专利名称：：一类新型埃坡霉素化合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一类新型聚酮化合物，特别涉及一系列新型埃坡霉素化合物，以及这类化合物的制备方法，和该化合物在制备抗肿瘤，抑制细胞过度增长和中止细胞生长的药物组合物中的应用。
背景技术：
：埃坡霉素A(EpoA)和埃坡霉素B(EpoB)为聚酮化合物衍生的16元大环内酯新型化合物，最初从土壤细菌纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)菌株Soce90中分离出来，其结构式如下所示。它们为最先被分离，合成并确证的埃坡霉素，(Hofleetal.,1996,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35(13/14):1567-1569;Gerthetal.,1996.J.Antibiotics49(6):560-563)。聚酮化合物在自然界存在于多种生物体中，由聚酮化合物合成酶合成。聚酮化合物合成酶通常被简称为PKS(polyketidesynthase)。OOH0EpoA:R=H;EpoB:R=CH3埃坡霉素A和B对治疗癌症有巨大的潜能。虽然在结构上不相似，但埃坡霉素族的作用机理和有名的癌症药物紫杉醇(paditaxd,Taxol)极为相似，包括诱导微管蛋白聚合，以及稳定微管形成(microtubuleassembly)。这些化合物表现出对不同癌细胞系的强大细胞杀伤力。特别是，它们对具有多种癌症药物耐药性(MDR)的肿瘤细胞系，尤其是对耐紫杉醇和其它抗癌药物的肿瘤细胞系，显示出引人注目的效果(AI加annetal.,2000.Biochem.Biophys.Acta.1470(3):M79-91;Bollagetal"CancerRes.55(11):2325-2333)。埃坡霉素A和B的脱氧配对物，也称为埃坡霉素C和D，已经成功地被化学全合成，但也能从天然的埃坡霉素产生菌株S.cdlulosum的发酵提取物中，和许多作为微量组分的其它埃坡霉素类似结构一起检测到。与埃坡霉素B相比，埃坡霉素D表现出类似的抗癌活性，但细胞毒性较小。美国专利US5843718和US6033883中描述了在重组宿主细胞内重组modularPKS基因而生产新型聚酮化合物，以及在宿主细胞体内，如链霉菌(Streptomyces),大肠杆菌(E.coli)及粘细菌(Myxobacterial)中引入异源PKS基因而生产聚酮化合物的重组方法，其中埃坡霉素的生物合成酶(聚酮化合物合成酶PKS)是由5个基因产物(epoA,B,C,D和E)所组成的多功能，多蛋白复合体。在不能生产埃坡霉素的宿主细胞内，如链霉菌Streptomycescoelicolor禾口茅占细菌黄色禾占球菌(Myxococcusxanthus)中，通过引入异源埃坡霉素基因并表达而生产埃坡霉素A和B已有报道(Tang,etal.Science287:640-642;Mien&Shah,2002,Amtimicrobial.AgentChemother.46(9):2772-2778，列于此以作参考)。目前，人们正致力于开发作为更加有效的化疗试剂的埃坡霉素和其相关结构的类似物，如通过化学半合成可对天然存在的埃坡霉素化合物进行修饰。PCT出版物WO99/27890中描述了埃坡霉素A和B转化成为相应的内酰胺类似物的转化反应。本发明的目的在于提供一系列新型埃坡霉素化合物；并提供了该类化合物的生产制备方法该方法用于制备这类新型埃坡霉素化合物中的4一脱甲基埃坡霉素D或B及相应的唑配对物，以及采用化学修饰或生物转化的方法从埃坡霉素D或B及4一脱甲基埃坡霉素D或B中，制得本发明的其它新型埃坡霉素化合物；本发明进一步提供了这类新型埃坡霉素化合物在制备抗肿瘤，抑制细胞过度增长和中止细胞生长的药物组合物中的应用。本发明提供的埃坡霉素衍生物，具有如下通式(I)
发明内容Q和R1独立地选自H，C卜4烷基或NH2中的任意一种，R4不存在，或当A-D为C-C单键时，R4为羟基基团；R2,R3各自独立地选自H，羟基，NH2和CH3;X为O或N-R,其中R为H,NH2，芳基，或CH3;W为S或O。所述的具有通式(I)的埃坡霉素衍生物，可以是为4一脱甲基埃坡霉氣见下式(II)。Q独立地选自H，C卜4垸基或NH2中的任意一种，R4不存在，或当A-D为C-C单键时，R4为羟基基团；R2,R3各自独立地选自H，羟基，NH2和CH3;X为O或N-R,其中R为H,NH2，芳基，或CH3;W为S或O。其中，4一脱甲基埃坡霉素D[见图11中式19]或B[见图11中式17]式(II)其中，A-D为下述式(a)的碳碳双键或为式(b)的环氧基团:可以通过发本发明所述的重组基因工程菌株发酵获得。在本发明较合适的实施例中，采用重组的黄色粘球菌或纤维堆囊菌基因工程菌株制备4一脱甲基埃坡霉素D或B。本发明提供的重组基因工程菌株，包含了一种修饰后的埃坡霉素PKS基因，所修饰的基因是通过DNA重组技术使宿主细胞中的埃坡霉素PKS基因中第8组件(module8)的转甲基功能基团(methyl-transferase，MTdomain)的DNA序列通过突变，缺失或取代而失活,从而使宿主细胞中的埃坡霉素PKS基因被修饰的埃坡霉素PKS基因替代。其中宿主细胞是包含埃坡霉素PKS基因并生产埃坡霉素的任何细胞。所述的宿主细胞可以是黄色粘球菌细胞或纤维堆囊菌细胞。本发明提供的基因工程菌株是通过重组技术获得的，该技术利用同源重组的方法将所需被改变的基因或功能基团的相邻区域克隆到自杀载体中，通过自杀载体中的基因与宿主细胞核所含基因组中的同源基因进行双杂交重组，导致参与埃坡霉素生物合成的一个或多个基因或功能基团失活或被取代，而得到重组的基因工程生产菌株。例如，用一个对丙二酰辅酶A(malonyl-CoA)特异的酰化酶(acyl-transfemse，ATdomain)功能基团取代对甲基丙二酰辅酶A(methylmalonyl-CoA)特异的AT功能基团或使MT功能基团失活。这种失活作用可通过随机或点基因突变，缺失或取代来完成。由此得到的重组PKS不同于天然的PKS，它可以在重组宿主细胞中生产以埃坡霉素衍生物为主要产物，其衍生物在埃坡霉素相应的C-4部位缺少一个或两个甲基基团。例如，包含有埃坡霉素PKS合成基因的宿主细胞M.xanthus，可产生埃坡霉素B为主要产物，当其中埃坡霉素PKS中第8功能单位(module8)的MT功能基团的DNA序列发生缺失致使失活，从而该重组菌株合成4-脱甲基-埃坡霉素B和D为主要产物。所述的通式(II)化合物进一步优选W=0也就是4-脱甲基-埃坡霉素的唑配对物(oxazole)[例如式18,20]，它是利用重组的黄色粘球菌细胞或纤维堆囊菌细胞，通过改变发酵条件而获得。本发明的其它化合物可通过对例如S.cellulosum天然生产菌株，或其它遗传工程菌株发酵制备的化合物，或化学合成的化合物进行进一步的化学修饰或微生物转化而制得。通式(I)化合物进一步优选7-0-甲基-12-羟基埃坡霉素(BGE8[式5])、BGE5[式21]。该类化合物可通过实施例5中描述的微生物转化方法制得。BGE5结构如下通式(I)化合物进一步优选4-脱甲基，21-羟基埃坡霉素B[式14]。该类化合物可通过实施例6中描述的微生物转化方法制得。通式(I)化合物进一步优选4-脱甲基，14-羟基埃坡霉素D。使用一种来源于微生物的羟化酶使4-脱甲基-埃坡霉素D的C-14羟基化，可获得该化合物。此类转化的示例性的方法在实施例7中描述以埃坡霉素D制备出14-羟基埃坡霉素D,结构式如下通式(I)化合物进一步优选化合物的环氧化物(12，13-环氧衍生物)。该类化合物可通过实施例8中描述的化学反应式的环氧化方法制得。通式(I)化合物进一步优选7-0-甲基埃坡霉素衍生物。该类化合物可通过实施例11中化学反应式描述的通用方法制得。通式(I)化合物进一步优选12-羟基埃坡霉素衍生物。该类化合物可通过实施例12中化学反应式描述的通用方法制得。通式(I)化合物进一步优选7-0-甲基埃坡霉素衍生物。该类化合物可通过实施例11中化学反应式描述的通用方法制得。通式(I)化合物进一步优选4-脱甲基，21-羟基埃坡霉素衍生物和4-脱甲基，21-氨基埃坡霉素衍生物。该类化合物可通过实施例13中化学反应式描述的通用方法制得。另外，使用来自于微生物的羟化酶使噻唑部分(thiozole)的甲基端基基团发生羟基化，也可获得4-脱甲基,21-羟基埃坡霉素衍生物。本发明进一步提供了具有通式(I)的埃坡霉素衍生物在制备抗肿瘤，抑制细胞过度增长和中止细胞生长的药物组合物中的应用。本发明所述的药物组合物通常包括一定数量的本发明提供的埃坡霉素衍生物和药学上可接受的载体。本发明的化合物可以是自由形式或者药物可接受的载体，如前体药物(prodrugs)和本发明化合物的盐和酯。化合物可以是任何形态的，如固态，半固态或液态。本发明的化合物可以采用其它如已知的制备低水溶性药物的制剂方法制得。例如，化合物可以和维生素E和/或PEG聚丙烯酸衍生物形成乳剂(参见文献WO00/71163和US6458373Bl)。通常，先将本发明的化合物溶于乙醇，然后加入维生素E和/或PEG聚丙烯酸衍生物形成治疗剂溶液。将乙醇去除，然后形成前体乳剂或者加入含表面活性剂(稳定剂)的水溶液来形成前体乳剂。用于静脉注射的给药方式，可将前体乳剂分散形成均匀的乳剂。用于口服药剂，前体乳剂一般置于凝胶胶囊中。埃坡霉素族的作用机理和癌症药物紫杉醇(paclitaxd,Taxol)极为相同，主要是通过诱导微管蛋白聚合以及稳定微管装配(microtubuleassembly),从而干扰细胞微管的功能。这就导致了对细胞分裂和细胞迁移以及胞内的信号传递和蛋白分泌的抑制，因为这些行为都有赖于微管快速和高效的解聚。一方面，本发明化合物可用于治疗癌症，包括头部和颈部；肝和胆部的癌症；乳腺癌，卵巢癌，肺癌，脑癌，肠癌，白血病，恶性肿瘤，以及淋巴瘤。该方法包括给癌症患者服用治疗有效量的本发明化合物。如果必要的话，该方法可以重复使用，以防止癌扩散或者是根治癌症。另一方面，本发明的化合物和组合物可以单独使用，也可以与其它抗癌药物或疗法共同使用。多重抗药性使常规化疗药对病人不起作用，这种抗药性的产生是因为药物被P—糖蛋白排出细胞外。埃坡霉素可以和其它抗癌药物和治疗手段联合使用，用于治疗癌症以及其它增生疾病，以增强其它化疗剂的药效，以及对控制多重抗药性非常有用。例如，可以和本发明的化合物一起用于联合治疗的其它化疗药可选自抗代谢物，如5-氟尿嘧啶和健泽(Gemcitabine)，或者选自垸化剂如卡铂(Carboplatin)和顺铂(Cisplatin),或者选自信号传导抑制剂如Iressa,Herceptin和geldanamycin衍生物。联合疗法可以采用先后给药的方式，即先用第一种药剂治疗后再用第二种药剂；也可以是两种药剂同时使用。另一方面，本发明的化合物可用于治疗以细胞过度增生为特征的非癌类疾病。在本发明的一方面，本发明描述的化合物用于包覆支架，类似于线-网管，用于中止细胞生长，以及防止再狭窄或动脉的再阻塞。临床试验上，本发明的化合物会导致一种或几种如下现象(i)增加动脉血流；(ii)减轻疾病的临床症状；(iii)降低心瓣手术后的再狭窄速率；或(iv)阻止/减轻慢性动脉硬化症的进程。图1A为实施例1中从QTB5培养物XAD洗脱液获得的产品的HPLC图.图1B为4-脱甲基埃坡霉素B的质谱图倒1C为4-脱甲基埃坡霉素D-2的质谱图图2A为4-脱甲基埃坡霉素D-l的色谱图图2B为4-脱甲基埃坡霉素D-l的LC/MS图图3为4-脱甲基埃坡霉素D-l的^-NMR图图4A为4-脱甲基埃坡霉素D-2的色谱图图4B为4-脱甲基埃坡霉素D-2的LC/MS图图5为4-脱甲基埃坡霉素D-2的'H-NMR图图6A为4-脱甲基埃坡霉素B的色谱图图6B为4-脱甲基埃坡霉素B的LC/MS图图7A为7-0-甲基-12-羟基埃坡霉素(BGE8)的色谱图图7B为7-0-甲基-12-羟基埃坡霉素的LC/MS图图8为7-0-甲基-12-羟基埃坡霉素的1H-NMR图图9A为化合物BGE5的色谱图图9B为化合物BGE5的LC/MS图图10为化合物BGE5的"H-NMR图图11为化合物式1至式24的结构式具体实施例方式实施例1从Mx""A^基因工程菌制备脱甲基埃坡霉素及其类似物本实施例描述了构建产4-脱甲基-埃坡霉素的M.xanthus生产菌株。此构建采用同源重组的方法使埃坡霉素PKS基因中第8功能单位(module8)的MT功能基团缺失。埃坡霉素PKS的第8功能单位包括了一个ketoreductasedomain(KS功能基团)，一个甲基丙二酰辅酶A特异的AT功能基团，一个导致在埃坡霉素C4位上形成对二甲基的MT功能基团(甲基转移酶功能团)。本实施例的方法使用能生产埃坡霉素的M宿主菌进行基因操作。用于本发明的埃坡霉素生物合成的埃坡霉素PKS基因和DNA序列可从天然资源，如从埃坡霉素生产菌株S.cellulosum中获得。从埃坡霉素天然生产菌株纤维堆囊菌Soce90中制备得到总DNA，方法参见文献Jaonaetal.,1992,Plasmid28:157-165.通过使埃坡霉素PKS中第8功能单位(module8的MT功能基团的DNA序列发生缺失致使MT功能失活来构建菌株。MT功能基团相邻区域的DNA序列通过PCR方法来克隆，其寡核苷酸引物是OBG-1,5，-TCCCATGGCGAAGCCGTGTTGC;禾卩OBG-2,5，-TTCCATGGACCGGAGGGCATCC。所得到的2.94kb的PCR片段经Ncol酶解，克隆到Ncol处理过的pLitmus28中得到质粒pBG101。然后用EcoRV部分酶解pBGlOl，将消化后的2.78kb大片段连接得到pBG102，由此而引入MT功能基团DNA序列的缺失。pBG102先用HindIII-AvrII酶解，将2.78kb的DNA片段克隆到一pLitmus28衍生载体的Spel-HindlII位点，其中该衍生载体在Dral位点含有3kb的卡那霉素抗性基因和galK基因(KG基因，Uekiet.al,1996，Gene183:153-157)，而得到转化质粒pBG103，利用电穿孔技术(electroporation)将质粒pBG103转入到生产埃坡霉素B的菌株Mx朋//^Klll-32(Jelien&Shah,Antimicrobial.AgentsChemother.46:2772-2778)。筛选转化子，挑选出卡那霉素敏感的和半乳糖抗性的存活子，从中鉴定除去KG基因的克隆菌株。将重组菌株接种到玻璃试管中的含有5mlCYE的种子培养基中，该培养基包括10g/1酪蛋白消化液(MarcorTypeM),5g/1酵母提取物(Difco)，2g/1MgS04*7H20，50mMHEPES缓冲液，pH7.6。细胞在3(TC，200rpm的摇床中培养3天，然后种子培养液用于接种50ml的CTS培养基，培养7天，该培养基包括5g/1酪蛋白消化液(MarcorTypeM)，2g/lMgS047H20和50mMHEPES缓冲液，pH7.6，以及2%XAD-16。从培养液收集XAD-16，并用10ml的甲醇从XAD中洗脱埃坡霉素等代谢产物。用HPLC和质谱分析甲醇提取物。由此获得一株命名为QTB5的工程菌能产生4-脱甲基埃坡霉素。图1A是在下述的HPLC条件下，从QTB5培养物XAD洗脱液获得的产品的HPLC总离子色谱。图1B和图1C是化合物4-脱甲基埃坡霉素B[式17]和4-脱甲基埃坡霉素D[式19]的质谱。化合物的HPLC色谱分析:先进行小规模的发酵(50ml规模)，用LC/MS和HPLC来鉴定遗传工程菌株生产的新产物。样品先通过一个4.6X10隨的前置保护柱(guardcolumn,Inertsil,ODS-3,5um)，然后通过一个分离柱(4.6X150醒，Inertsil,ODS陽3，5um)，以35%-100%乙腈浓度剃度，流速lml/min，经过进行洗脱达十几分钟并在UV250nm下监测。在此条件下，埃坡霉素D在9.9分钟洗脱出来，4-脱甲基埃坡霉素D的两个异构体在8.8分钟和9.0分钟洗脱出来，4-脱甲基埃坡霉素B在6.5分钟洗脱出来。化合物的结构说明&NMR(400MHz)的数据，以QNPzaxis梯度探测头装备的BrukerDRX400分光计在300K下CDC13溶液环境下测得的。CDCl3溶液的化学变化指iH谱中的S7.26。用AppliedBiosystemsMarinerTOF分光计通过手动峰匹配(manualpeaking-matching)，在采用负离子模式涡轮-离子喷射源(trubo-ionspraysource)(喷射端电压,5500V;喷腔温度400°C;喷嘴电压,110V)，由FIA获得HRMS谱。实施例2.从M.xanthusQTB5菌株制备并提纯4-脱甲基埃坡霉素本实施例描述了从遗传工程菌株M.xanthus分离和发酵本发明化合物。包含有埃坡霉素PKS合成基因的宿主菌M.xanthus，可产生主要产物为埃坡霉素B，当其中埃坡霉素PKS中第8功能单位(module8)的MT功能基团的DNA序列发生缺失致使失活，从而该重组生产菌株生产了4-脱甲基-埃坡霉素B和D为主要产物。本实施例描述的由M.xanthusQTB5菌株生产4-脱甲基埃坡霉素D和B的发酵及提纯过程如下。从新鲜的CYE培养基平板上将菌体转移至装有5mlCYE和l滴油酸甲酯(10(il)的玻璃培养试管中，细胞培养2—5天(30。C，175rpm)，直至在显微镜下观察到培养液变稠。然后将整个试管内的培养液转移到含有45mlCYE和100^1油酸甲酯的烧瓶中，经过48+/—12小时的生长(30°C，175rpm)后，培养液可用于制备冷冻储存的含20%甘油的细胞库。如果用于发酵罐接种的种子液，根据需要可进行进一步的种子扩增。用在冯马赫瓶(Fernbachflask)中的0.45L种子液(接种量为10%)接种装有4.0L种子培养基的5L种子发酵罐。在100L发酵罐中发酵时，发酵罐中使用的生产培养基为CTS培养基，及2XXAD-16，加上微量元素溶液4ml/1和油酸甲酯2ml/1。微量元素溶液浓H2SO4,10ml/l;FeCl3.6H20,14.6g/l;ZnCl2,2g/l;MnCl2.4H20,lg/l;CuCl2.2H20,0.42g/l;H3B03,0.31g/l;CaCl2.6H20,0.24g/l和Na2Mo04.2H20，0.24g/l。在100L发酵罐中添加酪蛋白消化液(MacroTypeM)和油酸甲酯进行补料分批发酵的主要操作过程如下对装有1.6kg的XAD-16(Rohm和Haas)及65L水的发酵罐(B.Bman)中进行高压灭菌。将过滤灭菌(通过预先灭菌的0.2微米聚醚砜膜囊过滤)后的0.3L微量金属溶液和足量的MgSO4溶液(到最终浓度2g/1)，直接加入发酵容器中。在10L的进料罐中对15g/L的酪蛋白消化液和175ml/L的油酸甲酯的混合液5L进行灭菌后，将3.2L的混合液加入100L发酵器中，使最终浓度分别各为5g/L和2ml/L。将水过滤后(使用同样的囊过滤器)注入容器中，使发酵容器的最终体积为70L。设定发酵罐中的搅拌速度为200rpm，喷射速度保持在0.1v/v/m。罐压力保持在100—300mbar。控制pH通过加入2.5N氢氧化钾和2.5N硫酸使pH保持在pH7.4。温度设定为30°C，通过调控搅拌速率200—400rpm和气流23—100Lpm，使溶解的氧保持在50%或略高于50%的饱和度。然后从5L发酵罐中的4L种子培养物接种(接种量为5%)到100L的发酵罐中。接种一天后，每隔1小时将酪蛋白消化液(150g/L)和油酸甲酯的混合物加入到发酵罐中，喂料速度为酪蛋白消化液2g/L/天，油酸甲酯3ml/L/天。接种后约12天，发酵中止收集XAD-16获得代谢产物。此方法获得的主要产物为4-脱甲基埃坡霉素D，有两种异构体产物，各占10-15mg/L，而4-脱甲基埃坡霉素B为2-3mg/L。4-脱甲基埃坡霉素类似物的鉴定和分离从发酵培养物中的分离和提纯方法包括以下的物质和步骤(1)从发酵培养物中用滤篮(150pm)收集XAD-16，堆入柱中，用3倍柱体积的水洗涤(1L/分钟)。用75%的甲醇水溶液17升洗脱产物(最后的流速保持在1L/分钟)(压力过高时可能需要重新堆柱)。(2)用50%的甲醇水溶液稀释产品库，并装载入柱(AmiconVA180)中，柱中装有0.5L预先被5倍柱体积的50。/。甲醇水溶液平衡过的HP20SS树脂(Mitsubishi),装载后(装载流速为1L/分钟)，用1.3L60。/。的甲醇洗涤，然后用8L75。/。的甲醇洗脱(流速325ml/分钟)。用UV250nm监测仪监测馏分，得到的含有代谢产物的部分在Buchi-Rotavapaor旋转蒸发器上，真空条件下将产品库浓縮为油状，必要时，加入乙醇以减少发泡。(3)用100ml甲醇重新悬浮干燥后的物质，并稀释至45%甲醇溶液，将得到的溶液装载到0.1LC18反相色谱柱上(55x4.8cm,Bakerbond，40fmi)，该色谱柱预先被3体积45%的甲醇溶液平衡过(装载流速平均为100ml/分钟)。用0.2L45%的甲醇洗涤，并依次用0.5L50%,1.1L55%,1.3L60%,0.5L65%的甲醇(流速为100mL/分钟)洗脱装载柱。对得到的产品库部分进行色谱分析，并顺次得到4-脱甲基埃坡霉素B，4-脱甲基埃坡霉素Cl，C2及4-脱甲基埃坡霉素Dl,D2.必要时对各产品库进行进一步分离。将各产品库稀释至40%，用泵打入70ml的C18反相色谱柱上(9xl0cm)，流速平均为360ml/分钟。用0.1L40X的甲醇洗涤，并用350mllOO。/。的乙醇洗脱装载柱。用旋转蒸发器将洗脱液蒸发至干燥。(4)在10ml丙酮中重悬浮固体，用Whatman2号滤纸过滤除去不溶物。丙酮抽提之后，在滤液中加入0.2§脱色碳。搅拌该混合物达1小时，然后用Whatman50号滤纸过滤。合并滤液并旋转蒸发至干燥.(4B，任选的)。将干燥的物质(4-脱甲基埃坡霉素D或B)在5L50%甲醇中重新悬浮，并装载到预先被3体积50%甲醇溶液平衡过的0.1LC18柱(55x4.8cm)上(装载流速平均为80ml/分钟)。继而用用0.1L50X的甲醇洗涤，并用65%的甲醇等度洗脱装载柱。(5)在良好的搅拌下，在大口杯中以15ml100%的乙醇重悬浮干燥物，并缓缓加入17ml的水。必要时加入少量(lmg)晶种以促进晶体的形成。埃坡霉素类似物的特征4-脱甲基埃坡霉素D-l[式19]:HRESITOFMSm/z;C26H4()N05S计算值478.2638;[M+H]+478.2622。4-脱甲基埃坡霉素D-l的色谱图，LC/MS以及JH-NMR的数据分别见图2A,图2B和图3所示。4-脱甲基埃坡霉素D-2[式19]:HRESITOFMSm/z;C26H4oN05S计算值478.2638;[M+H]+478.2622。4-脱甲基埃坡霉素D-2的色谱图，LC/MS以及^-NMR的数据分别见图4A,图4B和图5所示。4-脱甲基埃坡霉素B[式17]:色谱图和LC/MS数据分别见图6A和图6B所示。实施例3.利用S.cellulosum基因工程菌生产4-脱甲基埃坡霉素类似物本实施例描述了从埃坡霉素生产菌株S.cellulosum，通过基因重组技术使其在埃坡霉素的PKS中第8功能单位(module8)的MT功能基团的DNA序列发生缺失，从而该生产菌株产生4-脱甲基-埃坡霉素为主要产物。如在M.xanthus重组菌株中描述的一样，S.cellulosum的埃坡霉素PKS基因中第8功能单位(module8)的MT功能基团发生突变或缺失，构建产生4-脱甲基-埃坡霉素或其类似物的菌株。S.cellulosum的发酵条件参考PCT:WO93/101021中以及Gerthetal.,1996,J.ofAntibiotics,49:560-563中所描述的流程。本实施例构建产生4-脱甲基埃坡霉素的S.cellulosumSoce90的遗传工程菌株方法如下。与QTB5菌株构建相类似，含有MT功能基团缺失的质粒pBG102中的2.78kb片断被克隆至质粒pBG105中，其pBG105包括有来自Tn5的卡那霉素和博来霉素抗性标记和结合源RP4-oriT以形成质粒pBG106。质粒pBG106被转移导入到E.coliED8767中，其含有辅助质粒pUZ8(HedgesandMatthew,1979,Plasmid2:269-278)，该辅助质粒为质粒的转移提供了异体转移的功能，参见Jaouaetal.1992,Plasmid28:157-165。得到的重组E.coli菌在与作为供体的抗链霉素突变的S.cellulosumSoce90菌的结合试验(conjugate)中进行交配，该S.cellulosumSoce90利用抗链霉素的特征可进行选择性筛选掏汰作为受体的E.coli菌而筛选抗链霉素，卡那霉素和博来霉素的结合子。为了交配结合，约5X1(^的S.cellulosum细胞以l:1的细胞比例和重组E.coli菌混合，该S.cellulosum细胞来自生长在30。C的早稳定期的培养液。然后，培养液在4000rpm的速度离心10分钟，重新悬浮在0.5mlG51b培养基(0.2%葡萄糖，0.5%淀粉，0.2%蛋白胨，0.1%probion,0.05%CaCl2.2H2O,0.05%MgS04.7H20，1.2%HEPES,Ph7.4)中，并点滴在含有50mg/l卡那霉素的SolE琼脂培养基的平板中心。SolE琼脂培养基0.35%葡萄糖，0.05%胰化蛋白，0.15%MgSO4.7H2O，0.05%硫酸铵，0.1%CaCl2，0.006%K2HPO4，0.01%连二亚硫酸钠，0.0008%Fe-EDTA，1.2%HEPES，3.5%(v/v)无菌稳态S.cellulosum培养物悬浮液，pH调节至7.4。收集在30°C培养24小时后的细胞，并重新悬浮在0.8mlG51B培养基中，将0.1—0.3ml的悬浮液平铺于含有选择药物[腐草霉素(30mg/l)，链霉素(300mg/l)，卡那霉素(50mg/l)]的固体培养基平板上，经过30。C培养8—12天后，在选择平板上生长的菌落用塑料环分离，划线在同样的选择培养基上进行第二轮选择和提纯。如此在选择的琼脂培养基培养7天后得到的菌落应是通过同源重组将转入的质粒整合入染色体中的结合子。经过在液体培养基中的几代非选择性培养生长之后，培养物经过适当的稀释后平铺在SolE琼脂上，以分离腐草霉素-敏感的重组菌落，其重组菌落已经经过了使整合的质粒缺失的第二次同源重组。在分离出的三种腐草霉素敏感菌落中，其中两个回复到野生的类型以生产埃坡霉素A和B为主要产物，然而剩余的一个具有期望的重组突变，在其染色体的埃坡霉素基因伴随有MT的缺失。突变菌被指定为QTBG2。用HPLC分析，确认QTBG2摇瓶培养物中以生产4-脱甲基埃坡霉素A，B，C和D为主要产物。以下的方法用于从S.cellulosum重组菌株QTBG2发酵中分离埃坡素类似物。中间培养基G52:低盐酵母提取物(BioSpringer,MaisonAlfort,France)0.2%,MgS04.7H200.1%,CaCl2.2H20lg，脱脂大豆粉Soyamine50T(LucasMeyer,Hamburg,Germany)0.2%，马铃薯淀粉NoreduxA-150(Blattmann,Eaedenswil,Swizerland)0.8%，无水葡萄糖0.2%，EDTA-Fe(III)-Na盐(8g/l)1ml,用KOH调节PH至7.4。主要培养基1B12:马铃薯淀粉NoreduxA-150(Blattmann,Waedenswil，Swizerland)2%,脱月旨大豆粉Soyamine50T(LucasMeyer,Hamburg,Germany)1.1%，EDTA-Fe(III)-Na盐(8g/l)1ml,用KOH调节PH至7.8。发酵维持培养物从液氮中取出1ml的冷冻细胞库接种到10ml的G52中，并在30。C，180rpm，25mm位移的条件下培养3天。将5ml的种子培养物加入45ml的G52中生长3天,继续将50ml的培养物加入450ml的G52中生长3天，50mm位移(displacement^以后每3—4天，以10%接种量将50ml种子培养物接种到450ml的G52中，以进行连续的种子培养。100L主要发酵培养物将100L发酵罐加入60L的1B12培养基及2%XAD-16后进行灭菌，接种15L中间种子培养物。发酵培养6—7天，条件为30。C，200rpm，0.5L空气/L/分钟，过压为0.5bars,用H2S04/KOH控制PH值至7.6+/—0.5。20L中间种子培养物将含有18LG52培养基在30L的发酵罐用2L前种子培养液接种，并持续培养3—4天，条件为30°C，250rpm，0.5L空气/L/分钟，过压为0.5bars，不控制PH值。加入10ml硅树脂消泡齐U(Tegosipon，GoldschmidtAQEssen)以防止泡沫形成。产品分析从发酵罐中取出50ml含聚苯乙烯树脂AmberliteXAD-16(Rohm+Hass,Frankfurt,Germany)的样品。用150mm的尼龙筛过滤树脂，用少量水洗涤后，加入10ml甲醇并在室温下摇动30分钟。取2ml上清液用于HPLC分析。从100L发酵培养物中分离代谢产物用过滤器收集约8L的XAD。用水洗涤后，加入30L甲醇并搅拌30分钟洗脱。通过蒸发器浓縮洗脱液除去甲醇，用EtOAc抽提余下的水相3次。提取物在旋转蒸发器中浓縮干燥，然后溶解于500ml甲醇中，用折叠的过滤器滤去不溶物。将溶液加入SephadexLH20柱中并用甲醇洗脱。将含有代谢产物的提馏部分浓縮至干燥并再次溶解在50%的甲醇中，并装载在C18色谱柱中分离。以下的步骤将按照实施例2中(3)描述的进行。实施例4.含唑埃坡霉素的生产本实施例描述了通过调整M.xanthus宿主细胞的发酵条件来制备4-脱甲基埃坡霉素D的唑(oxazole)配对物，其唑的形成来自于丝氨酸与半胱氨酸的竞争结合epoB基因产物非核糖核酸多肽合成酶(NRPS)。本实施例中，通过在发酵中补充过剩的L-丝氨酸到埃坡霉素产生菌，例如由本发明提供的S.cellulosum菌株或M.xanthus菌株，在制备埃坡霉素化合物的发酵中进行调整发酵条件。例如，在采用实施例2中描述的条件进行发酵菌株QTB5时，以补充75mM的丝氨酸到发酵培养基中制备埃坡霉素，用HPLC和质谱分析发酵液样品。对QTB5发酵产物的分析表明，丝氨酸的补充导致了4-脱甲基埃坡霉素中含唑配对物增加。实施例5埃坡霉素衍生物BGE8和BGE5的生产本实施例描述了埃坡霉素D或衍生物经&7cc/wT，—orar固突变菌株QTB14生物转化得到的新型埃坡霉素类似物。用冷冻的一小瓶eo^/raefl突变菌株QTB14(无红霉素，erythramycin产生突变菌)接种5ml的R2YE培养基。培养物在30°C的摇床上培养24小时，加入10mg的埃坡霉素D到烧瓶中，继续培养2-3天。分离回收埃坡霉素衍生物。在生物转化液加入XAD-16搅拌30分钟，用IOO毫升甲醇洗脱，通过蒸发器浓縮洗脱液，用EtOAc抽提余下的水相3次。提取物在旋转蒸发器中浓縮干燥，将含有代谢产物的提馏部分利用HPLC进行分离纯化。例如，从作为起始化合物埃坡霉素D回收得到的几种埃坡霉素D的衍生物。A.7-0-甲基-12-羟基埃坡霉素(BGE8)[式5]:HRESITORMSm/z524.3019;C28H46N06S[M+H]+计算值，524.3040。7-0-甲基-12-羟基埃坡霉素的色谱图，LC/MS和^-NMR数据分别见图7A,图7B和图8所示。B.BGE5[式21]:HRESITORMSm/z508.2736;C27H42N06S[M+H〗+计算值，508.2727。化合物BGE5的色谱图,LC/MS和^-NMR数据分别见图9A,图9B和图IO所示。C.11-羟基埃坡霉素D[式22]:HRESITORMSm/z508.2703;C27H42N06S[M+H]+计算值，508.2727。'H-NMR(CDC13,400MHz)S6.97(s,H-19),6.56(s,H-17),5.28(t,J=8Hz,H-13),5.22(dd,J=6.0,3.0Hz,H-15),4.74(t,J=8.0Hz,H-11),4.42(dd,J=11.0，2.0Hz,H-3),3.75(dd,J=6.5,l.OHz，H-7),3.24(qd,J=7.0,l.OHz,H-6),2.69(s,H-21),2.52(2H,m,H2-14),2.44(dd,J=14.0,11.0,H-2a),2.19(dd,J=14.0,2.0，h-2B),2.01(d,J=1.0Hz,H-27),1.90(m,H-8),1.72(m,H-lOa),1.70(s,H-26),1.58(H-10b),1.55(m,H-9a),L37(s,H-23),1.29(m,H-9b),L14(s,H-22),1.03(d,J=7.0,H-25)。D.26-羟基埃坡霉素D[式23]:HRESITORMSm/z508.2723;C27H42N06S[M+H]+计算值，508.2727。^-NMR(CDC13,400MHz)S6.98(s,IH),6.66(s,IH)，5.45(dd，J=9.4,5.8Hz,IH),5.24(dd,J=8.8,2.0Hz,IH),4.33(dd,J=11.2,2.4Hz,IH),4.09(d,J=13.2Hz,IH),4.01(d,J=13.2Hz,IH),3.69(dd,J=4.4,2.0Hz,IH),3.18(qd,J=6.8,2.4Hz,IH),2.71(s，3H),2.63(dt,J=15.2,9.2Hz,IH),2,46(dd,J=14.8,11.2Hz,IH),2.37(m,IH),2.25(重叠，IH),2.24(dd,J=14.8，2.4AHz,IH),2.12(m,IH),2.05(d,J=1.2Hz，3H),1.76(m,IH),1.67(m,IH),L36(s,3H),1.34(m,3H),1.18(d，J二6.8Hz,3H),1.05(s,3H),0.98(d,J=9.6Hz,3H)。E.21-羟基埃坡霉素D[式24]:HRESITORMSm/z508.2713;C27H42N06S[M+H]+计算值，508.2727。！H-NMR(CDC13,400MHz)57.01(s,IH),6.59(s,IH),5.34(m,IH),5.24(d，J=8.6Hz,IH),5.13(dd,J=10.0,4.9Hz，IH),4.90(s,2H),4.30(dd,J=11.2,2.7Hz,IH),3.70(dd,J=4.0,2.4Hz，1H),3.14(qd,J=6.8,2.1Hz，1H),2.62(dt,J=15.0,9.8Hz，1H),2.47(dd,J=14.7,lUHz，1H),2.30(重叠，1H),2.27(dd,J=14.7,2.7Hz,1H),2.06(s,3H),2.00(m,1H),1.89(m,1H),1.75(m,1H),1.68(m,1H)，1.66(s,3H),1.33(s,3H),l'26(重叠，3H),U9(d,J=6.9Hz,3H),L05(s,3H),l.Ol(d,J=7.0Hz,3H)。实施例6制备21-羟基埃坡霉素衍生物的生物转化1.由4-脱甲基埃坡霉素D[式19]制备4-脱甲基，21-羟基4-脱甲基埃坡霉素B[式14]的生物转化30。C下，在IL培养基中培养S.cellulosum埃坡霉素生产菌或埃坡霉素PKS突变菌株(无埃坡霉素生产菌)或QTBG2，其培养基含马铃薯淀粉(0.8%)，葡萄糖(0.8%)，脱脂大豆粉(0.2%),酵母提取物(0.2%)，CaCl2.2H2O(0.1%)，MgSO4.7H2O(0.1%)，Fe-EDTA(8mg/L)，2%XAD-16，用KOH调节PH7.4。以150rpm搅拌培养物，并以0.1体积/分钟的速率喷射消毒空气。培养4天后，分离XAD，培养液通过0.3微米膜横流过滤以浓縮到0.3升体积。在细胞浓縮液中加入4-脱甲基埃坡霉素D(0.5g/L)的甲醇溶液。在30°C继续培养，以450rpm速度搅拌，同时以6升/分钟的速率喷射消毒空气。24小时后，添加10mlXAD-16到培养物中并继续搅拌半小时。在滤篮中收集XAD-16，并用水洗涤以除去液体培养基和细胞。然后将XAD用甲醇洗脱。浓缩洗脱液并用乙酸乙酯提取。用Na2S04干燥提取物，过滤并蒸发，得到粗埃坡霉素。用Si02色谱(1:2己烷/乙酸乙酯)分离得到21-羟基，4-脱甲基埃坡霉素D[式15]和B[式14]。2.4-脱甲基埃坡霉素B到4-脱甲基，21-羟基埃坡霉素B的生物转化冷冻的一小瓶爿w;;co/"toaMto&cp/^caATCC35203菌株(lml),如PCT出版物No.WO00/39276中所述，用于接种50ml的BGA培养基，该培养基包括10g/L的右旋糖，5g/L的麦芽糖提取物，5g/L的酵母提取物和lg/L的蛋白胨。培养物在30°C下在摇床上培养1天。添加lOmg的4-脱甲基埃坡霉素B到烧瓶中，在28。C摇床上继续2—3天。从培养物中分离出转化产物并回收产物，用HPLC和质谱分析确认为起始化合物的21-羟基配对物。实施例7产生14-羟基埃坡霉素衍生物的生物转化用1小瓶(lml)冷冻的5^eptomyce平ATCC55098菌株接种5mlFM-6培养基。培养物在30°C摇床上培养2天。将2.5ml的培养物转移到烧瓶内50ml的FM-6培养基中，然后在30°C下培养24小时，加入10mg的埃坡霉素D到烧瓶中，继续培养2到3天。从培养物中分离出转化产物并回收埃坡霉素衍生物。例如，14-羟基埃坡霉素D作为主要产物从作为起始化合物的埃坡霉素D中分离出来。14-羟基埃坡霉素D:HRESITORMSm/z508.2728;C27H42N06S[M+H]+计算值，508.2727。'H-NMR(CDC13,400MHz)S7.02(s,1H),6.67(s,1H),5.22(d,J=9.4Hz,1H),4.98(d,J=9.4Hz,1H),4.57(t,J=9.2Hz,1H),4.26—d,J=10.1Hz1H),3.70(m,1H)，3.14(qd,J=6.7,1.7Hz,IH),2.70(s,3H),2.45(m,IH),2.44(dd,J=14.3，11.2Hz,IH),2.22—d,J=14.3HzIH),2.17(s，3H)，1.96(m,IH),1.76(m,IH),L73(m,IH),1.72(s,3H),1.29(m,3H),1.34(s,3H),1.20(d,J=6.8Hz,3H)，L06(s,3H),1.03(d,J=7.0Hz,3H)。实施例8化学环氧化本实施例描述了当A-Q连在一起形成C=C双键(式I化合物的脱氧化合物)时，式I化合物的环氧化反应。在一78。C，滴加二甲基二环氧乙烷溶液(丙酮中O.IM，17ml)到本发明的脱氧化合物(505mg)的10mlCH2C12溶液中。将混合物加热到一50。C，保持1小时，之后加入另一部分二甲基二环氧乙烷溶液(5ml)，反应在一50。C下继续1.5小时。在一50。C的N2蒸汽中干燥反应物。这种通用方法适用于从本发明的其它化合物制造相应的12，13-环氧衍生物。用Si02色谱提纯产物。实施例94-脱甲基埃坡霉素B内酰胺的制备步骤l:用4(三苯基磷)钯(0.58g)在氩气中处理容于55ml脱气化的四氢呋喃/水(10:lv/v)溶液中的4-脱甲基埃坡霉素B(2.62g)和叠氮化钠(0.49g)。反应在45。C保持1小时，然后用50ml水稀释，并用乙酸乙酯提取。用饱和NaCl液洗涤提取物，用Na2S04干燥，过滤后蒸发。用Si02色谱提纯产物。步骤2:环境温度下，在氩气中用三甲基磷1.0M的甲苯(3ml)溶液处理容于15mlTHF/水(10:1)溶液的上述步骤1产物(565mg，15-叠氮化物)2小时。浓縮混合物，用Si02色谱提纯产物。步骤3:将上述步骤2产品(540mg，15-氨)容于15ml乙腈/二甲基甲酰胺(20:lv/v)溶液冷却到0。C，继而用1-羟基苯并三唑(0.135g)和1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(0.5g)处理。将混合物加热到环境温度下并保持12小时，然后用水稀释并用乙酸乙酯提取。继而用水，饱和NaHC03，以及饱和NaCl液洗涤提取物，然后用Na2S04干燥，过滤并蒸发。用Si02色谱提纯产品以获得4-脱甲基埃坡霉素B内酰胺式[式11](反应式中的步骤3的产物)。实施例104-脱甲基埃坡霉素D内酰胺的制备六氯化钨(0.76g)的四氢呋喃(20ml)溶液在一78。C，用L6M正-丁基锂的己垸溶液(2.5ml)处理。将混合物用20分钟以上时间加热至环境温度。将得到的溶液13.8ml加到在环境温度下容于2ml四氢呋喃溶液的4-脱甲基埃坡霉素B内酰胺(360mg)中。30分钟后，将反应物冷却到0°C，并用饱和NaHCO3(10ml)处理，过滤后蒸发。用Si02色谱提纯产物，得到4-脱甲基埃坡霉素D内酰胺[式IO](见实施9中反应式中的步骤4)。实施例11.制备7-甲氧基埃坡霉素a.TESCl/咪唑；210mg的埃坡霉素可以用1.5eq.的TESC1和0°C含2eq.咪唑的5mlCH2Cl2溶液保护；b.脱保护用0.4ml的NH2Cl/NaH2PO^B0.4ml的CH3CN脱保护。c.在THF:DMSO(l:l)中用MeBr及K-O-t-Bu使甲基化。d.用AcOH(ACN:H20)来脱保护。本实施例描述了式I化合物的C-7羟基到C-7甲氧基的化学改性。实施例12制备12-羟基埃坡霉素的制备<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>本实施例描述了了通过化学改性制备式I的C-12羟基化合物。实施例13:将4-脱甲基-埃坡霉素B转化为21-OH,4-脱甲基-埃坡霉素B和D以及21-NH2-4-脱甲基-埃坡霉素B禾口D。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>(a)1.98g(3.9mmol)的4-脱甲基-埃坡霉素B在氩气下溶解于60ml无水的CH2C12中。在溶液中加入0.72g的m-氯过苯甲酸(4.17mmol,1.07当量)，25。C下搅拌25.5小时。该反应混合物用60ml的NaHC03中止，然后用3X75ml的CHCl3萃取。继而用水，饱和NaHC03，以及饱和NaCl液洗涤提取物，然后用Na2S04干燥，过滤并蒸发。用Si02色谱提纯产品以获得4-脱甲基埃坡霉素B的N-氧化物。(b)0.97g的N-氧化物在氩气下溶解于含35ml的无水CH2C12，2,6-二甲基吡啶(L73ml,14.8mmol,8叫u)和(CF3CO)20(1.84ml,13mmol,7叫u.)管中，然后密封，7(TC加热25分钟。将混合液冷却，在氩气下去除溶剂，接着真空浓缩。反应被25ml的MeOH稀释，加入2.9ml28%的NH4OH(溶液)，然后45。C下加热20分钟，再冷却到室温。粗产品浓縮并用硅胶色谱层析制得21-0H-4-脱甲基-埃坡霉素B成[式14].采用已知方法，将21-0H-4-脱甲基-埃坡霉素B环氧化物脱氧，制得21-0H-4-脱甲基-埃坡霉素D[式15]。(c)在(TC氩气下，在20ml的四氢呋喃中搅拌21-0H-4-脱甲基-埃坡霉素B(957mg,1.83mmol);再加入0.47ml的联苯磷酰基叠氮化物(604mg,2.19mmol,1.2equ.)，揽摔3分钟；力口入1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7ene(0.27ml,278mg,1.83mmol,1equ.)，在0。C搅拌2小时，升温至25。C保持20小时。然后用150ml乙酸乙酯稀释及用水洗，水相再用乙酸乙酯提取。继而将有机相用饱和Na2S04干燥，过滤并蒸发。用Si02色谱提纯产品以获得21-叠氮化物的4-脱甲基埃坡霉素B。(d)在氩气下，将0.22ml三甲基磷化氢(0.163g,2.145mmol,1.1equ.)加入到含21-叠氮化物的30ml的THF中。再加入5.5ml的H20,25。C搅拌。3小时以后，加入3ml28X的液态NH40H，完成从磷酰基亚胺到胺的转化。搅拌1小时以后，在真空环境下去除溶剂。粗产品浓縮并用硅胶色谱层析制得21-氨基-4-脱甲基-埃坡霉素B[式13].(e)在21-氨基_4-脱甲基-埃坡霉素B(126mg,0.24mmol)的乙醇(4ml)溶液中，加入三乙胺(67ul,0.48mmol,2equ.)和2-t-丁基-碳酸氢钠(65mg,0.3mmol,1.25equ.)。反应物搅拌2小时。粗产品浓縮并用硅胶色谱层析制得21-NHB0C-氨基-4-脱甲基-埃坡霉素B。(f)无水THF(3ml)在氩气下置于烘干的烧瓶中，冷却至-78"C。在氩气流下，将WC16(206mg,0.52mmol,2叫u.)加到冷却的THF中，在加入正-丁基锂(在正乙烷中的0.65ml的1.6M溶液，1.04mmol,4equ.)。将反应从-78。C的冷却池中移出，在室温下搅拌15分钟，放到0。C再搅拌5分钟，加入21-N-BOC-氮基-4-脱甲基-埃坡霉素B溶液。反应在0"C保持45分钟。用饱和的液态NaHC03(5ml)中止反应，反应物在饱和的液态NaHC03(25ml)和CH2C12(50ml)形成两相。液相用CH2Cl2萃取3次。继而将有机相用饱和Na2S04干燥，过滤并蒸发。用Si02色谱提纯产品以获得21-N-80。氨基-4-脱甲基-埃坡霉素D。g.在0。C，21-N-B0C-氨基-4-脱甲基-埃坡霉素D(98mg,0.16mmol)用预冷的含10%三氟代垸酸的CH2C12(4ml)溶液处理。40分钟后，反应升至常温，20分钟后，加入0.6ml纯的三氟代烷酸。再过50分钟，又加入0.5ml的三氟代垸酸。2小时后，反应快接近完成的50%时，真空去除溶剂。残基用乙酸乙酯(50ml)和饱和的NH40H(50ml)水溶液溶解，再用乙酸乙酯(3X50ml)萃取。继而将有机相用饱和Na2S04干燥，过滤并蒸发。用Si02色谱提纯产品以获得21-氨基-4-脱甲基-埃坡霉素D[式12]。实施例14生物活性的测定采用硫罗丹明B(SRB)试验(参见Skehanetal.,J.Natl.CancerInst.82:1107-1112(1990)，列于此以作参考)，筛选本发明的选择性化合物对四种不同的肿瘤细胞品系的抗癌活性。培养的细胞被胰蛋白酶化，然后计数，并用生长培养基稀释到合适的浓度(5000-7500细胞/100pl)。将lOOpl/孔的细胞悬浮液加入96-孔的微量滴定板。20小时后,将在生长培养基中稀释成2xl000nM至2x0.001nM的100pl化合物加到每个孔中。经过3天的培养后，用10(^110%的三氯乙酸，在4。C下固定细胞1小时，然后用0.2%SRB/1%乙酸在室温下染色20分钟。用1%的乙酸漂洗未结合的染料，用200nl，10mM的Tris碱溶解结合的SRB。结合染料的量通过测定波长515nm的OD值来推算。，结合染料的量与总的细胞蛋白量成正比。数据用KaleidaGraph程序分析并计算半数抑制浓度(IC50)。平行测定埃坡霉素D和B以作比较。本发明中测试的选择化合物的细胞毒性试验结果如下所示。本发明的其它化合物也可用相似的方法测定。本发明的新型埃坡霉素化合物对于人类的癌细胞系的抗增生作用见下表表1所示。结果表明它们不但对一般非耐药性肿瘤细胞，而且对多重耐药性的肿瘤细胞具有强大的抗生长活性。用细胞水平的(cell-based)微管蛋白聚合试验测定作用机理。试验中，在37°C下，用l|iM的每种化合物对培养于35mm培养皿中的MCF-7细胞处理1小时。用2mL不含Ca和Mg的PBS洗涤细胞两遍，在室温下用300pL的裂解液(20MmTris,ph6.8,1mMMgCl2,2mMEDTA,1%TritonX-100,加上蛋白酶抑制剂)处理细胞5-10分钟而使细胞裂解。将裂解液转移到1.5-mL的Eppendorf管中。室温下，裂解液在18000g离心12分钟。将含有可溶性或未聚合的微管蛋白的上清液与含不溶性或聚合的微管蛋白的粒状沉淀分离，并转移到新管中。然后用300mL的裂解液重新悬浮粒状沉淀。通过SDS-PAGE和用13-微管蛋白抗体(Sigma)进行免疫印迹分析每个样品，，然后用NIHImage程序分析印迹上P-微管蛋白信号的量，从而测定细胞中微管蛋白聚合的变化。微管蛋白聚合试验说明4-脱甲基埃坡霉素，BGE8,BGE5具有和埃坡霉素D相同的作用机理，在测试条件下它们均能强烈促进微管蛋白的聚合，与埃坡霉素D有相似的动力学和效用。本发明的其它化合物也可用相同方法测定。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>权利要求1、一种制备以下通式表示的埃坡霉素类似物的方法id="icf0001"file="S2007101995604C00011.gif"wi="94"he="39"top="5"left="5"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中当A-D为下述式(a)的碳碳双键或为式(b)的环氧基团时，R4不存在，id="icf0002"file="S2007101995604C00012.gif"wi="75"he="27"top="5"left="5"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>当A-D为C-C单键时，R4为羟基或氢，Q选自H、C1-4烷基或NH2，R2和R3各自独立地选自H、羟基、NH2和CH3，X为O或N-R，其中R为H、NH2、芳基或CH3，W为S或O；所述方法包括以下步骤中的至少一种1)产埃坡霉素D微生物纤维堆囊菌菌株经发酵制备埃坡霉素D化合物；2)埃坡霉素通过生物转化制备羟基化或环氧化埃坡霉素衍生物；3)按以下反应图解将A-D为碳碳双键经环氧化获得A-D为环氧基团的化合物的化学环氧化反应id="icf0003"file="S2007101995604C00013.gif"wi="154"he="29"top="5"left="5"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>4)通过化学改造制备Q为甲基的埃坡霉素类似物；5)将X为氧的内酯化合物通过化学改造获得X为N-R的内酰胺化合物；6)通过化学改造制备R4为羟基的埃坡霉素类似物。2、如权利要求l所述的方法，其包括将埃坡霉素D作为中间体制备埃坡霉素类似物，所述的埃坡霉素类似物为以下化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>3、埃坡霉素类似物，其选自:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>4、权利要求1所述通式表示的埃坡霉素类似物，其中所述埃坡霉素类似物为以下化合物通式中的W为O，其余基团的定义同权利要求1的化合物；或者A—D为C-C单键并且R4为羟基或氢，其余基团的定义同权利要求l的化合物；或者A—D为式(b)的环氧基团，其余基团的定义同权利要求1的化合物；或R2为OH，其余基团如权利要求1中所定义。5、下式表示的埃坡霉素类似物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>6、权利要求2—5任一项所述的埃坡霉素类似物在制备抗肿瘤、抑制细胞过度增长和/或中止细胞生长的药物中的应用。7、抗肿瘤、抑制细胞过度增长和/或中止细胞生长的药物组合物，其包含至少一种如权利要求2—5任一项所述的埃坡霉素类似物以及至少一种药用载体和/或稀释剂。8、药物组合物，其包括权利要求2—5任一项所述的埃坡霉素类似物和其它抗增殖性疾病的药物以及药用载体和/或稀释剂。9、权利要求2—5中任一项所述埃坡霉素类似物和其它抗增殖性疾病的药物的组合在制备抗增殖性疾病的药物中的应用。10、如权利要求9所述的应用，所述的增殖性疾病选自肿瘤或血管生成失控相关的疾病。全文摘要本发明涉及制备由通式表示的埃坡霉素类似物的方法，其包括以下步骤中的至少一种1)产埃坡霉素D微生物纤维堆囊菌菌株经发酵制备埃坡霉素D化合物；2)埃坡霉素通过生物转化制备羟基化或环氧化埃坡霉素衍生物；3)将A-D为碳碳双键经环氧化获得A-D为环氧基团的化合物的化学环氧化反应4)通过化学改造制备Q为甲基的埃坡霉素类似物；5)将X为氧的内酯化合物通过化学改造获得X为N-R的内酰胺化合物；6)通过化学改造制备R4为羟基的埃坡霉素类似物。本发明还涉及一类新型的埃坡霉素类似物、包含所述埃坡霉素类似物的药物组合物、以及所述埃坡霉素类似物的用途。所述埃坡霉素类似物的通式如式Ⅰ。文档编号C07D413/06GK101177425SQ200710199560公开日2008年5月14日申请日期2003年1月28日优先权日2003年1月28日发明者邱荣国申请人:北京华昊中天生物技术有限公司