胆固醇代谢调控蛋白及其用途的制作方法

专利名称：胆固醇代谢调控蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种胆固醇代谢调控蛋白， 所述蛋白可制备调节胆固醇代谢的药物或作为筛选调节胆固醇药物的耙点。
背景技术：
体内高水平胆固醇如高胆固醇血症可直接导致动脉粥样硬化，是中风和冠 心病的主因；老年痴呆症、肥胖症、糖尿病等的发生也与胆固醇代谢紊乱密切 相关。随着人们饮食结构变化及社会老龄化，胆固醇代谢紊乱引起的心血管病、 老年痴呆症等的发生越来越多，迫切需要研发调节胆固醇代谢的药物。
胆固醇是一种重要的甾醇类分子，广泛存在于生物界，它是生物膜的关键 组分，同时也是胆汁酸、甾醇类激素和一些维生素合成的唯一前体，并参与了 许多重要的信号转导途径。胆固醇代谢异常会直接导致严重疾病的发生，如 动脉粥样硬化(是心血管疾病、中风的主因)、阿尔海默氏疾病及胆结石等。因 此研究胆固醇的代谢平衡具有重要的科学意义和广泛的医用价值。
细胞内胆固醇的合成，是以乙酰辅酶A为原料，经过约30步连续的酶促 反应最终合成胆固醇。这一过程受到严格的调控，其中主要的限速反应是由羟 甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)至甲羟戊酸(Mevalonate)这一步，催化这一反应的 是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG CoA reductase, HMGCR)。羟甲基戊二酰辅 酶A还原酶在多种水平上受到细胞内胆固醇的反馈调控，在转录水平，转录因 子月旦固醇调节序歹廿结合蛋白(Sterol regulation element binding protein, SREBP)调控羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的启动子活性；在蛋白水平，甾醇 促进羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解而减少自身胆固醇的合成。宋保亮博士等 研究发现，甾醇调控的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解是通过泛素-蛋白酶体 途径；鉴定出胆固醇合成中间体Lanosterol是特异性促进羟甲基戊二酰辅酶A 还原酶蛋白降解的内源调节小分子；并发现了该降解途径特异的泛素连接酶 gp78和降解关键蛋白VCP。
综上可见，胆固醇的合成是一个复杂的途径，尽管对该途径已经有了一定 的了解，然而还有必要进行进一步的研究，从而找到胆固醇代谢调节的良好耙点。

发明内容
本发明的目的在于提供一种胆固醇代谢调控蛋白一一泛素融合降解蛋白1 (Ubiquitin fusion degradation 1， Ufdl) 及其应用。
在本发明的第一方面，提供泛素融合降解蛋白1 (Ufdl)或其拮抗剂或激动 剂的用途，用于制备调节胆固醇代谢的制剂或组合物。 在另一优选例中，所述的泛素融合降解蛋白1选自
(1) SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列的蛋白；或
(2) 将SEQIDNO: 1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的，且具有调节细胞胆固醇代谢功能的由(l)衍生的蛋白。
在另一优选例中，所述的泛素融合降解蛋白1是(3)保留SEQIDNO: 1 中第258-275位氨基酸所示的gp78结合域的蛋白；和/或保留SEQ ID NO: 1中 第92-93位氨基酸或SEQ ID NO: 1中第81-85位氨基酸的蛋白。
在本发明的第二方面，提供一种筛选调节胆固醇代谢的物质的方法，所述方 法包括步骤
(a) 将泛素融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78相互作用的体系和候选物质 进行接触；
(b) 观察候选物质对于泛素融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78相互作用的 影响；
其中，若所述候选物质可促进泛素融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78相互 作用，则表明该候选物质是降低细胞胆固醇水平的潜在物质；若所述候选物质 可抑制泛素融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78相互作用，则表明该候选物质 是提高细胞胆固醇水平的潜在物质。
在另一优选例中，步骤(a)包括在测试组中，将候选物质加入到泛素融合 降解蛋白1与泛素连接酶gp78相互作用的体系中；和/或
步骤(b)包括检测测试组的体系中泛素融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78
相互作用，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的泛素 融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78相互作用的体系；
如果测试组中泛素融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78相互作用在统计学上
强于(优选显著强于，如强20%;更优选的强40%或更强)对照组，就表明该候 选物是降低细胞胆固醇水平的潜在物质；如果测试组中泛素融合降解蛋白l与 泛素连接酶gp78相互作用在统计学上弱于(优选显著弱于，如弱20%;更优选 的弱40%或更弱)对照组，就表明该候选物是提高细胞胆固醇水平的潜在物质。 在另一优选例中，所述体系中还含有羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，并且所 述方法还包括步骤观察体系中羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化情况或降 解情况；
如果羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化或降解加速，就表明该候选物质 是降低细胞胆固醇水平的潜在物质；如果羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化 或降解减缓，就表明该候选物质是提高细胞胆固醇水平的潜在物质。
在另一优选例中，所述的泛素融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78相互作用 的体系是含有泛素融合降解蛋白l和泛素连接酶gp78的细胞；或是含泛素融 合降解蛋白1和泛素连接酶gp78的溶液。
在另一优选例中，还包括步骤
观察细胞的低密度脂蛋白(LDL)内吞情况；
如果细胞的低密度脂蛋白内吞加速，就明该候选物质是降低细胞胆固醇水平 的潜在物质；如果细胞的低密度脂蛋白内吞减缓，就明该候选物质是提高细胞 胆固醇水平的潜在物质。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤对获得的潜在物质进行进一步的 细胞实验和/或动物试验，以选出对于调节胆固醇代谢的物质。
在另一优选例中，所述的泛素连接酶gp78选自(A)SEQIDNO:2所示的 氨基酸序列的蛋白；或(B)将SEQIDNO:2所示氨基酸序列经过一个或多个氨 基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有泛素连接酶活性的由(A)衍生 的蛋白；或(3)保留SEQIDNO:2中第383-497位氨基酸所示的Ufdl结合域的 蛋白。
在本发明的第三方面，提供一种泛素融合降解蛋白l(Ufdl)的用途，用于: (a)制备增强泛素连接酶gp78活性的组合物；
(b)制备促进羟甲基戊二酰辅酶A还原酶泛素化的组合物； (C)制备促进羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解的组合物；
(d) 制备促进低密度脂蛋白内吞的组合物；和/或
(e) 制备降低细胞胆固醇水平的组合物。
在本发明的第四方面，提供一种体内或体外调节胆固醇代谢的方法，所述方 法包括调节细胞内泛素融合降解蛋白1的表达或活性，或调节细胞内泛素融
合降解蛋白1与泛素连接酶gp78的相互作用。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易 见的。


图1显示了 Ufdl与gp78的免疫共沉淀实验，证明了 gp78与Ufdl可发生
相互结合。
图2显示了在细胞内过表达全长或缺失部分序列的Ufdl蛋白与gp78进行 免疫共沉淀实验的结果。
图3显示了过表达Ufdl显著促进羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化。
图4显示了过表达Ufdl加速羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的降解。
图5显示了在单体泛素结合位点上序列发生突变的Ufdl转染细胞后，可明 显阻碍羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化。
图6显示了在单体泛素结合位点上序列发生突变的Ufdl转染细胞后，可明 显阻碍羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的降解；在多聚泛素结合位点上序列发生突 变的Ufdl转染细胞后，可明显阻碍羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的降解。
图7显示了在中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达Ufdl，导致羟甲基戊二酰辅酶A 还原酶蛋白量下降，成熟型胆固醇调节序列结合蛋白增加。
图8显示了在中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达Ufdl，细胞对LDL的吸收明显 增加。
具体实施例方式
本发明人经过深入的研究，首次发现泛素融合降解蛋白1 (Ubiquitin
fusion degradation 1， Ufdl)通过增强gp78的泛素连接酶活性，加速羟甲 基戊二酰辅酶A还原酶(画GCR)的泛素化与降解，参与调节细胞胆固醇代谢。 以该蛋白为靶点，可以筛选新型降胆固醇药物。
本发明鉴定出了 Ufdl作为泛素连接酶gp78的共作用因子，证明了 Ufdl与 gp78直接相互作用，确定了 Ufdl与gp78相互结合所必须的氨基酸序列，证明 Ufdl与gp78的结合能够促进羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化以及蛋白酶 体介导的降解，并减少细胞内源胆固醇合成，确定了 Ufdl参与促进羟甲基戊 二酰辅酶A还原酶泛素化和降解的氨基酸序列。利用本发明成果，可为预防或 治疗胆固醇相关疾病(包括高胆固醇血症、动脉粥样硬化、冠心病等)提供有效 的途径。
首先，本发明提供了一种Ufdl蛋白或其激动剂或拮抗剂的用途，用于制备 调节胆固醇代谢的制剂；或筛选调节胆固醇代谢的物质。
Ufdl是一种泛素降解相关蛋白，定位在人染色体22q11上。在本发明中， 所用的Ufdl蛋白可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离自哺乳动物。优 选的，所述天然存在的Ufdl的氨基酸序列可以与SEQIDNO: 1所示的序列基 本上相同。此外，所述的Ufdl蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规 的基因重组技术来生产重组的Ufdl蛋白。
本发明还包括Ufdl蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片 段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的Ufdl蛋白相同的生 物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是有一个或 多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，在一 个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或附加的氨基酸序列融合到此多 肽序列而形成的多肽。
本发明也可采用经修饰或改良的Ufdl蛋白，比如，可采用为了促进其半衰 期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的Ufdl蛋白。也即，任 何不影响Ufdl蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。
作为本发明的一种方式，所述的Ufdl蛋白的活性片段是保留SEQ ID NO: 1 中第258-275位氨基酸所示的gp78结合域的蛋白；更优选的，所述的Ufdl蛋白 的活性片段是保留SEQ ID NO: 1中第92-93位氨基酸或SEQ ID NO: 1中第81-85 位氨基酸结合域的蛋白，其中，SEQ ID NO: 1中第92-93位氨基酸位点与羟甲
基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化相关，SEQ ID NO: 1中第8卜85位氨基酸位点与 羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的降解相关。
所述的Ufdl蛋白可在体内或体外通过直接或间接的方式施用于哺乳动物 (比如人)，从而通过促进gp78蛋白的活性，加速羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的 泛素化与降解，降低细胞胆固醇水平。
所述的Ufdl是泛素连接酶gp78的共作用因子。Ufdl通过与gp78相互作用， 增强gp78的泛素连接酶活性，加速羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化或降解， 从而降低细胞内的胆固醇水平。
gp78是一种糖蛋白。在本发明中，所用的gp78蛋白可以是天然存在的，比 如其可被纯化和分离自哺乳动物。优选的，所述天然存在的gp78的氨基酸序 列可以与SEQIDNO:2所示的序列基本上相同。此外，所述的gp78蛋白也可 以是人工制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的gp78蛋白。
本发明还包括gp78蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片 段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持全长gp78蛋白相同的生物学功 能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是有一个或多个保 守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，在一个或多 个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或附加的氨基酸序列融合到此多肽序列 而形成的多肽。
本发明也可采用经修饰或改良的gp78蛋白，比如，可采用为了促进其半衰 期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的gp78蛋白。也即，任 何不影响gp78蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。
作为本发明的一种方式，所述的gp78蛋白的活性片段是保留SEQ ID N0: 2 中第383-497位氨基酸所示的Ufdl结合域的蛋白。
基于本发明的新发现，Ufdl蛋白与gp78蛋白相互作用的硏究有着多方面的 用途，所述的用途包括(但不限于)筛选调节(促进或抑制)Ufdl蛋白与gp78 蛋白相互作用的调节剂(促进剂或抑制剂)、从而用于制备调节细胞胆固醇代谢 的药物等。
本发明还提供了一种筛选调节胆固醇代谢的物质的方法，所述方法包括将
候选物质与Ufdl蛋白与gP78蛋白相互作用的体系接触；观察候选物质对于 Ufdl蛋白与gP78蛋白相互作用的影响；其中，若所述候选物质可促进Ufdl
蛋白与gp78蛋白相互作用，则表明该候选物质是降低细胞胆固醇水平的潜在 物质；若所述候选物质可抑制Ufdl蛋白与gp78蛋白相互作用，则表明该候选 物质是提高细胞胆固醇水平的潜在物质。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到Ufdl蛋白与gp78 蛋白相互作用的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选 物质的Ufdl蛋白与gp78蛋白相互作用的体系。
此外，由于Ufdl蛋白与gp78蛋白相互作用可影响到羟甲基戊二酰辅酶A 还原酶的泛素化或降解，因此，在进行筛选时，还可进一步观察体系中羟甲基 戊二酰辅酶A还原酶的泛素化情况或降解情况；如果羟甲基戊二酰辅酶A还原 酶的泛素化或降解加速，就表明该候选物质是降低细胞胆固醇水平的潜在物 质；如果羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化或降解减缓，就表明该候选物质
是提高细胞胆固醇水平的潜在物质。
此外，由于Ufdl蛋白与gp78蛋白相互作用还可影响到细胞的低密度脂蛋 白(LDL)，因此，在进行筛选时，还可进一步观察细胞的低密度脂蛋白(LDL) 内吞情况；如果细胞的低密度脂蛋白内吞加速，就明该候选物质是降低细胞胆 固醇水平的潜在物质；如果细胞的低密度脂蛋白内吞减缓，就明该候选物质是 提高细胞胆固醇水平的潜在物质。
当用于筛选时，可以采用全长的Ufdl蛋白或gp78蛋白，也可采用Ufdl蛋 白或gp78蛋白的活性片段，例如，所述的Ufdl蛋白可以是保留SEQIDNO: 1 中第258-275位氨基酸所示的gp78结合域的蛋白；所述的gp78蛋白可以是保 留SEQ ID NO: 2中第383-497位氨基酸所示的Ufdl结合域的蛋白。
这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，可对这些物质进行进一步的细胞 实验和/或动物试验，以便于最终可以从中筛选出能够对于调节胆固醇代谢真 正有用的药物。
因此，本发明还包括一类通过本发明的筛选方法获得的调节胆固醇代谢的调 节剂(Ufdl蛋白与gp78蛋白相互作用的激动剂或拮抗剂)。
目前，己知DNA序列，将该目的DNA序列引入到各种己知DNA分子(如载体)
和细胞中是本领域中的常规技术， 一般人员只要根据本发明的提示，都可以方 便的进行操作。此外，将各种形式的突变引入到各种DNA分子中也是本领域熟 知的技术。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子 和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞也是本领域技术人员熟知的常规技术。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用 CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需 要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转 染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。 获得的转化子可以用常规方法培养，表达目的多肽。
在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种 本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术、噬菌体展示技术、酵母双杂 交系统、荧光共振转移技术或免疫共沉淀技术。
在本发明的一种优选方式中，采用免疫沉淀技术来验证蛋白与蛋白之间的特 异性相互作用。所述的免疫共沉淀技术的原理是在保持蛋白-蛋白相互作用 的条件下，收获和裂解细胞，从细胞提取液中特异性地免疫沉淀目的蛋白，然 后通过电泳等方法分离免疫沉淀物。具有己知特性的蛋白的共沉淀，可采用抗 该蛋白的抗体，通过比如Western印迹来检测。此外，如果细胞在裂解前已经 用标记物进行过标记，则可通过放射自显影或其它免疫学技术来观察共沉淀的 蛋白。
本发明的主要优点在于
本发明通过对Ufdl在羟甲基戊二酰辅酶A还原酶泛素化和降解过程中的作 用研究，首次证明Ufdl通过与gp78的结合，促进了 gp78的泛素化连接酶活 性，加速了胆固醇合成途径限速酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化与降解， 从而参与了对胆固醇代谢平衡的调节。针对Ufdl为靶点设计和筛选药物，通 过调节Ufdl的表达量或Ufdl与gp78的结合或Ufdl的活性，可以调节细胞胆 固醇合成代谢的水平，达到治疗动脉粥样硬化和冠心病等的目的。
依据本发明，可以针对Ufdl与gp78的结合，或Ufdl对羟甲基戊二酰辅酶 A还原酶泛素化及蛋白降解的影响为靶点，筛选新型降胆固醇药物。针对这一 耙点的药物，避免他汀药物只是竞争抑制酶活性而造成羟甲基戊二酰辅酶A还
原酶蛋白代偿性增多的药物剂量增高依赖及其引起毒性等问题，从而为治疗高 胆固醇血症引起的严重疾病(如动脉粥样硬化、冠心病等)提供更好的治疗手 段。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定 义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
I.实验材料和方法 材料
Protein A/G beads: Santa Cruz Biotechnology。
抗体
抗gp78抗体通过常规的多克隆抗体制备方法，由常规方法制备的 GST-gp78(362-643aa)融合蛋白免疫兔子获得。
抗Ufdl抗体购自Carnegie Institution of Washington and Howard Hughes Medical Institute, Baltimore, MD。
抗丽GCR抗体通过常规的多克隆抗体制备方法，由常规方法制备的 GST-HMGCR(347-888aa)融合蛋白免疫兔子获得。
抗Myc抗体购自Roche和Upstate。
抗T7抗体购自Novagen。
抗Ub抗体购自Santa Cruz。
抗HA抗体购自Sigma。
抗Actin抗体购自Sigma。
抗Flag抗体购自Sigraa。
抗SREBP-l抗体购自Santa Cruz。
抗SREBP-2抗体购自Santa Cruz。
二抗贝勾自Jackson ImmunoResearch Laboratories。
MG-132:购自Calbiochem。
25-羟胆固醇购自Steraloids, Inc. (Newport, Rhode Island)。 细胞转染试剂FuGene6:购自Roche。 细胞转染试剂Oligofectamin:购自Invitogen。 Dil:购自Sigma。
去脂蛋白血清常规的超速离心法从胎牛血清中制备。 LDL:常规的超速离心法从人血中制备。 DiI-LDL:常规方法由Dil标记LDL得到。
细胞HEK293购自ATCC; CH0-K1购自ATCC; SV589购自ATCC; CH0-7细 胞购自ATCC。
方法
1.过表达HMGCR， Insig， Ubiquitin， Ufdl， gp78的质粒的构建 以ACGGGATCCATGTTGTCAAGACTTTTTCG (SEQ ID NO: 3) 和 ACGGAATTCGGCTGTCTTCTTGGTGCAAGC (SEQ ID NO: 4)为引物，以常规 方法获得的人基因组cDNA文库为模板，PCR扩增获得HMGCR的基因序列，用 BamHI/EcoRI酶切后连接入经过同样酶切的pCMV-3xT7质粒中，获得在导入细 胞后可表达目的基因HMGCR的表达质粒PCMV-HMG-Red-T7。
其中pCMV-3xT7质粒的构建方法是全基因合成编码3xT7序列的DNA (SEQ ID NO: 12)，同时5'端设置Notl位点，3'端设置XhoI酶切位点，酶切后连 接入经过Notl/Xhol酶切后的pcDNA3质粒(购自Invitrogen)中，获得 pCMV-3xT7质粒。
以ACGGGATCCATGCCCAGATTGCACGACCAC (SEQ ID NO: 5)禾口 ACGGAATTCATCACTATGGGGCTTTTCAGG (SEQ ID NO: 6)为引物，以常 规方法获得的人基因组cDNA文库为模板，PCR扩增获得人Insig-l的基因序列， 用BamHI/EcoRI酶切后连接入经过同样酶切的pCMV-6xMyc质粒中，获得在导 入细胞后可表达目的基因Insig的表达质粒PCMV-Insig-l-Myc。
其中pCMV-6xMyc质粒的构建方法是全基因合成编码6xMyc序列的DNA (SEQ ID NO: 13)，同时5'端设置Notl酶切位点，3'端设置XhoI酶切位点，酶切 后连接入经过Notl/Xhol酶切后的pcDNA3质粒(购自Invitrogen)中，获得 pCMV-6xMyc质粒。
全基因合成编码HA-泛素序列(即HA与人泛素融合蛋白，其中HA序列在人 泛素序列的5'端，中间加入6个氨基酸长度的连接序列，具体序列如SEQIDNO: 14所示)的DNA，同时5'端设置NcoI酶切位点，3'端设置Notl酶切位点，酶切 后连接入经过NcoI/Notl酶切后的pEF/myc/cyto质粒(购自Invitrogen)中，获得 pEF-HA-泛素质粒。
AACATGTTCGAC (SEQ ID NO: 7)和ACGCTCGAGCCAATCAGCCAACA GTCCTCAC (SEQ ID NO: 8)为引物，以常规方法获得的人基因组cDNA文库为 模板，PCR扩增获得Flag-Ufdl的基因序列(其中Flag序列来源于5'端引物所含编 码Flag的序列)，用BamHI/XhoI酶切后连接入经过同样酶切的pCDNA3载体 (Invitrogen)中，获得在导入细胞后可表达目的基因Uf dl的表达质粒 PCMV-FLAG-Ufdl 。
以ACGAAGCTTATGCCGCTGCTCTTCCTCGAG (SEQ ID NO: 9)禾口 ACGGGATCCGGAGGTCTGCTGCTTCTGAAGC (SEQ ID NO: 10)为引物， 以常规方法获得的人基因组cDNA文库为模板，PCR扩增获得gp78的基因序列， 用HindlII/BamHI酶切后连接入经过同样酶切的pCMV-5xMyc质粒中，获得在导 入细胞后可表达目的基因gp78的表达质粒pCMV-gp78-Myc。
其中pCMV-5xMyc质粒的构建方法是全基因合成编码5xMyc序列(SEQ ID NO: 15)的DNA，同时在5'端设置Notl酶切位点，在3'端设置XhoI酶切位点， 酶切后连接入经过Notl/XhoI酶切后的pcDNA3质粒(购自Invitrogen)中，获得 pCMV-5xMyc质粒。
表达Ufdl缺失突变体的载体的构建如下
采用StrataGene公司的QuickChange定点突变试齐!J盒(StrataGene QuickChange Site-directed Mutagenesis Kit),以pCMV-FLAG-Ufdl质粒为模板分 别制备缺失8-119位，120-214位，215-302位，216-241位，242-257位，258-275 位，276-307位氨基酸的Ufdl缺失突变体(A8-119, A120-214， A215-302， △ 216-241， A242-257， A258-275， A276-307)，获得在导入细胞后可表达相应
的缺失突变体的载体。
表达gp78缺失突变体的载体的构建如下
采用StrataGene公司的QuickChange定点突变试齐!j盒(StrataGene QuickChange Site-directed Mutagenesis Kit),以pCMV-gp78-Myc为模板分别制备 缺失8-119位，7-308位，309-382位，383-578位，579-638位，341-382位，383-455 位，456-497位，498-578位，309-643位氨基酸的gp78缺失突变体(A7-308， △ 309-382， △ 383-578， △ 579-638， △ 341-382， △ 383-455， A456-497， A 498-578， A309-643 )，获得在导入细胞后可表达相应的缺失突变体的载体。
PCMV-FLAG-Ufdl(PB Mut)的构建如下 采用StrataGene公司的QuickChange定点突变试剂盒(StrataGene QuickChange Site-directed Mutagenesis Kit),以pCMV-FLAG-Ufdl质粒为模板 制备第S1位甘氨酸，第82位缬氨酸，第83位亮氨酸，第84位谷氨酸，第85 位苯丙氨酸同时突变为丙氨酸的Ufdl突变体(PCMV-FLAG-Ufdl(PB Mut))，获 得在导入细胞后可表达相应的缺失突变体(即多聚泛素结合位点发生序列突变) 的载体。
PCMV-FLAG-Ufd 1 (MB Mut)的构建如下 采用StrataGene公司的QuickChange定点突变试剂盒(StrataGene QuickChange Site-directed Mutagenesis Kit),以pCMV-FLAG-Ufdl质粒为模板 制备第92位半胱氨酸，第93位酪氨酸同时突变为丙氨酸的Ufdl突变体 (PCMV-FLAG-Ufdl(MB Mut))，获得在导入细胞后可表达相应的缺失突变体(即 单体泛素结合位点发生序列突变)的载体。
2.免疫共沉淀实验
收集未处理细胞或转染了可表达gp78、 Ufdl或它们的片段的质粒的细胞 并裂解于0.5 ml裂解缓冲液(PBS + 0.1% NP-40 + 5 mM EGTA + 5mM EDTA + 20 亮肽素+ 25 )ug/ml ALLN + 5 jug/ml抑肽素A + 2 jag/ml抑肽酶)。100000 g 4r离心10分钟，转移上清并加入交联抗gP78的抗体(图l)或抗Flag的抗体 (图2)的琼脂糖颗粒。于4'C中混匀4小时后用裂解缓冲液洗5次。用O. 1 M
PH2. 9的醋酸-醋酸纳缓冲液洗脱。分别用免疫沉淀后的上清(IP-sup.)与酸洗 脱液(IP-Pellet)进行电泳，用抗Ufdl与抗gp78的抗体(图1)，或抗Flag与 抗Myc的抗体(图2)分别进行Western Blot检测。
3. 泛素化实验
细胞培养于含去脂血清的培养基中，分别转染可表达HMGCR， Insig-l， 泛素，Ufdl的质粒(pCMV-HMG-Red-T7、 pCMV-Insig-l-Myc、 pEF-HA-泛素、 pCMV-FLAG-Ufdl)。转染6小时后在培基中加入至终浓度10 的Compactin (美伐他汀，购自Sigma)，及10(^M的甲羟戊酸。16小时后，细胞换液，加入 蛋白酶体抑制剂10 MG-132和无水乙醇(对照)或1 i!g/ml25-羟胆固醇 (25-HC)处理。3小时后收集细胞并裂解于0.5 ml裂解液(PBS + 1% NP-40 + 1% 去氧胆酸纳+ 5 mM EGTA + 5 mM EDTA + 20 亮肽素+ 25 pg/ml ALLN + 5 貼/m抑肽素A + 2 jug/ml抑肽酶)。100000 g 4°C离心10分钟，转移上清并加 入交联T7抗体的琼脂糖颗粒(Novagen)。于4"中混匀4小时后，1000 g4。C离 心5分钟，取出120nl上清，加入40(il4x上样缓冲液，即得到免疫沉淀反应 的上清蛋白样品。弃取其余上清，用裂解缓冲液洗5次。加入lx上样缓冲液， 95'C温浴处理10分钟，离心取出上清，即得到免疫沉淀反应的沉淀蛋白样品。
将上清蛋白电泳并用抗Flag的抗体Western Blot检测Flag-Ufdl蛋白。将 沉淀蛋白电泳并分别用抗HA的抗体Western Blot检测泛素(HA-泛素)蛋白， 用抗T7的抗体Western Blot检测羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(羟甲基戊二酰辅 酶A还原酶-3xT7)蛋白。
4. 降解实验
细胞培养于含去脂血清的培养基中，转染可表达HMGCR， Insig， Ufdl 的质粒(pCMV-HMG-Red-T7、 pCMV-Insig-l-Myc、 pCMV-FLAG-Ufdl)，或转 染可表达Ufdl突变体的质粒。转染6小时后在培基中加入至终浓度lOpM的 compactin，及10pM的甲羟戊酸。16小时后，细胞换液，加入无水乙醇(对照) 或1吗/ml 25-羟胆固醇及10mM甲羟戊酸处理。5小时后收集细胞并裂解于120 lLil裂解液(50 mM TrisHCl pH8.0 + 150 mM NaCl + 0.1% SDS + 1.5% NP-40 + 0.5%去氧胆酸纳+ 2 mM MgCl2 + 20 jliM亮肽素+ 25 pg/ml ALLN + 5 |ug/ml 抑肽素A + 2吗/ml抑肽酶)。利用相应的抗体进行Western Blot检测。
5. 荧光LDL吸收试验
CHO-7细胞培养于含去脂血清的培养基中，加入终浓度10 pg/ml的 DiI-LDL。 37。C培养2小时。弃去培基用PBS洗3次，多聚甲醛固定，Hochest 染核，封片。
6. RNA干扰实验
SV587细胞培养于DMEM+10。/。胎牛血清的培养基中。RNA干扰试验时， 将培养基弃去，每个60 mm培养皿中加入1.6 ml无血清的DMEM培养基。取 24 pl DMED，加入6 fil Oligofectamin (Invitrogen)，混匀后室温静置10分钟。 取350 pl DMEM，加入20 pl合成的针对Ufdl的siRNA(靶序列为 CAUUACCUAUCCCAUGCUG (SEQ ID NO: ll))。将以上两溶液混匀，室温静置20分 钟。加入细胞中。细胞培养6小时后加入1 ml DMEM+30y。胎牛血清的培养基。
7. 瞬时转染实验
CH0-K1细胞培养于F12/DMEM+5。/。胎牛血清的培养基中。瞬时转染实验 时，取194 pl F12/DMEM，加入6 pl FuGene6 (Roche)，混匀后室温静置5分钟。 加入需转染的重组质粒，混匀后室温静置15分钟。加入细胞中。
8. 中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达Ufdl
CHO-K]细胞培养于F12/DMEM+5。/。胎牛血清的培养基中。瞬时转染 Flag-Ufdl质粒，转染一天后，细胞换成含1 mg/ml G418的M19培养基中培养。 细胞培养10天，每2-3天换一次培养基。套圈法挑出单克隆化的细胞，在含 0.2mg/mlG418的M19培养基中培养，用于实验。
II.具体实施例
实施例1 Ufdl与gp78直接相互作用
将HEK293细胞于裂解缓冲液中裂解，加入交联有抗gp78抗体的 ProteinA/G琼脂糖颗粒，CC旋转混匀4小时免疫沉淀(IP)内源的gp78，用裂 解缓冲液洗涤琼脂糖颗粒5次，再用0. 1 M pH2. 9的醋酸-醋酸纳缓冲液洗脱， 酸洗脱液中即包含与gp78结合的蛋白，通过质谱分析鉴定出数个gp78结合蛋
白，其中包括Ufdl。目前尚未有任何报道Ufdl与泛素连接酶的直接相互作用。
裂解HEK293细胞获得服K293细胞裂解液，加入交联有T7抗体的琼脂糖 颗粒(作为对照组，购自Novagen)或交联有抗gp78抗体的琼脂糖颗粒，4'C旋 转混匀4小时，免疫沉淀内源gp78。用裂解缓冲液洗涤琼脂糖颗粒5次，再用 0.1 M pH2.9的醋酸-醋酸纳缓冲液洗脱。分别用免疫沉淀后的上清(IP-Sup.) 与酸洗脱液(工P-Pellet)进行电泳，用抗Ufdl与抗gp78.的抗体分别Western Blot检测。如图1所示，酸洗脱液中存在内源gp78同时也存在Ufdl，而对照 组酸洗脱液中不存在gp78同时也不存在Ufdl，因此可见，gp78与Ufdl的结 合
瞬时转染结合免疫共沉淀实验发现沉淀Ufdl，可以检测到gp78，而另 一个定位在内质网的跨膜泛素连接酶Hrdl则检测不到，表明Ufdl与gp78的 相互作用具有特异性。原核表达的gp78与Ufdl结合，证明两者间是直接的相 互作用。
因此可见，Ufdl可与gp78发生直接相互作用，是gp78的共同作用因子。 实施例2相互结合的位点
将编码全长或一系列缺失突变的pCMV-gp78-Myc质粒分别与 pCMV-FLAG-Ufdl质粒共转染CH0-K1细胞，利用交联有抗Myc抗体的琼脂糖 颗粒免疫沉淀全长或缺失突变的gp78-5xMyc之后Western Blot检测 Flag-Ufdl，发现gp78的第383-497氨基酸区段对于与Ufdl的结合是必需的， 把这一段缺失之后，Ufdl就不再与gp78相结合。而全长或缺失其他部分的gp78 仍与Ufdl相结合。
另外，将编码全长或一系列缺失突变的pCMV-FLAG-Ufdl质粒分别与 pCMV-gp78-Myc质粒共转染CHO-Kl细胞，利用交联有抗Flag抗体的琼脂糖 颗粒免疫沉淀全长缺失突变的Flag-Ufdl之后Western Blot检测gp78_5xMyc， 结果发现Ufdl的第258-275氨基酸区段对于与gp78的结合是必需的，把这一 段缺失之后，Ufdl就不再与gp78相结合，而全长或缺失其他部分的Ufdl仍与 gp78结合，见图2。
因此可见，gp78的第383-497个氨基酸与Ufdl的第258-275个氨基酸对 于Ufdl与gp78的结合是必需的。
实施例3 Ufdl促进羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化降解
利用RNA干扰(RNAi)的方法，降低内源Ufdl蛋白表达，处理细胞，利用 抗羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的抗体免疫沉淀羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，分 析其泛素化修饰。发现，当Ufdl表达下降，甾醇调控的羟甲基戊二酰辅酶A 还原酶的泛素化明显减弱。
利用瞬时转染实验发现，过表达Ufdl显著促进羟甲基戊二酰辅酶A还原 酶的泛素化，并呈剂量依赖关系，见图3。
因此可见，Ufdl促进羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化与降解。
同时，过表达Ufdl加速羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的降解(图4)。转染全 长Ufdl显著增强羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化，而将Ufdl与gp78结 合所必需的268-275氨基酸的序列缺失，Ufdl则失去了增强羟甲基戊二酰辅酶 A还原酶的泛素化的作用。同样，全长Ufdl加速羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降 解；相反，将Ufdl与gp78结合所必需的268-275氨基酸的序列去除，Ufdl就 失去了加速羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的降解的作用。
实施例4 Ufdl蛋白结合单体泛素或多聚泛素的功能
用携带单体泛素结合位点序列突变(即第92位半胱氨酸，第93位酪氨酸 同时突变为丙氨酸的Ufdl突变体)的Ufdl表达载体(pCMV-FLAG-Ufdl(MB Mut)质粒)转染细胞，与对照(未转染Ufdl或转染全长的Ufdl)相比，明显阻 碍羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化和降解的作用，见图5和图6。用携带 多聚泛素结合位点序列突变的Ufdl(即第81位甘氨酸，第82位缬氨酸，第83 位亮氨酸，第84位谷氨酸，第85位苯丙氨酸同时突变为丙氨酸)的表达载体 (pCMV-FLAG-Ufdl(PB Mut))转染细胞，该Uf dl突变体仍然促进羟甲基戊二酰 辅酶A还原酶的泛素化，但阻碍羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的降解。
因此可见，Ufdl蛋白结合单体泛素促进羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素 化，Ufdl蛋白结合多聚泛素促进多聚泛素化的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解。
实施例5过表达Ufdl可以提高细胞对低密度脂蛋白的内吞
在中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达Ufdl，导致羟甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋
白量下降；并且调节胆固醇代谢相关酶表达的转录因子-成熟型胆固醇调节序
列结合蛋白1和2(n-SREBP-1与n-SREBP-2)增加，见图7。
当过表达Ufdl后，细胞对LDL的吸收明显增加，从而反映了 LDL受体(LDLR)
的增加，如图8所示。
在人成纤维细胞中通过RNAi降低内源Ufdl表达，细胞对LDL的吸收减少。 因此可见，过表达Ufdl可以提高细胞对低密度脂蛋白(LDL)的内吞。
实施例6筛选药物
以HEK293细胞为受试对象，用免疫沉淀的方法分别检测候选物质刺激前 后的HEK293细胞中内源Ufdl与gp78的相互作用情况，基本方法如实施例1。 测试组添加候选物质的HEK293细胞； 对照组不添加候选物质的服K293细胞。
利用免疫共沉淀法观察测试组和对照组的HEK293细胞内Ufdl与gp78的 相互作用。如果与对照组相比，测试组中的HEK293细胞中Ufdl与gp78的相 互作用加强，则说明该候选物质是可加强gp78的活性，促进羟甲基戊二酰辅 酶A还原酶泛素化或降级，从而降低胆固醇的物质。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110〉中国科学院上海生命科学研究院
<120〉胆固醇代谢调控蛋白及其用途
<130〉 074450
<160〉 15
<170〉 Patentln version 3. 3
〈210〉 <211> <212〉 <213>
1
307 PRT 智人
<400> 1
Met 1
Asn
Gly
Pro
Met
65
Gly
Trp
Glu
Ser
Ala 45 Asn
Asp
Ala
Ser
Phe 225 Gly
Phe
Arg
Pi-o
Pro
50
Leu
Val
Met
Ser
Pro 130 Leu
Tyr
Lys
Pro
Thr 210 Arg
Val
Ser
Phe
Asn
35
Ser
Phe
Leu
Met
Val 115 Asp
Arg
Asn
Ala
I>eu 195 Glu
Ala
Glu
(Homo Sapiens)
Phe
Ser
20
Asp
Ala
Lys
Glu
Gin 100 Asn
Phe
Asn
Glu
Val 180 Gly
Gly
Phe
Pro
Asn 5
Thr
Arg
Leu
Leu
Phe
85
Asn
Leu
Leu
Phe
L_ys 165 Ser
Tyr
Glu
Ser
Ser 245
Met Gin
Ser
Asp
Thr
70
Val
Leu
Gin
Asp
Ala 150 lie
lie
Lys
Ala
Gly 230 Pro
Phe
Tyr
Asp
Gin
55
Asn
Ala
Leu
Val
lie 135 Cys
Tyr
lie
Glu
Asp 215 Ser
Ser
Asp
Arg
Val
40
Leu
Lys
Asp
Leu
Ala 120 Thr
Leu
Glu
Glu
Pro 200 His
Gly
Pro
His
Cys
25
Glu
Ser
Asn
Glu
Glu 105 Thr
Asn
Thr
Leu
Cys 185 Glu
Ser
Asn
lie
Pro lie 10
Phe Ser
Lys Gly
Arg Leu
Ser Asp
75 Gly lie 90
Glu Gly
Tyr Ser
Pro Lys
Thr Gly 〗55 Arg Val 170
Asp Met
Arg Gin
Gly Tyr
Arg Leu 235 Lys Pro 250
Pro Arg
Val Ser
Gly Lys
45 Asn lie 60
Arg Met
Cys Tyr
Gly Leu
Lys Phe 125 Ala Val 140
Asp Val
Met Glu
Asn Val
Val Gin 205 Ala Gly 220
Asp Gly
Val
Met
30
lie
Thr
Thr
Leu
Val 110 Gin
Leu
lie
Thr
Asp 190 His
Phe
15
Leu
lie
Tyr
His
Pro
95
Gin
Pro
Glu
Gin
Ala
Met
Pro
Cys
80
His
Val
Gin
Asn
Glu Lys Gly Asp lie
Ala lie 160 Lys Pro 175
Phe Asp
Glu Glu
Leu Gly
Lys Lys 240 Lys Arg 255Gly lie Pro
Asn Ser Arg 275
Arg Phe Val
290 Arg Lys Pro 305
<210〉2
<211〉643
<212〉PRT
〈213〉智人
<400〉2
Met 1
Tyr
Tyr
Leu
Ala
65
Ser
teu
Ser
Lys
Val 145 Met
Thr
Met
Tyr
Pro
Thr
Arg
Thr
50
Gly
Leu
Val
Glu
Phe 30 Val
Val
Thr
Leu
Thr 210 Leu Val
Leu
Gly
Ala
35
Ala
Gly
Phe
Ala
Arg 115 lie
Met
Gin
Pro
Leu 195 His
Asn 260 Pro
Ala
Tyr Glu Phe
Leu Val Lys
Phe Ser Gly 295
Lys
Lys 280 Glu
(Homo Sapiens)
Leu
Leu
20
Leu
Ser
Pro
Val
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Trp
Leu
Met 訓 Ser
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70
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Leu
Phe
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75
Ala
Phe
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Ala Ala Val
Pro
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Gly
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60
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Cys
Gly
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Gin 140 Val
Leu
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Glu 285 Arg
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Glu
45
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Phe
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lie
30
Pro
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Val
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Val
Leu
Phe
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15
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Asp
Pro
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Leu
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Leu Ser Leu Leu Val
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Ala
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Ala
190
Cys Ser lie Thr Gly
205
Thr Uu Ala Phe Met Ala Ala Glu Ser Leu
215 220 Thr Val Arg Thr Ala His Val lie ILeu Arg Tyr Val lie His 225 230 235 240
Leu Trp Asp Leu Asn His Glu Gly Thr Trp Glu Gly Lys Gly Thr Tyr
245 250 255
Val Tyr Tyr Thr Asp Phe Val Met Glu Leu Thr Leu Leu Ser Leu Asp
260 265 270
Leu Met His His lie His Met Leu Leu Phe Gly Asn lie Trp Leu Ser275 280 285
Met Ala Ser Leu Val lie Phe Met Gin Leu Arg Tyr Uu Phe His Glu
290 295 300
Val Gin Arg Arg .lie Arg Arg His Lys Asn Tyr Leu Arg Val Val Gly 305 310 315 320
Asn Met Glu Ala Arg Phe Ala Val Ala Thr Pro Glu Glu Leu Ala Val
325 330 335
Asn Asn Asp Asp Cys Ala lie Cys Trp Asp Ser Met Gin Ala Ala Arg
340 345 350
Lys Leu Pro Cys Gly His Leu Phe His Asn Ser Cys Leu Arg Ser Trp
355 360 365
Leu Glu Gin Asp Thr Ser Cys Pro Thr Cys Arg Met Ser Leu Asn lie
370 375 380
Ala Asp Asn Asn Arg Val Arg Glu Glu His Gin Gly Glu Asn Leu Asp 385 390 395 400
Glu Asn Leu Val Pro Val Ala Ala Ala Glu Gly Arg Pro Arg Leu Asn
405 410 415
Gin His Asn His Phe Phe His Phe Asp Gly Ser Arg lie Ala Ser 丁rp
420 425 430
Leu Pro Ser Phe Ser Val Glu Val Met His Thr Thr Asn lie Leu Gly
435 440 445
lie Thr Gin Ala Ser Asn Ser Gin Leu Asn Ala Met Ala His Gin lie
450 455 460
Gin Glu Met Phe Pro Gin Val Pro Tyr His Leu Val Leu Gin Asp Leu 465 470 475 480
Gin Leu Thr Arg Ser Val Glu lie Thr Thr Asp Asn lie Leu Glu Gly
485 490 495
Arg lie Gin Val Pro Phe Pro Thr Gin Arg Ser Asp Ser lie Arg Pro
500 505 510
Ala Uu Asn Ser Pro Val Glu Arg Pro Ser Ser Asp Gin Glu Glu Gly
515 520 525
Glu Thr Ser Ala Gin Thr Glu Arg Val Pro Leu Asp Uu Ser Pro Arg
530 535 540
Leu Glu Glu Thr Leu Asp Phe Gly Glu Val Glu Val Glu Pro Ser Glu 545 550 555 560
Val Glu Asp Phe Glu Ala Arg Gly Ser Arg Phe Ser Lys Ser Ala Asp
565 570 575
Glu Arg Gin Arg Met Leu Val Gin Arg Lys Asp Glu Leu Leu Gin Gin
580 585 590
Ala Arg Lys Arg Phe Leu Asn Lys Ser Ser Glu Asp Asp Ala Ala Ser
595 600 605
Glu Ser Phe Leu Pro Ser Glu Gly Ala Ser Ser Asp Pro Val Thr Leu
610 615 620
Arg Arg Arg Met Leu Ala Ala Ala Ala Glu Arg Arg l_eu Gin Lys Gin 625 630 635 640
Gin Thr Ser
<210〉 3 <211> 29 <212〉 DNA
<213〉 人工序列 <220>
<221> misc—feature
<223〉 引物
<400> 3
acgggatcca tgttgtcaag actttttcg 29
<210〉 4
<211〉 30
〈212〉 DNA
<213> 人工序列
〈220〉
<221〉 misc一feature <223〉.引物
<400> 4
acggaattcg gctgtcttct tggtgcaagc 30
<210〉 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature
<223〉 引物
<400> 5
acgggatcca tgcccagatt gcacgaccac 30
<210〉 6
<211> 30
<212> DNA
<213〉 人丁.序列
<220〉
<221〉 misc—feature <223> 引物
<400〉 6
acggaattca tcactatggg gcttttcagg 30
<210> 7 <211〉 57 <212> DNA <213〉 人工序列
<220>
<221〉 misc—feature
<223> 引物
<400〉 7
acgggatcca tggattacaa ggatgacgac gataagttct ctttcaacat gttcgac 57
<210〉 8
<211〉 31
<212〉 DNA
<213> 人工序列
〈220〉
<221> misc_feature
<223〉 引物
<400〉 8
acgctcgagc caatcagcca acagtcctca c 31
<210〉 9
<211〉 30
<212> DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature
〈223〉 引物
<400〉 9
acgaagctta tgccgctgct cttcctcgag
<210〉 10
<211> 31
<212> 隱
<213〉 人工序列
<220>
<22〉misc—feature
<223〉 引物
<400> 10
acgggatccg gaggtctgct gcttctgaag c 3:
<210〉 11 <211> 19
<212〉 腿 <213〉 人工序列
<220>
<221〉 misc—feature <223> 小干扰RNA
<400> 11
cauuaccuau cccaugcug 19
<210〉 12
<211〉 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220〉
<221> misc—feature <223〉 3XT7 DNA序列
<400〉 12
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtggtatgg ctagcatgac tggtggacag 60 caaatgggtg gtatggctag catgactggt ggacagcaaa tgggtggctg a 111
<210> 13
<211〉 219
<212〉 廳
<213〉 人工序列
<220〉
<221> niisc—feature <223〉 6XMyc DNA序列
〈400〉 13
gagcaaaagc tcatttctga agaggacttg aatgagcaaa agctcatttc tgaagaggac 60
ttgaatatcg gcgaacaaaa actcatctca gaagaggatc tgggtggtga gcagaagttg 120
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aatgagcaaa agctcatttc tgaagaggac ttgaattga 219
〈210〉 14
〈211〉 276
<212〉 DNA
〈213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature <223〉 HA-泛素序列
<400〉 14
tatccctatgacgtccccgactatgcctccgctagcctcgagcatatgcagatcttegtc60
aagacgttaaccggtaaaaccataactctagaagttgaatcttccgataccatcgacaac120
gttaagtcgaaaattcaagacaaggaaggcattccacctgatcaacaaagattgatcttt180
gccggtaggcagctcg鄉acggtagaacgctgtctgattacaacat teagagggagtcg240
accttacatcttgtcttaagactaagaggtggttga276
〈210〉 15说明书第24/24页
<211〉 186
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature
<223> 5XMyc DNA序列
<400> 15
gagcaaaagc tcatttctga agaggacttg aatgagcaaa agctcatttc tgaagaggac 60
ttgaatatcg gcgaacaaaa actcatctca gaagaggatc tgggtggtga gcagaagttg 120
atttctgagg aagacctggg cccgcggttc gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 180
aattga 18权利要求
1.泛素融合降解蛋白1或其拮抗剂或激动剂的用途，其特征在于，用于制备调节胆固醇代谢的制剂或组合物。
2. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的泛素融合降解蛋白1选自(1) SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列的蛋白；或(2) 将SEQIDNO: 1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的，且具有调节细胞胆固醇代谢功能的由(l)衍生的蛋白。
3. —种筛选调节胆固醇代谢的物质的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(a) 将泛素融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78相互作用的体系和候选物质 进行接触；(b) 观察候选物质对于泛素融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78相互作用的 影响；其中，若所述候选物质可促进泛素融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78相互 作用，则表明该候选物质是降低细胞胆固醇水平的潜在物质；若所述候选物质可抑制泛素融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78相互作用， 则表明该候选物质是提高细胞胆固醇水平的潜在物质。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括在测试组中，将候选物质加入到泛素融合降解蛋白1与泛素 连接酶gp78相互作用的体系中；禾B/或步骤(b)包括检测测试组的体系中泛素融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78 相互作用，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的泛素 融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78相互作用的体系；其中，如果测试组中泛素融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78相互作用在统 计学上强于对照组，就表明该候选物是降低细胞胆固醇水平的潜在物质； 如果测试组中泛素融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78相互作用在统计学上 弱于对照组，就表明该候选物是提高细胞胆固醇水平的潜在物质。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述体系中还含有羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，并且所述方法还包括步骤观察体系中羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化情况或降解情况； 如果羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化或降解加速，就表明该候选物质是降低细胞胆固醇水平的潜在物质；如果羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化或降解减缓，就表明该候选物质是提高细胞胆固醇水平的潜在物质。
6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的泛素融合降解蛋白1与 泛素连接酶gp78相互作用的体系选自含有泛素融合降解蛋白1和泛素连接酶gp78的细胞；或含泛素融合降解蛋白1和泛素连接酶gp78的溶液。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括步骤观察细胞的低密度脂蛋白内吞情况；如果细胞的低密度脂蛋白内吞加速，就明该候选物质是降低细胞胆固醇水平 的潜在物质；如果细胞的低密度脂蛋白内吞减缓，就明该候选物质是提高细胞胆固醇水平 的潜在物质。
8. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤对获 得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以选出对于调节胆固醇 代谢的物质。
9. 一种泛素融合降解蛋白1的用途，其特征在于，用于(a) 制备增强泛素连接酶gp78活性的组合物；(b) 制备促进羟甲基戊二酰辅酶A还原酶泛素化的组合物； (C)制备促进羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解的组合物；(d) 制备促进低密度脂蛋白内吞的组合物；和/或(e) 制备降低细胞胆固醇水平的组合物。
10. —种体内或体外调节胆固醇代谢的方法，其特征在于，所述方法包括 调节细胞内泛素融合降解蛋白1的表达或活性，或调节细胞内泛素融合降解蛋 白1与泛素连接酶gp78的相互作用。
全文摘要
本发明公开了泛素融合降解蛋白1或其拮抗剂或激动剂的用途，用于制备调节胆固醇代谢的制剂。本发明还公开了利用泛素融合降解蛋白1与泛素连接酶gp78之间的相互作用筛选调节胆固醇代谢的物质的方法。本发明首次揭示泛素融合降解蛋白1通过增强gp78的泛素连接酶活性，加速羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的泛素化与降解，参与调节细胞胆固醇代谢这一机制。以泛素融合降解蛋白1为靶点，可以筛选出新型降胆固醇药物。
文档编号C07K19/00GK101357946SQ20071004454
公开日2009年2月4日 申请日期2007年8月3日 优先权日2007年8月3日
发明者宋保亮, 炜 戚, 剑 曹, 江 王, 缪红华 申请人:中国科学院上海生命科学研究院