专利名称：：新的通关藤提取物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新的通关藤提取物及其提取方法。背景介绍通关藤系萝摩科牛奶菜属植物，始载于《滇南本草》，主产于云南，又名通关散、通光藤、乌骨藤、通光散等。有消炎、清热解毒、止咳平喘、散结止痛等功效。以通关藤含有的独特的化学成分制备而成的中药消癌平，具有诱导和促使肿瘤细胞赖以分裂、扩散的载体微管蛋白聚合、微管装配与微管稳定的作用机制，从而铲除肿瘤细胞有丝分裂的原生动力。临床上用于治疗肝癌、胃癌等各种晚期恶性肿瘤已获良好疗效，其溶液能明显抑制肿瘤细胞，并能促进食欲，消除疼痛，使病灶稳定或缩小，是一种很有前途的抗癌中药。目前，国内有关通关藤化学成分的研究工作表明其藤、茎中含有(321甾体皂甙、生物碱、黄酮、多糖、树脂、色素及油脂等多种化学成分，但反映通关藤临床功效与药理作用的单体有效成分尚有待进一步明确。c2l甾体苷是通关藤主要抗癌活性成分之一。
发明内容本发明提供了新的通关藤提取物。本发明还提供了新的通关藤提取物的混合物。本发明还提供了包含新的通关藤提取物的药物组合物。本发明还提供了包含新的通关藤提取物的混合物的药物组合物。本发明还提供了新的通关藤提取物在抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了新的通关藤提取物的混合物在抗肿瘤药物中的应用。本发明所指的新的通关藤提取物，具有式I的结构通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中R,及R2分别如下:本发明的新的通关藤化合物的分离过程如下:通关藤藤茎，粉碎，用95%乙醇回流提取3次，每次2h，减压回收乙醇，得乙醇提取物。该提取物用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯部分。将乙酸乙酯部分进行硅胶柱层析分离，依次用石油醚丙酮(15:1，10:1，5:1，4:1，3:1，2:1，3:2，1:1，丙酮，V:V)梯度洗脱，按薄层同一斑点合并，得组分I、II。经过硅胶柱层析、反相柱层析、LH-20凝胶系统及半制备HPLC的分离、纯化，得到新化合物Sl、S2、S3、S4、S5。相关的鉴定数据如下<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>OCHj58.063-43(s，3H)5"7〗.443.70(m，lH)6"18.681.23(d，3H),OCH357.953.42(s，3H)化合物S3、S4和S5S3C-顧Rla37.961.70(m)lbl.OO(m)2a31—582b1.77(m)3376.93,64(m)4a33.CM1.98(ni)4b1.91(m)45.31.02(m;j6a3，1.66(m)6b1.3(m)24.531.62(m)7b875,589a46.451.21(m)1036.261U23,71.84(m)lib2.01(m)12a75.4(82(dd，J=2.5,12,5)1356.631487.9615a34.131.30(nO15b1.86〔m)16a28,7216b1.53(m)1787.96llib11.81i.eu(s)1%12.50.96(s)2070.983.67(n02]17.981.04(d，J=6.25)r165.72,130.133'129.54S.05(dd，J=1.03，8.28)S4H-NMRla38l,72(m)lb38l.OO(m)2a28.751,84匿1.85(m)2b28.751.53(likedd，J-1.03，11.07)3a77.073.64(m)4a24.551.60(m)4b24.55U7(m)5a45.361.03(m)6a34.151.84陽1.85(t06b34.15U9(m)7a33.951.87(m)7b33.951.67(m)875.619a46.51.22(m)1036.281u23.732,01(likcd，J=12,21)nb23.731,84-1.85(m)I2a75.434.82(likedd，J二4.51，11,32)1356.691487.9715a31.611.84-1.85(m〕15b31.611.77(m)16a33.041.97(m)16b33.041.91(m)1787.9718b11—78l-61(s)19b12.512070.962118].04(d,J=6.24)r165.722,130.2涯558"5(dt,J=lJ4，8夠S5C-N證H-丽R37.971.72(m)]bl.OO(m)2a28.761.84匿l,85(m)2bl邻ik:edd,J=1.03,11.07)377.063.64(m)4a24.55l,60(m)4bL.17(m〕545,361.03(m)6334.26b1.29(m)7233.947b1.67(it075-56946.561.22(ir01036.29Ua23.72.01(m)lib1.84-l.85(ir01275,164力9(dd，J=4.33，11.35)L356.481487.9431.611.84-l,85(m)15bL77(m)16a33.031.97(m)16b1.91(m)17881811.871.52(s)1912.530-97(s)2071.273.66(m)2117.751.08(d，〗=6.26)r166,062，117.486.42(d，J=15.94)3'了73(d,J=l—64,128.717.46(Uket，J=7.99)5'133.427.58(liket..l=7.45)r95.34.94(dd，J=l.84,9.59)2"a37.162.06(m)1.70(m)3,,66,54,23(Hked，J=2,94)4"82.653.19-3.21(m)5"68.023.78(m)6"18.191.23(d，J=6.22)r'98.25锡(dd,h〗.89,9,68)2"'a36.772,13(m)2"'b1.72(m)66.564.23(liked，J=2'94)4"'82.453.19-3.21(m)5,.,68.123.84(m>6"'18.191.23(d，J二6.22)r，〗00.134.53(dd，J=2.00，9.75)2'"'a35.751.52(m)2川'b2.36(m)3'"'71.653.33(m)79.173.36(m)v，'78.643.3S(m)6'"'18.571.35(d，J=5.65)Me56-09"9(s)the:1"■，,101.744.48(d,J=S.04;i2'""7丄"3.46(lilcet，JU)4',6'128.697.46(td，J=1.61,8.02)5'133'397.58(uJ,J-l,30'7.44)r95.394.93〔dd，J=1.89，9.5S)2"37」82.06(m)2,,37.83"66,444.22(iikeq，J=3.10)4"82.63.20(m)68.063.77(ddd，J=3,20>6.21，12.45)6"18,211.23(d，J，6'25)r'98.414.81〔dd，J=2.03,9.38)2"'35.772,,,35.771.60(m)3，"773.79(m)4"'82.53,22(m)5"'68.673.91(ddd，J二2.79，6.:21，12.32)6"'18-21L22(d,J=6，21)3'"扁0Me58.453-45(s)1l"l101.244.47(dd,J=l.90,9.73)35.S62.37(ddd，J=l.84,4.26,12.29)2""35.861,52(m)78.713.36(m)79.53.33(m)71.423.33(m)6""18.61.35(d,J二5.6)3""-0Me55.923.38(s)10L714.48(d，J:8)2"'"73—33站〔lilceq，J=S77)4,130.685',9'128.947-39(m)6'，8'128.317.54(m)7,134,097.39(m)r95,384.卿d，片1.89'9.59)37.182.0拳)2"b1.69(m)3"66.434.22(liked)4"82.65"68.063,77(ddd，J=3.20,6.21,12,45)6"18.181.23(d，J=6.24)r'98.44,引(dd，J=l.94,9.72)2"'a2.11〔m)2'"b35.761.60〔m)3,,,773.79(m)4','82.483.22(m)5,,68.663.91(ddd，J=2.79，6.21，12.32)6"'18.221"(d，J=6.24)丁.58—46345(s)10U44.47(dd，J=l.90,9.73)2'"'a2.37(m)2"'t)35.851.52(m)3'"'78.713.36(m)4'"，79.473'33(m)si"'71.423.33(m)6""18,61.35(d，J=5,5)7""".92"卿7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本发明的新的通关藤化合物在分离的过程中可形成多组分的混合物，包括上述提及的化合物S1、S2、S3、S4、S5本发明的新的通关藤化合物或其混合物可与药学上可接受的载体形成组合物。根据本领域内技术人员熟知的细胞毒活性化合物的常规筛选方法，通过体外多种肿瘤细胞株的筛选研究，研究人员发现，式I化合物具有一定的抗肿瘤活性，可作为抗肿瘤药物的候选药。具体实施例方式以下通过实施例对本发明做进一步的说明。本发明中没有具体描述的提取、分离方法均为本领域普通技术人员熟知的方法，本领域普通技术人员可以根据说明书的提示采用药典规定的方法或者其他操作规程限定的方法结合所使用仪器的说明书进行操作，即可实现本发明。实施例1粗分组分的制备通关藤藤茎30kg，粉碎，用95%乙醇回流提取3次，每次2h,减压回收乙醇，得乙醇提取物。该提取物用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯部分400g。将乙酸乙酯部分进行硅胶注层析分离，依次用石油醚丙酮(15:1，10:1，5:1,4:1,3:1,2:1，3:2,1:1，丙酮，V，V)梯度洗脱.按薄层同一斑点合并，得^B分I(7.985g)、II(26g)。实施例2化合物S1的分离将组分I(7.985g)，依次经硅胶柱层析〔氯仿甲醇石油醚(40:1:40)洗脱〕、凝胶柱层析(二氯甲烷:甲醇(l:l)洗脱)、反相柱层析(73%甲醇洗脱)、甲醇凝胶柱层析分离纯化，按薄层同一斑点合并，得到化合物S1(12mg)。实施例3化合物S2的分离将组分I(7.985g)，依次经硅胶柱层析(氯仿甲醇石油醚(40:1:40)洗脱〕、凝胶柱层析〔二氯甲垸:甲醇(l:l)洗脱)、反相柱层析(73%甲醇洗脱〕、硅胶柱层析〔石油醚丙酮氯仿(8:1.4:1)洗脱)分离纯化，按薄层同一斑点合并，得化合物S2(10mg)。实施例4化合物S3的分离将组分II(26g)，依次经硅胶柱层析(氯仿甲醇(30:1)洗脱〕、反相柱层析〔38%丙酮洗脱)、硅胶柱层析〔正己烷石油醚丙酮(4:2.3:3.5)洗脱〕，按薄层同一斑点合并，得到化合物S3(7mg)。实施例5化合物S4的分离将组分II(26g),依次经硅胶柱层析〔氯仿甲醇(30:1)洗脱)、反相柱层析(48%丙酮洗脱)、硅胶柱层析〔石油醚甲醇氯仿(15:1:15)洗脱〕，按薄层同一斑点合并，得到化合物S4(13mg)。实施例6化合物S5的分离将组分II(26g),依次经硅胶柱层析(氯仿甲醇(30:1)洗脱〕、反相柱层析(48%丙酮洗脱)、甲醇凝胶柱脱色、硅胶柱层析(氯仿甲醇(55:1)洗脱〕、氯仿甲醇(1:1)凝胶柱纯化，按薄层同一斑点合并，得到化合物S5(12mg)。实施例7活性实验筛选的细胞株有人肝癌细胞株(Bel-7402)，人非小细胞肺癌细胞株(A549)，人胃癌细胞株(SGC-7901)。测定按常规采用SRB法。材料细胞株(共3株)1.1人非小细胞肺癌细胞株(A549)1.2人肝癌细胞株(Bel-7402)1.3人胃癌细胞株(SGC-7901)以上细胞株用相应培养基，于37'C，5%C02的培养箱中培养。2.药物化合物S1、S2、S3、S4、S53.试剂3.1RPMI1640培养基(RPMI1640+10。/。小牛血清+HEPES3.5g/l+NaHC032.2g/l+青霉素0.13g/l+链霉素0.15g/l)。3.2高糖DMEM培养基(DMEM+10%小牛血清+HEPES3.5g/l+NaHCO32.2g/l+青霉素0.13g/I+链霉素0.15g/I)。3.3胰酶、DMSO4.设备4.1C02培养箱、无菌操作台、酶标仪、离心机等。4.2移液枪、移液管、离心管、96孔板等。二.方法2.1操作步骤2丄1接禾中取处于指数生长期，状态良好的细胞一瓶，加入适量胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，用含10。/。小牛血清的RPMI1640(或DMEM)培养液配成细胞悬液，计数，并将细胞密度调整稀释至一定浓度.取细胞悬液接种于96孔板上，180ul/孔。2丄2培养将培养板转入恒温C02培养箱中，在37'C，5%(302及饱和湿度条件下培养24小时。2丄3初筛加药受试23种化合物先用DMSO配制成0.1M浓度，再作5个稀释度，用于筛选(浓度见结果)。加入受试化合物，20ul/孔，培养72小时。每组设3个平行孔，并重复3次。2丄4染色将96孔板各孔接种细胞加TCA固定1h，水洗5遍干燥，加SRB染色15min，醋酸洗涤5遍干燥，Tris溶解。2丄5测定酶标仪设定波长为490nm,测定96孔板每孔吸光值，记录结果并计算细胞抑制率，10以判断受试药物的抗肿瘤活性。2.2注意事项2.2.1细胞悬液需充分混匀，以避免各孔之间细胞分布不均，加细胞的过程应控制在4小时以内，避免细胞活性受损。2.2.2各板需单独设定空白对照及阴性对照。2.3数据处理2.3.1细胞抑制率的计算对照组平均OD值-给药组平均OD值抑制率=-------------------------------------------------------------xl00%对照组平均OD值.2.3.2IC5o的计算根据SPSS软件计算所得。活性筛选结果(IC5G吗/ml)__化合物非小细胞肺癌A549人肝癌Bel-7402人胃癌SGC-7901Sl85.847.4380S283.183.188.9S3跳511096.6S4103.28797.8S5101.695.389.61权利要求1、从通关藤中提取分离的化合物，具有式I结构其特征是R1及R2分别如下2、一种从通关藤中提取的混合物，其特征在于包含权利要求1所述的化合物。3、一种药物组合物，其特征在于包括权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。4、一种药物组合物，其特征在于包括权利要求2所述的混合物和药学上可接受的载体。5、权利要求l的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。6、权利要求2的混合物在制备抗肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明提供了具有式I结构的新的通关藤化合物及其混合物，或与药学上可接受的载体构成的组合物，以及它们在抗肿瘤药物中的应用。文档编号C07J17/00GK101463060SQ20071019148公开日2009年6月24日申请日期2007年12月20日优先权日2007年12月20日发明者张安元,檀爱民,华章申请人:江苏先声药物研究有限公司