专利名称：一种从转基因牛乳中纯化重组人α-乳清白蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种从转基因牛乳中纯化重组人 a-乳清白蛋白的方法。
背景技术：
a-乳清白蛋白是哺乳动物乳腺中特异表达的一种蛋白，其主要生理功能 是改变卩-l,4-半乳糖苷转移酶的底物特异性，促进乳糖的合成，从而调节乳中 的渗透压。oi-乳清白蛋白具有较高的营养价值，含有人体营养所需要的各种 必须氨基酸(必须氨基酸的含量占氨基酸组成的63%)，其中半胱氨酸、色氨 酸、异亮氨酸和亮氨酸含量丰富。半胱氨酸是体内抗氧化剂谷胱酐肽的一种 前体，有利于体内自由基的清除；色氨酸是神经递质5-羟色胺的合成前体，
可以促进婴儿的神经发育和改善睡眠质量；异亮氨酸和亮氨酸属于支链氨基 酸，能促进肌肉中蛋白质的合成。同时，来源于人(x-乳清白蛋白的生物活性 肽，具有抑菌功效，并能提高机体的免疫力。因而a-乳清白蛋白成为配方奶 粉和各种功能性食品的主要原料。近年来的研究发现，人a-乳清白蛋白多聚 体或结构变异体能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡，是一种潜在的 新型抗肿瘤药物，临床试验表明人a-乳清白蛋白结构变异体可以有效地治疗 乳头瘤状病毒感染导致的皮肤疣。
鉴于人ct-乳清白蛋白的重要性，需要获得大量高纯度的人ct-乳清白蛋白 以进行功能研究，并满足功能性食品和临床药物开发的需要。从人乳中获得 这种蛋白远远不能满足需求。牛乳腺是天然的大型生物反应器，利用转基因 克隆技术，在牛乳腺中重组表达具有生物活性的转基因人a-乳清白蛋白成为 理想的选择。
由于牛乳中含有内源的a-乳清白蛋白，为重组蛋白的后继纯化带来挑战。 目前，用于分离、纯化天然的a-乳清白蛋白的方法可分为三类'.根据蛋白质 的理化特性进行选择性沉淀；利用蛋白质的分子大小进行膜过滤；与特定介
质的选择性吸附和洗脱。前两类方法只能对牛乳中的蛋白质进行粗分离，且
回收率低，不能获得高纯度的a-乳清白蛋白。第三类是比较常用的分离乳中
特定蛋白质的方法，主要包括亲合层析、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、疏 水互作色谱等。
用亲合层析纯化ct-乳清白蛋白，主要是利用a-乳清白蛋白的钙离子结合
特性，选择性吸附乳中钙离子结合蛋白，配合凝胶过滤层析，能够提高蛋白
的纯度；阴离子交换色谱纯化a-乳清白蛋白是当前较为常用的蛋白纯化技术， 具有纯化成本低、色谱柱载样量不受样品体积限制、纯化工艺容易放大等优 点；疏水互作色谱需要使用有机溶剂进行洗脱，易使目的蛋白质变性，失去 生物活性，因而很少采用。
转基因牛乳中表达的重组人a-乳清白蛋白和牛a-乳清白蛋白具有相似的 理化特征，例如相近的分子量(人a-乳清白蛋白为14,070 Da,牛a-乳清白蛋 白为14,178 Da)和相似的等电点(pH4.2-4.6),目前的纯化方法不能有效 的将二者分离。要获得高纯度的重组人a-乳清白蛋白，就必须对现有的纯化 方法进行优化。
发明内容
(一) 要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种从转基因牛乳中纯化重组人a-乳清白蛋白的方法。
(二) 技术方案
本发明提供了一种从转基因牛乳中纯化重组人a-乳清白蛋白的方法，它 包括如下步骤
(1) 用超速离心沉淀转基因牛乳中的酪蛋白，并脱脂，获得含有重组人 a-乳清白蛋白的乳清；
(2) 将获得的乳清用50 mM Tris-HCl稀释平衡，采用阴离子交换色谱 进行第一步纯化先用50mMTris-HCl的缓冲液将没有与色谱柱上的载体介
质结合的蛋白质洗脱，再用50 mM Tris-HCl + 1 MNaCl的缓冲液进行分步梯 度洗脱，分步梯度洗脱的操作为先用50 mM Tris-HCl + 0.05 MNaCl直接洗 脱，再用50 mM Tris-HCl+ 0.05-0.4 M的NaCl梯度洗脱。收集各个洗脱峰， 采用15%的Native-PAGE电泳法(具体操作参见《分子克隆》第三版，科学 出版社，2002年8月出版)检测重组人a-乳清白蛋白，结果分步梯度洗脱时 用50 mM Tris-HCl + 0.05 M NaCl直接洗脱得到的洗脱峰组分中含有重组人 a-乳清白蛋白，而用50 mM Tris-HCl + 0.05-0.4 M的NaCl梯度洗脱得到的洗 脱峰组分中含有转基因牛乳的内源cx-乳清白蛋白和(3-乳球蛋白。
本步的原理是根据多次蛋白纯化条件的摸索，发现在pH值接近中性 的缓冲液中，重组人a-乳清白蛋白和牛a-乳清白蛋白与阴离子交换介质结合 能力存在一定的差别，用低离子浓度NaCl可以先将重组人a-乳清白蛋白从 色谱柱上洗脱，从而与内源a-乳清白蛋白分离。
(3)收集含有重组人a-乳清白蛋白的组分，浓缩，釆用凝胶过滤色谱进 行第二步纯化首先用50 mM Tris-HCl + 0.1 M NaCl缓冲液平衡凝胶过滤色 谱柱，再用50 mM Tris-HCl+ 0.1 MNaCl作为洗脱缓冲液进行洗脱，收集各 个洗脱峰，采用15%的Native-PAGE电泳法检测组分为重组人a-乳清白蛋白 的洗脱峰，从而得到纯化的重组人a-乳清白蛋白。
本步的原理是采用凝胶过滤色谱根据蛋白质的分子大小分离各种蛋白成分。
在本发明所述的方法中，步骤(2)中洗脱的流速是60cm/h,步骤(3) 中洗脱的流速是30 cm/h。所用的Tris-HCl缓冲液的pH均是7.4。 本发明所述的方法可以用于从转基因家畜乳中分离转基因蛋白。 (三)有益效果
本发明提供的从转基因牛乳中纯化重组人a-乳清白蛋白的方法，采用了 两步液相色谱分离纯化法，可以有效的将转基因牛乳中表达的重组人a-乳清 白蛋白与牛乳中的其它蛋白分离，避免了牛内源性(x-乳清白蛋白的污染，得 到的目的蛋白纯度达到99.9%以上。将该方法按比例放大，可用于工业化生 产。
采用本发明所述方法得到的重组人a-乳清白蛋白，保持了 a-乳清白蛋白 完整的生物活性，具有与天然的人a-乳清白蛋白相似的空间结构。
不仅如此，由于在整个纯化过程中所使用的缓冲液成分简单，避免了大 量盐分的使用，从而有效降低了纯化成本，并减少了废液对环境的污染。
图l是转基因牛乳中重组人a-乳清白蛋白阴离子交换纯化色谱图，其中 箭头表示含有重组人a-乳清白蛋白的色谱峰；
图2是15%Native-PAGE检测阴离子交换色谱纯化结果，其中方框内表 示含有重组人a-乳清白蛋白分离组分的电泳结果；
图3是转基因牛乳中重组人a-乳清白蛋白凝胶过滤纯化色谱图，其中箭 头表示重组人a-乳清白蛋白色谱分离峰；
图4是15。/。Native-PAGE检测凝胶过滤色谱纯化结果，其中椭圆内所示 纯化后的重组人a-乳清白蛋白；
图5是纯化的重组人a-乳清白蛋白15% Native-PAGE和Westem-Blot检 测图6是15。/。SDS-PAGESYPRORuby蛋白染色检测重组人a-乳清白蛋白 纯度，其中，Sl、 S2、 S3代表纯化的重组人(x-乳清白蛋白，并以人天然cc-乳清白蛋白作为阳性对照，whey为转基因牛乳清；
图7是重组人oc-乳清白蛋白结合钙离子的电泳迁移率图，其中，从左往 右数，泳道3-8代表重组人a-乳清白蛋白，泳道l、 2代表人天然的a-乳清白 蛋白，9、 10为牛a-乳清白蛋白对照；
图8是重组人(x-乳清白蛋白合成乳糖能力检测结果图，其中，XW、 LW、 HW代表重组人a-乳清白蛋白，Sl、 S2、 S3代表天然的人a-乳清白蛋白。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中所用的主要试验仪器与试剂如下
AKTApurifierlO快速蛋白液相层析系统、阴离子交换色谱柱HiLoad 16/10 Q Sepharose high performance,凝胶过滤色谱柱HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade购自Amersham Pharmcia;超速离心机LT-65购自Beckman; mini-Protean II蛋白质电泳系统购自Bio-Rad公司；超滤浓缩管Amicon Ultra-15，购自Millipore; SYPRO Ruby蛋白染色试剂购自Invitrogen;乳糖 检测试剂盒购自德国r-Biopharm,人、牛a-乳清白蛋白纯品购自Sigma公司， 兔抗人a-乳清白蛋白抗血清购自美国Nordic Immunological Laboratory,奶牛 催乳针剂购自国营西安草滩制药厂，其它药品非特殊注明均为国产分析纯或 进口分装。
实施例1 从转基因牛乳中纯化重组人a-乳清白蛋白
1.1转基因乳清的获得
给6-8月龄的转人a-乳清白蛋白的奶牛注射不孕奶牛催乳针，使其产奶， 注射方法如下连续肌肉注射I号针10天，每天一次，剂量为该试剂说明书 推荐的1/4; 1I号针在第13、 15、 17天各注射一支。从注射7天开始每天温 水按摩乳房，n号针注射完毕后开始人工挤乳两周，每天两次，收集乳样， 立即置于-20'C冰箱冻存备用。将冻存的转基因牛乳充分解冻，使蛋白质全部 溶解。用超速离心机在20。C， 90,000 x g离心1小时，弃去最上层的乳脂肪 和沉淀的酪蛋白，小心吸取中层的乳清。用50mMTris-HCl (pH7.4)稀释， 0.45pm微孔滤膜过滤。 1.2采用阴离子交换色谱进行第一步纯化
用于色谱纯化的所有溶液都用分析纯药品和Millipore水配制，并经过 0.22(im滤膜过滤和脱气处理，蛋白纯化操作在室温进行。
取10 ml稀释的乳清加入到快速蛋白液相层析系统的加样杯中，阴离子 交换色谱柱先用50mMTris-HCl (pH7.4)平衡5个柱体积，之后开始进样。 用50mMTris-HCl(pH7.4)洗2个柱体积，将未与柱载体介质结合的蛋白洗
掉；继而采用分步梯度洗脱(segmentgradient)的方法，先用50mMTris-HCl (pH7.4) +0.05MNaCl洗脱，直至基线趋于平稳，接着用50 mM Tris-HCl (pH 7.4 ) + 0.05-0.4 M的NaCl梯度洗脱，线性流速60 cm/h。收集各个洗脱 峰，用15。/。的Native-PAGE电泳检测重组人a-乳清白蛋白。阴离子交换色谱 图如图1所示，电泳检测结果如图2所示，可见图1中箭头所指的洗脱峰含 有重组人a-乳清白蛋白。 1.3采用凝胶过滤色谱进行第二步纯化
用超滤管(最小蛋白质截留分子量为5,000 kD)将上述含有重组人a-乳 清白蛋白的组分浓缩，加到快速蛋白质液相层析系统的加样杯内。用2倍柱 体积的50 mM Tris-HCl (pH 7.4 ) + 0.1 MNaCl缓冲液平衡凝胶过滤色谱柱， 开始进样，1.5倍柱体积的50 mM Tris-HCl (pH 7.4 ) + O.lMNaCl缓冲液洗 脱，收集洗脱峰，用15。/。的Native-PAGE电泳检测重组人a-乳清白蛋白。蛋 白质分离的色谱图如图3所示，电泳结果如图4所示，可见图3中箭头所指 的洗脱峰为重组人a-乳清白蛋白。这样就得到了纯化的重组人a-乳清白蛋白。
实施例2WestemBlot鉴定纯化的蛋白
为了确证纯化的蛋白为重组人a-乳清白蛋白，将纯化的蛋白用15%的 Native-PAGE电泳分离，并用人和牛的a-乳清白蛋白纯品作为对照，进行 Western Blot鉴定。结果如图5所示，表明纯化的蛋白Sl、 S2、 S3确为重组 表达的人a-乳清白蛋白。
实施例3重组人a-乳清白蛋白纯度检测
为了鉴定用此方法分离的重组人a-乳清白蛋白纯度，将纯化的蛋白用15%的 SDS-PAGE电泳分离。凝胶染色用SYPRORuby染色试剂进行染色，该染色 剂为荧光染料，灵敏度达到每条带lng。检测结果如图6所示，表明蛋白的 纯度至少为99.9%。
实施例4重组蛋白的钙离子结合实验
(x-乳清白蛋白是钙离子结合蛋白，钙离子的结合对蛋白质空间结构的稳定是 必须的。通过非变性凝胶电泳分离，可以观察到结合钙离子后，重组蛋白电 泳迁移率与天然蛋白相似，从而间接验证重组蛋白是否与天然蛋白具有相似
的空间构象。结果如图7所示，图中l、 3、 5、 7、 9分别加入10mMCaCl2， 2、 4、 6、 8、 IO分别加入10mMEGTA, 1、 2为人a-乳清白蛋白纯品对照， 9、 10为牛a-乳清白蛋白纯品对照。从图中可以看出重组蛋白与天然蛋白具 有相似的电泳迁移率，表明重组蛋白的空间结构与天然蛋白相似。
实施例5重组人a-乳清白蛋白生物活性检测
a-乳清白蛋白可以改变p-l，4-半乳糖苷转移酶底物的特异性，使乳糖能在 生理条件合成。在缺乏a-乳清白蛋白的情况下，卩-l,4-半乳糖苷转移酶催化 UDP-半乳糖与N-乙酰葡萄胺结合，合成N-乙酰乳糖胺和UDP，化学反应式如 下
UDP陽galaGtose + N-acety1—D-glucosamine — N陽acetyllaGtosamine + UDP。 而加入(x-乳清白蛋白后，可以提高P-l,4-半乳糖苷转移酶对葡萄糖的底物 结合能力，化学反应式为UDP-D-galactose + D-glucose — lactose+ UDP。
为了鉴定重组的人a-乳清白蛋白是否具有此活性，进行体外验证。在此 反应体系下100^1溶液中加入5.78mUGTase, 50mM Hepes (pH6.63), 0.0245% Triton X-IOO， 0.0245% BSA, 9 mM MnC12， 25 mM Glucose, 0.4 mM UDP-Galactose, 10^1重组a-乳清白蛋白，37'C反应2小时，合成乳糖。用乳 糖检测试剂盒检测乳糖的合成。结果如图8所示，重组蛋白同样可以合成乳 糖，说明利用此纯化方法并不影响重组a-乳清白蛋白的生物活性。
权利要求
1、一种从转基因牛乳中纯化重组人α-乳清白蛋白的方法，其特征在于它包括如下步骤(1)用超速离心沉淀转基因牛乳中的酪蛋白，并脱脂，获得含有重组人α-乳清白蛋白的乳清；(2)将获得的乳清用50mM Tris-HCl稀释平衡，采用阴离子交换色谱进行第一步纯化先用50mM Tris-HCl的缓冲液将没有与色谱柱上的载体介质结合的蛋白质洗脱，再用50mM Tris-HCl+1 M NaCl的缓冲液进行分步梯度洗脱，收集各个洗脱峰，检测重组人α-乳清白蛋白；(3)收集含有重组人α-乳清白蛋白的组分，浓缩，采用凝胶过滤色谱进行第二步纯化首先用50mM Tris-HCl+0.1 M NaCl缓冲液平衡凝胶过滤色谱柱，再用50mM Tris-HCl+0.1M NaCl作为洗脱缓冲液进行洗脱，收集各个洗脱峰，检测重组人α-乳清白蛋白，得到纯化的重组人α-乳清白蛋白。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所述的分步梯度 洗脱为先用50mMTris-HCl + 0.05MNaCl直接洗脱，再用50mMTris-HCl + 0.05-0.4 M的NaCl梯度洗脱。
3、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中洗脱的流速是 60 cm/h。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中洗脱的流速是 30 cm/h。
5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所用的Tris-HCl缓冲液的 pH均是7.4。
6、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于检测重组人a-乳清白蛋白釆 用15%的Native-PAGE电泳法。
7、 根据权利要求l-6之任一项所述的方法在从转基因家畜乳中分离转 基因蛋白上的应用。
全文摘要
本发明提供了一种从转基因牛乳中纯化重组人α-乳清白蛋白的方法，它采用了两步液相色谱分离纯化法。该方法可以有效的将转基因牛乳中表达的重组人α-乳清白蛋白与牛乳中的其它蛋白分离，避免了牛内源性α-乳清白蛋白的污染，得到的目的蛋白纯度达到99.9％以上。将该方法按比例放大，可用于工业化生产。采用本发明所述方法得到的重组人α-乳清白蛋白，保持了α-乳清白蛋白完整的生物活性。而且整个纯化过程中所使用的缓冲液成分简单，有效降低了纯化成本，并减少了废液对环境的污染。
文档编号C07K14/76GK101104635SQ20071010203
公开日2008年1月16日 申请日期2007年4月30日 优先权日2007年4月30日
发明者宁 李, 杨鹏华, 波 汤, 王建武 申请人:北京济普霖生物技术有限公司;李 宁