人乳头瘤病毒外壳蛋白l1短肽及其应用的制作方法

文档序号:3560184阅读:608来源:国知局
专利名称:人乳头瘤病毒外壳蛋白l1短肽及其应用的制作方法
技术领域
本发明涉及一种多肽,具体地说是一种人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短 肽及其应用。 技术背景
1933年人类首次发现人乳头瘤病毒(HPV), 1978年,第一例生殖道 HPV被鉴定。目前,根据人乳头瘤病毒(HPV) DNA序列表达基因不同, 己确定的人乳头瘤病毒(HPV)亚型超过200种,其中,85种HPV的基因 克隆被鉴定,另有120种的部分基因型被鉴定,并且,有30余种是从生 殖道组织中分离得到。根据人乳头瘤病毒(HPV)感染的部位,分为皮肤 型和粘膜型;根据其致病性的大小,分为高危型和低危型。高危型主要 有HPV16、 18、 33、 31、 58和52等,与宫颈癌的发病有关,低危型主要 有HPV6、 11、 42和44等,与生殖道疣状物有关。
目前,随着宫颈癌病因学的研究进展,其防治方法也在不断地提高 和发展。在HPV疫苗尚未在人群中应用之前,普查仍是预防和控制宫颈 癌的主要手段。大量研究表明人乳头瘤病毒(HPV)持续感染是引起宫颈 上皮癌变的主要危险因素,尤其是高危型HPV。随着检测技术的提高,宫 颈癌组织中HPV的检出率高达99X,其中,HPV16占55%至60%, HPV 18 占10%至12%, HPV31和HPV45分别占有4X至5X。因此许多学者提 出把检测HPV作为宫颈癌的筛査手段。目前,HPV的检测主要有病理学 变化、免疫组化、分子生物学技术和血清学检测等方法。
l.HPV感染宫颈的病理学改变
细胞病理学改变在宫颈移行区取材,行巴氏染色,可见由HPV引 起的挖空细胞,即可诊断。此方法简单易行,无痛苦,经济实用,可用 于大规模普查和筛查。但其敏感性低,假阴性率高。近年来,己由传统 的巴氏涂片发展成薄层巴氏涂片和涂片自动检测系统。此方法应用新的 收集和制作过程,大大降低了结果的假阴性率。主要有以下PAPNET系统、Auto Pap3000Qc、 Thinpr印2000和CYTORICH等。
组织病理学改变对宫颈无明显癌变的可疑区取材做病理检査,当 发现挖空细胞,就可诊断有HPV的感染,并可发现宫颈细胞是否有异型 性,是宫颈癌及其癌前病变确诊的依据。
2. 免疫组化检测HPV感染
取少量病变组织制成涂片,用特异抗人类乳头瘤病毒的抗体作染色。 如病损中有病毒抗原,则抗原抗体结合。常用过氧化物酶抗过氧化物酶 方法(即PAP),此方法有较好的特异性,还能显示出病毒感染的部位, 操作简单,有一定的诊断价值,但是检测率低,敏感性不高,且不能分 型。另外,有学者在不典型鳞状细胞(ASCIIS)患者的宫颈涂片和活检组 织中加入抗P16抗体和克隆E6H4后进行免疫组化染色,发现巴氏涂片为 ASCUS并且活检为鳞状上皮内瘤样变(SILs)的患者P16表达的强弱与 服HPV的病毒量密切相关,P16免疫染色检测服HPV病毒量的灵敏度、 特异度、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)分别为95%、 96%、 91%、 98%。 P16的过度表达是HR HPV致病活跃的指示器。此法可作为 宫颈癌普査中检测宫颈上皮细胞是否感染高危型HPV的可靠简单的方法。
3. 分子生物学技术 3.1样本
分子生物学技术检测的样本通常是宫颈部的上皮组织,可以是用于 细胞学检査的宫颈刮片或宫颈细胞拭子,这些生殖道脱落细胞为检材避 免了活检取材、研磨组织繁杂操作。但如果样本量不够,会影响结果的 灵敏度,故大多数还是通过阴道镜下宫颈活检来获得样本。也有学者提 出,宫颈癌患者的血液也可用来检测HPV DNA。但是,PattiKey通过实 验指出宫颈癌患者晚期,HPVDNA才释放到血液,即使被检测到,也无 诊断学意义,它只对判定有无宫颈癌血液转移具有一定的参考价值。最 近,B.K. Prusty等提出,宫颈外周的上皮及阴道正常的脱落细胞进入尿 液,当有HPV感染时,这些脱落细胞中也会含有病毒基因或毒粒。收集 尿液可直接用于PCR检测HPV DNA,他们对55名已婚妇女的尿液、宫颈 刮片、活检组织分别进行PCR检查,结果发现三者中检测到的HPV阳性
符合率接近100% 。用尿液作为检测生殖性HPV的感染是一种有用简单无
创伤性的方法,可进一步证实并被采用。
3. 2检测指标
目前,检测的指标主要有以下三种(l)HPVDNA检测是最常用的 检测指标,作为宫颈癌的初筛手段可更灵敏地检出宫颈癌及其癌前病变, 其方法简单,客观性强。但是不能区分是持续性感染还是重新感染。(2) HPVmRNA检测可以监测致癌基因如E6、 E7的表达,这与疾病的恶化进 程相关,当病变恶化,E6、 E7raRNA的水平升高,但RNA稳定性差,不宜 储存。HPV mRNA检测的敏感度高达100%,特异性为70%,但假阳性率 较高。Lie AK等通过实验指出,对于低度病变,DNA检测的阳性率较高, 而对于高度病变,mRNA检测的阳性率很高,mRNA检测似乎更适合预测宫 颈病变的危险程度。(3) HPV病毒量HPV病毒量被提出作为识别疾病 的危险性的手段,但是存在争议,大多数研究还不能为每份样本的细胞 数定下统一标准,因此,在进行有效的HPV病毒量评估前应调整标本中 的细胞数。
3. 3影响分子生物学实验结果的因素
HPV检测的结果会受诸多因素的影响。主要有以下几方面(l)样品 的来源HPV检测的阳性率与取样患者的年龄段有关。另夕卜,还与宫颈病 变程度有关,收集样本的量也影响HPV检测的成败。(2)样本运输和储 存的稳定性也很重要,检测的假阴性可由于内生的核酸内切酶使其核酸 降解所造成。现有一些商业性样品储存液,如PreservCyt(Cytyc Corp.), 它可延长核酸在室温下的储存时间。(3)检测的方法不同分子生物学 实验方法检测宫颈中HPV的灵敏度和特异度也不同。引物为PGMY09/11 和GP576+ (PGMY/GP+)的巢式PCR检测宫颈样品中的HPV DNA,与以MY/GP+ 为引物的巢式PCR相比较,发现前者更具有型特异性和敏感性,可检测 更广泛的型别和复制低下的病毒。更好发现样本的多型病毒感染。(4) 实验仪器和设备发展中国家的仪器设备收集和分析样本,进行HPV检 测的敏感性普遍低于发达国家。
3. 4临床常用检测方法3. 4. 1核酸分子杂交技术
原位核酸杂交(ISH):此技术是一种敏感、特异、相对简便的方法,
又有细胞定位准的优点,能在亚细胞水平上定位特异性核酸分子序列,
从细胞分子水平上来探讨HPV感染。例如Narimatsu R等利用荧光原 位杂交法(FISH)检测高度鳞状上皮内瘤样病变(HSIL)标本中HPVE6、 E7 mRNA,结果显示,其灵敏度为83.3%,特异度为91.3%,均高于杂 交捕获法(HC) (Digene公司)。
杂交捕获试验(HC):它利用化学发光对抗体捕获的信号加以放大。 能检测13种高危型HPV,包括HPV16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 68。 Zolt6n Hernddi等用HC (Digene , USA)检测 61名上皮内瘤样病变(CIN)患者治疗后宫颈中HPVDNA,发现43例HPV 阴性者,最终没有发展成为CIN和持续性细胞不典型性增生(NPV二100X), 结果提示,CIN治疗后HPV阴性说明消除了复发的危险。
第二代杂交捕获试验(HC2):试验采用RNA探针,能特异性确定一 定型别的高危HPV型(16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59和68)或低危HPV型(6、 11、 42、 43、 44),可对病毒量进行半定量 测定。对于检测CIN2、 3和浸润癌中的HPV,其敏感度为66%至100%, 特异度为61%至96%。
3.4.2聚合酶联反应(PCR)
PCR:此方法特异性敏感性高,是目前最好的HPV检测方法,简单易 行,标本来源不受限,可用型特异性引物进行HPV分型,但可发生样品 间的交叉反应,从而导致假阳性率。H. De Vuyst等对653名妇女进行 HPVDNAPCR检测,结果对于C顶2及以下的病人,HPV PCR和服HPV PCR 灵敏度分别为94. 4%和73. 3%,特异度分别为69. 3%和77. 6%。
实时定量PCR:该方法灵敏度高,漏诊率低,可一次性完成生殖道 HPV的检测,但其设备和仪器较贵,限制了其临床应用。LoKW等用实时 定量PCR对HPV16阳性的宫颈赘生物标本中的病毒加载进行定量检测, 结果发现,高度病变组(HG-L)、低度病变组(LG-L)和正常组中DNA 复制明显不同,其程度与病情严重程度呈正比。HPV 16E6/7在三组中的
阳性率分别为88.6%、 58.8%和5.9%。实验表明,实时定量PCR在区 分上述三组人中具有诊断价值。
多重巢式PCR (MNP):检测15种服HPV (16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 66、 68和70),它的引物是针对HPV基 因的早期区,它比其它巢式服HPV PCR检测CIN中HPV的阳性率高。另 外,可通过对其产物分析进行HPV分型。Brian Brestovac等用MNP对 282个常规刮片进行HPV检测,HPV阳性率为17%。对于CIN1, CIN2和 CIN3患者超薄细胞样品,服HPV阳性率为91. 7%均高于限制性片段长度 多态性分析(RHRP) (12. 5%和57. 0%)。
PCR-酶免疫测定法此法特异性强,灵敏度高,可大量样本同时检 测,且操作简单,检测成本低。Soderlund-Strand A等用PCR-EIA对患 者进行HPV DNA检测,结果发现,PCR-EIA对CIN III和CIN 11+诊断的 灵敏度分别为100. 0%和92.9%,是CIN n/in诊断的有效手段。
半巢式PCR结合反向杂交 一种简单便宜的高危型HPV的检测及分 型方法。HaoLin等用纯化的SiHa DNA连续稀释10倍后作为半巢式PCR 结合反向杂交及荧光检测的模板进行半巢式PCR结合反向杂交实验,结 果发现,正常者、CIN和浸润癌中HPV阳性率分别为15%、 89.7%和 96. 4%。
3.4.3 HPV检测新的分子生物学实验方法
AMPLIC0R HPV检测方法(Roche公司)它是利用PCR和分子核酸杂 交技术对HPV-DNA进行扩增,可检测高危型HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59和68等13种基因型。Jos印h Monsonego等人 用AMPLIC0R方法对270名巴氏涂片检査异常(MAPS)的患者和234名参 与宫颈癌普査的患者进行检査,发现对于中重度上皮内瘤样病变(CIN2、 3)患者,Roche AMPLICOR HPV检测特异度为42. 4% (35. 7%-49, 2%), 灵敏度为95.2% (89.9%-100.0%)。
INFORM(R): Layfield LJ等比较了第二代杂交捕获(R) (HCII(R)) 和INFORM(R)两种方法对ASCUS患者诊治的价值,他们用这两种方法对 431位ASCUS患者进行HPV DNA检查,通过治疗费和诊断精确性表明,
INFORM方法优于HCII,尽管前者比后者费用增加了 16%,但减少了 41% 的患者进行阴道镜检査,且前者特异性较高。
短PCR片段PCR结合线状探针排列反向杂交法(SPF10/LiPA):可 检测11种低危型HPV (6、 11、 34、 40、 42、 43、 44、 53、 54、 70、 74) 和14种高危型HPV(16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 66和68),并且,SPF10/LiPA系统可判断高危型HPV持续感染及型别。 Chris Perrons等用SPF10/LiPA对138名因宫颈病变做阴道镜检查和6 个月后再复査阴道镜的患者进行HPV检测。两次检测HPV阳性率分别为 81% (112/138)和51% (142/276)。通过宫颈涂片,将患者分为正常 组、临界病变组(BNC) 、 LSIL和HSIL四组,其HPV阳性率分别为55%, 69%, 50%, 72%。并且,SPF10/LiPA可检测低量HPV DNA,具有高敏 感性。
HPVDNA芯片最近出现的一种新的HPV分型方法。它通过大量固化
的寡核苷酸探针与生物样品的靶系列进行分子杂交,根据产生的杂交图 谱排列出革巴DNA的序歹'」。可以快速高效对已知序列进行重测序。Hai Kwang Lee等用一种以寡核苷酸微集阵列系统为基础的HPV DNA芯片检测20个 HPV为阳性的妇科临床标本,此HPV DNA芯片可检测22种高危型HPV (16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 66、 68、 69)和7种低 危型HPV(6、 11、 34、 40、 42、 43、 44),结果证明HPV DNA芯片的精确 性和重复性几乎高达100%。 3.5 HPV DNA检测临床价值
HPVDNA检测的临床价值主要有几个方面(1)单独应用HPV检测进 行宫颈癌普查。很多研究发现,HPVDNA检测的灵敏度很高,特别对于高 度病变。但是,其特异性低,特别是对于年轻已婚妇女。(2) HPV检测联 合细胞学进行宫颈癌普查。在宫颈普査中,细胞学检査有效但缺乏敏感 性,高危型HPV DNA检测可有效地、极大地减少细胞学检查的假阴性结 果。对于CIN1,两者联合使用,灵敏度、特异度、PPV和NPV分别为100% 、 97.2%、 30.8%和100%。 (3)决定低度病变进一步诊断和治疗。减少 阴道镜检查及病理活检率,延长复査间隔时间。(4)作为宫颈病变治疗 后的随访指标。
4.血清学检查
因HPV不能在体外组织细胞中增殖,故血清学检查发展缓慢。并且, 血清学方法准确性不高,不能区别是现在还是过去感染。目前,尚不能
用血清学方法对HPV进行确诊及分型。但是,随着不断的研究,在血清
中可检测到一些具有参考价值的指标,作为宫颈癌诊断治疗检测及随诊
中的标志物。先前,有研究指出,HPV16/52/58 DNA阳性的CIN有显著的 针对自身Ll衣壳蛋白的抗体反应。针对HPV16抗原的IgGl和IgG2在宫 颈癌中明显高于CIN患者,因此,对血清学反应为阳性的患者进行IgG 亚类分析或直接检测针对病毒抗原的细胞免疫可以有效预测CIN的自然 消退,但是,KojiMatsumoto通过实验发现Ll衣壳蛋白的IgG抗体与2 年后CIN的消退无关联,因此指出HPV Ll衣壳蛋白的IgG反应不能预测 未治疗的CIN I/II的自然消退。另外,最近发现,宫颈病变患者的血清 之中,Ll表面暴露区縮氮酸18283 (55pNNNKILVPKVSGLQYRVFR74)和18294 (,LYIKGSGSTANLASSNYFPT,)可被抗体特异性识别,有学者用EILSA法对 这两个縮氨酸进行检测,发现抗縮氨酸18283和18294抗体与服HPV所 致宫颈病变密切相关,其灵敏度和特异度分别为94.5-97.2 %和 90.9-97.5%,并且,EILSA法简单、便宜、快速,可用于大规模血清学 普査。
近年来,HPV的检测发展迅速,在宫颈癌的筛査和宫颈癌前病变的预 报中发挥了的重要作用。目前的观点是联合应用薄层巴氏涂片法和HPV 检测,对所有高危妇女定期复查,逐渐消除宫颈癌的可能。此外,HPV检 测技术的改进方向是使其灵敏度和特异度进一步提高,可以大规模应用, 同时可分型,能够自动化,减少财力、人力和物力,成为宫颈病变筛査 中不可少的辅助手段。

发明内容
本发明的目的就是提供一种能同时诱导针对多种型别,尤其是同时诱 导对高危型和低危型均能产生免疫反应的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短 肽,它可以诱导形成针对多种型别人乳头瘤病毒(HPV)和外壳蛋白(HPV
Ll)的抗体,以便用于多种型别HPV或HPVL1的检测,这种抗体还可用 于生物制药工程,用于多种型别HPV或HPV Ll的纯化、制备。
本发明的技术方案是 一种人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽,其特
征是该人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的序列为
N端一EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK—C端。所述的人乳头瘤病 毒外壳蛋白Ll短肽是以HPV16 Ll 448—477aa区段的蛋白序列为基础, 肽长度为30个的氨基酸,序列为EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK。
所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽是多克隆抗血清或单克隆抗体。
本发明具有以下用途
1. 以所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽的氨基酸序列为基础作 为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型人乳头 瘤病毒及人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll的检测。
2. 对所述人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽的一个或多个氨基酸残基 进行变换后,作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体 用于各型HPV及HPV Ll的检测。
3. 以所述人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽为基本结构单元,借连接 段肽链连接,形成具有多个重复结构的蛋白或长肽,将此具有多个重复 结构单元的蛋白作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗 体用于各型HPV及HPV Ll的检测。
4. 将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽与具有佐剂效应的蛋白 相联接,形成融合蛋白,将此融合蛋白作为抗体诱导物,用所诱导的多 克隆抗血清或单克隆抗体用于各型HPV及HPV Ll的检测。
5. 将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽与化学合成佐剂或生物 佐剂混合后使用,作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆 抗体用于各型HPV及HPV Ll的检测。
6. 将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽作为抗体诱导物,以所 诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型HPV或HPV Ll的分离、纯化。
7. 将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽作为人乳头瘤病毒抗血清或人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll抗血清和单克隆抗体的被检测物。


图1. Western Blot检测。1带为表达重组HPV16 Ll的sf9培养细 胞;2带为Marker。
图2.兔抗血清对细胞裂解物的ELISA检测
图3. Western Blot检测。1, 4带为Caski细胞;3, 5带为Hela 细胞;2带为Marker。
图4.兔抗血清对临床标本的ELISA检测。HPV16、 18型的样本为宫 颈癌组织;HPV6、 11型的样本为尖锐湿疣组织;HPV其他型别的样本为 寻常疣组织。
图5.鼠抗血清对临床标本的Western Blot检测。1带为蛋白 MARKER:条带分别对应119KD、 79. OKD、 46. OKD、 31. OKD、 24. OKD、 19. OKD; 2带HPV16型;3带HPV18; 4带HPV6型;5带HPVll型;6带其他型 别。
图6.兔抗血清对临床标本的组化检测。HPVll型的尖锐湿疣标本。 阳性主要见于表面的角化层,某些挖空细胞核内呈阳性反应。
图7.兔抗血清对临床标本的组化检测。HPV16型的宫颈上皮内病变 标本。阳性见于上皮各层,细胞胞质或核内出现棕黄色颗粒。
图8.短肽内优势表位的ELISA试验确定。对照为抗短肽抗血清对短 肽的反应。
图9. 4个小肽对抗短肽抗血清封闭效能的ELISA检测。对照为抗短 肽抗血清对短肽的反应。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明及其用途作进一步说明 本发明人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽的序列为-
N端一EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK—C端。所述的人乳头瘤病 毒外壳蛋白Ll短肽是以HPV16 Ll 448—477aa区段的蛋白序列为基础, 肽长度为30个的氨基酸,序列为EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK。
所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽是多克隆抗血清或单克隆抗
体。
以所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽的氨基酸序列为基础作为抗
体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体可以用于各型人乳头
瘤病毒及人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll的检测。
对所述人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽的一个或多个氨基酸残基进行 变换后,作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体可以 用于各型HPV及HPV Ll的检测。
以所述人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽为基本结构单元,借连接段肽 链连接,形成具有多个重复结构的蛋白或长肽,将此具有多个重复结构 单元的蛋白作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体可 以用于各型HPV及HPV Ll的检测。
将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽与具有佐剂效应的蛋白相联 接,形成融合蛋白,将此融合蛋白作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆 抗血清或单克隆抗体可以用于各型HPV及HPV Ll的检测。
将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽与化学合成佐剂或生物佐剂 混合后使用,作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体 可以用于各型HPV及HPV Ll的检测。
将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽作为抗体诱导物,以所诱导 的多克隆抗血清或单克隆抗体可以用于各型HPV或HPV Ll的分离、纯化。
将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽可以作为人乳头瘤病毒抗血 清或人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll抗血清和单克隆抗体的被检测物。
实施例l
(a) HPV Ll短肽的合成
本实施例中,以HPV16 Ll aa448—477区段的蛋白序列为基础,肽 长度为30个氨基酸,序列为EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK。
委托北京赛百盛基因技术有限公司在美国Genemed Synthesis Inc. 公司用常规方法合成该序列短肽。
(b) 抗血清的制备
将合成短肽以PBS溶解后,1:1加FurencT s完全佐剂,乳化后分别 以25ug及10ug的剂量免疫日本长耳大白兔及Balb/c小鼠,共3次。于 最后一次免疫的第14天,处死动物,取抗短肽的兔抗血清及鼠抗血清。 实施例2
抗短肽抗血清对重组HPV16 Ll反应性的Western Blot检测
表达重组HPV16 Ll的sf9细胞由中国医学科学院基础医学研究所获得。
将表达重组HPV16 Ll的sf9培养细胞的裂解液进行聚丙烯酰胺凝胶 电泳,将电泳后的凝胶转移至硝酸纤维膜,再以兔或小鼠的抗短肽抗血 清为一抗与之进行反应。结果,小鼠及兔的短肽免疫抗血清能使表达重 组HPV16 Ll的sf9培养细胞裂解液的电泳泳道上,在56KD的位置上出 现特异性的反应条带(图1)。 实施例3
抗短肽抗血清对含HPV病毒培养细胞反应性的ELISA检测及Western Blot检测
含HPV16病毒的Caski细胞和含HPV18病毒的Hela细胞购自武汉大 学中国细胞保藏中心。进口 HRP标记及荧光标记二抗购于北京中山生物 技术有限公司(sigma产品)。
分别将含HPV16病毒的Caski培养细胞及含HPV18的Hela培养细胞 裂解液包被塑料板,以兔或小鼠的抗短肽抗血清为一抗与之进行反应。 结果,小鼠及兔的抗短肽抗血清能使Caski培养细胞及Hela培养细胞裂 解液包被的塑料板呈现阳性反应(图2)。
将含HPV16病毒的Caski培养细胞及含HPV18的Hela培养细胞的裂 解液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,将电泳后的凝胶转移至硝酸纤维膜,再 以兔或小鼠的抗短肽抗血清为一抗与之进行反应。结果,小鼠及兔的短 肽免疫抗血清能使Caski培养细胞及Hela培养细胞裂解液的电泳泳道 上,在56KD的位置上出现特异性的反应条带(图3)。 实施例4
抗短肽抗血清对PCR鉴定HPV阳性临床标本反应性的ELISA检测
分别将经PCR鉴定的临床标本中筛选出的HPV6、 11、 16、 18四种主 要HPV型别及除此以外的其他型别的5种类型的标本进行裂解,将裂解 液包被塑料板,以兔或小鼠的抗短肽抗血清与之进行反应。结果,小鼠 及兔的短肽免疫抗血清,能使标本裂解液包被的塑料板呈现阳性反应(图 4)。
抗短肽抗血清对HPV阳性临床标本反应性的Western Blot检测
分别将经PCR鉴定的临床标本中筛选出的HPV6、 11、 16、 18四种主 要HPV型别及除此以外的其他型别的5种类型的标本进行裂解,裂解液 作SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜后以兔抗短肽抗血清作一抗,结果于 蛋白分子量约为56K的区间,均可见有一条阳性反应带(图5)。 实施例6
抗短肽抗血清对HPV阳性临床标本反应性的免疫组织化学检测
将临床病理检验为肿瘤,或尖锐湿疣的病理组织进行PCR鉴定,取 PCR鉴定为HPV6, 11, 16,和18阳性的进行反应。结果抗短肽抗血清可 使HPV6, 11阳性的尖锐湿疣组织内的一些细胞的胞质内呈现阳性反应, 可见阳性反应仅出现于胞浆之内,胞质被染成棕黄色,胞核透亮,呈负 染状态,反应越近表层越强,角化层反应最强。抗血清可使HPV16, 18 阳性的病变组织内的一些细胞出现阳性反应,反应常呈巢状,阳性细胞 与阴性细胞分界明显,胞质内反应强(图6, 7)。 实施例7
(a) 短肽序列内的小肽合成
由吉尔生化(上海)有限公司以上述短肽氨基酸序列为基础、合成 15个氨基酸残基长、相互错开5个氨基酸残基的4个小肽,序列分别为.-EVNLKEKFSADLDQF , EKFSADLDQFPLGRK , DLDQFPLGRKFLLQA 和 PLGRKFLLQAGLKAK (以下简称为:EF、 EK、 DA、 PK)。
(b) 抗血清的制备
按实施例1的方法取得上述4个小肽的抗血清。 实施例8
短肽内优势表位的ELISA试验确定
以上述4个小肽包被塑料板,以抗短肽抗血清(1:100)作为一抗与 之结合,检测抗短肽抗血清与包被在塑料板上的小肽的反应能力,通过 对4个小肽反应能力,确定短肽内的优势表位存在的区段。结果显示, 抗短肽抗血清对4个小肽的反应强度基本相近,仅对EK区段的小肽反应 稍强,平均反应强度仅为12.8%。说明短肽内表位分布相对比较均衡, 没有明显的优势线性表位,短肽内可能有独立的构象表位(图8)。 实施例9
4个小肽对抗短肽抗血清封闭效能的ELISA检测
以短肽包被塑料板,以4个小肽与抗短肽抗血清(2:900)共同孵育, 37。C封闭lh后作为一抗,检测抗短肽抗血清与包被在塑料板上的短肽的 反应能力,通过4个小肽对抗短肽抗血清的封闭效应,确定短肽内的优 势表位。结果4个小肽对抗短肽抗血清的封闭效应基本相近,仅EK区段 的小肽封闭作用稍强,平均封闭效能约为33.6%。这也说明短肽内表位 分布相对比较均衡,没有明显的优势线性表位(图9)。
氨基酸序列表
TTTACTACAAGCAGGATTGAAGGCCAAAHPV LI. seq. txt
Organization Applicant
Street :大学路8号 City :宜昌 State :湖北 Country :中国 PostalCode : 443002 PhoneNumber : 13972605871 FaxN腦ber : 0717-6252960 EmailAddress : xiao^iy@ctgu. edu. cn 〈110〉 0rganizationName :三峡大学
Application Project
<120> Title :人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽及其应用
<130〉 AppFileReference : 071203
Sequence
〈211〉 Length : 90
SequenceName : HPV LI DNA氨基酸序列 <212> Type : DNA
<213> OrganismName :人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus) <400〉 PreSequenceString :
GAAGTAAATT TAAAGGAAAA GTTTTCTGCA GACCTAGATC AGTTTCCTTT AGGACGCAAA 60 TTTTTACTAC AAGCAGGATT GAAGGCCAAA 90
权利要求
1.一种人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽,其特征是该人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的序列为N端-EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK-C端。
2. 根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽,其特征 是所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽是以HPV16 Ll 448—477aa区 段的蛋白序列为基础,长度为30个的氨基酸,序列为EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK 。
3. 根据权利要求1或2所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽,其 特征是..所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽是多克隆抗血清或单克隆 抗体。
4. 权利要求1、或2所述的一种人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽的用 途,其特征是以所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的氨基酸序列为 基础作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型 人乳头瘤病毒及人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll的检测。
5. 权利要求1、或2所述的一种人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽的用 途,其特征是对所述人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的一个或多个氨基 酸残基进行变换后,作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克 隆抗体用于各型HPV及HPV Ll的检测。
6. 权利要求1、或2所述的一种人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽的用 途,其特征是以所述人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽为基本结构单元, 借连接段肽链连接,形成具有多个重复结构的蛋白或长肽,将此具有多 个重复结构单元的蛋白作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单 克隆抗体用于各型HPV及HPV Ll的检测。
7. 权利要求1、或2所述的一种人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽的用 途,其特征是将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽与具有佐剂效应 的蛋白相联接,形成融合蛋白,将此融合蛋白作为抗体诱导物,用所诱 导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型HPV及HPV Ll的检测。
8. 权利要求1或2所述的一种人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽的用途,其特征是将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽与化学合成佐剂或生物佐剂混合后使用,作为抗体诱导物,用所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型HPV及HPV Ll的检测。
9. 权利要求1或2所述的一种人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽的用 途,其特征是将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽作为抗体诱导物, 以所诱导的多克隆抗血清或单克隆抗体用于各型HPV或HPV Ll的分离、纯化。
10. 权利要求1或2所述的一种人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽的用 途,其特征是将所述的人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll短肽作为人乳头瘤病 毒抗血清或人乳头瘤病毒外壳蛋白Ll抗血清和单克隆抗体的被检测物。
全文摘要
本发明涉及一种多肽,具体地说是一种人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽及其应用。其特征是该人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽的序列为N端-EVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAK-C端。本发明能够同时诱导对高危型和低危型均能产生免疫反应的人乳头瘤病毒外壳蛋白L1短肽,它可以诱导形成针对多种型别人乳头瘤病毒(HPV)和外壳蛋白(HPVL1)的抗体,以便用于多种型别HPV或HPV L1的检测,这种抗体还可用于生物制药工程,用于多种型别HPV或HPV L1的纯化、制备。
文档编号C07K14/025GK101186636SQ20071016871
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月6日 优先权日2007年12月6日
发明者涛 万, 肖长义, 黄利鸣 申请人:三峡大学
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