专利名称：用可挥发氨烷基硅胶合成羟基多肽库的固相合成方法
技术领域：
本发明属固相合成载体及化合物合成，主要涉及用可挥发氨烷基硅胶合成羟基多肽库的固相合成方法。
背景技术：
固相合成由于其独特的快速合成优势，已被广泛应用于组合库的合成。固相合成的基本过程是通过固相树脂的反应基团与反应物结合形成带有此反应物结构的载体，然后在固液多相反应条件下将其他反应物逐一连接到树脂上，最后将目标产物从固相载体上解离下来，通过分离，得到产物。
至今虽有多种材料如聚苯己烯、聚酰、硅胶、玻璃珠和微芯片等可作为固相合成的载体。但目前在所有的固相合成中，无论产物是多肽、有机小分子还是杂环类化合物，其最后一步都必须用切割试剂把产物从固相载体上解离下来，然后用溶剂把产物从消耗的固相载体上多次萃取、过滤，最后蒸发溶剂得到产物。在合成化合物数量较大的组合库时(由几百至几千个化合物组成)，这步骤不仅低效，增加成本，而且在产物转移过程中降低产率，在合成组合库内的化合物以位置扫描法(Positional Scanning)形式合成的混合物形式的化学库(Mixture-based Library)时，由于混合的各化合物在某一特定溶剂中的溶解度不一样，产物洗涤过滤后有时使混合物中各化合物的当量数不一致，导致筛选结果有偏差。所以，开发一种新的固相合成载体用于平行合成和自动化合成化合物组合库具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供用可挥发氨烷基硅胶合成羟基多肽类化合物的固相合成方法，本发明利用一类氨烷基聚硅氧烷类固相合成载体，通过氨基连接臂与氨基酸的羧基结合，通过常规固相合成多肽的策略，逐步延长合成多肽，连接在硅胶上的多肽首先经氢氟酸溶液或氟化氢气体切割，使聚硅氧烷的硅氧键断裂，硅胶溶解并生成四氟化硅气体挥发，然后采用过氧化氢氧化断裂碳硅键，冷冻干燥后直接得到羟基多肽类化合物。
用氨烷基硅胶合成的羟基多肽类化合物的结构通式为
其中n＝2-5m＝0-3R1，R2，R3相同或不同，选自氢，甲基，异丙基，异丁基，苄基，胍基丙基，乙酰氨，丙酰氨，羟基甲基，2-羟基乙基，羧基甲基，羧基乙基，氨基丁基，对羟基苄基。
本发明的氨烷基聚硅氧烷类固相合成载体和羟基多肽衍生物可通过以下步骤制得(1)冰水浴下，正硅酸乙酯中加入一定量水搅拌5-30分钟后，加入三烷氧基氨烷基硅烷，至生成白色沉淀后，继续搅拌0.5-2小时，停止搅拌，陈化24小时，(2)大量水洗涤沉淀，100-130℃下真空加热过夜，(3)再次洗涤，110℃下真空干燥，得到氨烷基硅胶(化合物I)， 其中n＝2-5用 表示上述氨烷基硅胶，氨烷基硅胶选用氨基乙基、氨基丙基、氨基丁基、氨基戊基中的一种。
(4)硅胶过筛，(5)上述氨烷基硅胶(化合物I)与氨基酸(化合物II)，在HOBt(1-羟基苯并三唑)，DIC(N，N′-二异丙基碳二亚胺)，DMF(N，N-二甲基甲酰胺)条件下反应，生成连接在硅胶上的Boc(叔丁氧羰基)保护的氨基酸(化合物III)，用55％TFA(三氟醋酸)脱Boc保护得到化合物IV，(6)化合物IV与氨基酸(化合物II)在HOBt，DIC，DMF条件下反应，生成连接在硅胶上的Boc保护的二肽，用55％TFA(三氟醋酸)脱Boc保护得到连有二肽的硅胶，(7)重复步骤6一次，二次，三次，分别得到连有三肽、四肽、五肽的硅胶(化合物V)，(8)用氢氟酸溶液或氟化氢气体切割连有多肽结构的硅胶(化合物V)，使硅氧键断裂生成四氟化硅气体和水，冷冻干燥后再用H2O2(双氧水)在有机溶剂中氧化断裂碳硅键，有机溶剂可以是醇、DMF、THF(四氢呋喃)等，在20-80℃反应18-40小时，生成羟基多肽类化合物(化合物VI)。
反应过程表示如下 本发明的特点是开发了一种全新的氨烷基聚硅氧烷类固相合成载体，在可分解挥发的固相载体上进行常规的固相有机合成反应合成目标分子，然后采用适当的切割条件分解固相载体为可挥发性的物质、连接剂和产物，真空干燥后直接得到产物，避免了萃取、分离、蒸发溶剂等步骤。本发明方法设计合理，成本低，操作简便，非常适合平行合成和自动化合成化合物组合库以供活性筛选。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步的说明。
实施例12-氨基乙基硅胶的制备20g(mmol)四乙氧基硅烷和4.75克水加入烧杯，在冰水浴下搅拌5分钟，再加入氨基乙基三甲氧基硅烷，搅拌3分钟后生成沉淀。停止搅拌，陈化24小时。过滤，并用大量水洗涤。真空110℃下干燥24小时后，水洗，再次真空110℃下干燥，得到白色的氨基乙基硅胶固体，产率100％。
实施例23-氨基丙基硅胶的制备20g(mmol)四乙氧基硅烷和4.75克水加入烧杯，在冰水浴下搅拌5分钟，再加入氨基丙基三乙氧基硅烷，生成沉淀继续搅拌1小时。停止搅拌，陈化24小时。过滤，并用大量水洗涤。真空110℃下干燥24小时后，水洗，再次真空110℃下干燥，得到白色的氨基丙基硅胶，产率55％。
实施例34-氨基丁基硅胶的制备20.8g(mmol)四乙氧基硅烷和4.75克水加入烧杯，在冰水浴下搅拌8分钟，加入3.9ml 4-氨基丁基三乙氧基硅烷，生成沉淀后继续搅拌1小时。停止搅拌，陈化24小时。过滤，并用大量水洗涤。真空110℃下干燥24小时后，水洗，再次真空110℃下干燥，得到白色的4-氨基丁基硅胶，产率100％。
实施例45-氨基戊基硅胶的制备20.8g(mmol)四乙氧基硅烷和4.75克水加入烧杯，在冰水浴下搅拌10分钟，加入5-氨基戊基三乙氧基硅烷，生成沉淀后继续搅拌1小时。停止搅拌，陈化24小时。过滤，并用大量水洗涤。真空110℃下干燥24小时后，水洗，再次真空110℃下干燥，得到白色的5-氨基戊基硅胶，产率90％。
实施例5C-端(2-羟基乙基氨基)Ala-Phe二肽的制备取按实例1合成的氨基乙基硅胶100mg装入聚丙烯网袋，加入5倍过量的Boc-丙氨酸、HOBt、DIC和DMF，室温下反应2小时后，倒去反应液，用DMF洗涤三次后，加入55％的TFA/DCM(DCM二氯甲烷)，反应30分钟脱去Boc保护基。DCM洗涤，DIEA(二异丙基乙胺)中和后，加入5倍过量的Boc-苯丙氨酸、HOBt、DIC和DMF，室温下反应2小时，即得连接在氨基乙基硅胶树脂上Boc保护的二肽。加入55％的TFA/DCM，反应30分钟脱去Boc保护基，DCM洗涤，DIEA中和后，DCM、CH3OH(甲醇)洗涤。在聚丙烯试管中加入1ml 35％的氢氟酸水溶液，摇床上室温振摇15分钟，使树脂溶解。冷冻干燥后加入1ml DMF和1ml 30％H2O2，室温下反应40小时，冷冻干燥后，即得C-端(2-羟基乙基氨基)Ala-Phe的二肽。经LC-MS分析产物的分子量为279，经HPLC分析产物纯度为92％。
实施例6C-端(3-羟基丙基氨基)Phe-Ala的二肽的制备取按实例2合成的氨基丙基硅胶100mg装入树脂袋，5倍过量的Boc-苯丙氨酸、HOBt、DIC和DMF，加入15ml的反应瓶中，密封后放上摇床，室温振摇2小时后，倒去反应液，用DMF洗涤三次后，加入55％的TFA/DCM，反应30分钟脱去Boc保护基。DCM洗涤，DIEA中和后，加入5倍过量的Boc-丙氨酸、HOBt、DIC和DMF，室温下反应2小时，加入55％的TFA/DCM，反应30分钟脱去Boc保护基，DCM洗涤，DIEA中和后，DCM、CH3OH洗涤。在聚丙烯试管中加入1ml 35％的氢氟酸水溶液，摇床上室温振摇15分钟，使树脂溶解。冷冻干燥后加入1ml THF和1ml 30％H2O2，55℃反应24小时，即得C-端(3-羟基丙基氨基)Phe-Ala二肽。经LC-MS分析产物的分子量为293，HPLC测定产物的纯度为73.7％。
实施例7C端(3-羟基丙基氨基)Ala-Phe-Leu三肽的制备取按实例2合成的氨基丙基硅胶100mg装入聚丙烯树脂袋，5倍过量的Boc-丙氨酸、HOBt、DIC和DMF，加入15ml的反应瓶中，密封后放上摇床，室温振摇2小时后，倒去反应液，用DMF洗涤三次后，加入55％的TFA/DCM，反应30分钟脱去Boc保护基。DCM洗涤，DIEA中和后，加入5倍过量的Boc-苯丙氨酸、HOBt、DIC和DMF，室温下反应2小时，加入55％的TFA/DCM，反应30分钟脱去Boc保护基。再按上述步骤加入Boc-亮氨酸、HOBt、DIC和DMF，室温下反应2小时，DMF、DCM、CH3OH洗涤后，HF气体切割，然后在冰水浴下保温2小时，使硅胶溶解并同时脱去侧链保护基。通氮气吹赶氟化氢气体，待氟化氢气体驱赶完全后，加入1ml乙醇和1ml 30％H2O2，55℃下反应24小时，即得C端(3-羟基丙基氨基)Ala-Phe-Leu三肽。经LC-MS分析产物的分子量为406，经HPLC分析产物纯度为84.7％实施例8C端(4-羟基丁基氨基)Leu-Phe二肽的制备实施例3中制备的树脂100mg装入聚丙烯树脂袋，5倍过量的Boc-亮氨酸、HOBt、DIC和DMF，加入15ml的反应瓶中，密封后放上摇床，室温振摇2小时后，倒去反应液，用DMF洗涤三次后，加入55％的TFA/DCM，反应30分钟脱去Boc保护基。DCM洗涤，DIEA中和后，加入5倍过量的Boc-苯丙氨酸、HOBt、DIC和DMF，室温下反应2小时，倒去反应液，用DMF洗涤三次后，加入55％TFA/DCM，反应30分钟脱去Boc保护基，在-78℃的干冰-丙酮冷阱冷却，5分钟后，通入氟化氢气体。然后在冰水浴下保温2小时，使硅胶溶解并同时脱去侧链保护基。通氮气吹赶氟化氢气体，待氟化氢气体驱赶完全后，加入1ml DMF和1ml 30％H2O2，室温下反应20小时，即得C-端为(4-羟基丁基氨基)Leu-Phe二肽。经LC-MS分析产物的分子量为349，经HPLC分析产物纯度为92％。
实施例9C端(4-羟基丁基氨基)Ala-Arg-Phe三肽的制备实施例3中制备的硅胶100mg密封于树脂包，5倍过量的Boc-丙氨酸、HOBt、DIC和DMF，加入15ml的反应瓶中，密封后放上摇床，室温振摇2小时后，倒去反应液，用DMF洗涤三次后，加入55％的TFA/DCM，反应30分钟脱去Boc保护基。DCM洗涤，DIEA中和后，加入5倍过量的Boc-精氨酸、HOBt、DIC和DMF，室温下反应2小时，加入55％的TFA/DCM，反应30分钟脱去Boc保护基。再按上述步骤，加入5倍过量的苯丙氨酸、HOBt、DIC和DMF，室温下反应2小时，DMF、DCM、CH3OH洗涤后，HF气体切割，然后在冰水浴下保温2小时，使硅胶溶解并同时脱去侧链保护基。通氮气吹赶氟化氢气体，待氟化氢气体驱赶完全后，加入1ml DMF和1ml 30％H2O2，室温下反应24小时，即得C端(4-羟基丁基氨基)Ala-Arg-Phe三肽。经LC-MS分析产物的分子量为463，经HPLC分析产物纯度为92％。
实施例10C端(4-羟基丁基氨基)Ala-Thr-Phe-Leu四肽的制备操作过程同实施例9，在实施例3得到的树脂上依次反应缩合丙氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸后，硅胶置于聚四氟乙烯试管中，在-78℃的干冰-丙酮冷阱冷却，5分钟后，通入氟化氢气体。然后在冰水浴下保温2小时，使硅胶溶解并同时脱去侧链保护基。通氮气吹赶氟化氢气体，待氟化氢气体驱赶完全后，加入1ml DMF和1ml 30％H2O2，室温下反应40小时，即得C端(4-羟基丁基氨基)Ala-Thr-Phe-Leu四肽。经LC-MS分析产物的分子量为521，经HPLC分析产物纯度为76.4％。
实施例11C端(4-羟基丁基氨基)Leu-Phe-Gly-Gly-Trp五肽的制备实施例3中制备的树脂100mg装入聚丙烯树脂袋，按照实施例10中的方法依次在树脂上反应偶合上亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、甘氨酸、酪氨酸，用55％TFA/DCM脱Boc保护后，在-78℃的干冰-丙酮冷阱冷却，5分钟后，通入氟化氢气体。然后在冰水浴下保温2小时，使硅胶溶解并同时脱去侧链保护基。通氮气吹赶氟化氢气体，待氟化氢气体驱赶完全后，加入1ml DMF和1ml30％H2O2，室温下反应22小时，即得C端(4-羟基丁基氨基)Leu-Phe-Gly-Gly-Trp五肽。经LC-MS分析产物的分子量为626，经HPLC分析产物纯度为92％。
实施例12C端(5-羟基戊基氨基)Leu-Phe-Gly-Gly-Trp五肽的制备实施例4中制备的硅胶100mg装入聚丙烯树脂袋，按照实施例11中的方法依次在硅胶上反应偶合上亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、甘氨酸、酪氨酸，用55％TFA/DCM脱Boc保护后，在-78℃的干冰-丙酮冷阱冷却，5分钟后，通入氟化氢气体。然后在冰水浴下保温2小时，使树脂溶解并同时脱去侧链保护基。通氮气吹赶氟化氢气体，待氟化氢气体驱赶完全后，加入1ml DMF和1ml30％H2O2，室温下反应22小时，即得C-端为5-羟基戊基氨基Leu-Phe-Gly-Gly-Trp五肽。经LC-MS分析产物的分子量为612，经HPLC分析产物纯度为85％。
权利要求
1.一种用可挥发氨烷基硅胶合成羟基多肽类化合物的固相合成方法，该羟基多肽类化合物的结构通式为 其中n＝2-5，m＝0-3，R1，R2，R3相同或不同，选自氢，甲基，异丙基，异丁基，苄基，胍基丙基，乙酰氨，丙酰氨，羟基甲基，2-羟基乙基，羧基甲基，羧基乙基，氨基丁基，对羟基苄基，其特征是通过以下步骤实现(1)冰水浴下，在正硅酸乙酯中加入水搅拌5-30分钟后，加入三烷氧基氨烷基硅烷，至生成白色沉淀后，继续搅拌0.5-2小时，停止搅拌，陈化24小时，(2)用大量水洗涤沉淀，100-130℃下真空加热过夜，(3)再次洗涤，110℃下真空干燥，得到化合物I氨烷基硅胶，(4)硅胶过筛，(5)将氨烷基硅胶与氨基酸II，在1-羟基苯并三唑，N，N′-二异丙基碳二亚胺，N，N-二甲基甲酰胺条件下反应，生成连接在硅胶上的叔丁氧羰基保护的氨基酸III，用55％三氟醋酸脱叔丁氧羰基，得到化合物IV，(6)化合物IV与氨基酸II在1-羟基苯并三唑，N，N′-二异丙基碳二亚胺，N，N-二甲基甲酰胺条件下反应，生成连接在硅胶上的叔丁氧羰基保护的二肽，用55％三氟醋酸脱叔丁氧羰基保护得到连有二肽的化合物V硅胶，(7)重复步骤(6)三次，分别得到连有三肽、四肽、五肽的化合物V，(8)用氢氟酸溶液或氟化氢气体切割连有多肽结构的化合物V，使硅氧键断裂生成四氟化硅气体和水，冷冻干燥后再用双氧水在有机溶剂中氧化断裂碳硅键，在20-80℃反应18-40小时，生成化合物VI的羟基多肽类化合物，反应式为
2.根据权利要求1所述的用可挥发氨烷基硅胶合成羟基多肽类化合物的固相合成方法，其特征是作为固相合成载体的化合物I氨烷基硅胶具有以下结构式 其中n＝2-5，氨烷基硅胶选用氨基乙基、氨基丙基、氨基丁基、氨基戊基中的一种。
3.根据权利要求1所述的用可挥发氨烷基硅胶合成羟基多肽类化合物的固相合成方法，其特征是步骤(8)中的有机溶剂选用醇、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃中的一种。
全文摘要
本发明提供用可挥发氨烷基硅胶合成羟基多肽类化合物的固相合成方法，是利用氨烷基聚硅氧烷类固相合成载体，通过氨基连接臂与氨基酸的羧基结合，用常规固相合成多肽的策略，逐步延长合成多肽，连接在硅胶上的多肽先经氢氟酸溶液或氟化氢气体切割，使聚硅氧烷的硅氧键断裂，硅胶溶解并生成四氟化硅气体挥发，再用过氧化氢氧化断裂碳硅键，冷冻干燥后直接得到羟基多肽类化合物。本发明在可分解挥发的固相载体上进行常规的固相有机合成反应，用切割条件分解固相载体为可挥发性的物质、连接剂，真空干燥后直接得到产物，避免了萃取、分离、蒸发溶剂等步骤。本发明方法设计合理，成本低，操作简便，适合平行合成和自动化合成化合物组合库以供活性筛选。
文档编号C07K1/04GK101041688SQ20071006680
公开日2007年9月26日 申请日期2007年1月22日 优先权日2007年1月22日
发明者李扬眉, 孙静, 理查德·霍顿, 俞永平 申请人:浙江大学, 迈克斯科技公司