及其制备方法与应用 (专利申请号CN03124061 . 5)、 一种组装型磁性复合微粒及其制备方法与应用其中，R,、 R9分别表示H、低级烷基或低级芳烷基；R2表示H或低级垸基，R3、R4分别表示低级烷基；X表示含1 5个碳原子的烷烃、含杂原子取代基的1 5 个碳原子的烷烃、羰基、羧基或酰胺基；n表示2 5之间的整数；P表示微米级的 Fe304磁性微粒；所述的低级烷基为含1 6个碳原子的直链或支链烷基，所述的低 级芳垸基为连接有芳基的低级烷基。上述吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，其化学结构式U )如下<formula>formula see original document page 6</formula>上述吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，其化学结构式(II)如下:<formula>formula see original document page 6</formula>(专利申请号CN03153486 . 4)、磁性荧光微球及其制备方法和米用该磁性荧光 微球进行生物分子检测的方法(专利申请号CN02139365 . 6)、磁性微球介导的 微流体分析系统及其检测方法(专利申请号CN03134319 . 8)等研究，均与磁性 微粒的制备与应用相关。《中国药师》(陶利军，孙永海，张宏，刘建行9: 24-26， 2006)最近有文章报道了一种将亚甲蓝包加在磁性明胶微粒中以制备磁性药物缓释 剂的方法，仅仅对产品的性能进行了评价。对吩噻嗪类染料，如天青B修饰的磁性 微粒用于灭活及去除血液及血液制品中病毒的方法及装置则未报道。 发明内容本发明的目的在于提供一种吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒及其制备方法和用 途，其解决了背景技术中无法将杀灭病毒的物质以及灭活后的病毒从血液或血液制 品中完全去除的技术问题。本发明的技术解决方案如下一种吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，其化学结构如下<formula>formula see original document page 6</formula>上述吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，其化学结构中的R,、 R2、 R3、 R9以分别采 用C,-C3低级烷基或低级芳垸基为宜。上述吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，其化学结构中的R4以采用甲基，n以采用 4， R,、 R2、 R3、 R9以分别采用CH3或苯基为佳。一种制备上述吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的方法，其包括以下实现步骤(1) 将磁性微粒悬浮于极性溶剂中，搅拌下加入吩噻 染料及辅助试剂，反 应温度为室温或回流温度，优选的反应温度为室温；反应时间为6 12小时；其中磁性微粒吩噻P員染料辅助试剂二l :4:6;(2) 将反应混合物进行磁性分离，固形物用95%乙醇洗漆(20ml X 3)，再 用去离子水洗至洗出液无紫外吸收，得吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，保存于纯水 或生理盐水中。上述吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的制备方法，用于制备化学结构式(I )表示 的物质时，所述的磁性微粒可采用羧基化的微米级Fe304磁性微粒；所述的极性溶 剂可采用水、二氯甲垸、乙腈或四氢呋喃，优选为水、二氯甲垸；所述的辅助试剂 可采用縮水剂，所述的縮水剂可采用l， 3-二环己基碳酰二亚胺(DCC)或l-乙基 -3- (3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC);反应温度为室温，反应时间为8 10 小时。上述吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的制备方法，用于制备化学结构式(I)表示 的物质，所述的极性溶剂取二氯甲烷时，縮水剂优选1， 3-二环己基碳酰二亚胺 (DCC);所述的极性溶剂取水时，縮水剂优选1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳酰 二亚胺(EDC)。上述吩變錢染糊針布的磁性微粒的制备方法，用于制^4t学结构式(II)标的物 质时，所述的磁性微粒可采用环氧乙烷化的微米级Fe304磁性微粒，戶，的极性、MIJ可 采用醚、乙腈或四氢呋喃，优选四氢呋喃；所述的辅助试剂可采用催化剂，所述的催化 剂可采用过渡金属的三氟甲基磺酸盐；反应温度为室温，反应时间为4 8小时。上述吩, 染料修饰的磁性微粒的制备方法，用于制备化学结构式(II)表示的物 质，所述的过渡金属的三氟甲基磺酸盐可采用四苯基三氟甲基磺酸锑、三氟甲基磺 酸亚锡或三氟甲基磺酸锡，优选三氟甲基磺酸亚锡。其中，R,、 R9分别表示H、低级烷基或低级芳垸基；R2表示H或低级垸基，R3、 R4分别表示低级烷基；X表示含1 5个碳原子的垸烃、含杂原子取代基的1 5 个碳原子的烷烃、羰基、羧基或酰胺基；n表示2 5之间的整数；P表示微米级的 Fe304磁性微粒；低级烷基为含1 6个碳原子的直链或支链烷基，低级芳烷基为连 接有芳基的低级烷基。本发明吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，其化学结构式(I )如下<formula>formula see original document page 8</formula>本发明吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，其化学结构式(II)如下<formula>formula see original document page 8</formula>一种吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒用作杀灭并去除血液或血液制品中的病毒。 上述吩噻嗉类染料修饰的磁性微粒用作杀灭并去除血液或血液制品中的病毒，所 述的血液包括全血或成分血，所述的成分血包括浓縮红细胞、洗涤红细胞、代浆血、 少白细胞的红细胞、冰冻红细胞、浓缩血小板、新鲜冰冻血浆、冰冻血浆或冷沉淀 等；所述的血液制品包括白蛋白、丙种球蛋白、特异性免疫球蛋白、浓縮VIII因子、 凝血酶原复合物、干扰素或转移因子等；所述的血液或血液制品中的病毒包括含有 包膜的RNA病毒，或含有包膜的DNA病毒。 本发明具有如下优点本发明产品特异性强，无毒副作用，安全可靠。既能杀灭血液及血液制品中的 病毒，又能做到病毒灭活后无染料残留，还能将灭活后的病毒从血液或血液制品中 完全去除。产品生产制造简单，成本低，使用简便。.具体实施方式
本发明吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，其化学结构如下<formula>formula see original document page 8</formula>OH-(CH2)n—CH—CH2—NR,、 R2、 R3、 R9可分别采用C,_C3低级烷基或低级芳烷基，具体可采用R,、 R2、 R3、 R9分别是CH3或苯基；R4具体可采用甲基，n具体可采用4。 本发明吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的制备方法，其实现步骤如下(1) 将磁性微粒悬浮于极性溶剂中，搅拌下加入吩噻B員染料及辅助试剂；反 应温度为室温或回流温度，优选的反应温度为室温；反应时间为6 12小时。其中磁性微粒吩噻嗪类染料辅助试剂=1 :4:6。(2) 将反应混合物进行磁性分离，固形物用95%乙醇洗涤(20ml X 3)，再 用去离子水洗至洗出液无紫外吸收，得吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，保存于纯水 或生理盐水中。结构式(I)所示吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒制备方法中，磁性微粒可采用羧 基化的微米级Fe304磁性微粒，极性溶剂可采用水、二氯甲垸、乙腈或四氢呋喃。 优选为水、二氯甲烷。辅助试剂可采用缩水剂，极性溶剂取二氯甲烷时，縮水剂优 选l， 3-二环己基碳酰二亚胺(DCC);极性溶剂取水时，縮水剂优选1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)。反应温度为室温，反应时间为8 10小时。结构式(II)所示吩噻麟染料斷布的磁性微粒制备方法中，磁性微粒可采用环氧乙 烷化的惊妹级Fe304磁性微粒，极性溶剂是醚、乙腈或四氢呋喃，j腿四氢呋喃。辅助 试剂可采用催化剂，催化剂可采用逾度金属的三氟甲基磺酸盐。过渡金属的三氟甲基磺 M^具体可采用四苯基三氟甲基磺酸锑、三氟甲基磺酸亚锡^H氟甲基磺酸锡， H 氟甲基磺酸亚锡。反应温度为室温，反应时间为4 8小时。本发明的吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒主要用作杀灭并去除血液或血液制品中 的病毒。血液主要是指全血或成分血，如浓缩红细胞、洗涤红细胞、代浆血、少白 细胞的红细胞、冰冻红细胞、浓縮血小板、新鲜冰冻血浆、冰冻血浆、冷沉淀等。 血液制品主要是指白蛋白、丙种球蛋白、特异性免疫球蛋白、浓縮vni因子、凝血 酶原复合物、干扰素、转移因子等。血液或血液制品中的病毒主要是指含有包膜的 RNA病毒，如丙肝病毒(HCV)以及反转录病毒艾滋病病毒(HIV)等；或含有 包膜的DNA病毒，如乙肝病毒(HBV)等。结构式(I)所示吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒制备方法实施例，步骤如下 (1)将羧基化的微米级Fe304磁性微粒(羧基含量0.24mmol/g， lg)悬浮于15ml二氯甲烷中。(2) 搅拌下加入吩噻嗪类染料天青B (293mg， 0.96mmo1)及l， 3-二环己基 碳酰二亚胺 (297mg， 1.44mmo1)，室温下反应8-10小时。(3) 将反应混合物倾倒入放在磁铁上的50ml小烧杯中，用少量二氯甲烷洗涤 反应瓶两次(5mlx2)，洗出液并入同一小烧杯中。待磁性微粒完全沉降后，倾滗 除去溶剂；固形物用95%乙醇洗涤(20mlx3)，再用去离子水洗至洗出液无紫外吸 收；所得产品保存于纯水或生理盐水中。产品鉴定结果IR(KBr,cm"): 1635 (酰胺)，1465 (芳环)。 用氧瓶燃烧法测定、按每克干磁性微粒计算，含硫量0.47%。结构式(II)所示吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒制备方法实施例，步骤如下(1) 将含环氧乙烷基团的微米级Fe304磁性微粒(环氧乙烷含量0.3mmol/g， lg)悬浮于15ml四氢呋喃中；(2) 搅拌下加入吩噻嗪类染料(天青B) (367mg， 1.2mmo1)及三氟甲基磺 酸亚锡 (417mg， 1.8mmo1)，室温下反应6小时；(3) 将反应混合物倾倒入放在磁铁上的50ml小烧杯中，用少量四氢呋喃洗涤 反应瓶两次(5mlx2)，洗出液并入同一小烧杯中，(4) 待磁性微粒完全沉降后，倾滗除去溶剂；固形物用95%乙醇洗涤(20ml x3)，再用去离子水洗至洗出液无紫外吸收；所得产品保存于纯水或生理盐水中。产品鉴定结果IR(KBr,cm"): 3410 (羟基)，1465 (芳环)； 用氧瓶燃烧法测定、按每克干磁性微粒计算，含硫量0.42%。
权利要求
1. 一种吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，其化学结构如下其中，R1、R9分别表示H、低级烷基或低级芳烷基；R2表示H或低级烷基，R3、R4分别表示低级烷基；X表示含1～5个碳原子的烷烃、含杂原子取代基的1～5个碳原子的烷烃、羰基、羧基或酰胺基；n表示2～5之间的整数；P表示微米级的Fe3O4磁性微粒；所述的低级烷基为含1～6个碳原子的直链或支链烷基，所述的低级芳烷基为连接有芳基的低级烷基。
2.根据权利要求1所述的吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，其化学结构如下<formula>formula see original document page 2</formula>
3.根据权利要求1所述的吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，其化学结构如下:<formula>formula see original document page 2</formula>
4. 根据权利要求1或2或3所述的吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，其化学结构中， 所述的R,、 R2、 R3、 R9分别是C,-C3低级烷基或低级芳垸基。
5. 根据权利要求4戶脱的吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，其化学结构中，所述的 R4是甲基，n为4， R,、 R2、 R3、 &分别是013或苯基。
6. —种制备权利要求1戶湖吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的方法，其包括以下实现步骤(1)将磁性微粒悬浮于极性溶剂中，搅拌下加入吩噻嗪类染料及辅助试剂，反应温度为室温或回流温度，反应时间为6 12小时；其中 磁性微粒吩噻《 染料辅助试剂=1 :4:6;(2)将反应混合物进行磁性分离，固形物用95%乙醇洗涤，再用去离子水洗 至洗出液无紫外吸收，得吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，保存于纯水或生理盐水中。
7. 根据权利要求6所述吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的制备方法，其特征是-所述的磁性微粒是羧基化的微米级Fe304磁性微粒，所述的极性溶剂是水、二氯甲 垸、乙腈或四氢呋喃；所述的辅助试剂是縮水剂，所述的縮水剂是1， 3-二环己基碳酰二亚胺或1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺；反应温度为室温，反应时间为8 10小时。
8. 根据权利要求7所述吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的制备方法，其特征是 所述的极性溶剂取二氯甲烷时，縮水剂取1， 3-二环己基碳酰二亚胺；所述的极性溶剂取水时，縮水剂取1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺。
9. 根据权利要求6戶脱吩噻P錢染料斷制勺磁性微粒的制备方法，其特征是戶腿的磁性微粒是环氧乙烷化的慎 级Fe304磁性微粒，所述的极性溶剂是醚、乙腈或四氢 呋喃；戶诚的辅助试剂是催化剂，戶腿的催化剂^^度金属的三氟甲基磺Ma;反应温 度为室温，反应时间为4 8小时。
10. 根据权利要求9所述吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的制备方法，其特征是 所述的过渡金属的三氟甲基磺酸盐是四苯基三氟甲基磺酸锑、三氟甲基磺酸亚锡或 三氟甲基磺酸锡。
11. 一种权利要求1所述的吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，用作杀灭并去除血液 或血液制品中的病毒。
12. 根据权利要求11所述的吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒用作杀灭并去除血液或 血液制品中的病毒，其特征是所述的血液包括全血或成分血，所述的成分血包括 浓縮红细胞、洗涤红细胞、代浆血、少白细胞的红细胞、冰冻红细胞、浓縮血小板、 新鲜冰冻血浆、冰冻血浆或冷沉淀；所述的血液制品包括白蛋白、丙种球蛋白、特 异性免疫球蛋白、浓縮VIII因子、凝血酶原复合物、干扰素或转移因子；所述的血液或血液制品中的病毒包括含有包膜的RNA病毒，或含有包膜的DNA病毒。
全文摘要
本发明涉及一种吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒及其制备方法和用途，其将磁性微粒悬浮于极性溶剂中，加入吩噻嗪类染料及辅助试剂，室温下反应6～12小时后，进行磁性分离，固形物用95％乙醇洗涤，得吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒。本发明既能杀灭血液及血液制品中的病毒，又能做到病毒灭活后无染料残留，还能将灭活后的病毒从血液或血液制品中完全去除。本发明产品特异性强，无毒副作用，安全可靠。产品生产制造简单，成本低，使用简便。
文档编号C07D279/00GK101273995SQ20071001764
公开日2008年10月1日 申请日期2007年3月30日 优先权日2007年3月30日
发明者张腾霄, 超 陈, 高文运 申请人:陕西北美基因股份有限公司