专利名称：6′－o－咖啡酰基熊果甙的制备方法
技术领域：
本发明涉及化学领域化合物的分离提取方法，具体的涉及植物天然生理活性物质6′-O-咖啡酰基熊果甙的制备方法。
背景技术：
6′-O-咖啡酰基熊果甙为熊果甙衍生物，化学名称为对羟基苯基6′-O-反式-咖啡酰基-β-D-葡萄糖甙(p-hydroxyphenyl-6′-O-trans-caffeoyl-β-D-glucopyranoside)。该化合物最初从山龙眼科银桦属植物或哈克木属植物的叶中分离得到，对皮肤具有脱色素作用，为水溶性的配糖体类化合物，极性大，分离纯化困难，现有技术的制备该化合物的方法存在分离纯化过程繁琐，得率低等问题，迄今没有工业化批量生产该化合物的制备工艺。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种成本低、得率高、纯度高、制备过程简单易行、生产周期短，易于批量制备和工业化生产6′-O-咖啡酰基熊果甙的制备方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案6′-O-咖啡酰基熊果甙(6′-O-caffeoyl-arbutin)的制备方法，取忍冬科荚蒾属植物或杜鹃花科熊果属植物或越桔属植物或山龙眼科银桦属植物或哈克木属植物或鹿蹄草科鹿蹄草属植物任一种，烘干、粉碎，用含水甲醇或乙醇加热回流提取，或用含水丙酮冷浸提取，提取液经过滤、浓缩、脱脂，残留水液进一步浓缩去除部分水后，室温或4-10℃低温放置析出沉淀，过滤，干燥，得6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品；滤液经大孔吸附树脂柱层析分离，用含水乙醇或甲醇梯度洗脱，收集含有6′-O-咖啡酰基熊果甙的洗脱液，浓缩干燥，得6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品，粗品进一步重结晶，得6′-O-咖啡酰基熊果甙纯品。
上述技术方案中用于提取6′-O-咖啡酰基熊果甙的植物原料为忍冬科荚蒾属植物，如浙皖荚蒾(Viburnum wrightii)，小叶乌饭(V.carlesii)，荚蒾(V.dilatatum)等；杜鹃花科熊果属植物，如Arctostaphylos canescens，A.columbiana，A.nevadensis，A.patula，A.viscida等，越桔属植物，如越桔(Vaccinium vitis-idaea)，笃斯越桔(V.uliginosum)，樟叶越桔(V.dunalianum)等；山龙眼科银桦属植物，如银桦(Grevillea robusta)等，哈克木属植物，如荣华木(Hakea saligna)等；鹿蹄草科鹿蹄草属植物，如日本鹿蹄草(Pyrolajaponica)，圆叶鹿蹄草(P.rotundifolia)等。使用的植物部位包括上述植物的叶、芽、茎、枝、花、果实、种子或全草。
上述技术方案中用于柱层析分离的大孔吸附树脂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂。可以是如SEPABEADS SP825(SP850，SP70，SP207，SP700)，MCI gel CHP20P(75-150um)，Diaion HP20(HP20SS)，XAD-2，XAD-4，D-101，KB-8等。提取物与大孔吸附树脂的重量比为1∶8-15，柱径高比为1∶10-15。
上述技术方案中的重结晶步骤是将6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品用适量水加热溶解后，室温或4-10℃低温放置过夜，将析出的结晶或沉淀用水反复洗涤，或再次进行重结晶，过滤，干燥，得到纯度大于90％的6′-O-咖啡酰基熊果甙纯品。
上述技术方案中6′-O-咖啡酰基熊果甙的干燥方法可用加热干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或微波干燥。
经过上述制备工艺提取分离6′-O-咖啡酰基熊果甙，操作简单可行，产品收率高，纯度大于90％，无有机溶剂的残留，可直接用作为制药或化妆品的天然原料。
本发明制备6′-O-咖啡酰基熊果甙的具体步骤如下(1)植物原料去杂、洗净、烘干、粉碎成粗粉(过20-40目筛)。
(2)将该植物粗粉用80％含水低级醇(可以是甲醇或乙醇)加热回流提取2-3次，每次提取时间为2-3小时，或用80％含水丙酮冷浸提取3-4次，每次提取时间为2-5天，过滤、合并滤液，浓缩、回收溶剂。
(3)残留水溶液经过滤脱脂，再进一步浓缩去除部分水后，室温(或4-10℃低温)下放置析出沉淀，过滤沉淀，干燥得到6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品。
(4)上述滤液浓缩至小体积后缓缓倾入大孔吸附树脂(如DiaionHP20，D-101，KB-8等)层析柱的上端。层析柱的柱径高比为1∶10-15，提取物与大孔吸附树脂的重量比为1∶8-15。以不同浓度的低级醇(可以是甲醇或乙醇)梯度洗脱，收集含6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品。
(5)将6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品用适量水加热溶解后，室温(或4-10℃低温)下放置过夜，析出结晶或沉淀。将结晶或沉淀用水反复洗涤，或再次进行重结晶后，过滤，干燥，得到6′-O-咖啡酰基熊果甙纯品。
(6)6′-O-咖啡酰基熊果甙纯品的干燥，可用加热干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或微波干燥等。
(7)6′-O-咖啡酰基熊果甙的高压液相色谱(HPLC)定量分析按以下的方法进行仪器与试剂HPLC仪器为Alliance高效液相色谱仪，自动进样器，PDA二级管阵列可变波长检测器。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余溶剂均为分析纯。
色谱条件及检测波长的选择用十八烷基硅胶为填充剂(如Agilent ZORBAX C18酸性柱，4.6×150mm)；甲醇∶水(1％HAc)(5∶95→30∶70，线形梯度)为流动相。柱温30℃，流速1ml/min。
实验材料精密称取6′-O-咖啡酰基熊果甙1mg，加1ml甲醇充分振荡溶解后，即得对照品溶液。
色谱条件与系统适用性试验1.用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇∶水(1％HAc)溶液(5-30％，60min)为流动相；检测波长为254nm。柱温30℃。理论板数按6′-O-咖啡酰基熊果甙峰计算应不低于10000。
2.用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇∶水(1％HAc)溶液(0-90％，30min)为流动相；检测波长为254nm。柱温30℃。理论板数按6′-O-咖啡酰基熊果甙峰计算应不低于10000。
3.用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇∶水(1％HAc)溶液(13-30％，30min)为流动相；检测波长为254nm。柱温30℃。理论板数按6′-O-咖啡酰基熊果甙峰计算应不低于10000。
含量测定由上述工艺制备的6′-O-咖啡酰基熊果甙的含量＞90％。
经过上述制备工艺提取分离得到的6′-O-咖啡酰基熊果甙，收率高，产品的纯度大于90％，无有机溶剂的残留，可直接作为制药或化妆品的天然原料。
与现有技术相比，本发明的方法具有下述的优点1、本发明是从忍冬科荚蒾属植物、或杜鹃花科熊果属植物或越桔属植物、或山龙眼科银华属植物或哈克木属植物、或鹿蹄草科鹿蹄草属植物中的任何一种含6′-O-咖啡酰基熊果甙的植物中提取6′-O-咖啡酰基熊果甙。
2、本发明采用含水低级醇(可以是甲醇或乙醇)或含水丙酮为溶剂从植物原料中提取6′-O-咖啡酰基熊果甙，得率高，成本低。
3、本发明采用浓缩水溶液在室温(或4-10℃低温)下放置析出沉淀得到6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品，得率高，成本低。
4、本发明采用薄层层析法作为检测手段，指导柱层析的分离纯化，所得产品的得率高，纯度高。
5、本发明使用的柱层析填充剂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂，填充剂材料可以重复使用。
6、本发明采用水重结晶的方法纯化6′-O-咖啡酰基熊果甙，不仅产品形状好、纯度高、无溶剂残留，而且简单易行、成本低。
具体实施例方式下面以本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1从樟叶越桔(V.dunalianum Wight)的叶中提取6′-O-咖啡酰基熊果甙(1)樟叶越桔叶原料去杂、洗净、烘干、粉碎成过30目筛的粗粉。
(2)上述粗粉8kg用80％的含水乙醇加热回流提取3次，每次提取时间2小时，过滤、合并滤液、减压浓缩、回收溶剂(可用于反复提取)。
(3)残留水液经过滤脱脂后再进一步浓缩去除部分水后，室温(或4-10℃低温)下放置过夜，析出沉淀，经过滤干燥，得6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品452g。
(4)上述滤液进一步浓缩至小体积后，缓缓倾入D101大孔吸附树脂层析柱的上端，提取物与大孔吸附树脂的重量比为1∶8-15，柱径高比为1∶10，以不同浓度的乙醇梯度洗脱。同时，用薄层层析法检测指导洗脱，薄层层析的条件为苯-甲酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，2％的三氯化铁乙醇液为显色剂。收集含有6′-O-咖啡酰基熊果甙的洗脱液，减压浓缩，得到6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品214g。
(5)将6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品用适量水加热溶解后，室温(或4-10℃低温)下放置过夜，析出结晶。反复用水洗涤结晶，过滤，干燥，得到66′-O-咖啡酰基熊果甙564g。
(6)应用HPLC定量分析方法，对得到的6′-O-咖啡酰基熊果甙进行纯度检测，纯度大于90％。
实施例2从樟叶越桔的芽中提取6′-O-咖啡酰基熊果甙(1)樟叶越桔芽原料去杂、洗净、烘干、粉碎成过30目筛的粗粉。
(2)上述粗粉1.77kg用80％含水丙酮冷浸提取3次，每次浸提取时间2天，过滤、合并滤液、减压浓缩、回收溶剂(可用于反复提取)。
(3)残留水液经过滤脱脂后再进一步浓缩去除部分水后，室温(或4-10℃低温)下放置过夜，析出沉淀，经过滤干燥，得6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品316g。
(4)上述滤液进一步浓缩至小体积后，缓缓倾入D101大孔吸附树脂层析柱的上端，提取物与大孔吸附树脂的重量比为1∶8-15，柱径高比为1∶10，以不同浓度的甲醇梯度洗脱。同时，用薄层层析法检测指导洗脱，薄层层析的条件为苯-甲酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，2％的三氯化铁乙醇液为显色剂。收集含有6′-O-咖啡酰基熊果甙的洗脱液，减压浓缩，得到6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品155g。
(5)将6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品用适量水加热溶解后，室温(或4-10℃低温)下放置过夜，析出结晶。反复用水洗涤结晶，过滤，干燥，得到6′-O-咖啡酰基熊果甙390g。
(6)应用HPLC定量分析方法，对得到的6′-O-咖啡酰基熊果甙进行纯度检测，纯度大于90％。
由上述工艺制备的6′-O-咖啡酰基熊果甙的物理常数和光谱数据分子式C21H22O10分子量434结构式 性状淡白色粉末或白色针状结晶；易溶于甲醇、乙醇、丙酮、水。
熔点142-144℃
旋光[α]D22-49.9°(c 0.69，MeOH)红外光谱vmax(KBr)cm-13424(OH)，1680(C＝O)，1625(C＝C)，1600，1505(arom.C＝C)紫外光谱λmax(MeOH)nm(logε)326(4.55)，285(4.23)，240sh(2.83)，217(4.85).
质谱(FAB+-MS)457[M+Na]+，435[M+H]+1H NMR谱(氘代甲醇中，300MHz)δ7.57(1H，d，J＝15.9Hz，H-7″)，7.05(1H，d，J＝1.8Hz，H-2″)，6.94(1H，dd，J＝8.4，1.8Hz，H-6″)，6.93(2H，d，J＝8.7Hz，H-2，H-6)，6.79(1H，d，J＝8.4Hz，H-5″)，6.65(2H，d，J＝8.7Hz，H-3，H-5)，6.28(1H，d，J＝15.9Hz，H-8″)，4.72(1H，d，J＝6.9Hz，H-1′)，4.52(1H，dd，J＝11.7，2.0Hz，H-6′b)，4.34(1H，dd，J＝11.7，6.6Hz，H-6′a)，3.64(1H，ddd，J＝6.9，6.6，2.0Hz，H-5′)，3.46(1H，t，J＝6.9Hz，H-3′)，3.44(1H，t，J＝7.3Hz，H-2′)，3.42(1H，t，J＝6.9Hz，H-4′)。
13C NMR谱(氘代甲醇中，100MHz)δ169.0(C-9″)，153.8(C-1)，152.3(C-4)，149.6(C-3″)，147.2(C-7″)，146.8(C-4″)，127.7(C-1″)，123.1(C-6″)，119.6(C-2，6)，116.6(C-3，5)，116.5(C-5″)，115.0(C-2″)，114.8(C-8″)，103.7(C-1′)，77.8(C-3′)，75.4 C-5′)，74.9(C-2′)，71.7(C-4′)，64.6(C-6′)。
权利要求
1.6′-O-咖啡酰基熊果甙的制备方法，其特征在于取忍冬科荚蒾属植物或杜鹃花科熊果属植物或越桔属植物或山龙眼科银桦属植物或哈克木属植物或鹿蹄草科鹿蹄草属植物任一种，烘干、粉碎，用含水甲醇或乙醇加热回流提取，或用含水丙酮冷浸提取，提取液经过滤、浓缩、脱脂，残留水液进一步浓缩去除部分水后，室温或4-10℃低温放置析出沉淀，过滤，干燥，得6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品；滤液经大孔吸附树脂柱层析分离，用含水乙醇或甲醇梯度洗脱，收集含有6′-O-咖啡酰基熊果甙的洗脱液，浓缩干燥，得6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品，粗品进一步重结晶，得6′-O-咖啡酰基熊果甙纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于取植物的叶、芽、茎、枝、花、果实、种子或全草。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于大孔吸附树脂填充剂选用聚苯乙烯型的大孔吸附树脂，提取物与大孔吸附树脂的重量比为1∶8-15，柱径高比为1∶10-15。
4.根据权利要求1所述的方法，重结晶步骤是将6′-O-咖啡酰基熊果甙粗品用适量水加热充分溶解后，室温或4-10℃低温放置过夜，将析出的结晶或沉淀用水反复洗涤，或再次进行重结晶，过滤，干燥。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于6′-O-咖啡酰基熊果甙的干燥方法可采用加热干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或微波干燥。
全文摘要
一种从植物中提取制备6′－O－咖啡酰基熊果甙(6′－O－caffeoyl－arbutin)的新方法。植物原料的含水低级醇或含水丙酮提取液经过滤，浓缩，脱脂后析出沉淀，得到6′－O－咖啡酰基熊果甙粗品；滤液经柱层析纯化，得到残留在母液中6′－O－咖啡酰基熊果甙粗品。6′－O－咖啡酰基熊果甙粗品用水进一步重结晶，得到6′－O－咖啡酰基熊果甙，纯度大于90％。该方法所得6′－O－咖啡酰基熊果甙得率高，纯度高，制备过程简单易行，生产周期短，易于批量制备和工业化生产。
文档编号C07H13/00GK101066985SQ20071006595
公开日2007年11月7日 申请日期2007年6月14日 优先权日2007年6月14日
发明者赵平, 张颖君, 许敏, 杨崇仁 申请人:中国科学院昆明植物研究所