专利名称：白细胞介素23-白细胞介素6融合蛋白及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种白细胞介素23 (IL-23) —白细胞介素6(IL-6)的融合蛋白，提供一种生物技术来制备白细胞介素23—白细胞介素6融合蛋白的方法。
背景技术：
以往研究表明IL-23是由p19和IL-12的p40亚单位通过二硫键相连组成的异二聚体。由活化的树突状细胞(DC)和巨噬细胞(M(p)产生，它能促进DC对肿瘤抗原肽的提呈，能影响T细胞的增殖，并且除了直接作用于T细胞外，IL-23还能通过DC来活化和调节T细胞依赖的免疫应答。另外，IL-23具有较强的抗肿瘤作用，IL-23因其所诱导的IFN，的产生较少及对APC的激活作用将有望成为肿瘤治疗中一种新的、更为安全的选择。IL-6是一具有明显抗肿瘤活性的生物免疫调节剂，属参与造血、免疫的多功能因子，其特点是抗肿瘤活性高，毒性作用小。新近研究证实，IL"6可直接作用于NK细胞，并促进其功能分化。
发明内容
本发明目的是提供一种白细胞介素23 (IL-23) —白细胞介素6〈IL-6)的融合蛋白，提供一种生物技术制备白细胞介素23 —白细胞介素6融合蛋白的方法。
本发明的目的是通过下述方法实现的我们以IL-23功能区特异性的上下游引物，通过RT-PCR合成包含信号肽序列及BamHI-EcoRI两个酶切位点的IL-23 cDM，同理以IL~€功能区特异性的上下游引物合成无信号肽序列的包含Xhol-Xbal两个酶切位点及终止密码子TGA的IL-6 cDNA 。经过纯化酶切，连接重组至表达载体pcDNA3.1(+)。将该pcDNA3.1(+)/IL-23-IL-6重组质粒转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO)进行表达，表达产物即为IL-23-IL-6融合蛋白。
IL-23-IL-6融合蛋白较IL-23、 IL-6单因子或双因子联合都有更多的生物学效应，达到了很好的协同效应。
具体实施例方式
以下对本发明作详细说明
一、 引物合成利用Sequce程序通过计算机分析确定转译的最佳起始区域，使其具有最小自由能，最佳碱基排列，确保两个引物之间，引物与模板之间具有最少的配对以避免扩增不必要的序列。在IL-23上游引物中导入Bamffl酶切位点，接着为起始密码子ATG及信号肽序列；在下游引物中导入EcoRI酶切位点。在IL-6上游引物中导入Xhol酶切位点；下游引物中导入终止密码子TGA及XbaI酶切位点。
二、 基因克隆通过RT-PCR合成包含信号肽序列及BamHI-EcoRI两个酶切位点的IL-23 cDNA，同理以IL-6功能区特异性的上下游引物合成无信号肽序列的包含XhoI-Xbal两个酶切位点及终止密码子TGA的IL-6cDNA,经过纯化，再以T-A克隆进行扩增，最后将该IL-23 cDNA与IL-6 cDNA分别克隆入pcDNA3.1 (+)表达载体，以BamHI-EcoRI和Xhol-Xbal双酶切鉴定及测序分析。
三、 真核细胞表达将上述阳性克隆转染CHO细胞表达，收集表达上清，以ELISA检测IL-23与IL-6的表达。
四、 纯化及活性鉴定对表达上清进行蛋白纯化，纯化后的蛋白进行淋巴细胞增殖试验，证实该表达产物可明显增强淋巴细胞增殖，且比单独的IL"23与IL-6效果更为明显。
权利要求
1、一种白细胞介素23—白细胞介素6(IL-23-IL-6)的融合蛋白，其特征在于由白细胞介素23与白细胞介素6多肽序列组成。
2、 如权利要求l所述的融合蛋白，其特征在于IL-23cDNA含起始密码子、信号肽序列 和双酶切位点。
3、 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于IL-6 cDNA含双酶切位点及终止密码子。
4、 一种白细胞介素23—白细胞介素6融合蛋白的制备方法，其特征在于IL-23、 IL-6 基因的克隆；融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定。
5、 如权利要求l所述的融合蛋白，其特征在于两因子融合有较好的协同抗肿瘤效应。
全文摘要
一种白细胞介素23(IL-23)-白细胞介素6(IL-6)的融合蛋白，通过RT-PCR合成IL-23与IL-6 cDNA，经过纯化扩增酶切，将两者连接重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)。该重组质粒的表达产物为IL-23-IL-6融合蛋白。它较IL-23、IL-6单因子有更好的协同抗肿瘤效果。
文档编号C07K19/00GK101469029SQ20071017346
公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月27日 优先权日2007年12月27日
发明者峰 李 申请人:上海汇康生物科技有限公司