专利名称：Cyp2c19基因第六号外显子的单核苷酸多态性的检测方法
技术领域：
本发明涉及的是基因技术领域的核酸及其引物和检测方法，具体地讲是一种分离核酸、一种等位基因特异性的核酸引物和CYP2C19基因第六号外显子的单核苷酸多态性的检测方法。
背景技术：
细胞色素氧化酶P4502 C19(CYP2C19)又称为S-美芬妥英羟化酶，是细胞色素P450的一个成员，在CYP2C家族中，通过cDNA克隆方法已鉴定出6个基因，即CYP2C8、CYP2C9、CYP2C10、CYP2C17、CYP2C18、CYP2C19，其中CYP2C19催化临床常用的多种药物包括质子泵抑制剂(PPI)如奥美拉唑等药物在人体内的氧化代谢反应，是人类肝脏细胞色素氧化酶p450酶系中的一种肝药酶。该酶活性的遗传多态性影响着许多临床药物的代谢，其活性存在明显的个体差异，很多药物是CYP2C19的诱导剂和抑制剂，在药物联合使用时，常使CYP2C19酶活性的个体差异得到放大，以至于影响到药物的安全性和有效性。CYP2C19酶活性还与肿瘤的发生密切相关，食管癌患者CYP2C19PM者发生率显著高于正常对照组。此外，性别也可能影响CYP2C19的活性，女性的CYP2C19活性比男性高。年龄对CYP2C19活性亦有影响，Tanaka将研究的对象分成5个年龄组，实验结果表明CYP2C19在出生时最低，随后立即升高，至成年期达到最高峰，到老年时又下降。CYP2C19的活性受到遗传因素及环境因素的影响，但遗传因素是最主要的原因。多数CYP2C19的单核苷酸突变可以影响基因的后续转录和表达，进而改变了酶的结构和活性，这是造成个体差异的主要原因。鉴于CYP2C19在药物代谢中的作用及活性存在个体差异，因此对解决CYP2C19基因多态性的检测和相关问题是现有技术急需解决的技术难题。
对现有文献的检索，未发现有本发明的CYP2C19基因第六号外显子(C905G)SNP(单核苷酸多态性)相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种CYP2C19基因第六号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，同时涉及一种分离核酸、一种等位基因特异性的核酸引物，可用于评估个体患CYP2C19基因的第六号外显子相关疾病的易感性，以及用于CYP2C19基因多态性与临床用药安全关系的研究。
本发明是通过以下技术方案实现的，第一方面，提供了一种检测人CYP2C19基因第六号外显子的单核苷酸多态性的方法，它包括步骤(a)采用Primer 5.0等相关软件，以GenBank数据库CYP2C19基因(AY796203)第六号外显子以及外显子与内含子接合部位序列为模板设计一对等位基因特异性的核酸引物，利用引物对来扩增CYP2C19基因的第六号外显子的DNA序列，对扩增产物进行分离纯化，得到相应分离核酸。
(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。采用一些分析技术可用于检测分离核酸的CYP2C19基因第六号外显子的SEQ ID NO1所示序列的第905位核苷酸是否存在单核苷酸多态性，即C→G多态性。
这些分析技术包括(但并不限于)DNA测序法、杂交测序法；酶促错配切割法、异源双链分析法、点杂交法、寡核苷酸阵列法、微测序法、Taqman技术、分子信标法，变性高效液相色谱法。
在本发明的第二方面，提供了一种分离核酸，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第905位为G。
在本发明的第三方面，提供了一种等位基因特异性的核酸引物，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人CYP2C19基因第六号外显子的SEQ ID NO1所示序列的第905位的单核苷酸多态性的扩增产物。
本发明所述的“分离纯化”是指在基因组DNA水平上，利用引物对来扩增每个多态性位点的基因序列和利用纯化试剂盒对扩增产物进行提纯。
用于本发明的测试样品没有特别限制，对于检测SNP而言，可以是从血液、组织等样品中抽提出的DNA或mRNA。对于CYP2C19基因第六号外显子活性而言，可以任何含有CYP2C19基因第六号外显子的样品，如血液等。
本发明的实质性特点和显著进步表现在是一项原创性的发明。本发明的内容涉及一种分离出的或纯化的CYP2C19基因第六号外显子多态性位点的基因序列。所说的“分离出的或纯化的”是指在基因组DNA水平上，利用引物对来扩增多态性位点的基因序列和利用纯化试剂盒对扩增产物进行提纯。通过对所取样品CYP2C19基因测序结果，在沈阳中发现了1个样品含有CYP2C19基因第六号外显子SNP(即第905位C→G多态性)，频率为0.003。经分析发现，该SNP导致第302位氨基酸由Thr(T)→Arg(R)。由于这是不同性质氨基酸的置换，因此，会导致CYP2C19基因所编码的蛋白活性发生改变。从而引起酶活性发生改变，进一步影响CYP2C19酶代谢的药物。
本发明为研究我国人群中CYP2C19基因多态性与临床用药安全的关系奠定了基础，为药物设计和临床用药个体化提供了基因学理论根据，同时也为基于药物基因组学理念的新药研发提供指导依据，具有重大的理论意义和潜在的实用价值。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
步骤1一种核酸的分离和测序引物设计采用Primer 5.0软件，以GenBank数据库CYP2C19基因(AY796203)第六号外显子以及外显子与内含子接合部位序列为模板设计一对等位基因特异性的核酸引物，由Invitrogen公司合成。
引物信息扩增CYP2C19基因第六号外显子SNP位点的DNA序列引物信息正向引物5’-ACTGGCACAAGACAGGGATG-3’反向引物5’-CAGCTGCGGGCACAGAAAT-3’PCR扩增条件(体系各项试剂除DNA外均由Bio-Asia公司提供)
反应体系总体积为15μl，其中ddH2O 8.8μl灭菌双蒸水10 X Buffer 1.5μl聚合反应缓冲液包含KCl Tris-HCl溶液DMSO 0.6μl2mM dNTP 1.5μl 2mM dNTP溶液10pM正反向引物各 0.9μl5U Taq 0.3μlDNA合成多聚酶10ng DNA 0.5μl10ng人体DNA扩增摸板PCR反应条件94℃3mins；94℃30seconds；64℃30seconds，-0.5℃/CYCLE；72℃1min；14times to 2；30×(94℃ 30seconds；57℃30 seconds；72℃1min；)72℃ 10mins。
测序反应均作正反向，条件如下扩增产物酶纯化法PCR产物2μl加入2μl纯化酶系内含SAP(Shrimpalkal ine phosphatase，碱性磷酸酶)0.15u和Exo-nuclease I(核酸外切酶I)0.75u/ul，37℃30mins，85℃20mins，4℃保存备用。
测序采用ABI Prism BigDye terminator(BDT)cycle sequencing reactionkit(PE Applied Biosystems)，测序总体积为5μl，其中纯化后的PCR产物4μl，BDT 0.5μl，正向或反向引物0.5μl。反应条件是94℃2mins，35X(94℃30seconds，55℃40seconds，60℃1.5mins)，4℃保存备用。
上样前纯化5μl测序产物中加入25μl无水乙醇和3.0mol/L醋酸钠混合液(V∶V＝25∶1)，室温、避光、静置15min，4000rpm/min 45mins，700rpm/min5seconds弃上清；2X(75％Alcohol 25μl，4000rpm/min 10mins，700rpm/min5seconds弃上清)；室温、避光、静置、风干20mins；上样8μl于3100测序仪进行测序。
步骤2SNP的获得对CYP2C19基因进行直接测序。将测定的各样本序列与GenBank数据库CYP2C19基因序列(AY796203)进行比较，从而得出序列的差异。在沈阳中发现了1个样品含有CYP2C19基因第六号外显子SNP(即第905位C→G多态性)，而其它样品的基因型均为CC，只有这1个样品的基因型为CG，基因频率为0.003。经分析发现，该SNP导致第302位氨基酸由Thr(T)→Arg(R)。由于这是不同性质氨基酸的置换，因此，会导致CYP2C19基因第六号外显子所编码的蛋白活性发生改变。
CYP2C19基因CDS及其多态性位点的CDS序列如SEQ NO.1所示(a)序列特征*长度1473碱基对*类型核酸*链型双链(b)反义否(c)最初来源人(d)SEQ ID NO.1核酸序列描述如下1atggatcctt ttgtggtcct tgtgctctgt ctctcatgtt tgcttctcct ttcaatctgg61agacagagct ctgggagagg aaaactccct cctggcccta ctcctctccc agtgattgga121aatatcctac agatagatat taaggatgtc agcaaatcct taaccaatct ctcaaaaatc181tatggccctg tgttcactct gtattttggc ctggaacgca tggtggtgct gcatggatat241gaagtggtga aggaagccct gattgatctt ggagaggagt tttctggaag aggccatttc301ccactggctg aaagagctaa cagaggattt ggaatcgttt tcagcaatgg aaagagatgg361aaggagatcc ggcgtttctc cctcatgacg ctgcggaatt ttgggatggg gaagaggagc421attgaggacc gtgttcaaga ggaagcccgc tgccttgtgg aggagttgag aaaaaccaag481gcttcaccct gtgatcccac tttcatcctg ggctgtgctc cctgcaatgt gatctgctcc541attattttcc agaaacgttt cgattataaa gatcagcaat ttcttaactt gatggaaaaa601ttgaatgaaa acatcaggat tgtaagcacc ccctggatcc agatatgcaa taattttccc661actatcattg attatttccc gggaacccat aacaaattac ttaaaaacct tgcttttatg721gaaagtgata ttttggagaa agtaaaagaa caccaagaat cgatggacat caacaaccct781cgggacttta ttgattgctt cctgatcaaa atggagaagg aaaagcaaaa ccaacagtct841gaattcacta ttgaaaactt ggtaatcact gcagctgact tacttggagc tgggacagag901acaacaagca caaccctgag atatgctctc cttctcctgc tgaagcaccc agaggtcaca961gctaaagtcc aggaagagat tgaacgtgtc gttggcagaa accggagccc ctgcatgcag1021gacaggggcc acatgcccta cacagatgct gtggtgcacg aggtccagag atacatcgac1081ctcatcccca ccagcctgcc ccatgcagtg acctgtgacg ttaaattcag aaactacctc1141attcccaagg gcacaaccat attaacttcc ctcacttctg tgctacatga caacaaagaa1201tttcccaacc cagagatgtt tgaccctcgt cactttctgg atgaaggtgg aaattttaag1261aaaagtaact acttcatgcc tttctcagca ggaaaacgga tttgtgtggg agagggcctg
1321gcccgcatgg agctgttttt attcctgacc ttcattttac agaactttaa cctgaaatct1381ctgattgacc caaaggacct tgacacaact cctgttgtca atggatttgc ttctgtcccg1441cccttctatc agctgtgctt cattcctgtc tgaCYP2C19基因CDS及其多态性位点的氨基酸序列如SEQ NO.2所示SEQ ID NO.2氨基酸序列描述如下(a)序列特征*长度490氨基酸*类型蛋白质(b)反义否(c)最初来源人(d)SEQ ID NO.2核酸序列描述如下1mdpfvvlvlc lscllllsiw rqssgrgklp pgptplpvig nilqidikdv sksltnlski61ygpvftlyfg lermvvlhgy evvkealidl geefsgrghf plaeranrgf givfsngkrw121keirrfslmt lrnfgmgkrs iedrvqeear clveelrktk aspcdptfil gcapcnvics181iifqkrfdyk dqqflnlmek lnenirivst pwiqicnnfp tiidyfpgth nkllknlafm241esdilekvke hqesmdinnp rdfidcflik mekekqnqqs eftienlvit aadllgagte301ttsttlryal llllkhpevt akvqeeierv vgrnrspcmq drghmpytda vvhevqryid361liptslphav tcdvkfrnyl ipkgttilts ltsvlhdnke fpnpemfdpr hfldeggnfk421ksnyfmpfsa gkricvgegl armelflflt filqnfnlks lidpkdldtt pvvngfasvp481pfyqlcfipv本发明实施例中采用的样品包括上海(100例，男女各50例，年龄为18-53岁)、汕头(100例，男女各50例，年龄为18-53岁)、和西安(100例，男女各50例，年龄为18-53岁)，沈阳(100例，男女各50例，年龄为18-53岁)，均为正常人。全体参与者均在正式的知情同意书上同意签字。
对所取样品进行CYP2C19基因的PCR扩增与测序，根据对所取样品CYP2C19基因测序结果，在沈阳中发现了1个样品含有CYP2C19基因第六号外显子SNP(即第905位C→G多态性)，频率为0.003。经分析发现，该SNP导致第302位氨基酸由Thr(T)→Arg(R)。由于这是不同性质氨基酸的置换，因此，会导致CYP2C19基因第六号外显子所编码的蛋白活性发生改变。
CYP2C19基因的第六号外显子的cDNA序列列于SEQ ID NO1，其中开放阅读框为第1-1473位，其所编码的氨基酸序列列于SEQ ID NO2。CYP2C19基因的第六号外显子的基因组序列可以从GenBank中获得。
权利要求
1.一种CYP2C19基因第六号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于包括如下步骤(a)采用Primer 5.0软件，以GenBank数据库CYP2C19基因第六号外显子以及外显子与内含子接合部位序列为模板设计一对等位基因特异性的核酸引物，利用引物对来扩增CYP2C19基因的第六号外显子的DNA序列，对扩增产物进行分离纯化，得到相应分离核酸；(b)检测分离核酸的CYP2C19基因第六号外显子的SEQ ID NO1所示序列的第905位核苷酸是否存在单核苷酸多态性，即C→G多态性。
2.根据权利要求1的CYP2C19基因第六号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于步骤(b)检测多态性时采用的方法包括DNA测序法、杂交测序法；酶促错配切割法、异源双链分析法、点杂交法、寡核苷酸阵列法、微测序法、Taqman技术、分子信标法、变性高效液相色谱法。
3.权利要求1的检测方法的应用，其特征在于用于评估个体患CYP2C19基因的第六号外显子相关疾病的易感性，用于研究我国人群中CYP2C19基因多态性与临床用药安全的关系，用于新药的研究开发。
4.一种分离核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的序列，且第905位为G。
5.一种等位基因特异性的核酸引物，其特征在于，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人CYP2C19基因第六号外显子的SEQ ID NO1所示序列的第905位的单核苷酸多态性的扩增产物。
全文摘要
本发明涉及一种CYP2C19基因第六号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，同时涉及一种分离核酸、一种等位基因特异性的核酸引物。方法包括确定在人CYP2C19基因第六号外显子的SEQ ID NO1所示序列的第905位的核苷酸；检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性；一种分离核酸，具有SEQ ID NO1所示的序列，且第905位为G；一种等位基因特异性的核酸引物，其长度为15－50bp，且特异性地杂交并扩增出含人CYP2C19基因第六号外显子的SEQ ID NO1所示序列的第905位的单核苷酸多态性的扩增产物。本发明可用于研究CYP2C19基因多态性与临床用药安全的关系，为新药研发提供依据。
文档编号C07H21/00GK101063172SQ20071004172
公开日2007年10月31日 申请日期2007年6月7日 优先权日2007年6月7日
发明者秦胜营, 贺林, 陈玲玲, 邢清和 申请人:上海交通大学