专利名称：肺炎链球菌自溶酶蛋白及其原核表达纯化工艺和疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种有抗原性以及免疫原性肺炎链球菌自溶酶蛋白，制备肺炎链球菌自溶酶蛋白的原核表达纯化工艺，包含这种蛋白的疫苗，以及它在预防肺炎链球菌感染中的应用和给予免疫主体新的免疫途径。本发明所涉及的技术主要是分子生物学以及基因工程相关技术。在针对该疫苗的保护性效果评价中，还涉及到药效学、药理学、毒理学相关技术。另外，在针对免疫主体的免疫保护性研究当中，还涉及到动物实验技术。本发明是以分子生物学技术和生物制药技术为依托，在生物制药技术领域的一项创新。
背景技术：
由肺炎链球菌所引起的细菌性肺炎以及呼吸道感染是威胁人类健康的常见病和多发病。作为一种条件致病菌，它在正常条件下寄生于人体的呼吸道。约40％-50％健康人群携带有肺炎链球菌。当机体抵抗力下降时，如麻疹等呼吸道病毒感染以后，营养不良或者老年体弱等情况下，肺炎链球菌将透过黏膜防御体系，从黏附部位下行至肺或者进入血液引起细菌性肺炎，以及中耳炎、菌血症、脑膜炎等相关疾病。肺炎链球菌也是发达国家及发展中国家引起儿童及成人细菌性肺炎的主要致病菌。在发展中国家，每年有500万5岁以下的儿童死于肺炎链球菌所引起的肺炎，10-50万儿童死于肺炎链球菌所引起脑膜炎。与其他细菌相比，肺炎链球菌因其侵袭性更容易造成老年人、儿童及部分成人死亡，占世界疾病死因的第15位。目前已有的肺炎链球菌多糖疫苗由于其免疫原性较弱，不能有效的被机体识别并产生有效的抗体。尤其对高危人群(＜2岁或＞60岁)的保护性较差。更为严重的是，肺炎链球菌对各种抗生素的耐药性有逐渐升高的趋势，给治疗和预防带来诸多困难。
对此可行的方法之一就是发展并利用新的特殊疫苗。除了当前广泛应用的23价多糖疫苗外，几种荚膜蛋白结合疫苗作为候选疫苗正在试验当中。包括VitB成分结合蛋白如PspA、肺炎球菌溶血素的衍生毒素、神经氨酸酶及透性酶PsaA。
自美国于1977年研制出14价多糖疫苗起(Fedson DS，pneumococcal vaccine.InPlotkinSA.Vaccines Philadelphia，PaWB Saunderss Co-1988，271-299)，多糖疫苗的一直被认为是抗肺炎链球菌的有效武器。目前广泛应用地23价荚膜多糖疫苗(杨耀，23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的研制，中国生物制品学杂志，2000，13(3)154-156)仍然具有局限性。由于多糖成分属于胸腺非依赖性抗原，只能引起体液免疫应答，且只能产生IgM类抗体，不产生免疫记忆。另一方面，23价多糖疫苗仅对100多种不同血清型的肺炎链球菌中的23种有效。
而肺炎链球结合疫苗可克服以上缺点。婴幼儿肺炎链球菌结合疫苗的继发免疫反应具有T细胞依赖的特点。由于多价结合疫苗蛋白组份可能竞争数量有限的载体特异性T细胞，增加结合疫苗的价较为困难。使用单一载体蛋白可能导致载体的超负荷，并且由于缺乏足够的载体特异性T辅助细胞而降低免疫反应。2000年荷兰研究人员用破伤风和白喉类毒素作载体的11价肺炎链球菌结合疫苗在健康婴幼儿的耐受性和免疫原性，并观察铝佐剂对疫苗安全性和免疫原性的影响(Pediatr Infect Dis J 2000，20272)。我国蒋晓东等人于2005年研制出针对我国肺炎链球菌型别多价肺炎球菌多糖结合疫苗，并已经申请专利(申请专利号03141407.9)。
尽管多糖蛋白质结合疫苗是对肺炎链球菌感染治疗的一种突破，但目前国内外使用的结合疫苗的蛋白载体均是白喉或破伤风类毒素。也有使用脑膜炎球菌外膜蛋白的。这类结合疫苗容易与其他疫苗如白喉疫苗、破伤风疫苗产生冲突。而且多价结合疫苗蛋白组份可能竞争数量有限的载体特异性T细胞，使进一步增加结合疫苗的价变的非常困难。因此发展新一代肺炎链球菌蛋白质疫苗及其新的多糖结合载体成为趋势。肺炎链球菌本身的蛋白，如自溶酶、PspA、肺炎球菌溶血素、PsaA及PspC有望作为新的蛋白质疫苗及结合多糖的首选载体。使用这类蛋白可避免与其他如白喉疫苗、破伤风疫苗产生冲突；其自身蛋白可以在免疫上对多糖起到补充作用，从而增强免疫保护作用；可提高对以后肺炎链球菌感染的免疫记忆应答。
与荚膜多糖的高度异型性相比，自溶酶蛋白是肺炎链球菌的一种相当保守的蛋白成分，在不同血清型肺炎链球菌中的同源性非常高。因此少数几种具有免疫保护效应的自溶酶蛋白有望对几乎所有血清型的肺炎链球菌产生抵抗作用。另外，它属于胸腺依赖性抗原，既能引起体液免疫应答也能引起细胞免疫应答，可产生IgG等多种类别的抗体，可诱导产生免疫记忆，有望对不同年龄层次的人群均可产生保护作用。
肺炎链球菌的自溶酶(autolysin，LytA)即是N-乙酰胞壁酸-L丙氨酸酰胺酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase)，是分子量为36KD的一种蛋白质。它是首先在基因水平定性的自溶酶，其编码基因序列已经于1986年首次被测定。该自融酶LytA蛋白参与细菌多种生理功能，包括细胞分裂、鞭毛形成和基因转移过程。它定位于细菌的细胞壁，与脂磷壁酸(LTA)的胆碱分子相连。另外，细菌细胞壁多糖(一种含有磷酸胆碱类碱基的磷壁酸复合物)通过LytA与肽聚糖相连。当LTA与肺炎链球菌细胞壁上的糖脂相连时自溶酶无活性，原因可能是自溶酶没有接近其底物。当LTA与肺炎链球菌细胞壁上的糖脂相连遭到破坏时，LytA被激活，水解N-乙酰胞壁酸与丙氨酸之间的连接键，将细胞壁分解为糖链和肽链，从而破坏细菌细胞壁，引起细菌自溶。而细菌自溶产生的细胞壁降解产物可导致炎症反应，并促使溶解素从细胞浆中释放出来，对宿主造成伤害。本发明人通过研究证实，肺炎链球菌可诱发小鼠的黏膜分泌型IgA升高。
有报道指出，肺炎链球菌自溶酶表达水平的高低与肺炎链球菌菌落的形态有关，透明型的肺炎链球菌Ly-tA表达水平较高，能定植于鼻咽部。而浑浊型的肺炎链球菌Ly-tA表达水平较低，不能有效的定植。另外，Garcia P等人证实Ly-tC有一个可以裂解的信号肽，推测几种自溶酶可能具有相似的结构。
本发明人经过研究，建立了稳定的重组自溶酶蛋白的表达、纯化体系，确立了精制该重组蛋白的制备方法，并进一步揭示了基于此蛋白的一系列应用。
发明内容
本发明涉及一种肺炎链球菌的抗原，包含以这种抗原为主要成分的新型疫苗，以及该疫苗蛋白质的最佳纯化表达方法和它在预防肺炎链球菌感染中的应用。
肺炎链球菌是一种常见的兼性革兰阳性机会致病菌，它是细菌性肺炎、社区获得性肺炎的主要病原菌，多存在于健康者和患者的鼻咽部及呼吸道。
我们已经从137株肺炎链球菌(血清型为23)的全基因组中克隆出Ly-tA自溶酶编码序列，发现不同血清型(例如23F、19F、6A、6B或14血清型)之间其核苷酸序列基本一致，并将其转化到E.coli JM109中，通过最佳表达、纯化途径得到了分子量为34KD的自溶酶蛋白。且发现，用该蛋白作为抗原免疫Balb/C小鼠，可以针对同血清型肺炎链球菌产生免疫性保护反应。
不同血清型肺炎链球菌蛋白间差异性较小，其相应编码基因序列间的同源性更是高达90％以上。在所有血清型肺炎链球菌中，23、19F、6A、6B等型致病性最强。本发明中的自溶酶蛋白是源自23型肺炎链球菌。
因此，第一方面，本发明提供了一种肺炎链球菌的自溶酶蛋白，该蛋白来源于23型肺炎链球菌，在SDS-PAGE胶中的分子量为34KD左右，等电聚焦测试等电点(PI)为5.0。该蛋白被称为LytA。
第二方面，本发明提供了优选的DNA序列，该序列编码本发明的蛋白。
第三方面，本发明提供了含有本发明蛋白质的疫苗制剂，如本文所述该蛋白可选择性的与一种或者多种载体/或佐剂配制在一起。
第四方面，本发明提供了本发明蛋白质在制备抗肺炎链球菌感染疫苗中的用途，以及免疫保护效果的评价。
第五方面，本发明提供了本发明蛋白最佳的表达、纯化途径，该途径在确定的具体操作步骤下是稳定的。
第六方面，本发明提供了本发明蛋白在预防肺炎链球菌感染中的方法，包括佐剂的搭配、剂量选择以及给予本发明疫苗组合物的步骤。
第七方面，本发明提供了本发明蛋白相关的抗原表位，包括重组抗原表位的预测，分子克隆与构建。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
本说明和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义核酸序列是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段和部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链和反义链。
氨基酸序列是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部分。
衍生物是指HFP或编码其的核酸的化学修饰物。这种化学修饰物可以是用烷基、酰基、或氨基替换氢原子。核酸衍生物可编码保留天然分子主要生物学特性的多肽。
本文所用的，表达纯化的肺炎链球菌自溶酶蛋白是指肺炎链球菌自溶酶基本上不含天然与其相关的其他蛋白、脂类、糖类或其他物质。基本上纯的多肽能在非还原性的聚丙烯酰胺凝胶上能产生一种比较单一的主带。肺炎链球菌自溶酶蛋白的纯度可以用HPLC相关技术进行分析。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种新的多肽-23F血清型肺炎链球菌自溶酶蛋白，基本上是由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列组成的。本发明包括肺炎链球菌自溶酶的片段、衍生物或类似物。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽、优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然化合物，或是化学合成的产物，或使用重组技术在原核或真核宿主中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基(起始氨基酸)。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，基本由编码23F血清型肺炎链球菌自溶酶蛋白的多核苷酸组成。它包含了多核苷酸序列全长为957个碱基，其开放读码框编码了318个氨基酸。本发明还提供了一种23F血清型肺炎链球菌自溶酶蛋白可能的抗原表位重组肽段。该重组抗原表位肽段为生物信息学预测所得的抗原表位。同时本发明提供了获得该重组抗原表位的预测方法以及在原核系统中的表达方法。
本发明的第三方面，在于提供了含有本发明蛋白质的疫苗制剂。该疫苗制剂主要由纯化后的精制肺炎链球菌自溶酶蛋白与相关佐剂如CPG等以一定的比例混合，制备成液体状以供注射免疫、粘膜免疫等。相关佐剂还包括弗氏佐剂、脱乙酰壳多糖颗粒等。该疫苗中，纯化的肺炎链球菌自溶酶蛋白或多肽主要溶于中性PBS或中性复方氯化钠溶液，或其他溶液载体如水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油或者它们的组合。
本发明的第四方面，在于提供了本发明蛋白质在制备抗肺炎链球菌感染疫苗中的用途，以及免疫保护效果的评价。本发明中的蛋白质或者多肽，来源于23F血清型肺炎链球菌自溶酶蛋白。它是疫苗的主要成分，在采用鼻内免疫(呼吸道滴鼻免疫)后，可以对免疫主体诱导产生针对肺炎链球菌感染起到抵抗作用的局部鼻粘膜免疫反应以及全身的免疫反应。在局部粘膜免疫反应中，主要诱导对外来抗原起调理作用的sIgA，该分泌型抗体对肺炎链球菌的定植可以起到破坏作用，而定植是肺炎链球菌感染过程中最关键的步骤。本发明的蛋白质或者多肽在诱导的全身免疫反应中，主要是刺激IgG的产生，对被肺炎链球菌攻击后的免疫主体可以产生一定的保护作用。这在小鼠作为免疫主体的试验中已经得到了证实，检测免疫后小鼠血清、肺灌洗液、鼻咽灌洗液中抗体水平可以判断免疫保护的水平，从细菌攻击后小鼠肺病理组织的改变可以判断免疫保护的效果。
本发明的第五方面，在于提供了本发明蛋白或多肽最佳的表达、纯化途径，该途径在确定的具体操作步骤下是稳定的。本蛋白或多肽的实验条件下的表达工艺的研究主要包括蛋白或者多肽的表达方式、培养基的选择、诱导时间的选择、诱导温度的选择、接种量的选择、装液量的选择、表达过程中ph值的选择。这些研究所设计的技术要点、研究结果对于蛋白或多肽在大规模化的工业生产条件下蛋白质的表达纯化下游工艺提供了重要基础，是该疫苗应用开发过程中最基础与最重要的研究内容。本发明中，通过相关实验设备、方法、技术等确立了该蛋白或多肽表达纯化过程中一整套优化条件，运用这些优化条件可以在实验室条件下得到小批量精制的蛋白，同时为大规模工业化蛋白或多肽的生产提供依据与可靠的基础。
本发明的第六方面，在于提供了本发明蛋白在预防肺炎链球菌感染中的方法，包括佐剂的搭配、剂量选择以及给予本发明疫苗组合物的步骤。蛋白或多肽的组合物(疫苗)可以以方便的形式机型给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内等方式进行给药，但在这些方式中以鼻内给药是最为适合的给药方式，并且由于鼻内给药的方式简单并且容易操作，同时鼻内给药的方式在小鼠实验中已经证实其可以诱导局部以及全身的免疫防御反应，有效的对抗肺炎链球菌肺炎所引起的感染，在本发明蛋白运用中，鼻内给药的方式(粘膜滴鼻免疫方式)最为实用与有效。但施用于患者的量和剂量范围取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。在本发明中当免疫主体为小鼠时，相应的免疫方案为将小鼠随机分为3组，每组40只。实验组(A组)接受为期3周，每周2次，总共6次的滴鼻免疫。免疫剂量10ul/次/只，(6.5ug LytA+10ugCpG)/次/只；阴性对照组(B组)按上述方案，同等剂量灭菌盐水进行滴鼻。滴鼻时，将小鼠垂直抓紧，用微量移液器将10ul溶液缓慢小心滴入小鼠鼻孔，以确保小鼠吸入完全。阳性对照组(C组)每只小鼠肌肉注射10μgPS。
本发明的第七方面，在于提供了本发明蛋白相关的抗原表位，包括重组抗原表位的预测，分子克隆与构建。所谓表位(epitope)就是抗原中能被免疫细胞特异性识别的线性片段或空间构象性结构，是引起免疫应答和免疫反应的基本单位。根据表位特异性免疫应答的程度，可将抗原中的表位分为免疫优势表位、亚优势表位和隐性表位；根据识别的免疫细胞，可分为B细胞表位、辅助性T细胞(Th)表位、细胞毒性T细胞(Tc)表位等。抗原表位的寻找与筛选可为发展抗原性、免疫反应性更强，保护性更好的亚单位疫苗提供可靠的依据。在本发明中，主要是对致病性最强的23F型肺炎链球菌LytA的抗原表位进行预测。由于不同预测工具算法不同，预测的结果也存在着一定的差异。为此我们综合了多种分析预测工具的结果，参考单参数预测结果做出最综评价。
图1目的基因(带有双酶切位点)扩增鉴定[MDNAMark；1PCR product of Pgex-4T-1；2PCR product of Pgex-4T-1-LytA]第2泳道所示亮的条带为扩增的肺炎链球菌自溶酶编码基因片段(该片段两端带有酶切位点，扩增所用的引物上并不带有相应的酶切位点)，扩增的片段大小约为980bp左右，接近略小于1000bp。
图2融合蛋白在25℃条件下可溶性表达分析[Lane Mmolecular marker；Lane 1JM109induced at 25℃；Lane 2before JM 109-pGEX-4T-1-LytA induced at 25℃；Lane 3afterJM109-pGEX-4T-1-LytA induced at 25℃；Lane 4pGEX-4T-1-LytA induced at 25℃(superstratum)；Lane 5pGEX-4T-1-LytAinduced at25℃(deposition)]第4泳道中接近66.2KDa处的主带为LytA与GST的融合蛋白条带，整个第4泳道的条带所显示的是含有Pgcx-4T-1-LytA重组质粒的工程菌(JM109)在本发明所述的优化蛋白纯化表达条件下所得到的融合蛋白在全菌蛋白表达中的情况。第4、5泳道分别显示的是全菌菌液经冻融和超声破碎后上清液与沉淀中融合蛋白表达情况，经过对比发现，在本发明所述的蛋白优化表达条件下，肺炎链球菌自溶酶可以最最大程度的减少包涵体的表达形式，基本上以可溶性表达为主。
图3LytA SDS-PAGE分子量分析[Lane Mmolecular marker；Lane 1、2purified LytA；Lane 3、4purified GST and LytA-GST]第1、2泳道中的明亮主带均为在本发明所述的蛋白优化表达条件下纯化表达的LytA，条带的位置显示，其大小约为34KDa左右。
图4工程菌生长特性分析分别摇瓶培养0.5，1.0，1.5，.2.0，2.5，3.0小时后测OD值。从结果看以1％的接种量接种后，培养1.5小时即OD(600纳米处)值达到0.6。而且细菌处于对数生长前期。提示此时假如诱导剂可以减轻细菌的生长负荷，使肺炎链球菌自溶酶蛋白量表达增强。
图5重组Ly-tA HPLC分析采用凝胶色谱、大孔径碳柱分析(省测试中心)，分析方法位IIPLC面积归一化法，测得在本发明所述的蛋白优化表达条件下肺炎链球菌蛋白样品的相对含量为95.6％。图中主峰的面积即为纯化的肺炎链球菌自溶酶蛋白的相对含量，结果提示所得的蛋白样品纯度很高。
图623F血清型肺炎链球菌自溶酶蛋白在抗肺炎链球菌感染感染中诱导粘膜免疫反应将23F血清型肺炎链球菌自溶酶蛋白作为主要成分与CPG或其他佐剂制成疫苗后，对免疫主体进行免疫。当免疫主体为小鼠时，可以在肺、鼻灌洗液中检测到较高水平的sIgA，该抗体可以破坏肺炎链球菌的定植，在呼吸道粘膜免疫防御反应中抵抗肺炎链球菌感染。
图7以重组质粒为模板进行PCR扩增l1l2(重组抗原表位的编码基因序列)鉴定第2、32、6、8、9、11泳道中的明亮条带为构建成功的肺炎链球菌自溶酶蛋白重组抗原表位的编码基因序列，由片段连接以及PCR扩增得到。
图8PGEX-4T-1-L1L2表达产物(肺炎链球菌自溶酶蛋白重组抗原表位)的SDS-PAGE分析[MProtein Marker；；2、5.The expression product in precipitation of recombinant plssmidPGEX-4T-1-L1L2 in E.coli JM109 after induced with IPTG]第2、5泳道中最明显的主带(位于35KDa与25KDa之间)为肺炎链球菌自溶酶蛋白的重组抗原表位与GST的融合蛋白在原核系统中的表达情况。
具体实施例方式
现参照下列具体实施例，来近一步描述本发明，这些实施例不应解释为以任何方式限制本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人所著《分子克隆实验室手册》(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行操作，或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1重组23F血清型肺炎链球菌Ly-tA的基因序列及氨基酸序列本发明中肺炎链球菌自溶酶蛋白来自于临床上致病性最强的23F型肺炎链球菌。本发明人根据国际通用的标准肺炎链球菌株R6株的自溶酶编码基因设计引物，通过23F型肺炎链球菌基因组扩增得到其编码基因。运用NCBI所提供的分析工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)得到其氨基酸序列。
实施例2重组Ly-tA表达中所用重组质粒的鉴定分析引物设计扩增带有酶切位点的自溶酶基因。
设计引物为下游引物5’-GCGCAGATCGTCAGTCAGTCAC-3’上游引物5’-GCATGGCCTTTGCAGGGCTG-3’可利用该对引物从重组质粒中扩增带有双酶切位点的Ly-tA基因片段。扩增反应条件为在50μl的反应体积中含有50MmKCl，10Mm TrisCl PH为8.5，1.5Mm MgCl2，200μmol/L dNTP，2μl的10pmol引物，0.5U Tap DNA聚合酶。在HEMA公司的热循环仪上按下列条件95预热3MIN后反应34个周期94℃ 1min，56℃ 2min，72℃ 2min。末轮后72℃延伸10min。扩增产物经纯化后，DNA序列分析结果表明，扩增基因片段序列与Ly tA基因序列一致(如附图1)。
实施例3不同血清型Ly-tA编码基因的同源性分析及蛋白质抗原表位分析LytA序列由318个氨基酸组成。6B、6A、14、19F三种血清型肺炎链球菌LytA氨基酸序列与23F血清型LytA氨基酸序列仅存在着一个氨基酸的差异，前三者在146处为苯丙氨酸(Y)，后者为半胱氨酸(C)。用不同抗原表位预测工具分析发现，不同血清型肺炎链球菌自溶酶蛋白的抗原表位分布并不存在差异。血清型为6A、14、19F三种血清型肺炎链球菌LytA(对应菌株分别为SH101、SH85、80)基因序列与23F血清型LytA(肺炎链球菌菌株SH137)基因序列仅存在着一个碱基的差异，前三者在746bp处为A，后者为G。血清型为6B的肺炎链球菌LytA(SH101)与23F血清型LytA基因序列相比有21处碱基发生改变，且改变均发生于氨基酸密码的2、3位。
血清型为6A、14、19F三种血清型肺炎链球菌LytA(对应菌株分别为SH101、SH85、80)氨基酸序列与23F血清型LytA(肺炎链球菌菌株SH137)氨基酸序列仅存在着一个氨基酸的差异，前三者在146处为苯丙氨酸(Y)，后者为半胱氨酸(C)。血清型为6B的肺炎链球菌LytA(SH101)与23F血清型LytA氨基酸序列相比，由于氨基酸密码的简并性，编码的氨基酸序列并没有改变。
用抗原表位预测工具ANTIGENIC(http://bioinfo.biosino.org/srs71bin/cgi-bin/wgetz)分析发现，不同血清型肺炎链球菌自溶酶蛋白的抗原表位氨基酸组成以及分布完全一致。用DNAstar分析也得到完全一致的结果。
实施例4最佳重组Ly-tA的体外表达、分离和纯化方法从-80℃低温保存柜中取出含有Pgex-4t-LytA重组质粒的种子级工程菌E.coli JM109，将其接种于Amp+LB平板、37℃、无菌操作条件下于温箱中培养12～24h。挑取单个菌落接种于5ml Amp+LB液体培养基中，37℃、280rpm、无菌操作条件下摇菌12H，得到二级种子液。按1％的接种量，取一级种子液取10ml在无菌操作条件下加入到1000ml LB液体培养基中，在培养基PH为6.4～7.0、37℃、280rpm、30-40％装液量条件下于摇床摇菌1.5-2h，得到三级种子液。紧接着按终浓度为1Mm在无菌操作条件下加入IPTG，于25℃、280rpm、培养基PH为6.4～7.0条件下摇菌发酵6H。发酵停止后，将菌液于4℃、8500rpm条件下于低温离心机中离心10～30MIN收集工程菌菌体沉淀。0℃～-20℃条件下反复冻融2次，然后置于冰上，150W、超声1秒停2秒的条件下超声5～10min，共15～30min。整个超声过程中保证盛有菌液的容器外始终被冰覆盖。在上述操作下可以最大限度减少融合蛋白的包涵体，而增加蛋白的可溶性表达(如附图2)。然后4℃、8500rpm条件下于低温离心机中离心30～40min收集上清液体，将上清液以20滴/分钟的速度注入GSTrap.FF层析柱(规格5ml层析柱)，于无菌室中操作。按30-50μl/500ml菌液加入1U/μl的THROMBIN酶，在23℃条件下反应16h。其余按Biopharmacia公司的GSTrap.FF层析柱说明操作。得到的重组Ly-tA蛋白溶液，于PH为6.4-7.0的PBS中，4℃、无菌操作条件下透析24h(透析带可透过的最大分子量为8KD)。应用Warburg程序于蛋白核酸仪测得浓度为8-10mg/ml。所纯化的Ly-tA经SDS-PAGE分析，其分子量约为34KDa(附图3)。经高效液色谱分析，其纯度达95％上。
实施例5重组Ly-tA表达中所用工程菌稳定分析构建的工程菌在菌落的大体形态，显微镜下观，电镜下观察均与标准菌株一致。应用BD公司的Phoenix NMIC/D-Panel测试仪，结果发现其与宿主菌相比对氨苄西林/舒巴坦以及哌拉西林耐药。生化反应测试显示基本一致。
将工程菌传代60代(每代12-24小时37度培养)，分别取第1、10、20、30、40、50代工程菌，应用BD公司的Phoenix NMIC/D-Panel测试仪测定其稳定性。包括生化反应，耐药性等。结果发现，本发明中所构建的工程菌具有良好的稳定性。10、20、30、40、50代工程菌与第一代初始工程菌具有相同的耐药谱。
实施例6工程菌于本发明所涉及实验条件下生长分析分别摇瓶培养0.5，1.0，1.5，.2.0，2.5，3.0小时后测OD值。从结果看以1％的接种量接种后，培养1.5小时即OD600达到0.6，而且细菌处于对数生长前期(附图4)。提示此时假如诱导剂可以减轻细菌的生长负荷，使表达增强。
实施例7重组Ly-tA表达中所用重组质粒稳定分析从LB琼脂平板中挑一单工程菌落接种于5mlLB中，Amp浓度为50ug/ml，37度，280rpm，过夜培养。将种子液以1％的比例接种到不含Amp5ml新鲜LB中。37℃，280rpm培养12小时，如此再转接4次，使菌株在诱导前已经在无抗生素压力下连续生长48小时以上，最后当工程菌生长到A600＝0.6时，假如诱导剂并37度诱导，诱导前每隔12小时及诱导后每隔1小时分别取样，涂于不含Amp的LB平板上，待长出单个菌落后，用高压灭菌过的枪头从每个平板中点取100个单克隆菌落点种于含有Amp的LB平板上，计算每份样品对的菌落对的抗性百分数。质粒稳定程度＝选择平皿菌落数/无选择平皿菌落数*100％。结果表明所构建的的用于表达肺炎链球菌自溶酶的工程菌具有较高的质粒稳定性，均在96％以上，如下表所示
实施例8重组Ly-tA物理化学性质应用等电聚焦的方法分析肺炎链球菌蛋白的等电点。分析软件ImageMaster 2D Platinum碱性端距目的蛋白的距离6.8CM，两端总长度23.6CM，所占百分比28.8％。分析所用的曲线图来自于相关网站(amershambiosciences.com曲线图编号18-1140-60 ImmobilineDryStrip PH 3-10，7，13，18 and 24CM)，蛋白等电点最终分析为PH 5.0左右。
实施例9重组Ly-tA色谱分析用本实施3所列的优化表达条件，可得到较高纯度的Ly-tA蛋白溶液，本发明人委托广州市分析测试中性对其纯度进行分析。运用HPLC面积归一化法测得其纯度为95.7％(附图5)。
实施例10重组Ly-tA质谱分析用本实施3所列的优化表达条件，可得到较高纯度的Ly-tA蛋白溶液，本发明人对其进行质谱鉴定。运用基体辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术进行分析，鉴定结果为肺炎链球菌自溶酶蛋白。
实施例11重组Ly-tA氨基酸组成分析应用日立L-8800氨基酸分析仪，采用盐酸水解法、茚三酮反应法，外标定量法，综合测得氨基酸的组成百分比。对照理论百分比组成(来自于NCBI查询结果)，我们发现，含量最高者为Asp，最底者为Cys。除Asp Thr、Glu、Gly、Val、Leu、Arg外，其他基本相符，而差异最大的是Asp、Val这两种氨基酸。而Asp正是一种重要酸性氨基酸，对蛋白质的等电点影响较大，而实际测得的PI也确实较为偏小。
实施例12蛋白质可选择性地与一种或多种载体/或佐剂配制在一起构成一种疫苗制剂。
在本发明中，在小鼠作为免疫主体的实验中。将小鼠随机分为3组，每组40只。实验组(A组)接受为期3周，每周2次，总共6次的滴鼻免疫。免疫剂量10ul/次/只，(6.5ug LytA+10ugCpG)/次/只；阴性对照组(B组)按上述方案，同等剂量灭菌盐水进行滴鼻。滴鼻时，将小鼠垂直抓紧，用微量移液器将10ul溶液缓慢小心滴入小鼠鼻孔，以确保小鼠吸入完全。阳性对照组(C组)每只小鼠肌肉注射10μg PS。在本发明中主要以CPG作为免疫佐剂，此外还可以用脱乙酰壳多糖微粒等作为佐剂。
细菌中含有的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡核苷酸序列(oligodeoxynucleotides，ODN)是一种强烈的非特异性免疫刺激剂。在细菌等非脊椎动物的DNA中，非甲基化的CpG二核苷酸出现频率较高，平均每16对二核苷酸出现1次，而在脊椎动物DNA中则出现频率低，仅有细菌的1/4，称为CpG抑制，并且甲基化程度高(80％左右)，这种显著差异可能使CpG序列成为免疫刺激信号的基础，从而在长期进化过程中使脊椎动物能辨别自身DNA与病原DNA从而形成免疫防护机制。即CpG基序可以作为一种危险信号分子诱导宿主的免疫应答，而人工设计合成ODN，只要含有非甲基化的CpG序列，也有免疫刺激作用。研究证实，CpGODN的免疫刺激作用主要体现在促B细胞增殖分化并分泌IL-6，从而诱导抗体的分泌；激活单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞分泌多种细胞因子如IL-12、IL-6、TNF-α、IFN-α和IFN-β等，并通过这些细胞因子间接促进CTL和NK细胞(自然杀伤细胞)的活性，诱导对胞内病原体产生细胞免疫，并诱导NK细胞和T细胞分泌IFN-γ。由于CpG序列诱导产生Thl型免疫反应，而Thl反应在CTL反应和抗感染中起着重要的作用，因此CpG序列作为免疫佐剂具有显著优势。本发明中以人工合成CpG ODN 1826，作为黏膜佐剂。在免疫过程中Ly-tA与一定比例的CpG佐剂混合后使用，以提高免疫效果。这种混合方法是提高粘膜免疫水平的一种方法。在该方法中，Ly-tA与CpG混合的质量比例在1∶1至1∶5。免疫时Ly-tA与一定比例的CpG溶于纯净蒸馏水或者高压灭菌后的PBS溶液中使用。免疫方式为针对上呼吸道的滴鼻免疫。
现已确定耐受可通过鼻的途径诱导，因为鼻粘膜诱导的耐受可作为免疫治疗对抗一些疾病，正受到积极的关注。研究人员开发了颗粒状的疫苗释放佐剂，抗原被嵌入颗粒或粘附于颗粒表面.Baudner认为，将无毒性LTK63突变体与脱乙酰壳多糖微粒联用可提高鼻内接种疫苗的免疫原性和效力。此外，这种方法能使LTK63佐剂用量减少，从而提高了安全性。Vander研究了小鼠口服和鼻腔接种脱乙酰壳多糖微粒后能否增强对白喉类毒素(DT)的全身和局部免疫应答。口服含DT的脱乙酰壳多糖微粒能产生针对DT的全身(IgG)和局部(sIgA)免疫应答，鼻腔接种此微粒后可显著增强全身免疫应答。因此脱乙酰壳多糖微粒是很有希望的粘膜疫苗传递载体。
实施例13本发明中23F血清型肺炎链球菌自溶酶蛋白在制备抗肺炎链球菌等呼吸道病原菌感染疫苗中的用途。
免疫后收集样品所有样品都在末次免疫后2周收集。血清的收集按常规方法收集小鼠静脉血，分离血清，-20℃储存；气管鼻咽冲洗液的收集小鼠处死后，解剖分离出气管，用5ml注射器吸入2ml复方氯化钠注射液经气管小心注入，用镊子夹紧靠近肺的气管的另一端收集从小鼠鼻孔流出的冲洗液，反复2次。收集冲洗液样品于-20℃储存。
免疫抗体水平测定采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测试抗LytA抗体及抗多糖疫苗PS的抗体(IgG和IgA)水平。①用5ug/ml的LytA和PS 4℃包被过夜；②牛血清白蛋白37℃封闭1h；③血清样品和冲洗液分别稀释100倍和10倍，每孔加入100ul，37℃温育1h；④加入100ul分别稀释10000倍和4000倍的HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgA(Sigma公司)，37℃温育1h；⑤加入现配现用的底物OPD，37℃温育15分钟。⑥1M硫酸50ul终止反应。⑦酶标仪在492nm处读数。
采用重组LytA经过鼻黏膜免疫途径，诱导小鼠产生了高水平的SIgA、血清IgG和IgA。腹腔攻击感染后重组LytA免疫小鼠的存活率与多糖疫苗免疫组(PS组)相似，且重组LytA免疫小鼠鼻咽部S.pn定植克隆数明显低于PS组和生理盐水对照组。结果初步表明，通过滴鼻接种重组LytA可诱导小鼠产生抵抗S.pn感染的保护性免疫力，且保护效果与目前广泛使用的23价多糖疫苗相似。已有资料显示，23价肺炎球菌多糖疫苗对菌血症性肺炎球菌病有明显的保护作用，保护率为21％～81％，整体保护效率为57％。
重组LytA(来自23F血清型肺炎链球菌菌株SH137)免疫小鼠后，可在血清中检测出高水平IgG以及较高水平的IgA。为进一步探讨该蛋白免疫诱导的粘膜免疫情况，运用重组的LytA蛋白作为主要的疫苗成分，选择性的与适当浓度的CpG佐剂相配合，免疫BALB/C小鼠。结果表明，与多糖疫苗免疫过的小鼠以及正常对照小鼠相比，运用重组的LytA蛋白免疫后的小鼠，其肺、鼻咽灌洗液中，血清中IgA均特异性升高，且肺灌洗液中sIgA升高更为明显(如图11)。经SPSS统计软件分析表明血清中IgA、粘膜灌洗液中sIgA的升高具有统计学意义。并且与多糖疫苗免疫的小鼠及正常对照小鼠相比也具有明显的统计学意义。
实施例14免疫主体抵抗肺炎链球菌感染的呼吸道粘膜免疫方法。
本发明中采用新型的给药途径(鼻内给药/鼻粘膜免疫)和药物递送系统。呼吸道粘膜表面是呼吸道病原体侵入的主要途径，并且粘膜免疫系统免疫细胞的散在分布使鼻免疫可诱导局部以及远处粘膜的免疫反应应答。采用脱乙酰壳多糖微粒为疫苗传递载体，可产生针对全身(IgG)和局部(sIgA)免疫应答。因此鼻腔接种联合疫苗后可增强全身免疫应答，并可产生局部鼻粘膜免疫应答效应。
经皮大或肌肉注射是疫苗接种的主要形式，近年来，粘膜免疫也成为新的疫苗接种途径(经口和鼻腔)并受到广泛的关注。由于鼻粘膜的独特结构和免疫学功能，鼻粘膜免疫已经成为免疫接种的新亮点。粘膜免疫系统与全身免疫系统一起进化，但独立于它。只有起源于粘膜诱导的位置才能导致自身组织的有效粘膜免疫的免疫反应。粘膜免疫与以前的免疫接种途径相比，更为安全有效。局部和系统的免疫反应可被粘膜耐受的诱导所取代。粘膜免疫系统区别于全身系统免疫的特征是天然防护的形成机制，一定数量独特淋巴细胞集群的存在，起源于粘膜组织的细胞对粘膜和外分泌腺的聚集以及对非危险抗原反应抑制的优先诱导。粘膜不仅是抵抗有害物质的屏障，而且是保护性免疫反应的诱导部位。在粘膜免疫反应中，sIgA起主要作用。粘膜免疫系统独立存在于外周免疫系统，外源性抗原进入后，被选择性摄取到启动免疫反应的高度结构化区域；起重要作用的另一方面是分散的效应细胞聚集体，包括B和T淋巴细胞、未分化的浆细胞、巨嗜细胞和其他的抗原呈递细胞(antigen presenting cells)，以及嗜酸性粒细胞，特别是肥大细胞。
鼻免疫系统是广泛而极其复杂的。它是呼吸道的开始，处于中耳、眼、口腔抵抗抗原物质的枢纽位置，有保护下呼吸道的作用它可对远处粘膜如泌尿生殖道、胃肠道免疫反应有影响，与系统免疫有关。鼻内免疫之所以有望成为一有吸引力的预防接种方法，有如下理由粘膜表面是病原体侵入的主要途径之一。鼻免疫可诱导粘膜和系统反应，由于粘膜免疫系统免疫细胞的分布散布，鼻内给药可能也诱导远处粘膜的反应免疫系统。现在，艾滋病、乙肝疫苗都有经鼻接种的试验研究。鼻疫苗对广大人群来说更方便经济，有利于在发展中国家配备疫苗。
实施例15一种重组的抗原表位肽段的获得(用生物信息学预测的方法得到)以及该重组抗原表位的分子克隆构建方法与技术。
预测工具 MHC-II类分子结合肽的预测采用Institute of microbial technology，Chandigarh，India提供的服务器Propred MHC class-II binding peptideprediction-ProPred预测(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)。B细胞表位用EMBOSS软件包中ANTIGENIC程序预测(http://bioinfo.biosino.org/srs71bin/cgi-bin/wgetz)。T细胞表位的预测用德国BMI提供的预测工具SYFPEITHI进行预测(http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/)。以及美国NIH提供的在线分析工具BIMAS进行分析(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)。Karplus-Schulz柔曲性、可塑性、疏水性等单参数的分析通过DNAstar进行。
预测方法 综合四种在线分析方法，按照相应分析工具所规定有效性原则选取分值最高可能性最大的抗原表位。最后用DNAstar软件对所选取的表位进行Karplus-Schulz柔曲性、IIopp&Woods亲水性、可塑性、疏水性评价以决定取舍。根据抗原表位筛选结果以及试验的可行性和难易程度选取预测的抗原表位进行重组。对重组表位的抗原性用B细胞表位用EMBOSS软件包中ANTIGENIC程序和DNAstar软件进行分析。以确定重组前后抗原性没有太大变化。作为B细胞抗原表位的预测工具，ANTTGFNIC的预测结果可信度较高。其预测分值最高的的三个肽段分别是序列5～26(分值1.141)、145～157(1.136)83～91(1.132)。由ProPred预测可知，最可能与MHC-II分子结合的肽段为序列8～18(55.79)、20～28(42)，前者包含在序列5～26内，后者与序列5～26有大部分的重复。而从另一MHC-II分子结合肽预测工具SYHPEITHI可知，最可能的结合肽段为序列2～16(评价分值为32)。通过DNAstarKarplus-Schulz柔曲性可知，序列1～28由三段柔性较好的肽段组成。提示其序列整体柔性较大，易于在一定条件下形成构象型表位。综合以上分析结果，同时由于序列20～28与序列2～26有大部分重叠，我们选定序列2～28为B细胞抗原表位。用BIMAS分析T细胞抗原表位，得到三个最可能的线性抗原表位，分别是序列98～106(781.58)、序列263～271(480.0)、序列104～112(432.0)。据DNAstar分析结果可知，序列98～106与序列104～112同时具有较强的表面可及性和亲水性，提示这两个肽段可能位于细胞膜外，为T细胞所识别的短片段的线形表位。综合以上的分析，我们选定序列2～28为可能的B细胞抗原表位，序列98～112为可能的T细胞抗原表位。在所选取的两个肽段之间我们加上了LIKER序列(GLY-GLY-GLY- GLY-SER)3，构成新的重组抗原多肽EINVSKLRTDLPQVGVQPYRQVHAHST-(GLY-GLY-GLY-GLY-SFR)3-FMTDYRLYIELLRNL，为方便以后的可隆和表达，对该序列加上了起始氨基酸M。对新构建的重组表位用EMBOSS软件包中ANTIGENIC程序预测，结果表明重组表位的亲水性、柔曲性、表面可及性不变。
引物设计连接B细胞表位序列2～28(L1)和T细胞表位序列98～112(L2)的中间接头是柔性肽(GLY-GLY-GLY-GLY-SER)3设搭建序列命名为L1L2。P1(正链引物)含EcoR I位点(下划线)，5’-GCGAATTCATGGAAATTAATG-3’；P2(负链引物)含柔性肽(黑体)以及Bamh I限制性酶切位点(用加以下划线加以标记)，5’-GCC AGTTGAGTGTGCGTG-3’；P3(正链引物)含Bamh I位点(下划线)，以及含柔肽(黑体)，5’-CCT ATGACGGAC 3’；P4(负链引物)含Xhol I位点(下划线)，5’-GCCTCGAGCTATAGATTGCG-3’。
目的片段的获得以合成的P1、P2和P3、P4为引物，以重组质粒PGEX-LytA为模板，扩增T细胞抗原表位基因序列(l1)、B细胞抗原表位基因序列(l2)。
PGEX重组表达载体的构建、筛选和鉴定PCR产物经过纯化回收后分别行Bamh I单酶切，酶灭活后以T4 DNA连接酶连接。重组质粒PGEX-LytA以及连接后产物l1l2经纯化回收后分别行EcoR I、Xhol I双酶切，将酶切后的质粒和重组片段进行连接。转化感受态JM109。用Amp抗性LB平板进行培养，挑取11个单克隆菌落，分别抽提重组质粒，以P1和P4为引物进行扩增，选取阳性克隆菌落送大连宝生物工程有限公司测定。
重组抗原表位的诱导表达及检测分别挑取含有重组质粒PGEX-4T-1-l1l2和空白对照质粒PGEX-4T-l的单个菌落以及空菌JM109，接种于含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇瓶培养至OD≈0.45，在细菌对数生长前期加入IPTG(终浓度为1mmol/L)，37℃继续摇瓶培养6h，12000rpm，1min离心收集菌体。收集菌体沉淀，加入一定比例的1×SDS和DTT，混均后至于沸水中煮沸5min.取10μl进行SDS-PAGE电泳分析。
重组表达载体的筛选和鉴定对挑选的11个单克隆菌落抽提重组质粒，以该重组质粒为模板，以P1和P4为引物进行扩增(附图7)，选取第1、2、5、7、8、9号阳性克隆菌落送大连宝生物工程有限公司测定。鉴定结果表明目的核苷酸序列没有发生移码突变，重组表位的基因序列与理论设计完全一致，适用于进一步的研究。
SDS-PAGE检测蛋白表达检测重组抗原表位L1L2在受体菌JM109中的表达。含有重组质粒PGEX-4T-1-l1l2的工程菌经37℃条件下IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳显示，在沉淀样品中出现一大小约为31kDa较浓的蛋白条带，为载体启动子下游还原型谷胱苷肽(GST)标签序列所编码的26kDa的GST和插入其下游的l1l2序列所编码的约5kDa的重组抗原表位L1L2所形成的融合蛋白。而经同样条件下IPTG诱导的空载PGEX-4T-1大肠杆菌在26kDa处出现一明显条带。
序列表<110>中山大学<120>肺炎链球菌自溶酶蛋白及其原核表达纯化工艺和疫苗<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>957<212>DNA<213>肺炎链球菌<400>1atggaaatta atgtgagtaa attaagaaca gatttgcctc aagtcggcgt gcaaccatat60aggcaagtac acgcacactc aactgggaat ccgcattcaa ccgtacagaa tgaagcggat120tatcactggc ggaaagaccc agaattaggt tttttctcgc acattgttgg gaacggttgc180atcatgcagg taggacctgt tgataatggt gcctgggacg ttgggggcgg ttggaatgct240gagacctatg cagcggttga actgattgaa agccattcaa ctaaagaaga gttcatgacg300gactaccgcc tttatatcga actcttacgc aatctagcag atgaagcagg tttgccgaaa360acgcttgata cagggagttt agctggaatt aaaacgcacg agtattgcac gaataaccaa420ccaaacaacc actcagacca tgtggatcca tacccttact tggcaaaatg gggcattagc480
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Ser Thr Val Gln Asn Glu Ala Asp Tyr His Trp Arg Lys Asp Pro Glu35 40 45Leu Gly Phe Phe Ser His Ile Val Gly Asn Gly Cys Ile Met Gln Val50 55 60Gly Pro Val Asp Asn Gly Ala Trp Asp Val Gly Gly Gly Trp Asn Ala65 70 75 80Glu Thr Tyr Ala Ala Val Glu Leu Ile Glu Ser His Ser Thr Lys Glu85 90 95Glu Phe Met Thr Asp Tyr Arg Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Arg Asn Leu100 105 110Ala Asp Glu Ala Gly Leu Pro Lys Thr Leu Asp Thr Gly Ser Leu Ala115 120 125Gly Ile Lys Thr His Glu Tyr Cys Thr Asn Asn Gln Pro Asn Asn His130 135 140Ser Asp His Val Asp Pro Tyr Pro Tyr Leu Ala Lys Trp Gly Ile Ser145 150 155 160Arg Glu Gln Phe Lys Tyr Asp Ile Glu Asn Gly Leu Thr Ile Glu Thr165 170 175Gly Trp Gln Lys Asn Asp Thr Gly Tyr Trp Tyr Val His Ser Asp Gly180 185 190
Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp tyr Tyr195 200 205Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr210 215 220Asp Gly Asn Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly225 230 235 240Trp Lys Lys Ile Ala Asp Lys Trp Cys Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala245 250 255Met Lys Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp260 265 270Ala Lys Glu Gly Ala Met Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp275 280 285Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Lys290 295 300Pro Glu Phe Thr Val Glu Pro Asp Gly Leu Ile Thr Val Lys305 310 315<210>3<211>177<212>DNA
<213>人工序列<400>3atggaaatta atgtgagtaa attaagaaca gatttgcctc aagtcggcgt gcaaccatat 60aggcaagtac acgcacactc aactggtggc ggtggctcag gtggcggtgg atccggcggt 120ggcggttcgt tcatgacgga ctaccgcctt tatatcgaac tcttacgcaa tctatag 17权利要求
1.一种肺炎链球菌自溶酶蛋白，它具有如下特征①SDS-PAGE分析其分子量为34KDa左右；②来源于23F、19F、6A、6B或14血清型肺炎链球菌，是肺炎链球菌自身蛋白质的一种；③在原核表达中的表达形式可以是可溶性表达或包涵体表达。
2.一种制备肺炎链球菌自溶酶蛋白的原核表达纯化工艺，它包括制备蛋白及其肽段或衍生物所需要的表达方式、发酵方式、制备流程、表达纯化的优化条件，其中表达方式为可溶性表达；表达纯化优化的条件包括以LB培养基为培养基，其PH值为6.4-PH 7.0；培养诱导温度为25℃；诱导时间为1.5至2小时；表达过程中接种量为1％的接种量；装液量为30％-40％。
3.根据权利要求2所述表达纯化工艺，其特征在于发酵方式为摇瓶发酵表达。
4.根据权利要求2所述表达纯化工艺，其特征在于在该蛋白的纯化过程中，以中性PBS为蛋白质的溶剂，将缓冲液为中性PBS，PH值为7.0的亲和层析柱作为纯化工具，以保持所得到蛋白质的活性不变；纯化流程中，结合蛋白质可溶性表达的特点，采用超声与冻融的物理方式破碎工程菌。
5.一种来源于权利要求1所定义蛋白质的重组抗原表位肽段，其特征在于该重组抗原表位包括一个B细胞抗原表位，即氨基酸序列2～28(EINVSKLRTDLPQVGVQPYRQVHAHST)；一个T细胞抗原表位，即氨基酸序列98～112(FMTDYRLYIELLRNL)；一个柔性肽段，即(GLY-GLY-GLY-GLY-SER)3，该柔性肽段位于两个抗原表位之间。
6.一种如权利要求5所述重组抗原表位的分子克隆构建方法，包括以PCR扩增得到抗原表位的基因编码序列，基因序列为ATG GAA ATT AAT GTG AGT AAA TTA AGA ACA GAT TTG CCT CAA GTC GGC GTG CAA CCA TAT AGGCAA GTA CAC GCA CAC TCA ACT GGT GGC GGT GGC TCA GGT GGC GGT GGA TCC GGC GGT GGC GGTTCG TTC ATG ACG GAC TAC CGC CTT TAT ATC GAA CTC TTA CGC AAT CTA TAG其中黑体为插入的柔性肽编码基因序列，柔性肽前端为B细胞抗原表位编码序列，后端为T细胞抗原表位编码基因序列，ATG为加上的起始密码子，TAG为加上的终止密码子；②三段肽段的连接采用酶切和DNA连接酶催化反应方法，并将从抗原表位的起始氨基酸开始第37，从柔性肽的起始氨基酸开始第9个氨基酸Gly的密码子第三个碱基由C替换为A；将从抗原表位的起始氨基酸开始第38，从柔性肽的起始氨基酸开始第10个氨基酸Ser的密码子第三个碱基由G替换为C；③利用分子克隆技术构建的重组抗原表位为一个新的由三个肽段构成的人工重组小分子蛋白质，该小分子蛋白氨基酸序列为EINVSKLRTDLPQVGVQPYRQVHAHST-(GLY-GLY-GLY-GLY-SER)3-FMTDYRLYIELLRNL。
7.一种以权利要求1所定义蛋白质制备的抗肺炎链球菌感染疫苗。
8.根据权利要求7所述疫苗，其特征是疫苗的主要成分肺炎链球菌自溶酶蛋白可选择性地与载体或佐剂配制在一起配伍形成疫苗。
9.根据权利要求8所述疫苗，其特征是所述载体或佐剂包括CPG、弗氏佐剂、脱乙酰壳多糖颗粒。
10.根据权利要求7所述疫苗，其特征是疫苗中纯化的肺炎链球菌自溶酶蛋白主要溶于中性PBS或中性复方氯化钠溶液，或其他溶液载体如水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油或者它们的组合。
全文摘要
本发明主要涉及分子生物学及基因工程技术领域，提供一种分离和纯化该肺炎链球菌自溶酶蛋白的工艺及方法，同时本提供一种能够诱导产生有效预防性免疫保护效果的蛋白质疫苗。本发明主要技术方案要点在于该疫苗蛋白质编码基因的克隆和转化，稳定性工程菌的构建，稳定高表达量蛋白分离纯化体系的建立，动物实验免疫保护效果的评价，蛋白理化性质的分析和评估。以及该蛋白可对呼吸道病原菌如肺炎球菌感染等产生预防作用。还包括确定该自溶酶蛋白的抗原表位，运用分子克隆技术构建重组抗原表位，并在原核表达系统进行了表达。
文档编号C07K7/00GK101063116SQ20071002789
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月30日 优先权日2007年4月30日
发明者吴忠道, 鲜墨, 甘慧泉, 袁竹青, 余新炳 申请人:中山大学