专利名称：高纯度替考拉宁的生产方法
技术领域：
本发明涉及利用变异株替考游动放线菌属(actinoplanes teichomyceticus var jianesis)提纯生产抗生物质替考拉宁的方法；更 具体地说，利用替考游动放线菌的新型变异菌株-替考游动放线菌提 纯生产抗生物质-替考拉宁的高效方法。
背景技术：
所谓抗生物质是指，在lmg/ml以下的低浓度环境中，抑制其他 生物体繁殖的低分子化合物。所以，通常抗生物质的范畴，不仅包括 医药用抗生物质，而且还包括抗癌剂、农业用杀菌剂、除草剂及杀虫 剂等；而且，根据抗菌活性、作用原理、生产菌株、合成方法、化学 结构等，还可以细分上述抗生物质。
另一方面，到目前为止从天然物中分离出了大约10000多种抗生 物质;而这些抗生物质的50%以上，是利用放线菌类进行提纯生产的； 其中大部分放线菌属于链霉菌属。从1974年起，研究人员开始对链 霉菌属之外的稀有放线菌开展了相关研究；通过多年的努力，从上述 稀有放线菌分离出了多种有效抗生物质。
随着抗生物质的不断发现及抗生剂领域的显著发展，抗生剂的使 用量也急剧增加；由于抗生剂的过度使用，导致了病菌的耐药性逐渐 增强的不良现象。例如，医院对患者的治疗中大量使用了各种抗生剂， 由此导致了耐抗生剂病原菌的出现和急速繁衍；作为从住院患者体内 分离出的主要病原菌之一，葡萄球菌属(Staphylococcus aereous) 是比较 代表性的生产|3-内酰胺酶的菌株，是一种对青霉素系抗生剂有耐药性 的微生物。为了有效地应付对抗生剂具备耐药性的病原菌，相关研究人员不 断在寻找，对耐药性病原菌有活性的抗生物质以及针对较广范围内病 原性微生物的选择性清除方法。与此同时，对人类、动物以及农作物 没有任何毒性的新型抗生物质，也逐渐成为该领域的研究重点；其中 最具代表性的是糖肽系列抗生剂。据悉上述糖肽系列抗生剂对革兰氏阳性菌非常有效。另外，糖肽 系列抗生剂的结构特点是，取代基带苯环的5个以上氨基酸直线状形 成了縮氨酸，而且根据种类的不同，每个氨基酸苯环上连接有糖、氯 基以及甲基等。替考拉宁(teicoplanin)是比较代表性糖肽系列抗生剂，如今广 泛应用于临床治疗；上述物质可分类为，根据极性差异划分的T-A2-l 或T-A2-5的复合体以及上述T-A2的提纯过程中生成的T-A3。而替 考拉宁的抗菌活性机理是，该物质可以阻碍，在革兰氏阳性菌株的细 胞壁合成过程中，肽聚糖合成中间体的相互结合，从而起到了抑制上 述细菌成长的作用。具备上述特性的替考拉宁，由于其出众的药效及极小的副作用， 其相关产品的进口量逐年大幅增加。但是，上述替考拉宁不仅化学合 成比较难，而且至今为止生物合成过程也没有得到完全证实；目前， 只能对发酵生产投入更多的研究力量。为了实现上述替考拉宁的高效大量生产，对新型菌株及提纯方法 的研究也逐渐加大力度；但是，现有的替考拉宁生成菌株只具备非常 低的产率，无法适用于产业性大量生产工程中；而且，现有的提纯方 法也存在效率低、得到的替考拉宁纯度差，很难实现产业化的缺点。现有的替考拉宁生产方法中，作为替考拉宁生成菌株， 一般性采 用替考游动放线菌属(Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC第 31121号)；但是，上述菌株存在生产效率低以及不利于产业性大量 生产工程的问题。株的培养液或者处理流出物中生成的水溶液，与能够吸收上述抗生物 质-替考拉宁的聚酰胺层析柱相接触，从水溶液中分离出上述树脂； 然后，用水性溶出剂混合物洗涤已分离出的树脂，接着从上述溶出剂 中分离/提纯出上述替考拉宁。其实，替考拉宁的最佳生长条件是pH 7以上的弱碱性状态；但是，上述分离方法只能在酸性pH培养液环 境中分离/提纯替考拉宁，而酸性环境会阻碍菌株的生长；因此上述 分离/提纯方法不仅存在生产效率低的缺陷，而且还存在无法解决菌 株的培养及替考拉宁的分离过程中产生的菌株自我毒性的问题点。所 谓自我毒性现象是指，上述菌株生成的抗生物质-替考拉宁阻碍菌株 的自我代谢，从而阻碍替考拉宁的生成；对抗生物质的生成来说，上 述自我毒性现象就会降低其生成效率。
还有，现有文献[参照M.R.巴尔顿(M.R.Bardon)等的Journal of Antibiotics,第31巻，第3号，第170-177页(1978年3月)]中记载 有，从菌株-游动放线菌属的过滤发酵液中分离替考拉宁的方法；而 上述分离方法中包括，在酸性pH环境内利用丁醇提取上述发酵液并 实施洗涤及浓縮的工程；由于强酸性离子交换树脂的使用，存在替考 拉宁的部分糖成分发生分解的问题点。如果采用强碱性离子交换树 脂，容易发生差向异构化，就会损失生物学活性。再加上离子树脂的 特性，使得从水溶液中的有色不纯物和副产物分离出替考拉宁的工程 难上加难。
就是因为现有的技术存在上述问题点，我们切实需要开发出，能 够适用产业化生产，且替考拉宁的生产效率较高的菌株及提纯方法。
发明内容
本发明是为了解决替考拉宁的生产方法上存在的上述问题而发 明的，其目的是提供高纯度替考拉宁的生产方法，能在稳定的条件下 实施整个生产过程，且经济实用，安全的高纯度替考拉宁生产方法。
为了达到上述目的，本发明提供了一种高纯度替考拉宁的生产方法，所述方法包括
阶段a，对替考拉宁粗品溶液进行凝胶层析、大孔吸附分离以得 到替考拉宁粗品溶液；
阶段b，将所述替考拉宁粗品溶液进行活性炭脱色、超滤、纳滤 及结晶以得到高纯度替考拉宁。
根据本发明，在阶段a中所述凝胶层析采用葡聚糖凝胶或琼脂糖 类凝胶进行层析。
根据本发明，在阶段a中所述大孔吸附分离采用孔径为20 300 埃的多孔性吸附树脂进行分离。
根据本发明，在阶段b中所述超滤采用陶瓷、聚醚砜或者再生纤 维素材质的分子量cut-off大小为3,000Da ~ 300，000Da的超滤膜进行 超滤。
其中，所述超滤膜分子量cut-off大小包括3,000Da 6,000Da。 根据本发明，在阶段b中所述纳滤采用纳滤膜为聚醚砜或者再生
纤维素材质的分子量cut-off大小为100~1000 Da的纳滤膜进行纳滤。 其中，所述纳滤膜分子量cut-off大小为700Da 800Da。 根据本发明，在阶段b中所述超滤和纳滤分别在温度0 55"C下进行。
根据本发明，在阶段b中所述超滤和纳滤分别在温度10 25°C 下进行。
根据本发明，在阶段b中所述结晶采用酮进行结晶，其中，所述 酮为C3-C6的酮，包括丙酮、丁酮或环己酮。 下面将进一步阐述本发明的生产方法。 阶段a:
上述替考拉宁的生产方法中，将变异株-actinoplanes teichomyceticus var jianesis作为生产替考拉宁的菌株。
上述替考拉宁的生产方法中，凝胶层析采用的凝胶为美国GE公 司的capto streamline, sephadex, sepharose Big Beads, sepharose XL,sepharose fast flow, sepharose high performance,source, superdex prep grade sephacryl high resolution, sepharose fast flow, sephadex g-25, sephadex LH-20。北京三博远志的葡聚糖凝胶G-IO、 G-15之一。上述替考拉宁的生产方法中，大孔吸附分离的树脂为上海华震的 Hz816、 Hz803、 HZ841,天津四光的DIOI、 D101-I DA201、 JD-1, 罗门哈斯的AmberliteTMXAD1180、 AmberliteTM XAD761 ，日本三菱 的DIAION(R) HP21之一。阶段b:上述替考拉宁的生产方法中，脱色阶段中所采用的活性炭型号为 活性炭型号针用活性炭767、 737，糖用活性炭303之一。上述替考拉宁的生产方法中，超滤阶段所采用的超滤膜为陶瓷、 聚醚砜或者再生纤维素材质的分子量cut-off大小为3,000Da ~ 300,000Da的超滤膜，本发明建议使用的超滤膜分子量cut-off大小为 3，000Da 6，000Da，可以使用以下超滤膜中的任意一种密理博公司 (Millipore Co.)的Pellicon module Biomax、 Ultracel超滤膜、Prostak module的PT、 PL超滤膜、Spiral Wound Ultrafiltration module的PT、 PL、Helicon超滤膜、德国赛多利斯股份公司(Sartorius AG)的Satrocon Ultrasart超滤膜、颇尔公司(Pall Co.)的OMEGATM、 ALPHATM、 REGENTM、 SUPORTM超滤膜、陶氏化学公司(Dow Chemical Co.) 的Filmtec 超滤膜、安法玛西亚公司(Amersham Pharmacia)的 KvickTM超滤膜。始终维持10 25。C温度条件和0 4.0bar的流入压及 0~3.5bar的流出压。上述替考拉宁的生产方法中，上述米格列醇生产方法中，纳滤阶 段所采用的纳滤膜为聚醚砜或者再生纤维素材质的分子量cut-off大 小为100 1000Da，本项发明中建议使用的纳滤膜分子量cut-off大小 为700Da 800Da,可以使用美国OSMONICS的纳滤膜，始终维持 10 25'C温度条件和0~2.0Mpa的流入压及0~1.8Mpa的回流压。上述替考拉宁的生产方法中，本发明采用向替考拉宁的浓縮液中加入C3-C6的酮，搅拌至有大量白色固体析出，回收固体，用红 外灯干燥晶体，即得到高纯度替考拉宁成品。用HPLC法检测，替 考拉宁A2峰面积为90.1%，纯度达93.1%以上。
正如前面所述，本项发明可以提供高效地提纯生产替考拉宁的方 法，采用了陶瓷膜超滤、离子交换、结晶等新技术，最大限度地提高 了替考拉宁的生产效率，从而实现高纯度替考拉宁的产业化。
具体实施方式
实施例l
将10g替考拉宁粗品溶解于200mlNa2CO3:NaHCO3 =0.05M:0.01M的缓冲溶液中，过滤得200ml滤液，对该滤液进行 HPLC分析，结果替考拉宁含量为7.05g,该滤液PH值为9.2，把上 述滤液以0.2BV/hr的流速滴在填充了 200ml Q sepharose凝胶的柱 (4)3mmx30mm)上，再分别以4BV的Na2CO3:NaHCO3=0.05M:0.1M 缓冲溶液，4BV含0.1%三羟甲基氨基甲垸的上述缓冲液以2BV/hr的 流速进行预洗，最后用含1%三羟甲基氨基甲烷的上述缓冲液以 2BV/hr的流速洗脱。得替考拉宁洗脱液400ml，经高效液相分析，洗 脱液中替考拉宁A2的峰面积为总面积的84.6%，得到高纯度粗提纯 物6.02g，回收率为85.4%。
实施例2
将实施例1中凝胶层析得到的工艺液，调PH至7.0，通过大孔吸 附树脂JD-1，用4BVPKN3的盐酸溶液，流速为2BV/hr洗涤该树脂 柱，再用4BV10。/。的乙醇溶液以2BV/hr的流速洗涤，然后用60%乙 醇溶液以lBV/hr的流速洗脱，得到320ml洗脱液，从而溶出了替考 拉宁，经HPLC分析，溶出液中的替考拉宁A2的峰面积为总峰面积 的87.2%，回收了5.4g替考拉宁，回收率为89.7%实施例3将实施例2中的乙醇洗脱液300ml，调PH至4.0,添加糖用活性 炭，针用活性炭各3g之后，控制温度为20 30°C搅拌30min，然后过 滤，清除活性炭得到澄清滤液。实施例4-7将实施例3中的澄清滤液经过截流分子量为6000Da的超滤膜去 除大分子杂质，超滤时分别在O'C、 10°C、 25°C、 55'C的温度条件和 0~4.0bar的流入压及0 3.5bar的流出压。期间用纯化水顶洗三次，得 到450ml澄清滤液l、 2、 3、 4。实施例8-11将实施例4-7中的澄清滤液1~4分别调PH至8.0，再用截流分子 量为800Da的纳滤膜浓縮至100ml，纳滤时分别在0°C、 10°C、 25°C、 55'C的温度条件和0 2.0Mpa的流入压及0~1.8Mpa的流出压。浓縮 过程中不断用纯化水顶洗，除去滤液中乙醇， 一边搅拌浓縮液， 一边 加入丙酮至丙酮浓度为68%，有部分杂质沉降出来，过滤除去沉降物， 得沉降液l G20ml)、 2 (326ml)、 3 (330 ml)、 4 (325 ml)，经HPLC 分析，沉降液中的替考拉宁A2峰面积为90.7y。、 90.6%、 90.2%、 88.5%，纯度为92.8%、 92.8%、 92.4%、 87.9%。实施例12-15将实施例8-11中沉降液1~4分别继续缓慢加丙酮至90%丙酮度， 搅拌均匀沉淀出替考拉宁粉末，静止1小时后，利用布氏漏斗过滤， 用丙酮顶洗后回收沉淀物，然后在红外灯下对回收的沉淀物进行6小 时干燥，用注射用水lmg/ml溶解已回收的替考拉宁粉末l (3.6g)、 2 (3.6 g)、 3 (3.5 g)、 4 G.2g)，经HPLC分析，纯度为93.1%、 93.1%、 92.8%、 91.0%。
权利要求
1、一种高纯度替考拉宁的生产方法，其特征在于，阶段a，对替考拉宁粗品溶液进行凝胶层析、大孔吸附分离以得到替考拉宁粗品溶液；阶段b，将所述替考拉宁粗品溶液进行活性炭脱色、超滤、纳滤及结晶以得到高纯度替考拉宁。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在阶段a中所述 凝胶层析采用葡聚糖凝胶或琼脂糖类凝胶进行层析。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在阶段a中所述 大孔吸附分离采用孔径为20 300埃的多孔性吸附树脂进行分离。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在阶段b中所述 超滤采用陶瓷、聚醚砜或者再生纤维素材质的分子量cut-off大小为 3，000Da 300，000Da的超滤膜进行超滤。
5、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述超滤膜分子 量cut-off大小包括3,000Da 6,000Da。
6、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在阶段b中所述 纳滤采用纳滤膜为聚醚砜或者再生纤维素材质的分子量cut-off大小 为100 1000Da的纳滤膜进行纳滤。
7、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳滤膜分子 量cut-off大小为700Da 800Da。
8、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在阶段b中所述 超滤和纳滤分别在温度0 55T:下进行。
9、 根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，在阶段b中 所述超滤和纳滤分别在温度10 25'C下进行。
10、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在阶段b中所述 结晶采用酮进行结晶，其中，所述酮为C3-C6的酮，包括丙酮、丁酮 或环己酮。
全文摘要
本发明提供了一种高纯度替考拉宁的生产方法，所述方法包括阶段a，对替考拉宁粗品溶液进行凝胶层析、和大孔吸附分离以得到替考拉宁粗品溶液；阶段b，将所述替考拉宁粗品溶液进行活性炭脱色、超滤、纳滤及结晶以得到高纯度替考拉宁。所述方法最大限度地提高了替考拉宁的生产效率，从而实现高纯度替考拉宁的产业化。
文档编号C07K1/16GK101302248SQ20071010718
公开日2008年11月12日 申请日期2007年5月9日 优先权日2007年5月9日
发明者孙新强, 章槐东, 胡三明, 葛永红 申请人:浙江医药股份有限公司新昌制药厂