专利名称：人吲哚胺2,3-双加氧酶多克隆抗体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种人吲哚胺2， 3-双加氧酶多克隆抗体及其制备方法，以及人吲哚胺2， 3-双加氧酶多 克隆抗体在免疫印迹和免疫组化中的应用。
背景技术：
人吲哚胺2， 3-双加氧酶(Indoleamine2，3-dioxygenase， ID0) 是一种广泛存在于哺乳动物体内的除肝脏外的细胞胞浆中的血红素 蛋白，为色氨酸代谢过程中的重要限速酶。它能氧化断裂生物体的必 需氨基酸一色氨酸的吲哚环的2-3双键，在体内迅速氧化成犬尿氨 酸，进而变成一系列的代谢产物。编码ID0的基因位于人的8号染色 体，包含10个外显子，全长15 kb。它含有2个干扰素 (interferon, IFN ) 刺激反应元件(interferon stimulating reaction element, ISRE) ， 5'端还包括干扰素调节因子-1 (IFN regulation factor, IRF-1)结合区域，表明IFN能影响ID0的表达。
二十世纪中期，人们对于IDO的研究主要集中于蛋白的提纯、催 化作用的动力学基础和抑制病原微生物的情况。当时的研究表明，机 体组织受到感染时，白细胞和淋巴细胞会聚集在感染部位，释放IFN， 从而诱导局部组织细胞内IDO的表达。这种诱导能抑制细菌、病毒、 寄生虫和肿瘤的生长，其原因是IDO的催化作用使感染部位的周围形 成了色氨酸缺乏的微环境，使病原微生物和肿瘤因缺乏色氨酸这种增
殖必需的氨基酸而死亡。
二十世纪末，越来越多的研究表明IDO在机体免疫调节中起了非 常重要的作用。人们发现IDO高表达于母体胎盘，其他表达量较高的 组织有小肠，淋巴结，脾，胸腺和肺。在David Munn等人的实验中， 他们发现胎盘的滋养层具有抑制母体T细胞，使胎儿免受母体的免疫 排斥反应的能力，而这种能力正是滋养层细胞中表达丰富的IDO所赋 予的；给怀孕母鼠服用ID0抑制剂1-MT造成母鼠流产这一事实也强有 力地说明了这一点。近年来大量的研究表明IDO在肿瘤免疫耐受中起 着重要作用，肿瘤细胞和抗原呈递细胞中IDO的表达与肿瘤的发生发 展密切相关。在抗肿瘤免疫反应的起始阶段，肿瘤引流淋巴节在受细 胞因子的刺激下会产生表达IDO的树突状细胞(dendritic cells, DCs)的亚群，通过细胞表面接触引起的信号传递能使T细胞进入无能 状态(anergy),从而无法激发有效的抗肿瘤免疫反应。在抗肿瘤免 疫反应的效应阶段，许多肿瘤细胞也被发现自身能表达IDO， ID0的过 度表达会使局部色氨酸代谢活动加剧，其结果是局部色氨酸浓度的下 降和有毒性的犬尿氨酸代谢产物的积累，使对这种环境敏感的效应T 细胞死亡而无法发挥杀伤性作用，同样的情况也很可能发生在肿瘤引 流淋巴结内。当人们用IDO特异性抑制剂l-甲基色氨酸
(1-methyl-tryptophan, 1-MT)来抑制DC或肿瘤细胞内的IDO时，人 们发现T细胞的抗肿瘤反应能力明显增强。
综上所述，对细胞内IDO表达的研究在探讨IDO在免疫调节中的作 用具有重要意义，由于IDO的表达与肿瘤治疗效果存在一定的联系，在肿瘤治疗中对IDO表达的检测有助于对治疗方案做进一步的改善。
但国内尚无关于相关抗体研制的报道。
发明内容
本发明的一个目的是填补国内人吲哚胺2， 3-双加氧酶多克隆抗 体的技术空白，提供一种ID0多克隆抗体，将人IDO基因克隆至原核 表达质粒中，并在大肠杆菌中大量表达并纯化，经免疫家兔，以得到 特异性好，浓度高的抗体，从而能大量制备出廉价的、高质量的抗人 ID0抗体。在各种细胞和组织中应用所制备出的抗体检测ID0的表达 情况，为进一步研究IDO在机体免疫系统中发挥的作用奠定基础。
本发明的另一个目的是提供所述人吲哚胺2， 3-双加氧酶多克隆 抗体的具体制备方法，简单易行，制备成本低。
本发明还有一个目的是提供了所述人B引哚胺2， 3-双加氧酶多克 隆抗体的应用。
本发明的技术方案是提供一种人吲哚胺2， 3-双加氧酶多克隆抗 体，将人IDO基因克隆至原核表达质粒中构建重组质粒，表达并纯化 后经免疫家兔得到。
所述重组质粒主要包括His表达标签，全长为1212bp的hIDO 的cDNA，相应编码蛋白质有43个氨基酸。
所述重组质粒表达并纯化后的融合蛋白分子量为50KD。 本发明提供了所述人吲哚胺2， 3-双加氧酶多克隆抗体的制备方 法，包括以下步骤
(1) pET30a(+)-MDO重组质粒的构建；
(2) His-hIDO融合蛋白的表达和纯化；
(3) 经免疫家兔制备兔抗人IDO多克隆抗体。
所述重组质粒的构建过程为根据GenBankTMhID0已知序列设计 引物，扩增hIDO基因，以EcWI、SW I酶切位点插入质粒pET30a(+)， 经酶切、测序等手段证明插入片段正确。
所述引物为
正向引物为5， -ACTA GAATTC AT GGC ACA CGC TAT GGA AAA CTC-3， 反向引物为5， -ACTA GTCGAC AC CTT CCT TCA AAA GGG ATTTC-3，
所述表达和纯化是将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌中，当细 菌长到对数生长期时，以0. 5 mmol/L IPTG为诱导剂、37。C过夜诱导 表达hIDO重组蛋白，收集细菌，RIPA洗涤法纯化产物，采用SDS-PAGE 鉴定。
所述经免疫家兔制备兔抗人IDO血清是将表达和纯化后的IDO 重组蛋白与佐剂混合乳化后在兔背部皮下多点首次免疫注射和加强 免疫注射，每次加强免疫注射7天测抗体效价后颈动脉插管收集兔血， 分离好的血清于-8CTC保存。
所述首次免疫注射是将重组蛋白与完全福氏佐剂等体积混合乳 化后注射，注射总量为lmg/只兔；加强免疫注射是将重组蛋白与不 完全福氏佐剂等体积混合乳化后注射，每次注射量为lmg/只兔。
本发明提供了所述人吲哚胺2， 3-双加氧酶多克隆抗体的应用， 具体应用于特异性识别A431、 CNE2、 H印G2、 MDA-MB-435s细胞或
SW1990细胞经IFN- Y诱导前后的ID0的表达或者用于检测胎盘组织、 宫颈癌组织、卵巢癌组织或鼻咽癌组织中的ID0的表达。 具体来说，本发明抗体的制备和应用的基本过程如下
1) pET30a(+)-IDO重组质粒的构建
以质粒pEGFP-N1-ID0为PCR反应模板，按照GENBANK上ID0序列 设计引物，用EcoW工和SW I双酶切的PCR产物和pET-30 a(+)载 体后将二者连接，连接产物转化DH5a感受态细胞，接种于含卡那霉 素的LB固体平板过夜培养。随机挑取菌落用PCR法鉴定出阳性克隆， 提取阳性菌质粒进行双酶切鉴定，并进行DNA测序，琼脂糖凝胶电泳 图和测序结果证实了构建出pET30a(+)-ID0质粒，克隆的基因序列是 GENBANK上ID0序列的从第115个碱基对到第1326个碱基对，包括 His表达标签，全长为1212bp的hIDO的cDNA，相应编码蛋白质有 43个氨基酸。所述GENBANK衔接地址
http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi db=nuccore&id=l 56071 492
2) IDO融合蛋白在大肠杆菌中的表达
接种含有pET30a(+)-ID0表达质粒的大肠杆菌BL21冻存菌于含 卡那霉素50mg/ml的培养基中，37"C过夜培养；按1:30 50将过夜 培养物接种于含卡那霉素50 mg/ml的LB中，37。C培养至0D值二0. 6 0.8;加IPTG至终浓度为0.5腿ol/L， 37。C过夜诱导表达。离心收 集菌体；用适量PBS重悬菌体，超声破碎；4。C下10 000 g离心10 min; 分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE，从电泳图可见IDO融合蛋白主
要在沉淀中，即在该原核表达系统中ID0融合蛋白主要以包涵体形式 表达。
3) ID0蛋白的纯化
超声破碎菌体；4。C下4000 g离心5min收集细菌；以适量预冷 的PBS洗涤2次；按照3 ml/g湿菌的比例将细菌重悬于预冷的PBS; 反复冻融3次；细菌悬液于冰水浴中超声至少30min。 4。C下5000 6000 g离心20 min收集包涵体；用RIPA洗涤2次，每次以5000 6000g离心15min收集包涵体。沉淀重悬于5% 10% SDS，依次用含 有0. 05%和0. 01% SDS的PBS透析。纯化样品冻存于-8CTC备用，取 其中少量进行SDS-PAGE电泳。
4) 兔抗人IDO多克隆抗体的制备
免疫动物前，从耳缘静脉取血5ml，常规分离血清，-8(TC保存， 作为免疫前对照。将纯化的重组人IDO融合蛋白作为抗原，与等量的 完全福氏佐剂混合并充分乳化，以每兔l mg的量背部皮下多点免疫 家兔。初次免疫14天后，进行第二次免疫。第二次免疫开始用不完 全福氏佐剂乳化抗原，每周加强免疫一次。从第二次免疫开始，由兔 耳静脉取血，按常规分离血清。
5) 多克隆抗体的鉴定
以His-probe (H-15)多克隆抗体(l :5000)为阳性参照，以细菌 中表达IDO融合蛋白为抗原，用免疫印迹法检测抗体的有效性。
6) 多克隆抗体的效价检测
以免疫兔的IDO融合蛋白为抗原，用尿素溶解后，经蛋白定量试
剂定量后，以lg， 0. 5g， 0.25g， 0. lg， 0.05g， 0.025g， 0. Olg为抗 原量进行上样，兔抗人IDO抗体用封闭液以1:20 OOO的比例稀释。
7) 多克隆抗体在免疫印迹法检测细胞内IDO表达的应用 以待测细胞的全细胞裂解物为抗原，兔抗人IDO抗体以1: 20 000
比例与封闭液混合，以(3-actin为系统的内参照，检测了 A431、H印G2、 CNE2、 MDA-MB-435s、 SW1990、 MOLT-4、 MDA-MB-231、 Jurkat等细胞 内经Y-干扰素诱导后IDO的表达情况，发现A431、 H印G2、 CNE2、 MDA-MB-435s、 SW1990经厂干扰素诱导后有IDO的表达，而M0LT-4、 MDA-MB-231、 Jurkat则无IDO的表达
8) 多克隆抗体在免疫组化法检测细胞和组织内IDO表达的应用
按常规SP法，抗体以l: 500比例稀释，检测了CNE2细胞、胎 盘组织、宫颈癌组织、卵巢癌组织、鼻咽癌组织中IDO的表达情况。
本发明的有益效果是用pET30a(+)所构建的pET30a(+)-ID0 的在体外原核表达系统能高效表达目的蛋白，进一步以成熟的方法进 行纯化、剪切，可方便地获得大量的hIDO;经此蛋白免疫家兔所制 备的兔抗人IDO多克隆抗体效价高、特异性好，能满足相关实验的需 要，在免疫印迹和免疫组化所需抗体浓度低，孵育时间短，实验效率 高，能大量制备出廉价的、高质量的抗人IDO抗体。在各种细胞和组 织中应用所制备出的抗体检测IDO的表达情况，为进一步研究IDO在 机体免疫系统中发挥的作用奠定基础。
图1 PCR鉴定重组质粒
图2重组pET30a(+)-ID0的酶切鉴定
图3 His-IDO融合蛋白诱导表达与纯化的SDS-PAGE分析，考马斯亮 蓝^^>
图4蛋白免疫印迹法鉴定IDO多克隆抗体的特异性 图5蛋白免疫印迹法分析IDO抗体的灵敏度
图6兔抗人IDO多克隆抗体通过蛋白免疫印迹法检测IDO在A 431 细胞中的表达情况
图7兔抗人IDO多克隆抗体通过蛋白免疫印迹法检测IDO在CNE2细 胞中的表达情况
图8兔抗人IDO多克隆抗体通过蛋白免疫印迹法检测IDO在H印G2 细胞中的表达情况
图9兔抗人IDO多克隆抗体通过蛋白免疫印迹法检测IDO在 MDA-MB-435s细胞中的表达情况
图10兔抗人ID0多克隆抗体通过蛋白免疫印迹法检测ID0在SW1990 细胞中的表达情况
图11兔抗人IDO多克隆抗体通过免疫组化法检测IDO在CNE2细胞中 的表达情况
图12兔抗人IDO多克隆抗体通过免疫组化法检测IDO在胎盘组织中 的表达情况
图13兔抗人IDO多克隆抗体通过免疫组化法检测IDO在宫颈癌组织 中的表达情况
图14兔抗人IDO多克隆抗体通过免疫组化法检测IDO在卵巢癌组织中的表达情况
图15兔抗人ID0多克隆抗体通过免疫组化法检测ID0在鼻咽癌组织 中的表达情况
具体实施方式
实施例1
一、多克隆抗体的制备 (1) pET30a(+)-hlDO重组质粒的构建
以质粒pEGFP-Nl-ID0为PCR反应模板，按照GENBANK上ID0 序列设计引物
正向引物为5， -ACTA GAATTC AT GGC ACA CGC TAT GGA AAA CTC-3' 含Ecof I内切酶位点；
反向引物为5， -ACTA GTCGAC AC CTT CCT TCA AAA GGG ATTTC-3， 含SW I内切酶位点。
PCR循环条件为:94"C预变性2min; 94°C， 40 s， 55°C， 1 min， 72°C， 30 s， 30个循环；72°C， 7 min。用凝胶回收试剂盒回收EcoW I和SaJ I双酶切的PCR产物和pET-30 a(+)载体，按载体和PCR产 物1:6的比例在16'C进行过夜连接。次日将连接产物转化DH5a感 受态细胞，接种于含卡那霉素50ng/ml的LB固体平板过夜培养。随 机挑取菌落用PCR法鉴定阳性克隆，提取阳性菌质粒进行双酶切鉴 定，并将正向连接产物进行DNA测序，见附图1和附图2，其中附图 1中泳道M: lkb DNA plus DNA分子量标准；泳道1、 2:阳性克隆菌
落的PCR产物；泳道3、 4、 5:阴性克隆菌落的PCR产物；泳道6:
阳性对照；泳道7;阴性对照，附图2中泳道M: lkb DNA plus DNA 分子量标准；泳道l: pET30a(+)质粒；泳道2: EcoR I和Sail双 酶切pET30a(+);泳道3:pET30a(+)-ID0质粒；泳道4:EcoRI和Sal I双酶切pET30a(+)-IDO。 (2 ) His-hIDO融合蛋白的表达和纯化
IDO融合蛋白在大肠杆菌中的表达 经测序验证的pET30a(+)-IDO表达质粒转化BL21感受态细胞，从转 化平板上随机挑取单菌落过夜培养，取菌液用甘油-8(TC冻存。接种 冻存菌于含卡那霉素50 ng/ml的培养基中，37"C过夜培养；按1:30 50将过夜培养物接种于含卡那霉素50 ng/ml的LB中，37'C培养至 OD值=0. 6 0. 8;力n IPTG至终浓度为0. 5 mmol/L， 37。C过夜诱导表 达。离心收集菌体；用适量PBS重悬菌体，超声破碎；4"C下10 000 g离心10 min;分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE，分析目标蛋白 在上清和沉淀中的表达情况。
IDO蛋白的纯化
超声破碎菌体；4"C下4000 g离心5min收集细菌；以适量预冷 的PBS洗涤2次；按照3 ml/g湿菌的比例将细菌重悬于预冷的PBS; 反复冻融3次；细菌悬液于冰水浴中超声至少30min。 4'C下5000 6000 g离心20 min收集包涵体；用R工PA洗涤2次，每次以5000 6000 g离心15 min收集包涵体。沉淀重悬于5 % 10 % SDS，依次 用含有0. 05 %和0. 01 % SDS的PBS透析。纯化样品冻存于-80。C备 用，取其中少量进行SDS-PAGE电泳。
结果见附图3，其中泳道1: IPTG诱导的pET30a(+)-ID0菌体 蛋白；泳道2:未诱导的pET30a(+)-ID0菌体蛋白；泳道3:未诱导 的pET30a菌体蛋白；泳道4: IPTG诱导的pET30a(+)-IDO菌体蛋白 超声后的上清；泳道5: IPTG诱导的pET30a(+)-IDO菌体蛋白超声后 的沉淀；泳道6: IPTG诱导的pET30a(+)-IDO菌体蛋白纯化后的包涵 体。
(3)经免疫家兔制备兔抗人IDO多克隆抗体
免疫动物前，从耳缘静脉取血5 ml，按常规血清分离法，室温 静置4-6小时，4° C冰箱放置过夜后，吸出上层血清保存。剩余部 分4° C下2500g离心20min，弃血块沉淀，与前面吸出血清于-80°C 保存，作为免疫前对照。将纯化的重组人IDO融合蛋白作为抗原，与 等量的完全福氏佐剂混合并充分乳化，以每兔1 mg的量背部皮下多 点免疫家兔。初次免疫14天后，进行第二次免疫。第二次免疫开始 用不完全福氏佐剂乳化抗原，每周加强免疫一次。从第二次免疫开始， 由兔耳静脉取血，按常规血清分离法分离血清。 实施例2多克隆抗体的鉴定
以His-probe (H-15)多克隆抗体(1:5000)为阳性参照，以细菌 中表达IDO融合蛋白为抗原，用免疫印迹法检测抗体的有效性。具体 步骤如下用2XSDS上样缓冲液悬浮包涵体，95-100° C加热5min， 最大转速离心3min，取上清上样于10%聚丙烯酰胺凝胶，先80V电泳 30min，再用100V电泳至结束。电泳后，采用湿转式电转印的方法将 蛋白转移至PVDF膜上，转膜条件为恒流IOO V， 1 h。 PVDF膜用
5。/o脱脂奶粉TBS-T (含l°;Tween-20)室温封闭2 h。将PVDF膜转移 至用封闭液稀释的兔抗人IDO抗体，His-probe (H-15)多克隆抗体 或免疫前的兔血清中，4T:下摇床慢慢振摇孵育过夜。其中，兔抗人 IDO抗体分别按不同比例与封闭液混合稀释；His-probe (H-15)多 克隆抗体是系统的阳性对照，以1:5000的比例稀释；免疫前兔血清 是系统的阴性对照，以1:500的比例稀释。次日用TBS-T洗膜，将 PVDF膜转移至1:10 000用封闭液稀释的羊抗兔-HRP中，室温下摇床 慢慢振摇孵育1 h后，TBS-T洗膜，用ECL化学发光检测试剂盒检测。 当ID0抗体效价达到1:12 000时，停止免疫，颈动脉插管取兔血。 按常规法分离血清，分装冻存于-8(TC备用。结果见附图4，其中图 4A为以His-probe (H-15)多抗为一抗的检测；图4B为以兔抗人多 克隆抗体为一抗的检测；泳道1:未诱导的pET30a菌体蛋白；泳道 2:未诱导的pET30a(+)-ID0菌体蛋白；泳道3: IPTG诱导的 pET30a(+)-IDO菌体蛋白 实施例3多克隆抗体的效价检测
以免疫兔的IDO融合蛋白为抗原，用8M尿素溶解其包涵体，经 蛋白定量试剂定量后，以lg， 0.5g， 0.25g， 0. lg， 0.05g， 0.025g， 0. Olg为抗原量进行蛋白电泳上样，兔抗人IDO抗体用封闭液以1:20 OOO的比例稀释，按实施例2的方法进行免疫印迹检测。结果见附图 5，泳道l-7依次是lg， 0. 5g, 0.25g， 0. lg， 0. 05g， 0. 025g和0. Olg 的IDO蛋白。
实施例4多克隆抗体的应用
1、多克隆抗体在免疫印迹法检测细胞内ID0表达的应用
将A 431、 H印G2、 CNE2、 MDA-MB-435s 、 SW1990、 M0LT-4、 MDA-MB-231、 Jurkat等细胞样本加入三去污细胞裂解液，冰上放置 30 min;收集细胞裂解液于EP管中；4。C最高转速离心25 min，收 集上清。用Bio-rad蛋白定量试剂定量后，取IO Ug的细胞总蛋白 进行按上述步骤5用SDS-PAGE电泳分离并转移到PVDF膜，于室温用 5Q/o脱脂奶粉TBS-T (含l%。TWeen-20)封闭液封闭1.5h。兔抗人IDO 抗体以l: 20 OOO比例与封闭液混合，于室温床慢慢振摇孵育l h。 用TBS-T洗膜，将PVDF膜转移至1:10 000用封闭液稀释的羊抗兔-服P 中，室温下摇床慢慢振摇孵育l h后，TBS-T洗膜，用ECL化学发光 检测试剂盒检测。以p-actin为系统的内参照，方法如下以 stripping buffer洗脱PVDF膜上抗体后，用封闭液于室温封闭1 h。 以l: 5000比例将(3-actin抗体用封闭液稀释，室温下摇床慢慢振摇 孵育l h，用TBS-T洗膜，将PVDF膜转移至1:10 000用封闭液稀释 的羊抗兔-服P中，室温下摇床慢慢振摇孵育lh后，TBS-T洗膜，用 ECL化学发光检测试剂盒检测。见附图6至附图10，其中附图6中泳 道l: IFN，诱导的A 431全细胞裂解物，泳道2:未经IFN-Y诱导的 A431全细胞裂解物；附图7中泳道1: IFN，诱导的CNE2全细胞裂 解物，泳道2:未经IFN-Y诱导的CNE2全细胞裂解物；附图8中泳道 1: IFNi诱导的H印G2全细胞裂解物，泳道2:未经IFNi诱导的H印G2 全细胞裂解物；附图9中泳道1: IFNi诱导的MDA-MB-435s全细胞裂 解物，泳道2:未经IFN-y诱导的MDA-MB-435s全细胞裂解物；附图
10中泳道1: IFN，诱导的SW1990全细胞裂解物，泳道2:未经IFN， 诱导的SW199全细胞裂解物。
2、 多克隆抗体在免疫组化法检测细胞内ID0表达的应用
CNE2细胞制备细胞爬片，取出玻片，PBS洗2次；冰冷丙酮固定 2min;蒸馏水洗2次；PBS洗2次，每次5min;浸入3%H202 (8C^甲 醇)室温避光静置30分钟；PBS洗2次各5min;滴加正常山羊血清 封闭液封闭1小时；甩去多余液体，滴加制得的多抗，抗体以1: 500 比例用封闭液稀释，室温静置l小时；PBS洗3次各5分钟；滴加II 抗20 40 n 1，室温静置1小时；PBS洗3次各5分钟；DAB显色5
IO分钟；自来水冲洗10分钟；苏木精复染2分钟，1%盐酸酒精分化 数秒；自来水冲洗10分钟；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂 封片、镜检。结果见附图ll，图A: IFN-Y诱导的CNE2;图B:未经 ifn-y诱导的CNE2
3、 多克隆抗体在免疫组化法检测组织内IDO表达的应用
胎盘组织、宫颈癌组织、卵巢组织、鼻咽癌组织等组织切片60 。C烘2小时；二甲苯脱蜡，每次5min;梯度乙醇水化，蒸馏水冲洗 后，PBS洗2 3次各5分钟；浸入3。/。H202 (80%甲醇)室^^显避光静置 30分钟；PBS洗2次各5分钟；浸泡入柠檬酸缓冲液(0. OIM， p朋.0) 用微波加热法进行抗原修复，煮沸10分钟；PBS洗3次各5分钟； 滴加含0. 3%TritonX-100正常山羊血清封闭液，37。C静置一小时；甩 去多余液体，滴加制得的多抗，抗体用封闭液以1: 500比例稀释， 室温静置l小时；PBS—T (0. l%Tween 20)洗3次各5分钟；滴加
II抗20 40 u 1，室温静置1小时；PBS-T洗3次各5分钟；DAB显
色5 10分钟，在显微镜下掌握染色程度；自来水冲洗10分钟；苏
木精复染2分钟，1%盐酸酒精分化lmin;自来水冲洗10分钟；梯度 乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片、镜检，结果见附图12至附 图15。图12中图A :兔抗人IDO多克隆抗体识别胎盘组织细胞中 IDO的表达(100X )，图B:未加兔抗人IDO多克隆抗体的宫颈癌组 织免疫组化图(IOOX)，图C兔抗人IDO多克隆抗体识别胎盘组织 细胞中IDO的表达(400X);图13中图A:兔抗人IDO多克隆抗体 识别宫颈癌组织细胞中IDO的表达(IOOX)，图B:未加兔抗人IDO 多克隆抗体的宫颈癌组织免疫组化图(IOOX)，图C兔抗人IDO多 克隆抗体识别宫颈癌组织细胞中IDO的表达(400X );图14中图A : 兔抗人IDO多克隆抗体识别卵巢癌组织细胞中IDO的表达(100X )， 图B:未加兔抗人IDO多克隆抗体的卵巢癌组织免疫组化图(100X )， 图C兔抗人IDO多克隆抗体识别卵巢癌组织细胞中IDO的表达(400 X);图15中图A :兔抗人IDO多克隆抗体识别鼻咽癌组织细胞中 IDO的表达(100X )，图B:未加兔抗人IDO多克隆抗体的鼻咽癌组 织免疫组化图(IOOX)，图C兔抗人IDO多克隆抗体识别鼻咽癌组 织细胞中IDO的表达(400X )。
权利要求
1、一种人吲哚胺2，3-双加氧酶多克隆抗体，其特征在于将人IDO基因克隆至原核表达质粒中构建重组质粒，表达并纯化后经免疫家兔得到。
2、 根据权利要求1所述人吲哚胺2， 3-双加氧酶多克隆抗体， 其特征在于所述重组质粒主要包括His表达标签，全长为1212bp的 hIDO的cDNA，相应编码蛋白质有43个氨基酸。
3、 根据权利要求1所述人吲哚胺2， 3-双加氧酶多克隆抗体， 其特征在于所述重组质粒表达并纯化后的融合蛋白分子量为50KD。
4、 权利要求1所述人吲哚胺2， 3-双加氧酶多克隆抗体的制备 方法，其特征在于包括以下步骤(1) pET30a(+)-hlDO重组质粒的构建；(2) His-hIDO融合蛋白的表达和纯化；(3) 经免疫家兔制备兔抗人IDO多克隆抗体。
5、 根据权利要求4所述人吲哚胺2， 3-双加氧酶多克隆抗体的 制备方法，其特征在于所述重组质粒的构建过程为根据 GenBankTMhID0已知序列设计引物，扩增hIDO基因，以EC、 SW I酶切位点插入质粒pET30a(+)。
6、 根据权利要求5所述人吲哚胺2， 3-双加氧酶多克隆抗体的 制备方法，其特征在于所述引物为正向引物为5， -ACTA GAATTC AT GGC ACA CGC TAT GGA AM CTC-3，反向引物为5， -ACTA GTCGAC AC CTT CCT TCA AAA GGG ATTTC-3，
7、 根据权利要求4所述人吲哚胺2， 3-双加氧酶多克隆抗体的 制备方法，其特征在于所述表达和纯化是将步骤(1)构建好的重组 质粒转化到大肠杆菌中，当细菌长到对数生长期时，以0.5mmol/L IPTG为诱导剂、37"C过夜诱导表达hlD0重组蛋白，收集细菌，RIPA 洗涤法纯化产物，采用SDS-PAGE鉴定。
8、 根据权利要求4所述人吲哚胺2， 3-双加氧酶多克隆抗体的 制备方法，其特征在于所述步骤(3)经免疫家兔制备兔抗人IDO血 清是将表达和纯化后的IDO重组蛋白与佐剂混合乳化后在兔背部皮 下多点首次免疫注射和加强免疫注射，每次加强免疫注射7天测抗体 效价后颈动脉插管收集兔血，分离好的血清于-8(TC保存。
9、 根据权利要求8所述人吲哚胺2， 3-双加氧酶多克隆抗体的 制备方法，其特征在于所述首次免疫注射是将重组蛋白与完全福氏佐 剂等体积混合乳化后注射，注射总量为lmg/只兔；加强免疫注射是 将重组蛋白与不完全福氏佐剂等体积混合乳化后注射，每次注射量为 lmg/只兔。
10、权利要求1所述人吲哚胺2， 3-双加氧酶多克隆抗体的应用， 其特征在于应用于特异性识别A 431、 CNE2、 H印G2、 MDA-MB-435s 细胞或SW1990细胞经IFN- y诱导前后的IDO的表达或者用于检测胎 盘组织、宫颈癌组织、卵巢癌组织或鼻咽癌组织中的IDO的表达。
全文摘要
本发明公开了一种人吲哚胺2，3-双加氧酶多克隆抗体及其制备方法，将人IDO基因克隆至原核表达质粒中构建重组质粒，表达并纯化后经免疫家兔得到特异性好，浓度高的抗体，从而能大量制备出廉价的、高质量的抗人IDO抗体，在各种细胞和组织中应用所制备出的抗体检测IDO的表达情况，为进一步研究IDO在机体免疫系统中发挥的作用奠定基础。
文档编号C07K16/18GK101182359SQ20071003133
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月9日 优先权日2007年11月9日
发明者鹏 刘, 军 杜, 谢白露 申请人:中山大学